Purificação alta do ácido nucleico da produção simplificada
Uma entrevista com bastões Mutamba e Nans Bodet, conduzido por James Ives
Dê por favor uma vista geral da bandeira de ouro actual na purificação alta do ácido nucleico da produção. Que favoriza e as limitações são estas para estes métodos?
Bastões: A bandeira de ouro histórica para o isolamento do ácido nucleico foi tecnologia baseada fora de uns trabalhos da coluna. Nos trabalhos regulares há uma etapa do lysis, onde as pilhas sejam tomadas e abertas para expr o ácido nucleico ao ambiente externo, a seguir a uma etapa obrigatória em uma membrana na coluna, seguida por diversas etapas da lavagem para obter livradas de todos os restos de pilha, das proteínas e de outros materiais fora dos ácidos nucleicos. Na etapa final da eluição, um amortecedor seria empregado para separar o ácido nucleico da matriz da coluna.
Estes trabalhos têm deslocado desde às tecnologias grânulo-baseadas magnéticas, que possuem essencialmente as mesmas etapas: o lysis, o emperramento, a lavagem e a eluição, mas esta acontecem em um grânulo em vez sobre de uma coluna.
as tecnologias Coluna-baseadas têm algumas desvantagens: os poços são obstrução inclinada com ou sem o uso dos distribuidores de vácuo. Isto pode ocorrer durante a adição de amortecedores assim como de etapas numerosas, incómodas e demoradas da centrifugação a girar abaixo das colunas. Este não é o caso com as tecnologias grânulo-baseadas, que são sistemas tanta mais limpos considerados com tempos de processamento mais curtos.
Nans: Os laboratórios estão exigindo a pureza e a flexibilidade para a purificação alta do ácido nucleico da produção, ao precisar de terminar a análise a jusante difícil, por exemplo com arranjar em seqüência seguinte do Gen ("NGS ").
A química baseada magnética é a bandeira de ouro porque pode fornecer muita pureza, como você pode seleccionar o tipo apropriado de resina magnética para caber sua aplicação e para se ajustar para as aplicações a jusante as mais apropriadas. Os grânulos magnéticos são flexíveis em termos da escalabilidade e do volume da entrada da amostra, assim como os números de amostras que precisam de ser executadas.
Isto é em comparação com outras técnicas conhecidas tais como a separação baseada vácuo, onde a placa completa precisa de ser usada, diminuindo a flexibilidade da técnica, e afetando o volume de amostra. Uma vantagem do método do vácuo está a uma velocidade, pode dar respostas rápidas, mas não segura aplicações a jusante de exigência assim como a química grânulo-baseada magnética.
Como o sistema® do GH de Maxwell trabalha para refinar o ADN ou o RNA? Que instrumentação o sistema® do GH de Maxwell trabalha com e em que escalas?
Bastões: A química® do GH de Maxwell mencionada mais cedo é predominante uma tecnologia grânulo-baseada para isolar ácidos nucleicos, ADN, RNA ou o ácido nucleico total (TNA), que inclui o ADN e o RNA. Se as pilhas precisam de ser lysed na etapa inicial do lysis, os amortecedores específicos estarãos, por exemplo ao isolado o ADN dos glóbulos brancos.
O ácido nucleico é limitado então nos grânulos magnéticos (ou na resina, como nós a chamamos), que podem ter tipos diferentes de superfícies. Nós costuramos a química obrigatória para fornecer a captação óptima das moléculas do interesse. Uma vez que o ácido nucleico liga aos grânulos magnéticos há três ou quatro lavagens, que podem ser à base de álcool, mas para alguns clientes que têm ensaios a jusante sensíveis, nós temos os amortecedores alternativos disponíveis.
O passo final é a etapa da eluição, envolvendo o destacamento do ácido nucleico do grânulo com um amortecedor da eluição, tipicamente a nuclease molha livre ou um amortecedor do tris-EDTA (amortecedor de TE). Se os ensaios a jusante do nosso cliente são sensíveis ao EDTA, que nós conhecemos somos um agente chelating, a seguir nós podemos usar o amortecedor de 25 milímetros Tris.
Os sistemas nós instalamos tipicamente o processo das centenas aos milhares de amostras. Nós somos plataforma agnóstica, assim que significa que nós integramos química do reagente em toda a plataforma que automatizada o cliente desejar. Isto dá-nos mais flexibilidade sem forçar nossos clientes a decidir nos sistemas que não podem ser ideais para eles. Nós não oferecemos recomendações e nenhuma exigência dura.
Nós temos alguma instrumentação de Promega que nós usamos para programas demonstrativos ou prova de estudos do conceito, e nós trabalhamos com empresas da instrumentação de todos os jogadores grandes que incluem Hamilton, Tecan, Beckman, ThermoFisher, Eppendorf e muito outro. Há um vasto leque das plataformas que podem ser usadas para as química e nossa equipe tem o conhecimento diverso scripting ou programar estas plataformas.
Nans: A beleza do sistema® do GH de Maxwell é a química bem-provada, que pode facilmente ser demonstrada no instrumento pequeno® de Maxwell RSC. Nós temos a abundância da experiência com nosso sistema e nós podemos escalar a mesma química a qualquer tipo da produção.
Promega oferece uma solução personalizada à purificação do ácido nucleico, descreve por favor o que você oferece a seus clientes.
Nans: O cliente ou o laboratório podem ter uma amostra muito padrão e nós temos as soluções estabelecidas para ela. Contudo, na maioria das vezes, as amostras que estão sendo testadas serão necessários para uma aplicação específica, por exemplo as bactérias da fezes, ou os ensaios a jusante puderam ser muito particulares para esta aplicação, ou o volume exigido é muito diferente.
Porque nós temos um aperto completo da química exigida, nós podemos ajudar o laboratório com uma solução personalizada, pedindo que o laboratório nos envia algumas das amostras para a avaliação. Nós trabalhamos então em nossos laboratórios da aplicação dentro ao redor do mundo para testar soluções diferentes da química nas amostras e para definir todos os volumes exigidos para o melhor desempenho da aplicação a jusante.
Baseado nisso, nós podemos ajustar nossa oferta final, nós podemos fornecer um jogo padrão para esta aplicação os reagentes extra se for necessário ou fazer um jogo inteiramente personalizado, com o mesmo número de lote pelo ano inteiro para o laboratório.
Bastões: Como Nans mencionou não há nenhum um cliente que for querer o exacto os mesmos trabalhos com o exacto a mesma produção, assim que Promega tem dois grupos adicionais que são responsáveis para a personalização. Nossa equipe do FSS (do "cientistas do apoio campo ") trabalha junto com os costumes e o grupo da solução do OEM assim como um departamento de pedido da alfândega (COD), que seguram a fixação do preço maioria, pedir e configurações feitas sob encomenda do jogo.
Por exemplo, se você é um cliente que quer levar a cabo uma química específica, e você não queira entrar em seus tempos múltiplos das garrafas de reagente pela corrida, nós pode empacotar os reagentes em uma maneira personalizada para seu laboratório. Nós trabalhamos com nossos clientes e nossas equipes de apoio ao cliente para trabalhar nas configurações diferentes do jogo que são óptimas para seus trabalhos. Se não é uma configuração padrão do jogo, nós temos a capacidade alfaiate-para fazer reagentes ou empacotamento para ajudar nossos clientes, nenhuma matéria o nível da produção.
Como a equipe® de apoio feita sob encomenda da purificação do ácido nucleico do GH de Maxwell ganha o tempo e reduz o esforço?
Bastões: A equipe do FSS trabalha primeiramente com o cliente e o representante local para desenvolver uma compreensão das exigências para trabalhos do laboratório e necessidades da automatização. A equipe usa nossa experiência em sistemas e em química automatizados de Promega para oferecer recomendações para que o cliente considere e então ajudará ao cliente no laboratório a programar o instrumento, a treinar o laboratório em usar o instrumento e a química e a oferecer apoio em curso.
Nans: Nós temos um processo muito bem conhecido, primeiramente em termos da documentação dos trabalhos, nós recolhemos exigências então que nós temos uma indicação de trabalho onde nós definimos as expectativas do laboratório como nós as vemos e compreendemos. Nós compartilhamos deste com o laboratório antes que nós vamos para que a aplicação no local verifique novamente que ambas as expectativas combinam. Com isto nós salvar muito tempo.
Nós igualmente salvar agradecimentos do tempo a nosso muito grande conhecimento da automatização dentro da equipe, todos os colegas da equipe têm trabalhado por muito tempo no campo da automatização, assim que nós podemos apoiar o laboratório em definir a melhor solução da automatização se planeiam em comprar um instrumento ou se já têm robôs em seu laboratório, dando o melhor conselho em que os parâmetros devem ser usados e em que os módulos.
Agradecimentos a nossa experiência nós podemos igualmente ajudar verdadeiramente o laboratório a executar a química porque nós apenas não estamos vendendo uma caixa da química e o assento atrás do cliente para mandá-los fazer sua coisa. Nós tomamos o controle do computador e definimos todos os protocolos manualmente sem ajuda mais adicional.
Nós estamos aqui entregar o desempenho biológico, este é geralmente algo que os clientes e o laboratório não esperam devido às experiências ruins do passado com outras empresas. Contudo, em nosso caso nós estamos realmente aqui entregar o desempenho biológico, e este ajuda a diminuição o nível de esforço do laboratório.
Que tipos de problemas da purificação do GH a equipe ajudou clientes a resolver?
Bastões: Nós recebemos frequentemente inquéritos dos laboratórios que são uma ou outra automatização de laboratório existente de tentativa da re-tarefa a um processo novo ou estão escolhendo começar a investir na automatização de laboratório. Aqueles clientes não podem ter a experiência da automatização e apreciam a capacidade para consultar com os peritos de automatização enquanto estão considerando várias opções.
Até problemas específicos da extracção, nós estamos mais do que felizes ajudar a resolvê-los. Em nossas equipes, nós podemos sempre ir no local e trabalhar com um cliente em seus tipos difíceis da amostra ou na outra alternativa é o cliente tem a opção para enviar-nos amostras onde nossa equipe científica das aplicações trabalhará em uma solução para aqueles tipos particulares da amostra.
Nós enviaremos então aquelas amostras de volta ao cliente, e podem então testar os isolados usando seus ensaios a jusante. Nós orgulhamo-nos como especialistas da automatização em ter a capacidade para ajudar no local um cliente com scripting ou programar.
Nans: Em um caso com uma empresa de biotecnologia em França, quiseram fazê-los a purificação do plasmídeo, normalmente fácil, mas desde que seu processo a jusante era trabalhar no transfection e na proliferação do anticorpo, necessários muito rendimento realmente enorme dos plasmídeo-um!
Eles necessários para automatizar os midipreps que partem de 20-30 ml das culturas, algo que nós não tínhamos feito antes. Contudo, desde que nós tivemos lotes do sucesso no formato do miniprep em 96 poços, nós tentamos aquele em nosso laboratório primeiramente com culturas e amostras de Promega. Com as amostras internamente desenvolvidas nós tentamos empurrar manualmente os limites de nossa química para ver se poderia segurar a variação do midiprep.
Uma vez que nós tivemos aquele trabalhar, nós perguntamos ao cliente se poderiam nos fornecer a alguma de sua cultura às diferenças do teste entre amostras internas e as externos. Nós testamos se trabalhou manualmente com estas amostras e então, desde que nós tivemos alguma confiança em nossa química e nós temos a automatização em nossos laboratórios, nós pôs a química sobre o instrumento automatizado em uns 24 formatos do poço profundo para segurar a escala do volume similar ao midiprep.
Após certas semanas da revelação, nós podíamos desenvolver um protocolo ajustado para segurar os midipreps e íamos então ao local do laboratório em Marselha executá-la mais e ajustar para as necessidades do laboratório. Esta foi uma instalação muito bem sucedida porque o laboratório está muito feliz e nós podíamos escrever junto um cartaz combinado.
Como pode a equipe ajudar a laboratórios com alguma plataforma da instrumentação?
Nans: Uma vez que você automatiza uma química em uma plataforma que seja consideravelmente directa mover sobre aquela para outras plataformas porque as questões básicas estão definindo basicamente o líquido apropriado que segura parâmetros, por exemplo: É esta amostra viscoso ou não? Que deve a temperatura da incubação e velocidade da agitação ser?
Uma vez que você tem aquele e você tem um conhecimento básico da automatização que é fácil traduzir em toda a outra língua da automatização. Dentro de nossa equipe nós todos temos a experiência precedente da indústria. Eu trabalhei por 10 anos em Tecan antes de juntar-se Promega e você encontrará a experiência similar em todos meus colegas na equipe do FSS. Desde que a equipe foi criada 8 anos há, nós produzimos tão muitos moldes que nós podemos se usar e então personalizar a toda a plataforma.
Bastões: Nossa equipe é tão diversa em termos do conhecimento que combinado nós recolhemos ao longo dos anos em plataformas diferentes. O software introduzindo com pipeta pode ser muito diferente em termos da programação mas, geralmente, se você tem um bom punho na química e se você pode programar em um do líquido mais grande que segura plataformas, a seguir o líquido que segura no conjunto não é tão incómodo como você pôde pensar.
Como um grupo que tem esses fundo e conhecimento diversos na automatização crua, nós não estamos indo ditar que plataforma um cliente escolhe para nossa química. Nós temos as recomendações para que automatizou o trabalho das plataformas melhor do que outro, alguns temos mais versatilidade ou flexibilidade, mas a mensagem neta aqui é que nós somos plataforma agnóstica. Nós não nos importamos que a plataforma o cliente usa com nossa química.
Que amostra desafiante dactilografa a equipe encontrada e pôde apoiar?
Nans: Ultimamente havia um foco no microbiome. Há muito interesse em amplificar ácidos nucleicos da fezes, não somente fezes humana mas igualmente os ratos e a outra espécie, que é tipicamente difícil de segurar devido à sujeira da amostra, e são geralmente muito difíceis ganhar um eluído limpo.
Nós igualmente temos lotes dos pedidos para amostras da planta. Agradecimentos a um de nossas química específicas, de Maxwell® RSC PureFood GMO e do jogo da autenticação, é fácil refinar estas amostras difíceis. Nós sempre temos que com cuidado controlar o armazenamento, a entrada e a manipulação da amostra, mas por outro lado nós somos bastante bem sucedidos neste campo.
Bastões: Nós igualmente tivemos os clientes que têm quiseram extrair o ADN do marisco e dos vários crustáceos, no fuzileiro naval e no sector de Biotech. Nós igualmente tivemos pedidos extrair o ácido nucleico das unhas e das unhas do pé! Os povos esquecem frequentemente que há muitos ADN e RNA nos pregos, assim como os folículo de cabelo. Nós tratamos os todos aqueles tipos de amostras.
Os ganhos líquidos são mesmo se nós não temos a experiência com um tipo específico da amostra, os clientes têm a opção de enviar-nos aquelas amostras completamente em Madison onde nós trabalhamos em conjunto com cientistas para conseguir seu extracto trabalhar.
Que garantias são oferecidas aos clientes sobre a qualidade dos sistemas® do GH de Maxwell?
Nans: Promega como uma empresa tem uma grande reputação neste campo, assim que eu diria que este é o primeiro nível de segurança. Então, naturalmente, nós gostamos sempre de dobrar e a verificação tripla tudo e nós gosta de tentar a amostra do laboratório com nosso sistema® de Maxwell RSC, que é muito fácil de segurar no local e demonstrar.
Em nosso ou laboratório do cliente, nós podemos testar a amostra em uma hora permitindo que nosso cliente ver para se se a química está trabalhando como esperado.
Quando um laboratório envia uma amostra a Madison ou a Lyon, onde nós podemos ajustar os parâmetros da automatização da experiência, nós escrevemos um relatório e enviamos o eluído de volta ao laboratório do cliente assim que podem igualmente ter um olhar claro no ADN e no RNA e considerar para se que está trabalhando. Se o laboratório está feliz, nós viríamos então no local e repetiríamos este trabalho com seus cientistas e sua plataforma, que dá uma quantidade alta de segurança.
Bastões: Nós podemos demonstrar que nossos eluído são ao padrão que o laboratório espera testando a amostra resultante. Nossa garantia do sucesso para nossos clientes é que a química não se encontra.
Por exemplo, com uma química da purificação do ácido nucleico, há umas relações da pureza para o controle da qualidade das amostras. Há duas relações que nós olhamos quando nós isolamos o ADN e/ou o RNA, primeiro somos a relação A260-280 que mede basicamente toda a contaminação da proteína em sua amostra do ácido nucleico. Quando você testa suas amostras, você pode esperar a relação ser aproximadamente 1,8 a 1,9. Se há proteínas ou a outra contaminação na amostra, a relação será isto é um 0,7 a uns 1,3 significativamente mais baixos. Isto diz-lhe que tipo de uma amostra você tem e como bem sucedido o isolamento foi.
A segunda relação é a relação A230-260, que essencialmente as medidas lavam os amortecedores ou o desperdício levados durante todo os trabalhos. Da etapa do lysis, etapa obrigatória, etapa da lavagem à etapa da eluição, se alguns daqueles componentes indesejáveis são levados com os trabalhos que a relação lhe mostrará. Nós procuramos tipicamente relações de 1.7-2.1, e se deixa cair a 0.7-1.0 você sabe que há uns níveis elevados de amortecedor ou dos materiais waste levado com os trabalhos.
Além do que isso nós trabalharemos então com o cliente nos processos a jusante. Tipicamente, se o sistema trabalha e as extracções eram bem sucedido que devem ser demonstrados naqueles os ensaios a jusante.
Que o futuro guardara para Promega e a equipe® do GH de Maxwell?
Nans: De uma perspectiva da equipe nós fomos bastante bem sucedidos, 5 anos há a equipe era apenas 2 povos nos E.U. e agora nós somos 9 povos e actualmente vista para contratar uma pessoa nova em Europa. Nós estamos expandindo e nós igualmente estamos tentando educar povos sobre a automatização durante todo nossa organização para fazê-los cientes dos desafios típicos da automatização no laboratório, assim que nós podemos ser ainda mais bem sucedidos neste campo.
Bastões: Em termos do futuro, nós somos entusiasmado sobre novas tecnologias que os cientistas estão trabalhando sobre na academia, hospital e laboratórios clínicos, e pharma e Biotech. Por exemplo, isolamentos do plasmídeo para CRISPR, a produção sintética do ADN e a operação bancária do sangue, onde as enormes quantidade do sangue são isoladas para fornecer produtos do ácido nucleico aos clientes. Nós vimos lotes da procura nestas áreas.
Como Nans mencionou, nossa equipe é proeminente. Eu penso como a tecnologia está sendo executado adiante, nós sou dinâmico e ver onde nossas química e nossa automatização podem melhor ser usadas.
Nans Bodet, é um cientista da automatização do apoio do campo em Promega Corporaçõ baseado em França e em cobrir a EMEA pelos últimos cinco anos. Adquiriu um mestre da biologia, da fisiologia e da imunologia celulares na universidade de Marselha Luminy.
Antes de juntar-se Promega, trabalhou em Tecan França como um especialista da aplicação e juntou-se então a matrizes de Tecan em Maennedorf (CH) para ser gestor de conta global do apoio e da chave da linha da frente. Em Promega, Nans está centrando-se sobre a combinação de soluções de Promega com todo o tipo da automatização para facilitar desafios dos laboratórios.
Sobre bastões Mutamba
Os bastões Mutamba, um cientista da automatização do apoio do campo com Promega Corporaçõ por três anos, eram nascidos e aumentados em Zimbabwe com um fundo na microbiologia, na bioquímica e na biotecnologia da universidade do Rodes, África do Sul.
Transportou-se aos E.U. onde terminou mestres na nutrição celular e molecular de UNC Greensboro. Em Duke University, trabalhou como um analista da pesquisa antes de ser contratado por Tecan como o especialista do produto para sistemas baseados em celulas.
Um quando mais tarde, os bastões foram sobre trabalhar para uma empresa da nanotecnologia como um cientista da pesquisa durante o desenvolvimento de produtos, utilizando os nanoparticles de prata para várias aplicações antimicrobiais. Trabalhou mais tarde para o desenvolvimento de produtos farmacêutico (PPD) em Richmond, VA da CTOC como um cientista superior responsável para a revelação e a validação de vários ensaios usando a manipulação líquida automatizada.
Então relocated com sua família a Phoenix, o Arizona onde trabalhou para ciências da vida de Caris, uma empresa molecular dos diagnósticos que especializa-se no cancro e personalizou a medicina. Em seu papel como o cientista da pesquisa purposed com tornar-se e o laboratório de automatização desenvolveu testes (LDTs) para a detecção atempada e o diagnóstico do peito e do cancro da próstata.
Promega Corporation. (2019, April 09). Purificação alta do ácido nucleico da produção simplificada. News-Medical. Retrieved on October 19, 2019 from https://www.news-medical.net/news/20190409/High-Throughput-Nucleic-Acid-Purification-Simplified.aspx.
Promega Corporation. "Purificação alta do ácido nucleico da produção simplificada". News-Medical. 19 October 2019. <https://www.news-medical.net/news/20190409/High-Throughput-Nucleic-Acid-Purification-Simplified.aspx>.
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