BrowseInterestsBiography & MemoirBusiness & LeadershipFiction & LiteraturePolitics & EconomyHealth & WellnessSociety & CultureHappiness & Self-HelpMystery, Thriller & CrimeHistoryYoung AdultBrowse byBooksAudiobooksArticlesSheet MusicBrowse allUploadSign inJoinÍndicePARTE 1: INTRODUÇÃO À PCR EM TEMPO REAL
Princípio da PCR em Tempo Real................................................................................................ Sobre os Sistemas para Detecção de Seqüências..................................................................... - Sistema TaqMan .............................................................................................................. - Sistema SYBR Green I ...................................................................................................... Sobre Ensaios de Quantificação ................................................................................................. Termos Utilizados na Análise de Quantificação ........................................................................ Como Funcionam os Ensaios de Quantificação para PCR em Tempo Real ........................... Quantificação Relativa e Quatificação Absoluta ....................................................................... - Métodos de Cálculo para a Quantificação Relativa ....................................................... - Método da Curva Padrão para Quantificação Relativa ........................................ - Método CT Comparativo para Quantificação Relativa ......................................... - Método da Curva Padrão para Quantificação Absoluta ................................................ - Construção de Curva Padrão para Quantificação Absoluta ...............................
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GUIA PARA QUANTIFICAÇÃO
RELATIVA DA
EXPRESSÃO GÊNICA UTILIZANDO PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL
Seção I : PCR em Tempo Real e Quantificação Relativa da Expressão Gênica ..................... 1. Introdução .................................................................................................................... 2. O que é Quantificação Relativa? ............................................................................... 3. Termos e Acrônimos .............................................................. ................................... 4. Quantificação Relativa da Expressão Gênica Exige Quantificação de Dois Genes Diferentes (Alvo e Controle Endógeno) ............................................................. 5. Fatores que Afetam a Precisão dos Resultados da PCR em Tempo Real ............ 16 16 16 17 20 21
6. O que é Eficiência de Amplificação da PCR? ........................................................... Seção II: Preparação do RNA e Transcrição Reversa ............................................................... 1. Introdução .............................................................. .................................................... 2. Quantificação do RNA .............................................................. ................................. 3. Transcrição Reversa para Quantificação Relativa da Expressão Gênica ............. 4. Seleção de Reagentes para Transcrição Reversa e PCR em Tempo Real ............ 5. Determinação da Quantidade de RNA um Estudo de Quantificação Relativa ...... 6. Identificação de Inibição da PCR .............................................................................. 7. Fatores que Afetam a Precisão dos Resultados da PCR em Tempo Real ............ 8. Quanto de DNA Genômico Contaminante Pode ser Tolerado em um Ensaio de Expressão Gênica de Quantificação Relativa? ............................................................. Seção III: Seleção e Desenho do Ensaio para Quantificação Relativa .................................... Seção IV: Identificação e Seleção de Controles Endógenos para Quantificação Relativa ... Seção V: Análise e Desenho Experimental da Quantificação Relativa da Expressão Gênica ............................................................................................................................................ Método da Curva Padrão Relativa e Método CT Comparativo ( CT) ....................
24 26 26 26 28 31 31 32 32 34 36 41 43 43 44 44
Método da Curva Padrão Relativa ............................................................................... Método CT Comparativo (Método CT) ..................................................................
PARTE 3: RECONSTITUIÇÃO E DILUIÇÃO DE PRIMERS E SONDAS TaqMan®
Princípio da PCR em Tempo Real
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em Tempo Real é capaz de monitorar o progresso da PCR enquanto ela progride (ou seja, em tempo real). Os dados são, desta forma, coletados ao longo da PCR, ao invés de serem apenas no final da reação. Isso revoluciona completamente o modo de abordagem da quantificação de DNA e RNA pela PCR. A PCR em tempo real utiliza o momento do ciclo da reação no qual a amplificação de um alvo é detectada pela primeira vez, ao invés da quantidade de alvo acumulado após um número fixo de ciclos. Quanto mais alto o número de cópias iniciais do ácido nucléico alvo, mais rápido será observado o aumento significativo na fluorescência. A PCR em tempo real também pode ser utilizada para realizar um ensaio endpoint (também chamado "ensaio de leitura de placa"), que mede a quantidade de produto da PCR acumulado ao final dos ciclos da reação.
Sobre os Sistemas para Detecção de Seqüências
Visão Geral: A Applied Biosystems desenvolveu dois sistemas para detectar produtos de PCR: • • Sistema TaqMan fluorescente")
Sistema do corante SYBR Green I
Sistema TaqMan
O sistema TaqMan utiliza uma sonda fluorescente para possibilitar a detecção de um produto específico da PCR conforme esse se acumula durante os ciclos da reação. Tipos de Ensaios que Utilizam o Sistema TaqMan O sistema TaqMan pode ser utilizado para os seguintes tipos de ensaios: • • • • • RT-PCR one-step (de uma etapa) para quantificação de RNA RT-PCR two-step (de duas etapas) para quantificação de RNA Quantificação de DNA/cDNA Discriminação alélica Presença/Ausência utilizando um controle positivo interno (IPC )
Sistema SYBR Green I O sistema do corante SYBR Green I utiliza o corante SYBR Green I, que possui ligação altamente específica ao DNA dupla-fita, para detectar o produto da PCR conforme ele se acumula durante os ciclos da reação. A diferença mais importante entre o sistema SYBR Green I e o sistema TaqMan é que o SYBR Green I detectará todo DNA dupla-fita, inclusive produtos de reação não específicos. Uma reação bem otimizada é, portanto, essencial para resultados precisos.
Tipos de Ensaio que Utilizam o Sistema SYBR Green I O ensaio do corante SYBR Green I pode ser utilizado para os seguintes tipos de ensaios: • • • RT-PCR one-step (de uma etapa) para quantificação de RNA RT-PCR two-step (de duas etapas) para quantificação de RNA Quantificação de DNA/cDNA
Histórico Inicialmente, foram utilizados corantes intercalantes do DNA para medir os produtos da PCR em tempo real. A desvantagem desses corantes é que podem detectar não apenas o acúmulo de produtos específicos, como também o acúmulo de produtos não específicos da PCR. Desenvolvimento do Sistema TaqMan Os sistemas em tempo real para PCR foram aperfeiçoados pela introdução de sondas marcadas com fluorescência que utilizam atividade nuclease 5´ da Taq DNA polimerase. A disponibilidade destas sondas fluorescentes permitiu o desenvolvimento de um método em tempo real para detecção somente de produtos de amplificação específicos. Como o Funciona o Sistema TaqMan O sistema TaqMan utiliza uma sonda fluorescente para permitir a detecção de um produto específico da PCR conforme este se acumula durante os ciclos da PCR. Eis aqui como ele funciona: Etapas do Processo 1. Uma sonda (oligonucleotídeo) é construída contendo um corante reporter fluorescente na extremidade 5´ e um corante quencher (silenciador) na extremidade 3´. Enquanto a sonda está intacta, a proximidade do quencher reduz bastante a fluorescência emitida pelo corante reporter através da transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) através do espaço. 2. Se a seqüência alvo estiver presente, a sonda se anela logo após um dos primers e é clivada através da atividade da nuclease 5´ da Taq DNA polimerase enquanto o primer é estendido. 3. Esta clivagem da sonda: • Separa o corante reporter do corante quencher, aumentando o sinal do corante reporter. • Remove a sonda da fita alvo, permitindo que a extensão do primer continue até o final da fita molde. Assim, a inclusão da sonda não inibe o processo geral da PCR.
4. o que reduz a mão-de-obra do ensaio e os custos de materiais.
Conseqüentemente. os quais permitem a amplificação de duas seqüências distintas em um mesmo tubo de reação. Moléculas adicionais do corante reporter são clivadas de suas respectivas sondas em cada ciclo. Dois Tipos de Sondas TaqMan • •
A Applied Biosystems oferece dois tipos de sondas TaqMan: Sondas TaqMan (com corante TAMRA™ como o corante quencher) Sondas TaqMan MGB
Sondas TaqMan MGB Recomendadas para Ensaios de Discriminação Alélica A Applied Biosystems recomenda o uso das sondas TaqMan MGB para os ensaios de discriminação alélica. As sondas podem ser marcadas com corantes reporter distintos e distinguíveis.
Desvantagem do Sistema TaqMan A principal desvantagem do sistema TaqMan é a necessidade de síntese de diferentes sondas para seqüências distintas. Vantagens do sistema TaqMan As vantagens do sistema TaqMan são as seguintes: • • É necessário a hibridização específica entre a sonda e o alvo para gerar sinal fluorescente. As sondas TaqMan MGB contêm: • Um quencher não-fluorescente na extremidade 3´ – Os instrumentos SDS podem medir as contribuições do corante reporter mais precisamente. principalmente quando as sondas TaqMan convencionais excedem 30 nucleotídeos. permitindo o uso de sondas menores. pois o quencher não fluoresce. que é proporcional à quantidade de amplicon produzido. resultando em um aumento na intensidade de fluorescência.
. O pós-processamento da PCR é eliminado. Um minor groove binder na extremidade 3´ – O minor groove binder aumenta a temperatura de melting (Tm) das sondas. o que fornece uma discriminação alélica mais precisa. as sondas TaqMan MGB apresentam diferenças maiores nos valores Tm entre as sondas específicas e não específicas.
Como funciona o Sistema SYBR® Green I O sistema SYBR Green I utiliza corante SYBR Green I para detectar produtos da reação em cadeia de polimerase (PCR) através da ligação ao DNA dupla-fita formado durante a reação. Como o SYBR Green I se liga a todo DNA dupla-fita. mais amplicons são criados. ele imediatamente se liga a todo DNA dupla-fita presente na amostra.Sistema SYBR Green I
Histórico Pequenas moléculas que se ligam ao DNA dupla-fita podem ser divididas em duas classes: • • Intecalantes Minor-groove binders
Independentemente do método de ligação. Vantagens do SYBR Green I As vantagens do sistema do corante SYBR Green I são as seguintes: • Pode ser utilizado para monitorar a amplificação de qualquer seqüência de DNA dupla-fita. ou "amplicons". Conforme a PCR progride. Eis aqui como ele funciona: Etapas do Processo Quando o corante SYBR Green I é adicionado à amostra. Nenhuma inibição da PCR
A Applied Biosystems desenvolveu condições que permitem o uso do corante SYBR Green I na PCR sem inibição da reação. Durante a PCR. o que cria os produtos da PCR. 3. o resultado é um aumento na intensidade da fluorescência proporcional à quantidade de produto gerado pela PCR.
. e aumento da sensibilidade de detecção quando comparado ao brometo de etídio. a DNA Polimerase AmpliTaq Gold amplifica a seqüência alvo. O corante SYBR Green I se liga a cada nova cópia de DNA dupla-fita. • • Aumento da fluorescência quando ligado ao DNA dupla-fita. 1. o que reduz a configuração do ensaio e os custos de execução. 2. • Não é necessário sonda. há duas exigências para um corante de ligação ao DNA ser utilizado para detecção em tempo real da PCR.
um único fluoróforo é liberado da supressão pelo quencher para cada molécula amplificada sintetizada. ou seja. a amplificação de um produto mais longo irá gerar mais sinal do que um mais curto. nos quais há pequena alteração no sinal fluorescente Ct (ciclo threshold): O número do ciclo no qual a fluorescência passa o threshold NTC (no template control) – Uma amostra que não contém o alvo. cDNA. independentemente do seu comprimento. Isso aumenta a sensibilidade de detecção para produtos de amplificação. Com a utilização da sonda fluorescente. É utilizado para verificar a qualidade da amplificação. se as eficiências de amplificação são as mesmas.Desvantagem do SYBR Green I A principal desvantagem do sistema SYBR Green I é poder gerar sinais falso-positivos. Esse ensaio mede (quantifica) a quantidade de ácido nucléico alvo durante cada ciclo de amplificação da PCR. Referência passiva: Um corante que fornece uma referência interna para a qual o sinal do corante reporter pode ser normalizado durante a análise dos dados. Quantificação de RNA utilizando RT-PCR two step (de duas etapas)
Termos Utilizados na Análise de Quantificação
Amplicon: Um curto segmento de DNA gerado pelo processo da PCR. Assim. ou RNA. Ácido nucléico alvo (target template) – Seqüência de DNA ou RNA que você deseja amplificar.
Sobre Ensaios de Quantificação
O que é um Ensaio de Quantificação? Um ensaio de quantificação é um ensaio da PCR em tempo real. O alvo pode ser DNA. A normalização é necessária para corrigir as flutuações causadas por alterações na concentração ou
. Uma conseqüência da ligação de múltiplos corantes é que a quantidade de sinal é dependente da massa de DNA dupla-fita produzido na reação. Há três tipos de Ensaios de Quantificação discutidos nesse manual: • • • Quantificação de DNA/cDNA Quantificação de RNA utilizando reação em cadeia de polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) one step (de uma etapa). Considerações Adicionais Outro aspecto da utilização dos corantes de ligação ao DNA é que múltiplos corantes se ligam a uma única molécula amplificada. ele também pode se ligar a seqüências não específicas de DNA dupla-fita uma vez que a molécula de SYBR Green I se liga a qualquer DNA dupla-fita. Gráfico da amplificação (Amplification Plot): O gráfico do sinal fluorescente em comparação ao número do ciclo Baseline: Os ciclos iniciais da PCR.
OU • Uma reação que não contenha nenhum template Rn (delta Rn): A magnitude do sinal gerado por um determinado conjunto de condições da PCR. há uma pequena alteração no sinal de fluorescência.
. O que é Quantificação Absoluta? O ensaio de quantificação absoluta é utilizado para quantificar amostras desconhecidas interpolando suas quantidades a partir de uma curva padrão. Rn+: O valor Rn da reação contendo todos os componentes. você pode utilizar quantificação absoluta ou relativa. Um aumento na fluorescência acima do Baseline indica a detecção de alvo acumulado.
Quantificação Relativa e Quatificação Absoluta
Visão Geral Para calcular os resultados dos seus ensaios de quantificação. Essa define o Baseline para o gráfico de amplificação. O parâmetro CT (ciclo threshold) é definido como o ciclo no qual a fluorescência ultrapassa o threshold. Correndo padrões de concentrações variadas. O threshold deve ser ajustado na região associada com um crescimento exponencial do produto da PCR. você cria uma curva padrão da qual você pode extrapolar a quantidade de uma amostra desconhecida.volume. Um threshold de fluorescência fixa pode ser ajustado acima do Baseline. Esta é a amostra cuja quantidade você quer determinar. O valor Rn é determinado pela seguinte fórmula: (Rn+) – (Rn-) Padrão: Uma amostra de concentração conhecida utilizada para construir uma curva padrão.
Como Funcionam os Ensaios de Quantificação para PCR em Tempo Real
Nos ciclos iniciais da PCR. incluindo o template Rn–: O valor Rn de uma amostra não reagente. Um corante de referência passiva está incluído em todos os kits de reagentes da Applied Biosystems. Rn (reporter normalizado): A intensidade de emissão de fluorescência do corante reporter dividida pela intensidade de emissão de fluorescência do corante da referência passiva. Threshold: O desvio padrão médio de Rn para os ciclos iniciais da PCR. O valor Rn pode ser obtido a partir de : • Ciclos iniciais de uma PCR em tempo real (aqueles ciclos antes de um aumento detectável na fluorescência). Desconhecida: Uma amostra contendo uma quantidade de template desconhecida. multiplicado por um fator ajustável.
Exemplo A quantificação absoluta deve ser utilizada para correlacionar o número de cópias virais com um estado de uma doença. Isso também elimina a possibilidade de qualquer erro de diluição das amostras para montagem da curva padrão. A quantificação absoluta pode ser realizada com os dados de todos os instrumentos SDS. as concentrações limitantes de primer devem ser identificadas e não devem afetar os valores CT. O que é Quantificação Relativa? Um ensaio de quantificação relativa é utilizado para analisar alterações na expressão gênica em uma determinada amostra relativa à outra amostra de referência (tal como uma amostra controle não tratada). Para amplificar o alvo e o controle endógeno no mesmo tubo. Para utilizar o método CT comparativo. Os métodos de cálculo utilizados para quantificação relativa são: • • Método da Curva Padrão Método CT Comparativo
Determinação do Método a Ser Utilizado Todos os métodos podem oferecer resultados equivalentes. O nível de expressão gênica de um gene específico em uma amostra tratada pelo medicamento seria comparada em relação ao nível de expressão gênica desse mesmo gene em uma amostra não tratada. no entanto. A vantagem de utilizar o método CT comparativo é que não é necessário utilizar uma curva padrão. um experimento de validação deve ser realizado para mostrar se as eficiências das amplificações do alvo e do controle endógeno são aproximadamente iguais.
Métodos de Cálculo para a Quantificação Relativa
A quantificação relativa pode ser realizada com dados de todos os instrumentos SDS. Isso aumenta o rendimento. É de interesse para o pesquisador saber o número exato de cópias do RNA alvo em uma determinada amostra biológica para monitorar o progresso da doença. Ao determinar o método que você deseja utilizar. as quantidades absolutas dos padrões devem ser conhecidas inicialmente por algum método independente. observe o seguinte: • Realizar amplificações do alvo e do controle endógeno em tubos separados utilizando o método de análise de curva padrão exige uma menor quantidade de otimização e validação.
. Exemplo A quantificação relativa deve ser utilizada para medir a expressão gênica em resposta a um medicamento. pois não é mais necessário a utilização dos poços para as amostras da curva padrão.
Os controles endógenos e exógenos são exemplos de referências ativas. você pode normalizar a quantificação de um RNA mensageiro (mRNA) alvo para diferenças na quantidade de RNA total adicionado a cada reação. Instruções Importantes As instruções abaixo são importantes para o uso apropriado do método de curva padrão para quantificação relativa. A referência ativa apresenta seu próprio conjunto de primers e sondas. pois a quantidade é expressa relativa a uma amostra de referência.
. tal como o calibrador. o calibrador se torna a amostra 1× e todas as outras quantidades são expressas como uma diferença de n vezes em relação ao calibrador. Quantidade do alvo normalizada: O menor número de unidades que pode ser utilizado para comparar a quantidade relativa do alvo em diferentes amostras. Para todas as amostras experimentais. Uma referência exógena ativa é normalmente uma construção in vitro que pode ser utilizada como um controle positivo interno (IPC) para diferenciar os verdadeiros alvos negativos da inibição da PCR. Se uma referência ativa for utilizada ou não. a quantidade do alvo é determinada a partir da curva padrão e dividida pela quantidade alvo do calibrador. Assim. Referência ativa significa que o sinal é gerado como resultado da amplificação da PCR. Ao utilizar um controle endógeno como uma referência ativa. para normalizar flutuações no sinal fluorescente não relacionadas à PCR. Controle endógeno: RNA ou DNA presente isoladamente em cada amostra experimental. Controle exógeno: RNA ou DNA conhecido inserido em cada amostra numa concentração conhecida. Uma referência exógena também pode ser utilizada para normalizar diferenças na eficiência da extração da amostra ou da reação para síntese de DNA complementar (cDNA) pela transcriptase reversa. em um estudo do efeito de um medicamento na expressão gênica. Como um exemplo.Ao executar as duas reações no mesmo tubo. o rendimento é maior e os efeitos dos erros de pipetagem são reduzidos.
Método da Curva Padrão para Quantificação Relativa
Visão Geral É fácil preparar curvas padrões para quantificação relativa. Padrão: Uma amostra de concentração conhecida utilizada para construir uma curva padrão. Calibrador: Uma amostra utilizada como a base para resultados comparativos. Termos Utilizados Os seguintes termos são utilizados nesta discussão de quantificação absoluta e relativa. o controle não tratado seria um calibrador apropriado. é importante sempre utilizar uma referência passiva contendo o corante ROX. Referência: Um sinal ativo ou passivo utilizado para normalizar os resultados experimentais.
exceto pelo fato que este utiliza a fórmula aritmética 2 relativa. 0. e assim por diante. o gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Ao utilizar o mesmo RNA ou DNA estoque para preparar as curvas padrão para múltiplas placas.
-∆∆CT
para atingir o mesmo resultado para a quantificação
. isso significa que qualquer DNA ou RNA estoque contendo o alvo apropriado pode ser utilizado para preparar uma curva padrão. Então. as unidades podem ser os valores de diluição 1. curvas padrão são preparadas para o alvo e para o controle endógeno.
Método CT Comparativo para Quantificação Relativa
O método CT comparativo é semelhante ao método da curva padrão. Para cada amostra experimental. 0. a quantidade do alvo e do controle endógeno é determinada a partir de uma curva padrão apropriada. 0. Isso requer a suposição de que a eficiência da transcrição reversa do alvo seja a mesma em todas as amostras.
Controle Endógeno A amplificação de um controle endógeno pode ser realizada para padronizar a quantidade da amostra de RNA e DNA adicionada à reação. mas o valor exato desta eficiência não precisa ser conhecido. para construir uma curva padrão. a unidade da curva padrão desaparece. Cada valor alvo normalizado é dividido pelo valor do calibrador (também normalizado pelo seu endógeno).25.•
É importante que o DNA ou RNA estoque seja diluído com precisão. tudo que é necessário para os padrões é que sejam conhecidas suas diluições relativas. o RNA ribossômico (rRNA). ou outros RNAs. É possível utilizar uma curva padrão de DNA para quantificação relativa de RNA. Para a quantificação relativa. de uma preparação de RNA total de uma linhagem celular controle. a quantidade alvo é dividida pela quantidade do controle endógeno para obter um valor alvo normalizado. Novamente. os pesquisadores têm utilizado como um controle endógeno a ßactina. mas as unidades utilizadas para expressar esta diluição são irrelevantes. Para a quantificação normalizada para um controle endógeno. Assim.5. Padrões Visto que a quantidade de amostra é dividida pela quantidade do calibrador. Para a quantificação da expressão gênica.125. as quantidades relativas determinadas podem ser comparadas entre as placas. para criar os níveis de expressão relativa. Se utilizar uma diluição na ordem de duas vezes. uma das amostras experimentais é o calibrador ou a amostra 1×.
com/support/tutorials/pdf/quant_pcr. principalmente para o RNA. a eficiência da amplificação do alvo (seu gene de interesse) e a eficiência da amplificação da referência (seu controle endógeno) devem ser aproximadamente iguais. IMPORTANTE! As orientações a seguir para construção da Curva Padrão complementam o documento "Creating Standard Curves with Genomic DNA or Plasmid DNA Templates for Use in Quantitative PCR" disponível em http://www. O DNA plasmidial e o RNA transcrito in vitro são comumente utilizados para preparar padrões absolutos. Para mais informações sobre a utilização do método CT comparativo para a quantificação relativa. Esse RNA ou DNA concentrado deve então ser diluído 106-1012 vezes para estar em uma concentração semelhante ao alvo nas amostras biológicas. consulte o Manual do Usuário Nº 2: Quantificação Relativa de Expressão Gênica (PN 4303859). o DNA plasmidial preparado a partir de E. exceto que as quantidades absolutas dos padrões devem ser inicialmente conhecidas através de algum método independente.Fórmulas Aritméticas: Para o método CT comparativo seja validado. É necessária uma pipetagem precisa. Por exemplo. Instruções Importantes As instruções abaixo são importantes para o uso apropriado do método de curva padrão para quantificação absoluta. armazene-as à -80ºC e descongele-as somente uma hora antes do uso. consequentemente aumenta o número de cópias determinadas para o plasmídeo. pois os padrões devem ser diluídos em várias ordens de magnitude. A estabilidade dos padrões diluídos deve ser considerada. • É importante que o DNA ou RNA seja uma de espécie única e pura. A concentração é medida pelo A260 e convertida ao número de cópias utilizando o peso molecular do DNA ou RNA.
Construção de Curva Padrão para Quantificação Absoluta
As quantidades absolutas dos padrões devem ser conhecidas em primeiro lugar através de algum método independente.
Geralmente não é possível usar o DNA como um padrão para quantificação absoluta de RNA. O DNA plasmidial ou RNA transcrito in vitro devem ser concentrados para medir um valor A260 preciso.appliedbiosystems. coli freqüentemente está contaminado com RNA.pdf
. Divida os padrões diluídos em pequenas alíquotas. pois não há um controle quanto à eficiência da etapa de transcrição reversa.
Método da Curva Padrão para Quantificação Absoluta
Visão Geral O método de curva padrão para quantificação absoluta é semelhante ao método de curva padrão para quantificação relativa. o que aumenta a medido de A260 e.
Confirmar a presença do inserto (segmento alvo) nas colônias selecionadas por meio de PCR e/ou seqüenciamento. SP6 ou T3 e replicação em bactérias competentes. Amplificar o segmento alvo do teste por meio de transcrição reversa e PCR convencional (protocolo "one" ou "two-step"). 7. Certifique-se de que o produto de PCR que foi clonado não possui sítio de restrição para a enzima selecionada. Concentrar o transcrito utilizando acetato de amônia (incluso no kit). 4. 3. 6. 2. Curva Padrão de RNA: 1.02 x 10^23 moléculas. 6. 1 mol = 6. Selecionar cerca de 5 a 10 colônias que apresentem o plasmídeo recombinante e isolar o DNA por meio de miniprep. Utilizar os seguintes parâmetros para converter a concentração obtida em ng/uL para n° moléculas/uL: PM médio de 1 b de ssRNA = 320 g/mol. Ambion P/N AM7119).
. T7 e T3. por meio de PCR convencional. no manual que acompanha o kit de clonagem). respectivamente). 8. AM1333 e AM1338 para as RNAs polymerases SP6. por seqüenciamento. Linearizar o clone contendo o inserto de interesse por meio de digestão com enzima de restrição com sítio único na região "polylinker" do plasmídeo correspondente à extremidade 3' do transcrito esperado (esta informação consta do mapa do plasmídeo. Identificar. 1 mol = 6. utilizando preferencialmente primers externos. Certifique-se de que o produto de PCR que foi clonado não possui sítio de restrição para a enzima selecionada.02 x 1023 moléculas. Linearizar o clone contendo o inserto de interesse por meio de digestão com enzima de restrição com sítio único na região "polylinker" do plasmídeo (esta informação consta do mapa do plasmídeo. Clonar o produto da PCR acima por meio de ligação a um plasmídeo contendo promotor T7. 9. utilizando preferencialmente primers externos. Tratar o produto da transcrição com Dnase antes de prosseguir para a próxima etapa. 10. Selecionar cerca de 5 a 10 colônias que apresentem o plasmídeo recombinante e isolar o DNA por meio de miniprep. Quantificar de forma precisa o trasncrito acima.Curva Padrão de DNA: 1. Realizar as diluições seriadas utilizando algum tipo de carreador como diluente (recomendamos Yeast tRNA 100 ng/uL. 5. Ambion P/N AM7119). Utilizar os seguintes parâmetros para converter a concentração obtida em ng/uL para n° moléculas/uL: PM médio de 1 pb de DNA =649 g/mol. Purificar o transcrito (recomendamos a utilização do MEGAclear™ Kit da Ambion P/N AM1908). no manual que acompanha o kit de clonagem). 4. Amplificar o segmento de DNA alvo do teste. Purificar o produto da reação acima utilizando acetato de sódio e etanol e verificar a presença de uma única banda do tamanho esperado (plasmídeo + inserto) por eletroforese em gel de agarose. as colônias que apresentam o inserto (segmento alvo) na orientação correta para transcrição por seqüenciamento. Transcrever com a RNA polimerase apropriada (recomendamos a utilização do "MEGAscript® High Yield Transcription Kit" da Ambion P/N AM1330. Realizar as diluições seriadas utilizando algum tipo de carreador como diluente (recomendamos Yeast tRNA 100 ng/uL. 3. 2. 8. 7. 9. 5. Clonar o produto da PCR acima por meio de ligação a vetor do tipo plasmídeo e replicação em bactérias competentes. Quantificar de forma precisa o DNA acima.
Guia para Quantificação Relativa da Expressão Gênica Utilizanda PCR Quantitativa em Tempo Real
Por exemplo. Ao longo deste tutorial há muitos hyperlinks para sites externos. documentação e links para páginas dentro deste documento. Introdução A PCR Quantitativa em Tempo Real oferece aos pesquisadores uma ferramenta poderosa para a quantificação de ácidos nucléicos alvos. não tratada no dia 0) e um gene de
. 2: Quantificação Relativa da Expressão Gênica). Todas opções de instrumentos de PCR em tempo real podem ser encontradas no site da Applied Biosystems (http://www. estratégias experimentais e métodos de análise de dados. O que é Quantificação Relativa? Os métodos para Quantificação Relativa da Expressão Gênica permitem quantificar diferenças no nível de expressão de um alvo específico (gene) entre as diferentes amostras.
A Applied Biosystems oferece uma variedade de sistemas. Após acessar um destes hyperlinks. você pode escolher uma amostra de calibrador (ou seja. Para esse estudo hipotético. Este tutorial se estende em muitos dos tópicos que são introduzidos no User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression (Boletim do Usuário nº. você verificar a alteração na expressão de um gene em particular em um determinado período de tempo nas amostras tratadas em comparação a amostras não tratadas. Ele o ajudará a entender os fundamentos da quantificação relativa e fornecerá orientações para selecionar ensaios. reagentes e consumíveis fornecidos pela Applied Biosystems. Traditional PCR (PCR em Tempo Real em comparação à PCR Tradicional) Essentials of Real Time PCR (Informações Essenciais sobre a PCR em Tempo Real) Este tutorial o guiará na realização da quantificação relativa da expressão gênica usando tecnologias de PCR em tempo real desenvolvidas pela Applied Biosystems. A produção de dados é expressa como uma alteração ou uma diferença no número de vezes nos níveis de expressão. Para entender o valor que a PCR em tempo real proporciona sobre os métodos tradicionais de PCR e para obter informações sobre químicas e estratégias você pode rever: Real Time PCR vs.Introdução: PCR em Tempo Real e Quantificação Relativa da Expressão Gênica
1. nos quais a PCR Quantitativa em Tempo Real pode ser realizada.com)
2. As informações apresentadas são relevantes para instrumentação. clicar no botão back (voltar) no seu navegador para retornar ao local original no documento.appliedbiosystems.
O sinal fluorescente de fundo (Background) emitido durante os primeiros ciclos da PCR antes do instrumento de PCR em tempo real detectar a amplificação do produto da PCR. Para todas as amostras. tanto os níveis dos genes alvos e controle endógeno seriam avaliados pela PCR em tempo real. O valor designado para a eficiência de uma reação de PCR é uma medida de desempenho global do ensaio de PCR em tempo real. Informações adicionais sobre definições específicas estão disponíveis no Apêndice ou clicando nos links apropriados. você precisa realizar a quantificação absoluta. Um produto de PCR gerado a partir de um template de DNA ou cDNA. Referência ativa significa que o sinal é gerado como resultado da amplificação da PCR. Os controles endógenos são exemplos de uma referência ativa. Se um amplicon dobrar em quantidade durante a fase geométrica de amplificação da PCR. Os valores de CT são logarítmicos e são usados diretamente (método CT comparativo) ou indiretamente (interpolação para curvas padrões para criar valores lineares) para as análises quantitativas. O CT é o número do ciclo no qual a fluorescência gerada dentro de uma reação cruza a linha threshold. A referência ativa tem seu próprio conjunto de primers e sonda. Custom TaqMan® Gene Expression Assays (Ensaios de Expressão Gênica Custom TaqMan®) são produtos desenhados. a amostra A apresentou um nível de expressão do gene alvo 10 vezes maior do que no dia 0". Termos e Acrônimos Os seguintes termos e acrônimos são usados ao longo deste documento. que está além do escopo deste documento.
3. geralmente medida como um valor percentual. Os resultados (níveis do alvo normalizados pelos níveis do controle endógeno) seriam expressos em um formato como "No dia 30. Se desejar obter quantidades absolutas dos genes alvos. A taxa na qual um amplicon da PCR é gerado.controle endógeno para normalizar seus resultados. sintetizados e entregues como cojuntos de primers e sonda MGB TaqMan® pré-misturados baseados
Amplicon Eficiência de amplificação
Calibrador CT
Produtos de Expressão Gênica Custom TaqMan®1
. Uma amostra utilizada como base para resultados de expressão comparativa Ciclo threshold. Termos/ Acrônimos Referência Ativa Definição Um sinal ativo usado para normalizar os resultados experimentais. então se diz que a PCR foi 100% eficiente.
nas informações de seqüência enviadas pelo cliente. O corante de referência não participa da PCR. Um grupo de dez camundongos representaria dez réplicas experimentais. Os controles endógenos são exemplos de uma referência ativa. as réplicas em outros poços podem. fornecer os dados. Esta normalização corrige as flutuações de fluorescência que são causadas por alterações na concentração ou no volume da reação. A falha em usar um corante de referência passiva pode comprometer a precisa quantificação do alvo.
Referência Passiva
Um corante que forneça uma referência de fluorescência interna para a qual um sinal do corante reporter pode ser normalizado durante a análise dos dados. Seqüência de um gene contida em uma amostra que é usada para normalizar as quantidades do alvo. porém não idênticas. As réplicas experimentais fornecem informações sobre a precisão geral do experimento. você trataria vários camundongos de forma idêntica com o medicamento para determinar a variação de resposta na população de camundongos. Uma amplificação que usa os mesmos reagentes da PCR como em outra amplificação e que usa templates de amostras semelhantes. um controle endógeno é quantificado como um meio de correção dos resultados que podem ser distorcidos pelas diferenças da quantidade inicial de ácido nucléico. Por exemplo. Uma amplificação realizada em múltiplos poços usando a mesma preparação de template e os mesmos reagentes da PCR. se você deseja examinar o efeito do tratamento com um medicamento no nível de expressão do mRNA de camundongo. sintetizados e entregues como conjuntos de primers e sonda MGB TaqMan® pré-misturados baseados nas informações de seqüência enviadas pelo cliente. A Applied Biosystems incorpora o corante ROXTM como referência passiva interna em todos os ensaios de PCR em tempo
. potencialmente. Monitoramento: As réplicas podem ser usadas para monitorar a precisão da amplificação da PCR e das etapas de detecção. Além da seqüência alvo. Produtos de Genotipagem Custom TaqMan®2 Custom TaqMan® Genotyping Assays (Ensaios de Genotipagem Custom TaqMan®) são produtos desenhados. A faixa (máxima para mínima) de concentrações de amostra ou quantidade inicial que um determinado ensaio é capaz de detectar. As réplicas idênticas fornecem:
Faixa de dinâmica
Controle endógeno
Réplica idêntica
Preservação de dados: Se a amplificação falhar em um poço.
PDAR TaqMan® TaqMan® Pre-Developed Assay Reagents (Reagentes de Ensaio Pré-Desenvolvidos TaqMan®) (PDARs TaqMan®) são conjuntos de primers e sondas desenhados para amplificar seqüências do alvo específico e do controle endógeno em amostras de cDNA usando o ensaio da nuclease 5'.real. homogeneidade do template e desempenho do instrumento. Etapa de Amplificação e Detecção: O grau para o qual as réplicas idênticas fornecem valores semalhantes (grau de concordância). uma melhor precisão (idêntica e experimental) permite que menores diferenças no número de cópias de um ácido nucléico sejam distinguidas com maior confiança estatística. Orientações para desenvolvimento de ensaios rápidos Uma série de orientações sobre o desenho de experimentos desenvolvidas pela Applied Biosystems especificam:
O uso dos Ensaios Genômicos da Applied Biosystems ou desenho automatizado de primer e sonda usando o Software Primer Express ® O uso de TaqMan® Universal PCR Master Mix ou SYBR® Green I PCR Master Mix (fornece concentrações padronizadas dos componentes e simplifica a configuração do ensaio) Os parâmetros de ciclagem universais (permite que vários ensaios sejam executados na mesma placa) Concentrações padrões do primer e da sonda (para eliminar a otimização do ensaio).
Gene de Referência
Um sinal fluorescente ativo usado para normalizar os resultados experimentais. Ensaios de Expressão Gênica TaqMan® são ensaios de expressão gênica pré-formulados e biologicamente informativos para rápida detecção e quantificação de
Padrões Ensaios de Expressão Gênica TaqMan®3
. Uma amostra de concentração conhecida usada para construir uma curva padrão. réplicas
Testes de Estatíticos de Precissão
Observação: Para quantificação relativa. Experimental: O grau para o qual as experimentais fornecem valores semelhantes. Uma referência ativa gera o sinal como resultado da amplificação da PCR usando seu próprio conjunto de primers/sonda. Os controles endógenos e exógenos são exemplos de referência ativa. Este tipo de precisão pode ser usado para monitorar a precisão da pipetagem do reagente e do template.
Cada produto é entregue como um pré-mix de primers e sondas MGB TaqMan® em uma concentração de 20X. Ao usar um
. Sondas fluorescentes que são desenhadas e sintetizadas como sondas MGB TaqMan® que contêm um motivo minor-groove-binding que aumenta a diferença Tm entre as sondas que se anelam perfeitamente das que não se anelam perfeitamente. As sondas MGB TaqMan® são ideais para o uso tanto em ensaios de expressão gênica como em ensaios de análise de SNP. Ele deve ser ajustado acima do Baseline.transcritos de mRNA de ratos.
Sondas MGB TaqMan®
Alvo Amostra
Também referido como TaqMan Assays-By-Design para Produtos de Expressão Gênica.. Também referido como TaqMan Assays-on-Demand Também referido como TaqMan Assays-By-Design
para Produtos de Expressão Gênica. Uma amostra comparada com um calibrador como um meio de testar uma alteração no parâmetro (por ex.
para Produtos de Genotipagem SNP. biologicamente informativos para detecção de SNPs humanos. Um nível d sinal reporter normalizado que é usado para determinação do CT nos ensaios de Real Time. transformação em tumor. Ensaios de Genotipagem TaqMan®4 Ensaios de Genotipagem TaqMan® são conjuntos de primers e sonda validados. Quantificação Relativa da Expressão Gênica Exige Quantificação de Dois Genes Diferentes (Alvo e Controle Endógeno) Para obter uma quantificação relativa do mRNA alvo com precisão. recomenda-se que também seja avaliado o nível de expressão de um controle endógeno. tratamento com fator de crescimento e outros. as sondas MGB TaqMan® contém um quencher não fluorescente que fornece melhor resolução espectral quando são utilizados múltiplos fluoróforos em uma reação. Cada produto é entregue como um pré-mix de primers e sonda MGB TaqMan® em uma concentração de 20X.
4. Também referido como TaqMan Assays-By-Design para Ensaios de SNP. O número do ciclo no qual o sinal fluorescente associado a um acúmulo de amplicon cruza o threshold é referido como CT. Uma seqüência de RNA ou DNA ou gene de interesse. camundongos e seres humanos. mas deve ser suficientemente baixo para se encontrar dentro da região de crescimento exponencial de uma curva de amplificação. o nível de expressão de um gene) após uma intervenção como um tratamento com medicamento. Além disso.
Portanto. a precisão dos dados é questionável. se você estiver procurando por pequenas variações na expressão de um alvo. ajudarão a atingir resultados mais precisos da PCR em tempo real . você pode aferir a precisão dos resultados. por exemplo. conseqüentemente. Por exemplo. você esperaria que a amostra do calibrador apresentasse inicialmente duas vezes mais cDNA do que a amostra em teste. para quantificar precisamente as diferenças no nível de expressão do alvo entre o calibrador e as amostras em teste. O uso destas réplicas pode ajudar na identificação de problemas de precisão.controle endógeno como uma referência ativa. Fatores que Afetam a Precisão dos Resultados da PCR em Tempo Real Uma variedade de fatores deve ser considerada na configuração da PCR em tempo real. descritas a seguir. se você determinar que o calibrador apresenta uma quantidade duas vezes maior de controle endógeno do que uma amostra em teste. Portanto. É importante considerar que devido à distribuição estatística. a. Algumas práticas. amostras que produzem valores de CT nesta faixa inevitavelmente originarão uma menor precisão e. Uma preparação de RNA de baixa qualidade pode ser caracterizada por um ou mais dos seguintes fatores:
. sempre há um alto nível de variação de CT quando as quantidades do alvo se aproximam de uma única cópia (valores de CT de 34 – 40). Durante a configuração inicial é importante incluir réplicas idênticas para cada amostra. Se as as réplicas idênticas das amostras apresentarem um desvio padrão de CT >0. Após realizar uma PCR em tempo real. Alguns experimentos somente podem tolerar apenas pequena variação entre as réplicas idênticas. menor capacidade em detectar pequenas alterações. você pode normalizar a quantificação dos alvos quanto às diferenças na quantidade do ácido nucléico total adicionada inicialmente em cada reação.3 e/ou uma curva padrão apresentar um coeficiente de correlação (valor R2) <0. Alguns fatores que podem causar diferenças na quantidade de amostra de RNA total:
Quantificação imprecisa do RNA após a extração Integridade do RNA Pipetagem imprecisa
5. Usar RNA de alta qualidade Amostras de RNA de baixa qualidade não originam bons resultados da PCR em tempo real. você teria que normalizar o alvo da amostra em teste em duas vezes.99.
Usar o mesmo pool de padrões e/ou calibrador durante todo o estudo Para cada estudo. aliquotar estes cDNAs em tubos para serem utilizados uma única vez. d. c. o que resulta em uma melhor precisão.Tabela 1: Efeitos de uma amostra de RNA de baixa qualidade nos resultados da PCR Características de uma amostra de RNA de baixa qualidade Impacto potencial nos resultados da PCR
Proteínas co-extraídas Inibição da PCR devido à presença de proteínas incluindo RNases e/ou à degradação do template de RNA devido à presença de RNases Substâncias residuais do Inibição da PCR processo de extração dos ácidos nucléicos (ex. O uso destes mix reduz bastante as chances de erros de pipetagem durante a montagem da reação. sonda e template de ácido nucléico. Fenol) Template de RNA degradado DNA genômico co-extraído Perda da detecção de transcritos raros Pode servir como um template de PCR e pode confundir os resultados de detecção do RNA
b. em seguida. Esta normalização pode compensar as pequenas variações do sinal. (ii) Mix de reagentes da PCR: Misturar todos os componentes de uma reação em um mix de reagentes (reagentes da PCR. Usar reagentes que contenham corante de referência interna ROX
O software da Applied Biosystems normaliza os sinais do corante reporter para o corante de referência passiva ROX . Massa da amostras que produzem resultados dentro da faixa dinâmica do ensaio Consultar "Determinação das quantidades de RNA a serem usadas em um estudo de quantificação relativa". Todos os reagentes de PCR em tempo TM real da Applied Biosystems contêm corante ROX . água e outros) e em
. A preparação e utilização do mesmo pool de cDNAs para a curva padrão e para o calibrador até a conclusão do estudo pode fornecer resultados da PCR em tempo real mais consistentes. e. (i) Master-mix da PCR em tempo real: Os Master-mix de PCR em tempo real da Applied Biosystems contêm todos os componentes da reação. primers. exceto primers. Usar master-mix de PCR e mix de reagentes de PCR O uso de master-mix de PCR e de mix de reagentes da PCR ajudará a reduzir a potencial variabilidade introduzida a partir da pipetagem de vários reagentes durante a montagem da reação. sondas. recomenda-se a preparação de grandes pools de cDNAs para a curva padrão e para o calibrador e.
f. 12 µL ao invés de impreciso. Tabela 2: Conseqüências de uma pipetagem imprecisa Problema de pipetagem Amostra: Pipetagem réplicas idênticas Padrões: padrões Pipetagem incorreta incorreta Conseqüência das Altos desvios-padrões de CT dos Altos desvios-padrões de CT (réplicas idênticas). A tabela a seguir lista algumas das conseqüências de uma pipetagem imprecisa. É importante descongelar e homgeneizar completamente todos os reagentes durante a montagem da reação. páginas 3 e 4. observada maior eficiência 10 µL) da PCR do ensaio Padrões: Constante déficit de pipetagem da amostra padrão na diluição seriada (ex. pipetagem da amostra padrão na embora declínio da curva padrão será diluição seriada (ex. o slope da curva padrão será impreciso. indicará menor eficiência da PCR Padrões: Constante déficit de Valor R2 potencialmente bom 0. o slope da curva padrão seriada (ex.99. a reação pode apresentar um efeito na precisão. através de uma centrifugação com baixa velocidade.99. antes de colocar a reação no equipamento.99. <5 L) pode contribuir com a imprecisão e. 8 L ao invés de 10 µL) valor R2 potencialmente bom 0. a menos que as pipetas apresentem a capacidade de pipetar pequenos volumes e sejam regularmente calibradas.
. Também se recomenda que as placas seladas sejam realizado um rápido spin. valor R2 <0. indicará maior eficiência da PCR Padrões: Constante excesso de Valor R2 potencialmente bom 0. Homogeinizar completamente os reagentes da PCR Se os vários componentes de uma reação de PCR em tempo real não forem completamente homogeneizados. 80 µL ao invés de 90 µL) será impreciso.seguida colocar nos poços da placa da reação. consultar o tutorial Reconstituting and Diluting Primers and TaqMan® Probes (Reconstittuição e Diluição de Primer e Sondas TaqMan®). pipetagem do solvente na diluição entretanto. o slope da curva padrão seriada (ex. 100 L ao invés de 90 L) será impreciso. Para um exemplo de uma mix de reagentes de PCR em tempo real.99. pipetagem do solvente na diluição entretanto. indicará menor eficiência da PCR
g. entretando.99
Padrões: Constante excesso de Valor R2 potencialmente bom 0. Realizar pipetagem precisa da amostra e do reagente A pipetagem precisa com pipetas calibradas regularmente é crucial para obter dados exatos e precisos. A pipetagem de pequenos volume (ou seja. a pipetagem de volumes menores que este não é recomendada.
geralmente expressa como porcentagem. consultar a seção intitulada "O que é Eficiência de Amplificação da PCR?" Os TaqMan® Gene Expression Assays da Applied Biosystems apresentam eficiências de amplificação de 100%. Para orientações sobre os ajustes manuais do Baseline e do threshold. Se o seu software não realizar cálculos automáticos de CT e baseline ou se você escolheu não usar esta configuração. Se um amplicon de PCR dobrar em quantidade durante a fase geomética da amplificação da PCR. quando usar cDNA ou DNA como substrato. então a PCR apresentou 100% de eficiência. A eficiência de amplificação da PCR é a taxa na qual um amplicon de PCR é gerado. devido à natureza não específica da detecção do SYBR® Green I. você precisa ajustar os thresholds e o Baseline manualmente. Eficiências deficientes da PCR podem resultar em quantificação deficiente. utilizando o Software Primer Express®. é crucial ajustar os baseline e threshold apropriados. qualidade da amostra e análise. Para as informações sobre o cálculo da eficiência da PCR. Altas eficiências de amplificação da PCR (próximo de 100%) podem ser atingidas seguindo algumas orientações: Utilizar TaqMan Gene Expression Assays da Applied Biosystems ou o desenho automatizado de primers e sonda. O que é Eficiência de Amplificação da PCR? Observação: A estimativa precisa da eficiência da PCR depende de uma série de fatores tais como os reagentes. i. Utilizar parâmetros de ciclagem universais da PCR (permite que vários ensaios sejam executados na mesma placa). Alguns software dos sistemas de PCR em tempo real da Applied Biosystems podem realizar cálculos automáticos de CT e baseline. Utilizar concentrações padrões de primers e sonda: 900nM de primer forward. O slope de uma curva padrão é comumente usado para estimar a eficiência de amplificação de uma reação de PCR em tempo real. Recomenda-se um estudo de otimização do ® primer ao usar reagentes do SYBR Green I. Usar de ensaios com alta eficiência da PCR A eficiência da PCR pode ser usada para determinar o desempenho de um ensaio de PCR em tempo real. Utilizar o Universal PCR Master Mix TaqMan® da Applied Biosystems ou SYBR® Green I PCR Master Mix (fornece concentração padronizada dos componentes da reação. Ajustar o baseline e o threshold apropriados Para obter valores precisos de CT .
6. Um slope da curva
.h. consultar o Manual do Usuário. montagem do experimento. 900 nM de primer reverse e 250 nM de sonda. simplificando sua montagem). Uma curva padrão de PCR em tempo real é graficamente representada como um gráfico de regressão linear semi-log do valor CT em comparação ao log do quantidade inicial do ácido nucléico.
ex.5) podem indicar má qualidade da amostra ou problemas de pipetagem.32 indica uma reação de PCR com 100% de eficiência.
Figura 1: Curva-Padrão da PCR em Tempo Real representando 100 % de Eficiência da PCR Um cálculo de estimativa de eficiência (E) de um ensaio de PCR em tempo real é: E = (10
–1/slope
–1) × 100
Alta eficiência de amplificação da PCR (próximas de 100%) pode ser rotineiramente atingidas se você seguir as orientações acima descritas. Para o método CT comparativo de quantificação relativa (discutida adiante neste tutorial) ser validado. a eficiência da amplificação do alvo e a eficiência da amplificação da referência ativa (controle endógeno) devem ser aproximadamente iguais. Baixa eficiências da PCR pode resultar em baixa precisão da réplica da amostra (réplicas idênticas & réplicas experimentais) e.3219).32 ciclos durante a fase exponencial de amplificação (log2 10 = 3. como conseqüência.padrão de –3. ex. -3. Os slopes mais positivos que –3.32 (p. pode resultar em uma quantificação deficiente. -2.9) indicam reações com menos de 100% de eficiência. A eficiência da PCR pode ser usada para determinar o desempenho de um ensaio de PCR em tempo real. Os slopes mais negativos que –3.32 (p.
. Observação: Uma reação 100% eficiente produzirá um aumento de 10 vezes no amplicon da PCR a cada 3.
Quantificação do RNA O RNA purificado em solução pode ser quantificado usando sua absorbância em 260nm (A260). A Applied Biosystems desenvolveu um sistema para a extração e purificação de RNA/DNA (também isolar DNA) que produz RNA (ou DNA) de extrema alta qualidade e tem com quantidades mínimas de proteínas contaminantes. Após o RNA de alta qualidade ser preparado. O manuseio. você não precisa adicionar Inibidor de RNase às reações de transcrição reversa. O sistema também co-purifica menos de 0. O RNA extraído que apresenta valor de A260/280 2.Seção II Preparação do RNA e Transcrição Reversa
1. Reagents and Consumables". Geralmente. consultar um guia padrão de laboratório de biologia molecular que discuta o manuseio adequado do RNA. o ABI PRISM™ 6100 Nucleic Acid PrepStation. Este sistema. Para informações sobre a seleção da química mais apropriada para seu tipo de amostra. Se você suspeitar que o RNA contém proteínas extraídas (ou seja. fornecem ao pesquisador o RNA da mais alta qualidade para análise de expressão gênica (com valores A260/280 2.0 é considerado relativamente livre de proteínas. que são proteínas altamente estáveis e persistentes. É susceptível à degradação por RNases.0 U/ L. Importante: As químicas e os consumíveis do ABI PRISMTM 6100 Nucleic Acid PrepStation não podem ser usados independentemente do instrumento. O isolamento de RNA de alta qualidade depende da seleção de um sistema/método de extração e purificação que forneça o produto de mais alta qualidade.5% do DNA genômico ao usar as químicas PrepStation de RNA e menos de 0. Se você estiver usando o ABI PRISM™ 6100 Nucleic Acid PrepStation e reagentes associados de purificação de ácido nucléico. recomenda-se que Inibidor de RNase seja adicionado à reação de RT na concentração final de 1. RNA é uma molécula muito instável. Alguns métodos de purificação de RNA podem co-extrair altos níveis de proteínas – incluindo RNases. consultar o guia "ABI PRISMTM 6100 Nucleic Acid PrepStation: Selecting Appropriate Protocols. uma pequena quantidade de RNA é diluída para a leitura em um
2. o procedimento de transcrição reversa (RT) gera o cDNA que será utilizado na PCR em tempo real. Introdução A quantificação bem-sucedida da expressão gênica exige que o RNA utilizado seja de alta qualidade. e as quimicas associadas.0).0). Proteínas co-extraídas e/ou RNA degradados podem resultar em resultados ruins de PCR em tempo real. processamento e armazenamento do RNA estão além do escopo deste documento.002% do DNA genômico se for realizado o tratamento adicional com DNase em coluna com o Absolute RNA Wash Solution (Solução de Lavagem de RNA Absoluta). Para informações. o valor A260/280 < 2.
Consultar o manual do usuário do espectrofotômetro para orientações sobre a faixa linear de quantificação. Se o valor de A não estiver dentro da faixa linear do espectrofotômetro. O valor de A260/280 é calculado simplesmente pela divisão do valor de A260 por A280. Tabela 1: Quantificação de RNA pela absorbância de UV Amostra Amostra A de RNA Volume da solução estoque de RNA 150 L Diluição 1:10 A260 0. a quantificação 260 pode não ser precisa.
Exemplo: 10 L da amostra A de RNA foi diluída em 90 L de solvente. A concentração de RNA é calculada usando a equação: Concentração de RNA ( g/mL) = A diluição
× 40 g/mL × fator de
Os valores de A260/280 podem ser usados para caracterizar a presença de proteínas em
uma preparação de RNA.58 A280 0.29 A260/280 2. a solução de eluição deve ser usada para a diluição do RNA e para calibração do branco do espectrofotômetro.8 g
A concentração de RNA da amostra A de RNA: = 0. usada para calcular o volume de RNA a ser adicionado a uma reação de transcrição reversa. é aproximadamente equivalente a 40 g/mL de RNA. Se o valor de A260/280 2. O volume total desta diluição foi pipetado em uma cubeta de 100 L e o espectrofotômetro foi programado para ler a amostra diluída em A260 e A280. a amostra de RNA é considerada como
relativamente livre de proteína. e produtos de consumo associados.0.58 (OD260) × 40 g/mL × 10 (fator de diluição) = 232 g/mL A Quantidade da amostra A de RNA:
. IMPORTAMTE! A absorção de 1 O.D. Consultar o manual do usuário do espectrofotômetro para orientações sobre o uso apropriado do instrumento. A concentração de RNA é. então.espectrofotômetro.0 Concentração Quantidade 232 g/mL 34. Observação: Se usar o ABI PRISMTM 6100 Nucleic Acid PrepStation.
Transcrição Reversa para Quantificação Relativa da Expressão Gênica Transcrição reversa é o processo pelo qual o RNA é usado como um molde para sintetizar cDNA. Também deve ser selecionado o tipo de primer para a transcrição reversa.0 . Observação: Os kits de reagentes de transcrição reversa da Applied Biosystems recomendam uma faixa e/ou uma quantidade máxima de RNA para a reação. assim como uma comparação dos diferentes primers que podem ser utilizados:
. As tabelas 2 e 3 descrevem características e benefícios dos métodos de one-step e twostep etapas. Consultar o protocolo apropriado para recomendações sobre a massa de RNA que deve ser utilizada.= 232 g/mL × 1 mL/1000 L × 150 L (volume do estoque) = 34.8 g O valor de A da amostra A de RNA:
A260/280 =
3.58 = 2. Entre as primeiras opções a considerar na seleção de um método para realizar a transcrição reversa está a opção de usar um método de RT de uma etapa (onestep) ou RT de duas etapas (two-step).
RT-PCR two-step
. random primers ou oligo d(T)16 para síntese de cDNA. todos os mRNAs. assim como a subunidade 18S do rRNA (ou seja. pois a RT e a PCR ocorrem no mesmo tubo AmpErase® UNG pode ser usada (o kit TaqMan® EZ RTPCR é exceção) Pode obter um melhor limite de detecção com raros transcritos Requer primer de seqüência específica para síntese de cDNA.Tabela 2: Comparação entre RT-PCR one-step e two-step Método Características e Benefícios
RT-PCR one-step
Exige um único mix de reação. alvos + controles endógenos) podem ser transcritos reversamente simultaneamente Pode usar primer de seqüência específica. Exige dois mix de reação (RT e PCR) O cDNA pode ser armazenado para uso posterior AmpErase® UNG pode ser usada se dUTP não for usado na etapa RT Quando utiliza random primers (primers randômicos).
hexâmeros)
Pode realizar transcrição reversa de todos os mRNAs simultaneamente. assim como da subunidade 18S do rRNA (ou seja.. alvos + controles endógenos) Tentar primeiro quando trabalhar com longos transcritos ou transcritos contendo hairpin loops.Tabela 3: Comparação dos primers para síntese de cDNA. Primers para síntese de cDNA Considerações
Primer de seqüência específica
Usado para realizar transcrição reversa somente da de seqüências de RNA complementar Único tipo de primer recomendado para RT-PCR one-step Pode ser usado em RT-PCR two-step Usado para realizar a transcrição reversa somente de mRNAs eucarióticos e retroviros com cauda de poli-A Não pode realizar transcrição subunidade 18S do rRNA reversa da
Oligo d(T)16
Pode apresentar problemas na transcrição de longos transcritos de mRNA ou transcritos contendo hairpin loops.ex. Prejudica a transcrição extremidade 3' do transcrito em direção à
Random Primers (p. Não prejudica a transcriçào em direção à extremidade 3' do transcrito
2. a Applied Biosystems recomenda a realização de uma curva padrão relativa. Para informações sobre o portfolio de reagentes que estão disponíveis.As réplicas das amostras réplica em cada quantidade ajudarão na identificação de problemas de precisão. o cDNA é recebe uma unidade de concentração relativa à concentração original do RNA na reação de RT. Ao invés disso. pequenas alterações são mais difíceis de serem quantificadas com precisão.3 podem indicar problemas
. conseqüentemente. Para verificar se a quantidade de template produz resultados dentro da faixa linear dinâmica de um ensaio. Usar o conjunto de primer/sonda apropriado. Faixa Dinâmica . a concentração de cDNA resultante seria de 100 ng/ L. se as reações de transcrição reversa forem realizadas sob as mesmas condições. Determinação da Quantidade de RNA um Estudo de Quantificação Relativa O volume de amostra que é necessário na(s) reação(ões) de transcrição reversa (RT) pode ser determinado. Por exemplo.4. Os kits de reagentes de transcrição reversa da Applied Biosystems recomendam uma faixa e/ou uma massa máxima de RNA por reação. Isto indicaria que a quantidade de template inicial é muito alta e que 10 ou 1 ng de amostra pode representar a faixa melhor para uso. que significa 1 L de amostra que contém cDNA gerado a partir de 100 ng de RNA. por exemplo 1 ng. Os resultados de PCR em tempo real (CTs) de uma curva padrão podem ajudar a determinar: 1. Devido à distribuição estatística. pelo cálculo da concentração de RNA. especialmente ao iniciar um novo ensaio. As quantidades de amostra que produzem valores de CT nesta faixa apresentam baixa precisão. é importante verificar se a quantidade de cDNA testada produz resultados de PCR em tempo real dentro da faixa linear dinâmica do ensaio de PCR em tempo real. Precisão do Ensaio . 100 pg ou 10 pg) pode produzir altos valores de CT (ou seja.A faixa de RNA (cDNA) que o ensaio pode detectar. Por exemplo. se utilizar 10 g de RNA em uma reação de RT de 100 L. 35 – 40). consultar o site da Applied Biosystems (http://www. com uma faixa de RNA (cDNA) de 100 ng a 10 pg (por exemplo.
5. é comum não quantificar o cDNA resultante por absorbância de UV. em um ensaio com alv altamente expresso. As réplicas das amostras que apresentam um desvio padrão de CT > 0. CT de 3 a 10).br). Seleção de Reagentes para Transcrição Reversa e PCR em Tempo Real A Applied Biosystems oferece uma variedade de reagentes para transcrição reversa e PCR em tempo real para aplicações de quantificação relativa.appliedbiosystems. um alvo com baixos níveis de expressão (ou seja. Embora a transcrição reversa não ocorra necessariamente com 100% de eficiência. Se este for o caso. em primeiro lugar. as eficiências de RT de cada alvo são comparáveis entre as reações. você deveria correr ensaios com uma quantidade de inicial mais alta. 100 ng seriam 1/10 de 1 g de uma reação de RT) em uma série de diluições de 10 vezes (em triplicatas) para cada diluição. Consultar o protocolo adequado pra recomendações da quantidade de RNA. um alto nível de variação CT sempre ocorre quando as quantidades de alvo se aproximam de uma única cópia (valores de CT 35 a 40). Após a RT. Ao contrário. supõe-se quantidade inicial de 100 ng produza baixos valores de CTs (ou seja. Cada vez que você usar uma nova fonte de RNA.com.
Identificação de Inibição da PCR Observação: Resultados precisos da PCR em tempo real dependem de uma série de fatores tais como reagentes.referentes à pipetagem.0 podem indicar altos níveis de proteínas em uma amostra de RNA. Alguns experimentos podem tolerar somente uma pequena variação das réplicas idênticas.0039 0.063 0. Eficiência do Ensaio – A curva padrão relativa pode ajudar na determinação da eficiência do ensaio.0. Tabela 4: Diluições de cDNAs usadas nos Gráficos de Inibição Diluições nº. se pesquisador estiver procurando por pequenas alterações na expressão do alvo. Os RNAs foram quantificados pela absorbância de UV. Como discutido na seção anterior.00098
. Reveja a seção "O que é Eficiência de Amplificação da PCR" para mais informações. homogeinização ou montagem da placa.0 não prediz que os níveis de proteínas estão altos o suficiente para
chance de se obter resultados imprecisos. 5 nº. 3 nº. quanto mais o valor de A260/280 se desviar de 2. Exemplo: Gráfico de Inibição Nas duas amostras dos experimentos que se seguem.0 0. consultar "Fatores que Afetam a Precisão dos Resultados da PCR em Tempo Real" 7. os valores de A260/280 < 2. um valor R2 <0. 4 nº.063 0.0 0.25 0. podem provocar inibição da PCR. estas curvas de padrão semi-log (páginas 21 e 22) são referidas como gráficos de inibição. porém. Fatores que Afetam a Precisão dos Resultados da PCR em Tempo Real Altos níveis de proteínas. 2 nº.0039 0. maior a
valor de A260/280 < 2. 3. Para uma lista de fatores que afetam a qualidade dos resultados da PCR em tempo real. o RNA foi purificado usando dois métodos diferentes de extração. 1 nº.99 pode indicar problemas de precisão. montagem do experimento.016 0. Quando usadas para caracterizar a inibição. Um causar inibição da PCR. qualidade da amostra e análise.25 0.
Você pode usar os dados da PCR em tempo real a partir de gráficos da Curva Padrão para identificar se a inibição está ocorrendo em um nível que cause resultados impresisos.00098 Amostra 2 (µg) 1. O RNA foi coletado a partir de cada preparação e transcrito reversamente.
6. assim como outros reagentes contaminantes nas preparações de RNA. em seguida uma série de diluições foi preparada a partir de cada estoque de cDNA (Tabela 4). Quando você avaliar a curva padrão. 6 Amostra 1 ( g) 1.016 0.
00098 0.063 0.00024
0. 1 do Gráfico de Inibição não demostrando inibição
. 2 (ex. amostra nº. 22 menos 20) N/A 2.0 2.nº.0 -1.0 2.0 2.2 -1. Tabela 5: Dados da PCR em tempo real (CT) a partir do experimento do gráfico de inibição Massa das Amostras ( g) Log de Entrada CT médio.25 0.8 -2.00024
Os cDNAs foram usados para PCR em tempo real.0 -3. 7
0.0 2.0 0. amostra 1 Diferenças entre os valores de CT.0
1.0 CT média.0 -0.0 2. amostra 2 Diferenças entre os valores de CT.6
28 27 26 26 28 30 32
Figura 2: Amostra nº.016 0.4 -3.0 2. 1 (ex.00024
0.0 0. Resultados Os dados da PCR em tempo real gerados a partir das amostras 1 e 2 são apresentados na tabela 5 e nas Figuras 2 e 3 nas páginas 21 e 22. 27 menos 28) N/A -1.0 2.6 -1.0039 0.0 2. amostra nº.
Como resultado. ao invés de efeitos inibidores. Este padrão de inibição pode ser menos dramático quando a eficiência calculada for próxima. se sua sonda MGB TaqMan se
. Quanto de DNA Genômico Contaminante Pode ser Tolerado em um Ensaio de Expressão Gênica de Quantificação Relativa? O DNA genômico é geralmente co-extraído com RNA e pode servir como template em ® processos posteriores.3). então um erro constante de pipetagem (amostra padrão ou solvente) pode ser o problema. O declínio na Figura 3 é causado por inibidores que estão altamente concentrados nas amostras de cDNA menos diluídas. Se a eficiência da reação de PCR em tempo real for calculada para acima de 100%. Como os inibidores estão mais concentrados nas amostras menos diluídas. No entanto. 3. Consultar a seção "Realizar pipetagem precisa da amostra e dos reagentes" para informações adicioniais. mas ainda acima. os inibidores são diluídos da mesma forma. Conforme o cDNA é titulado. Testar sua amostra em uma concentração de template mais baixa onde se sabe que a inibição de PCR não afeta os resultados da PCR em tempo real. Examine as diferenças de CT entre cada resultado para observar a inibição. 2 apresenta um slope que é muito menor e a eficiência da PCR é calculada como sendo maior que 100% (592%). 2 do Gráfico de Inibição demostrando presença de inibidor Os dados no Gráfico de Inibição nº.
8. Se você determinar que os inibidores da PCR estão na(s) sua(s) amostra(s) de RNA. 2. a inibição mais dramática deve ser observada nas amostras que representem os pontos da curva padrão com a mais alta concentração do template. sem inibição. assim como a PCR. Realizar a purificação do RNA de uma amostra usando um novo método de purificação. neste exemplo uma alteração de 4 vezes deve produzir uma diferença de CT +2). realizar um dos seguintes procedimentos. as amostras menos diluídas podem apresentar valores de CT mais altos do que na diluição seguinte e/ou a diferença predita de CT não é atingida (ou seja. de 100% de eficiência.Figura 3: Amostra nº. 1 mostram um ensaio de PCR em tempo real com amplificação de 100% de eficiência (slope = -3. mas ainda houver uma diferença consistente de CT entre cada ponto padrão. Purificar novamente o RNA. O gráfico de Inibição nº. Um slope que sugira uma eficiência de PCR maior que 100% pode ser um indicador de inibição da PCR. 1.
As reações de RT sem transcrição reversa (controles negativos da RT) podem ser usadas para avaliar os níveis de DNA genômico em uma preparação de RNA. Realizar um tratamento com DNAse ou repetir o tratamento com DNAse caso esse já tenha sido realizado. então. 1 CT diferença de 2 vezes na quantidade inicial do template). Observação: O ABI PRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation co-purifica menos de 0. Por exemplo. Você deve. determinar se a amplificação da PCR atribuível ao DNA genômico é desprezível comparada à amplificação da seqüência do cDNA. 2. Se você determinar que a quantidade de DNA genômico nas amostras de RNA for inaceitavelmente alta. Em contraste. Um controle negativo de RT é uma reação que foi preparada para transcrição reversa (incluindo RNA. Pode-se assim. o DNA genômico pode ser excluído como um template em uma reação de PCR em tempo real. Uma vez que o template alvo neste controle negativo de RT seria exclusivamente DNA genômico. se ambos os primers forem desenhados dentro de um éxon. podese concluir que 0. Purificar o RNA usando um novo método de purificação.000) da amplificação na amostra de RT é atribuível ao template de DNA genômico.002% de DNA genômico ao usar o tratamento adicional com DNAse em coluna com Solução de Lavagem de RNA Absoluta. dNTPs. então o DNA genômico pode servir como um template para a amplificação da PCR.5% do DNA genômico aos usar as químicas de PrepStation RNA e menos de 0.1% (1:1. Nestes casos. então. estimar a quantidade de amplificação nas amostras que são atribuíveis aos templates de DNA genômico ao correr controles negativos da RT. se uma amostra controle negativo da RT apresentar um valor de CT 10 ciclos a menos do que uma amostra teste de RT. a amostra de controle negativo de RT iniciou com uma quantidade template aproximadamente 1000 vezes menor (considerando 100% de eficiência. deve-se decidir se o DNA genômico é suficientemente desprezível.estender sobre uma junção éxon-éxon.
. tampão e outros). realize um dos seguintes procedimentos: 1. mas sem adição de transcriptase reversa.
que é central para todos os ensaios oferecidos pela Applied Biosystems. camundongos e seres humanos. todos os ensaios podem correr ao mesmo tempo. Os Ensaios de Expressão Gênica TaqMan são desenhados para serem usados em RT-PCR two-step. Quando são desenhados. Os critérios para o desenho de primers para PCR em tempo real podem não ter sido utilizados no desenho de primers de outras aplicações.Seção III Seleção e Desenho do Ensaio para Quantificação Relativa
Entre os fatores a considerar no desenho de um estudo de quantificação relativa estão:
Seleção ou desenho de primers e sondas para o(s) gene(s) alvo. assim como um várias de orientações para a seleção ou desenho de um ensaio. Cada ensaio contém primers pré-formulados e sondas TaqMan em uma concentração de 20X. seguindo as mesmas orientações. exige pouco. assim como ® para o Software Primer Express . Estes ensaios foram desenhados a partir de seqüências dos bancos de dados públicos e da ® Celera Genomics. Observação: Os Ensaios de Expressão Gênica TaqMan contêm sondas marcadas com FAM TM e são otimizadas para reações simplex. Identificação e seleção ou desenho de primers e sondas para gene(s) controle endógeno (controle interno). Cada tupo contém 250 reações com um volume de reação de 20 L ou 100 reações com um volume de reação de 50 L. A Applied Biosystems apresenta um grande número de produtos disponíveis. 1. ou nenhuma otimização. Esta universalidade do desenho dos primers. Ensaios de Expressão Gênica TaqMan (TaqMan Assays-on-Demand Gene Expression Products) Os ensaios de Expressão Gênica TaqMan® são ensaios de expressão gênica préformulados e biologicamente informativos.
Seleção ou Desenho de Primes e Sondas TaqMan para Quantificação Relativa da Expressão Gênica Os estudos de quantificação relativa exigem conjuntos muito bem desenhados de primers e sondas.
® ® ® ® ™ ®
. Observação: O uso de primers que foram usados em ensaios de PCR tradicional não é recomendado. utilizados para rápida detecção e quantificação de transcritos de mRNA de ratos. quando se utiliza o TaqMan Universal Master Mix em um Sistema de PCR em Tempo Real da Applied Biosystems.
Os Ensaios de Genotipagem Custom TaqMan® são usados para ensaios de SNP. O ensaio foi desenhado para um transcrito pertencente a uma família de genes com alta homologia de seqüência. mas o ensaio pode detectar DNA genômico caso ele esteja presente na amostra. Visitar o web site da Applied Biosystems (http://www. camundongo.000 a 30. os Ensaios de Expressão Gênica TaqMan® (TaqMan Assays-on-Demand Gene Expression Products) estão disponíveis. rato e detecção de patógenos específicos são alguns exemplos de aplicações que seriam beneficiadas a partir desta linha de produtos. Ensaios de Expressão Gênica Custom TaqMan® (TaqMan Assays-by-Design for Gene Expression Service) Os Ensaios de Expressão Gênica Custom TaqMan® são ensaios personalizados desenhados para estudos de expressão. você pode realizar um ensaio personalizado. As primeiras duas posições designam a espécie para a qual o ensaio é desenhado: Hs = Homo sapiens Mm = Mus musculus Rn = Rattus norvegicus. As aplicações que envolvem detecção viral. detectará o transcrito alvo com discriminação de 1. Se um gene alvo em particular não estiver atualmente disponível. _sH. 2. outra espécie que não seja humana.
A penúltima posição da identificação do Ensaio contém uma letra que indica o posicionamento do ensaio: Sufixo do Ensaio _m _s _g Posicionamento do Ensaio Um ensaio cuja sonda se estende em uma junção éxon-éxon e não detectará o DNA genômico. ou _gH
Observação: As amostras de RNA devem estar livres de DNA genômico ao usar um ensaio "s" ou "g".000 vezes (sensibilidade) maior do que o gene homólogo mais próximo. portanto.appliedbiosystems. de camundongo ou de rato. Para ensaios de expressão gênica em amostras humanas. tais ensaio detectarão DNA genômico. Um ensaio cuja sonda se estende em uma junção éxonéxon.Nomenclatura dos Ensaios de Expressão Gênica TaqMan®: Cada Ensaio de Expressão Gênica TaqMan é designado uma ID de Ensaio. Um ensaio cujos primers e sondas são desenhados dentro de um único éxon. Estes ensaios personalizados (Expressão Gênica e Genotipagem) fornecem ao pesquisador a oportunidade de selecionar um local específico de seqüência ao qual a sonda se liga e é útil para o desenho de um ensaio que não esteja atualmente disponível entre as opções de Ensaios TaqMan®. Um ensaio.
® ™ ® SM
. Observação: Ensaios de Expressão Gênica TaqMan® são adicionados regularmente no web site para solicitações.com.br) para atualizações regulares. Os ensaios são desenhados para oferecer uma diferença entre 10 CT e 15 CT entre o gene alvo e o gene com homologia de seqüência mais próxima.
_mH.
G ou Ns e os primers e as sondas não são desenhados em regiões contendo Ns. O BLAST pode ser realizado na página http://www. seqüências ALU) e seqüências de DNA de baixa complexidade. você pode submeter sua solicitação on-line. O sofware de desenho de Ensaios Custom TaqMan® aceita seqüências com A.com.ncbi.com) e a assista demostração de uso antes de submeter sua seqüência.nih. Baixe o File Builder no site da Applied Biosystems (http://appliedbiosystems.org/). sua(s) seqüência(s) é(são) inserida(s) no sofware File Builder e submetidas para solicitação. disponível na Home Page RepeatMasker (www. Além disso. Se você estiver trabalhando em um sistema transgênico. Uma ferramenta que deve ser usada é o Repeat Masker. bancos de dados genômicos e de EST) para identificar regiões da seqüência que apresentam alto grau de homologia com outras partes do genoma ou alta homologia dentro de uma família de genes. C. Antes da submissão. você deve se certificar de que seus primers e sondas são únicos para as espécies de interesse queira diferenciar entre as espécies. Você também deve alinhar sua seqüência utilizando o BLAST nos bancos de dados apropriados (por exemplo.
3. é importante realizar uma "análise de bioinformática" sobre a seqüência que você pretende submeter. Submeter a seqüência.Os Ensaios de Genotipagem e Expressão Gênica Custom TaqMan® (TaqMan® Assaysby-DesignSM Service) exige que você verifique a integridade da seqüência que deseja submeter usando várias ferramentas bioinformática. O Repeat Masker escaneia seqüências de DNA para repetições entremeadas (ex. múltiplos alvos PDAR TaqMan® podem ser testados em uma única placa de reação. PDARs TaqMan® estão disponíveis para genes alvos em humanos. Alguns controles endógenos PDAR TaqMan® estão disponíveis como "primer limitado" e contêm sondas marcadas com o corante reporter
.nlm. camundongos e ratos. Após verificar a integridade da seqüência. os PDARs TaqMan® são otimizados para uso com o TaqMan® Universal PCR Master Mix com (P/N 4304437) ou sem AmpErase® UNG (P/N 4324018) e utilizam condições de ciclagem universais idênticas à dos outros ensaios da Applied Biosystems. IMPORTANTE! O arquivo gerado pelo software File Biulder deve ser submetido para o email: vendas@appliedbiosystem. Após verificar a integridade da seqüência. T.repeatmasker. Verificar a Qualidade da sua Seqüência. b.gov/BLAST. Reagentes de Ensaio Pré-Desenvolvidos TaqMan® (PDARs TaqMan®) Os Reagentes de Ensaio Pré-Desenvolvidos TaqMan® (PDARs TaqMan®) são conjuntos de primers e sondas desenhados para amplificar um alvo específico e seqüências de controle em amostras de cDNA usando o ensaio de determinação da nuclease 5' Os . O processo de submissão é muito direto e exige os seguintes passos: a. Como resultado. As regiões de alta identidade podem ser mascaradas (substituídas) com Ns antes de submeter ao BLAST. O resultado é uma versão modificada da sua seqüência na qual todas as repetições e seqüências de baixa complexidade são mascaradas (substituídas por Ns).
A utilização completa do software Primer Express está além do escopo deste documento. Uso do Software Primer Express ® para o Desenho de Conjuntos de Primers e Sondas para Quantificação Relativa da Expressão Gênica.com. Observação: Verificar a qualidade da seqüência usada para o desenho de primer e sonda é muito importante. recomenda-se que realize um ensaio baseado na sonda TaqMan® para alcançar resultados quantitativos com maior precisão.
Desenho de Ensaios para Aplicações com Reagentes SYBR® Green
O SYBR Green I é um corante fluorescente que se liga ao sulco menor do DNA dupla-fita (ou seja. o reagente SYBR Green é útil como uma ferramenta de seleção se você quiser avaliar rapidamente os níveis de expressão relativa de uma série de genes em uma variedade de tipos de amostra.
No entanto. Isto permite a realização de ensaios multiplex de controles endógenos e alvos. especificamente:
O corante SYBR Green I também se liga e apresenta fluorescência na ligação com dímeros de primers e produtos não específicos de amplificação. o leitor tem referências aos seguintes tutoriais que podem ser encontrados no site da Applied Biosystems (http://www.VIC®. Em ensaios de expressão gênica. o controle endógeno deve ser corrido em um poço separado. considerando que o gene controle é mais abundantemente expresso do que o gene alvo. Após você obter os dados preliminares. Como nenhuma sonda está envolvida nestas reações. Primer Express® Tabs and Annotation Tools: An Overview of the Features of Primer Express® v2.
.br): Designing TaqMan MGB Probe and Primer Sets for Gene Expression Using Primer Express Software Version 2. O software Primer Express está incluso com a compra de qualquer Sistema de PCR em Tempo Real da Applied Biosystems.
5. há algumas desvantagens para o seu uso. Como resultado. O software Primer Express é um softaware de desenho de primer e sonda que permite que você personalize o desenho de conjuntos de primers e sondas para uma variedade de tipos de ensaios– incluindo quantificação relativa. 4. A Applied Biosystems possui várias orientações de desenho que são configuradas dentro do programa de software Primer Express.appliedbiosystems. amplicons) e que fluoresce quando ligado ao DNA e excitado por uma fonte de luz. etapas adicionais de otimização são necessárias para garantir uma amplificação robusta e uma quantificação precisa.0 Esse tutorial detalha como uma sonda MGB TaqMan® pode ser desenhada em uma região específica de uma seqüência de template como uma junção éxon-éxon (sítio de splice dos íntrons).0 Este tutorial fornece uma visão geral do Software Primer Express. no entanto. Os reagentes SYBR Green não podem ser usados em multiplex.
no entanto. Submeter somente os primers para síntese. se o ensaio com sonda TaqMan® for corrido futuramente. a seqüência da sonda compatível com o conjunto de primers já terá sido desenhada.Para o desenvolvimento do ensaio utilizando o SYBR Green. recomenda-se o desenho do ensaio com o software Primer Express®.
a expressão do controle endógeno permanece constante. tal como absorbância através de UV. É importante demostrar que enquanto os níveis de expressão do alvo podem variar amplamente. Assim. É importante normalizar a quantidade de RNA por alguma medida externa. Selecionar controles endógenos candidatos e obtenha ensaios (conjuntos de primers e sondas). é crucial determinar se o tratamento de estudo ou intervenção está afetando o nível de expressão do gene(s) controle endógeno candidato(s). Qualquer gene que não altere seu nível de expressão em todas as amostras do estudo pode ser potencialmente utilizado como controle endógeno. coloque quantidades equivalentes de RNA nas reações de RT e pegue volumes equivalentes de cDNA para as reações de PCR em tempo real. para verificar a uniformidade daexpressão do controles endógenos: a.
Uniformidade dos Níveis de Expressão do Controle Endógeno Como o controle endógeno é utilizado para normalizar diferenças na quantidade de cDNA que é colocado nos poços de reação da PCR. A seleção de um controle endógeno exige três critérios:
1. Verificar a integridade do RNA (gel de eletroforese) e qualidade (A260/280). Purificar o RNA a partir das amostras no estudo. A normalização para um controle endógeno (geralmente referido como controle interno) permite que você corrija resultados que possam estar distorcidos pelas diferentes quantidades iniciais de template de ácido nucléico. Consultar "Preparação do RNA e Transcrição Reversa". Usar um método externo (como absorbância de UV) para quantificar os níveis de RNA. Observação: A pureza e integridade do RNA também são cruciais para esta análise. você deve colocar quantidades idênticas de cDNA para cada amostra em teste. Em resumo. Os níveis de expressão gênica do controle endógeno não devem variar. Desta forma. b. os níveis de expressão de controle endógeno devem ser semelhantes em todas as amostras no estudo.Seção IV Identificação e Seleção de Controles Endógenos para Quantificação Relativa
Uma das estapas mais importantes para um estudo com Quantificação Relativa é a seleção de um controle endógeno adequado.
. Altos níveis de proteínas co-extraídas podem resultar em resultados duvidosos devido à inibição da PCR. A quantidade de amostra deve se estender na faixa esperada da expressão do gene alvo no estudo. você pode testar a uniformidade da expressão dos controles endógenos comparando os níveis de CT do controle endógeno em várias ou em todas as amostras de estudo. c. RNA altamente degradado também pode resultar em resultados duvidosos. Usando a PCR em tempo real. No teste. d.
Multiplex de Genes Alvos e Controles Endógenos Quando você realizar um ensaio múltiplex. Corra as reações do controle endógeno e de alvo separadamente para cada amostra e certifique-se de que todos os CTs do controle endógeno são menores do que os CTs do alvo. você pode realizar um dos itens a seguir:
Repetir usando outro controle endógeno que seja consistentemente expresso no conjunto de amostra a ser testado. Na realização do método CT comparativo (também conhecido como método certifique-se de que o(s) alvo(s) e o controle endógeno apresentam eficiências de PCR semelhantes ou relativamene equivalentes.br)
2. Analisar e interpretetar os resultados*. Alguns Controle Endógeno TaqMan® estão disponíveis como ensaios com primers limitados. Validação da Eficiência de Amplificação dos Genes Alvo e Controle para o Método CT Comparativo CT). Colocar quantidades equivalentes de RNA nas reações de RT. Conduzir o estudo correndo o controle e o alvo em poços separados (simplex). que contêm sondas marcadas com o reporter VIC®.com.
Para testar se o controle endógeno é mais expresso do que o gene alvo.e. O gene que está mais altamente expresso (ou seja. controle endógeno) está configurado com seus primers em um nível limitante.appliedbiosystems. Uma variedade de controles endógenos para algumas espécies está disponível como Ensaios de Expressão Gênica TaqMan® e podem ser encontrados no web site Applied Biosystems (http://www. g. certifique-se de que:
O nível de expressão do gene controle endógeno é maior do que o do gene alvo. usar as amostras em teste que se estendem na faixa esperada da expressão gênica do alvo. considerando que o gene controle é mais expresso do que o gene alvo. Selecionar controle(s) endógeno(s) para usar no estudo. Isto garante que a amplificação do alvo menos expresso não seja comprometida pela amplificação do alvo mais expresso. Isto permite o multiplex dos genes alvo e controle endógenos.
. Colocar volumes equivalentes de cDNA de reações de RT em reações de PCR em tempo real para todos os controles endógenos candidatos. h. f. A exclusão desta competição entre alvos é necessária para a quantificação precisa de ambos os genes.
3. Se não for este o caso. Observação: Os Ensaios de Expressão Gênica TaqMan® são otimizados somente para reações simplex.
Considerações (e Aplicações): Este método exige que cada placa de reação contenha curvas padrões e exige mais reagentes e mais espaço em uma placa de reação. particularmente quando você estiver procurando por discretas alterações na expressão gênica. Introdução A Applied Biosystems utiliza duas metodologias para a Quantificação Relativa da Expressão Gênica. Método CT Comparativo ( CT)
Vantagem: Não é necessário correr uma curva padrão em cada placa. Método da Curva Padrão Relativa Vantagem: Este método exige a menor quantidade de validação devido ao fato de que as eficiências da PCR do alvo e o controle endógeno não precisam ser equivalente. O método CT comparatvo é útil quando um grande número de alvos e/ou amostras são testados. Isto pode resultar numa economia de reagente. Esta abordagem oferece resultados quantitativos altamente precisos uma vez que os valores quantitativos das amostras desconhecidas são interpolados a partir de uma curva padrão. A Applied Biosystems oferece softwares de PCR em tempo real que realizam os cálculos de CT além da configuração e análise da placa de PCR em Tempo Real.
Método da Curva Padrão Relativa Método CT Comparativo ( CT)
Antes de começar o experimento. As informações que se seguem irão detalhar como os dados podem ser analisados usando qualquer uma das duas metodologias.Seção V Análise e Desenho Experimental da Quantificação Relativa da Expressão Gênica: Método da Curva Padrão Relativa e Método CT Comparativo ( CT)
1. Considerar este método quando necessitar de uma alta demanda e e ao validar os resultados de microarrays.
. As vantagens de cada método e fatores a considerar estão descritos abaixo. considere qual método atende suas necessidades. Considerações (e Aplicações): Recomenda-se a utilização de uma curva padrão relativa para validar as eficiências da PCR do alvo e do controle(s) endógeno(s). um método pode ser mais apropriado que outro. Dependendo de uma série de fatores. Considerar este método ao testar pequeno número de alvos e de amostras e se você estiver procurando por alterações muito discretas na expressão gênica.
em seguida. pois a quantidade é expressa em relação a alguma amostra de base. qualquer estoque de cDNA.5. O estoque de cDNA. divida pela quantidade do alvo do calibrador. Para todas as amostras experimentais. O calibrador. a unidade da curva padrão está cancelada. aliquote estes cDNAs em tubos para serem utilizados uma única vez. conseqüentemente. a quantidade de alvo é determinada pela interpolação a partir da uma curva padrão e. 2. Como a quantidade de amostra está dividida pela quantidade do calibrador. Assim. em seguida. em um estudo de efeitos de um medicamento sobre a expressão gênica. exceto por que usa fórmulas aritméticas para alcançar o resultado para quantificação relativa. se torna uma amostra 1X. RNA ou DNA para preparar curvas padrões para múltiplas placas. Uma curva padrão de DNA pode ser usada para a quantificação relativa de RNA.
3. e todas as outras quantidades são expressas como uma diferença de nvezes em relação ao calibrador. As curvas padrões para Quantificação Relativa são fáceis de preparar. Método CT Comparativo (Método CT) O Método CT Comparativo. é semelhante ao
. tudo o que é exigido dos padrões é que suas diluições sejam conhecidas. você pode usar DNA genômico (se os primers forem desenhados dentro de um único éxon) ou DNA plasmidial contendo o alvo de interesse. RNA ou DNA contendo o alvo apropriado pode ser usado para preparar os padrões. Para quantificação relativa. um controle não tratado seria um calibrador apropriado. como o calibrador. Ao usar o mesmo estoque de cDNA. RNA ou DNA deve ser diluído com precisão. Isto assume que a eficiência da transcrição reversa do alvo é a mesma em todas as amostras. portanto. 0. Isto é discutido em maiores detalhes nesta seção. as curvas padrões são preparadas tanto para o alvo como para o controle endógeno. Se diluições na ordem de duas vezes de um produto de transcrição reversa (cDNA) de uma linhagem celular controle for usada para construir uma curva padrão. É possivel eliminar o uso de curvas padrões e usar o Método CT para quantificação relativa enquanto as eficiências de PCR entre o(s) alvo(s) e o(s) controle(s) endógeno(s) forem relativamente equivalentes. Para cada amostra experimental. as unidades podem ser os valores de diluição 1. você determina a quantidade de alvo e do controle endógeno a partir da curva padrão apropriada. Observação: A AB recomenda que você prepare grandes pools de cDNAs da curva padrão e do calibrador e.25. Como a quantificação deve ser normalizada para um controle endógeno. 0. as quantidades relativas determinadas podem ser comparadas entre as placas.125 e assim por diante.2. O uso do mesmo pool de cDNA padrão e calibrador ao longo do estudo ajuda a melhorar a precisão dos resultados da PCR em tempo real. Para o uso adequado de curvas padrões relativas: 1. mas o valor exato desta eficiência precisa ser conhecido. Método da Curva Padrão Relativa O método da Curva Padrão relativa usa um conjunto de padrões relativos a partir do qual amostras desconhecidas são quantificadas.
CT. porém as unidades usadas para expressar as diluições não são importantes. também referido como Método
Método da Curva Padrão Relativa. Por exemplo. Um calibrador é uma amostra usada como base para comparação de resultados. 0. Por exemplo.
Se os experimentos de otimização produzirem concentrações alternativas de primers e/ou sondas. tais como reagentes. Observação: Os Ensaios de Expressão Gênica TaqMan® apresentam eficiências de amplificação de 100%. qualidade da amostra e análise. 100 ng para 10 pg) e englobar os níveis de expressão do(s) alvo(s). Um Experimento de Validação é Necessário para Determinar se o seu Cálculo de CT é Válido. ao usar Ensaios de Expressão Gênica TaqMan®. A AB tem testado extensivamente os parâmetros de desenho e acredita que os ensaios resultantes apresentarão 100% de eficiência (± 10%) quando medidos em uma faixa de diluição de log 6. Correr. é dada por: 2
a. 4. Correr as reações do alvo e do controle endógeno em poços separados (reações únicas). montagem do experimento. em amostras que não apresentem inibidores de PCR. uma vez que alguns pontos de diluição podem estar fora da faixa dinâmica do(s) ensaio(s). A avaliação das eficiências
em gráfico em comparação ao log de entrada para criar uma regressão linear semilog. a eficiência da amplificação do alvo e a eficiência da
relativas da amplificação do alvo e da amplificação do controle endógeno é alcançada pela corrida de curvas padrões para cada amplicon ao utilizar a mesma amostra.Fórmula Aritmética: A quantidade de alvo. Para um cálculo CT válido. Por exemplo. A quantidade inicial de cDNA deve se estender por 5 ou 6 logs (ou seja. A amostra no experimento de validação deve expressar ambos os genes alvo e o controle endógeno. você pode observar como o CT (CT alvo – CT referência) varia com a diluição do template. Observação: Pode não ser possível incluir todos os dados na análise de seu experimento de validação. 2. 3. ajustar as concentrações adequadamente. não é necessário medir a eficiência. Os valores C gerados a partir dos pontos de massa da curva padrão equivalente (alvo em comparação à referência) são usados no cálculo de CT (CT alvo – CT referência). Estes valores de CT são colocados
amplificação da referência devem ser aproximadamente iguais. Para determinar se as reações de amplificação apresentam a mesma eficiência. 3 réplicas para cada ponto da curva padrão. normalizado para referência endógena e em relação ao calibrador. As concentrações de primers e sondas devem estar nos níveis recomendados de 900 nM para cada primer e 250 nM para cada sonda. As orientações para realizar um experimento de validação efetiva são: 1. Conseqüentemente. Orientações para Validar um Experimento Observação: Resultados precisos da PCR em tempo real dependem de fatores. pelo menos. uma amostra que basicamente seja avaliada durante o experimento (como o calibrador) poderia ser utilizada. O slope da regressão linear semi-log resultante pode ser usado como um critério
04 26.97 ± 0.44 ± 0.62 ± 0.17 ± 0.0 -0.13 30. Quantidade de Entrada do RNA Total (ng) 1. em seguida.7 -2.16 32.14 ± 0.
No exemplo a seguir.82 2.2 0. A média e desvios padrões dos valores CT das réplicas das amostra são apresentados na tabela a seguir.1 0.82 ± 0.02 0.03 23. Tabela 10: Log de entrada do RNA e Quantidade de Inicial de RNA Total (ng) 1 0.77 ± 0.0 -1.64 ± 0.5 0.09 28.97 ± 0.73 ± 0.1 0.59 ± 0.02 0.14 ± 0.02 27.3 -0.04 ± 0.02 3.06 28.3 -1. tabular novamente os dados conforme apresentado abaixo.5 0.97 2.45 ± 0.10 3.19 2.1. Construção de Gráficos dos Resultados do Experimento de Validação Exportar os dados analisados para o software Microsoft Excel e.95 3.01 C de alvos para experimento de validação
Log de Entrada: ng do RNA Total 0.12 GAPDH CT Média 22.08 CT c-myc – GAPDH 2.geral para correr um experimento de validação. Observação: Se as eficiências das duas reações de PCR forem iguais.01 c-myc CT Média 25.95 ± 0.01 ± 0.42 ± 0.02 ± 0.13 2.03 31. Tabela 9: Cálculos de CT para o experimento de validação.16 ± 0.0
CT c-myc – GAPDH 2. Em um experimento de validação que é corrido.7 -1. o gráfico da quantidade do log de entrada em comparação ao CT tem um slope de
aproximadamente zero.07 2.14
b.05 25.11 3.10 29.18 ± 0.0 0.97
Para construir um gráfico destes dados no software Microsoft Excel®:
.2 0.01 2. o valor absoluto do slope de CT em comparação ao log de entrada é < 0.05 3.04 3.05 0. as réplicas de cada ponto da curva padrão foram avaliadas por PCR em tempo real.05 0.05 29.12 ± 0.10 26.
na opção "type" selecionar "LINEAR".
Figura 6: Gráfico de validação de de RNA
CT em comparação à quantidade do log de entrada
. na opção "options" selecionar "Display equation on chart". Para cada ponto da curva. Fazer o mesmo para Y values 5) Com duplo clique em cada eixo do gráfico pode-se modificar as escalas dos eixos 6) Em seguida clicar com o botão direito em um dos pontos do gráfico e selecionar "trendline". calcular o log da quantidade de material (diluição) correspondente (esses valores irão compor o eixo x do gráfico). esse valor deverá ser entre -0. se a eficiência de ambos o alvo e o endógeno estiverem semelhantes. A equação que aparece é do tipo y=ax+b. 4) Ainda na opção "Series". Dentro de Trendline. Em seguida calcular os Ct entre alvo e endógeno utilizando as médias de cada ponto (esses valores de Ct irão compor o eixo y do gráfico). Dentro de Trendline. tirar as médias de Ct para as triplicatas de cada ponto da curva. Para montar o gráfico: 1) Selecionar os valores a serem plotados no gráfico (selecionando as células onde estão listados) 2) Ir em INSERIR – GRÁFICO – XY (Scatter) 3) Na opção "Series" remover "Series 2". O valor que aparece na posição a corresponde ao slope da reta e. clicar em X values e selecionar os valores correspondentes.1.1 e 0.Após ter feito as curvas de diluição para o alvo e o controle endógeno.
pois pipetar pequenos volumes pode ser impreciso. Recomendamos não pipetar menos do que 5 L de qualquer reagente em uma mix de PCR ou a própria reação. No
exemplo a seguir um primer liofilizado com uma massa de 119. Reconstituição do primer ou da sonda TaqMan® Para reconstituir um primer ou uma sonda.
[119.
Exemplo: Observação: Para os cálculos a seguir é importante entender estas definições. Molar (M) é definido como apresentando um mole de soluto em um litro de solução. uma solução 50 M teria
50 µmol L
Primeiro converta a massa da sonda para mols. As sondas TaqMan® às vezes são enviadas liofilizadas.119 µmol 1. É importante considerar os volumes que serão pipetados rotineiramente do estoque de trabalho do primer ou sonda. Uma faixa comum de concentração estoque de trabalho do primer é de 10 molar ( M) a 100 M. 0.
Determinação da concentração estoque de trabalho do primer ou sonda TaqMan® Primeiro. determine a concentração estoque de trabalho do primer ou sonda necessária. Mole (mol) é definido como uma unidade fundamental para medir a quantidade de uma substância.0) ou em H2O estéril livre de nuclease. pH 8. embora mais freqüentemente sejam enviadas em solução (TE 1X) e suas concentrações são descritas na bula da Applied Biosystems.000. Por definição. As unidades de uma sonda ou primer liofilizado são oferecidas como uma massa.Reconstituição e Diluição de Primers e Sondas TaqMan®
Introdução Os primers TaqMan® são normalmente enviados liofilizados.1mM EDTA. Para criar um estoque de primers ou sonda.000 pmol ]
1µmol = 0.00 pmol
. deve-se reconstituir o primer ou sonda em TE 1X estéril (1mM Tris. visto que o estoque de trabalho da sonda estará em uma concentração de M. em picomoles.000 picomoles (pmols) será reconstituído para uma concentração do estoque de trabalho de 50 M. deve-se calcular o volume de TE ou H2O estéril necessário para alcançar a concentração do estoque de trabalho. Uma faixa comum de concentrações de estoque de trabalho da sonda é de 2 M a 10 M.
Uma faixa comum de concentração estoque de trabalho é de 2 µmolar a 10 µmolar. Exemplo: Diluição de sondas TaqMan® já reconstituídas com uma concentração de 100 M para uma concentração de estoque de trabalho de 10 M.38 mL L
Para atingir uma concentração de 50 M.00 µL 1.00238L]
1000 mL = 2. O cálculo utilizado é C1V1=C2V2 Onde C = Concentração Inicial da solução
V1 = Volume Inicial da solução C2 = Concentração Final da solução V2 = Volume Final da solução Uma concentração Molar é um mole de soluto em um litro de solução. X = 0.
Diluição de sondas TaqMan® já reconstituídas para uma concentração estoque de trabalho As sondas TaqMan® são normalmente enviadas em solução e suas concentrações são relatadas na bula da Applied Biosystems. Observe que neste exemplo a Applied Biosystems reconstituiu a sonda TaqMan® com 50 L de TE 1X para atingir uma concentração inicial de 100 M.
0. para encontrar V2 .000.000 pmol será reconstituído com 2.000 L em 1 L.000.00 µL
Resolvendo a equação. O exemplo a seguir demonstra como diluir sondas para uma concentração estoque de trabalho desejada.000. V2 = 500 L Para atingir um volume final de sonda de 500 L. seria adicionado 450 L de TE 1X a 50 L de solução de sonda TaqMan® 100 M. Portanto.Então. Armazenamento de primers e sondas TaqMan®
. resolva a seguinte equação para identificar o volume X necessário para alcançar a concentração estoque de trabalho.38 mL de TE 1X ou H O estéril. há 1.
100 µmols [50 µL] = 10 µmol [V2 ] 1.119 µmol 50 µmol = X L
Pela multiplicação cruzada. E.00238L Litros podem ser convertidos para uma unidade de volume mais prática. um primer liofilizado com uma massa de 119. uma solução de 100 M teria 100 mol em um litro.
então. Neste exemplo o usuário executará 50 reações e preparará a mistura de reagentes da PCR como se fosse para 55 reações. Exemplo: Preparação de uma mistura de reagentes de PCR com concentrações finais de reação de primer de 900nM e concentrações finais de reação de sonda TaqMan® de 250nM. O exemplo a seguir descreve como calcular os volumes de primers e sondas necessários de tal forma que os primers e a sonda estejam em uma concentração final desejada na reação. As reações são preparadas com o TaqMan® Universal PCR Master Mix (fornecido em uma concentração de 2X. a otimização do primer SYBR® Green I deve ser eliminada somente com cuidado. Esse mix pode. mas preferivelmente pipetar os primers e sondas num mix de reagentes da PCR.Assim que os primers e as sondas forem reconstituídos e/ou diluídos.taf. No entanto.appliedbiosystems. Devido à natureza não específica de sua detecção. Os protocolos podem ser obtidos a partir do serviço Documents on Demand da Applied Biosystems em http://docs. com
. se todas as instruções forem seguidas. Otimização das concentrações de primer e sondas TaqMan® Consulte o protocolo apropriado da Applied Biosystems para determinar como otimizar as concentrações da sonda e do primer para um ensaio de nuclease 5' ou concentrações de primer para um ensaio de PCR em tempo real utilizando o corante SYBR® Green. recomenda-se que os primers e as sondas sejam distribuídos em alíquotas de único uso. para a grande maioria dos ensaios quantitativos de nuclease 5' desenvolvidos e executados seguindo as instruções de desenvolvimento de ensaio da ABI. Preparação de mix de reagentes da PCR Recomenda-se não pipetar primers e sondas TaqMan® diretamente em sua reação. 50 reações + 5) já que provavelmente algum volume de mistura será perdido devido à aderência dos reagentes nas paredes do tubo. Este exemplo é apresentado simplesmente para demonstrar como diluir primers e sondas TaqMan® em um mix de reagentes da PCR. Consulte o protocolo específico da Applied Biosystems para determinar as recomendações específicas para uso dos reagentes da Applied Biosystems. pode-se acessar o protocolo do TaqMan® Universal PCR Master Mix para encontrar informações específicas sobre a otimização dos primers e sondas.com/search. Fazer alíquotas de único uso limita o descongelamento dos primers e sondas TaqMan® e. No entanto. a utilização de uma concentração de primers forward e reverse de 900 nM e sonda de 250 nM fornecerá um ensaio altamente sensível e reprodutível ao utilizar cDNA ou DNA como um substrato. p/n 4304437). Determine o número de reações que o experimento necessitará e acrescente 10%-20% adicionais (ex. Recomenda-se armazenar os primers e as sondas TaqMan® a –20 C.appliedbiosystems. que fornece todos os reagentes necessários para o processo de PCR pelo sistema Taqman. Também é importante manter as sondas TaqMan® no escuro para evitar danos induzidos pela luz. as concentrações do primer forward e reverse de 50 nM devem fornecer amplificação robusta com um bom nível de especificidade quando utilizar cDNA ou DNA como um substrato. aumenta sua validade. Os protocolos podem ser obtidos a partir do serviço Documents on Demand da Applied Biosystems em http://docs.com/search.taf . portanto. Por exemplo. ser adicionado a cada um dos poços da placa de reação.
25 µmols [50 µL] 1.000. A concentração estoque de trabalho dos primers são de 50 M e a concentração estoque de trabalho da sonda é de 10 M.000.9 L necessário por reação).000.
.95 L H2O Estéril. utilize o cálculo a seguir. portanto.25 L (sonda) – 10 L (DNA template) = 11.25 µl Resolva o cálculo para determinar o volume de H2O estéril necessário por reação subtraindo os volumes de todos os outros componentes da reação de 50 L. C1V1=C2V2 Onde C1 = Concentração Inicial da solução V1 = Volume Inicial da solução C2 = Concentração Final da solução V2 = Volume Final da solução Resolva o cálculo para determinar V1 (volume de cada primer estoque necessário por reação).00 µL 1.
50 µmols [V1 ] ≡ 0.000 µL
V1 = 0. Calcule os volumes de todos os reagentes necessários para uma única reação. Os volumes de reação são de 50 L.00 µL 1.9 µmols [50 µL] 1. Resolva o cálculo para determinar V1 (volume de cada sonda estoque
10 µmols [V1 ] ≡ 0. metade da reação ou 25 L para estar numa concentração de 1X. Para diluir o primer e a sonda. 10 L de DNA template será acrescentado a cada poço. O TaqMan® Universal PCR Master Mix está em uma concentração de 2X e constituiria.000 µL
V1 = 1.000.9 L (primer 1) – 0.25 L (TaqMan® Universal PCR Master Mix) – 0. 50 L (volume final da reação) .9 L (primer 2) – 1.exceção de primers e sonda TaqMan® e o template de DNA.
5 µL 49.
.25 µL 11.75 µL 657. Para solicitar primers e sondas TaqMan® da Applied Biosystems.95 µL
X 55 X 55 X 55 X 55
49. envie um e-mail para vendas@appliedbiosystems.com. ou pelos telefones: 0800-704-9004 ou 50709662 (Grande São Paulo).Multiplique todos os componentes (exceto o DNA template) por 55.9 µL 0. Reagente Concentração de estoque Volume de uma única reação 25 L X 55 Volume necessário o Master Mix 1375 µL Concentração final
TaqMan® Universal PCR Master Mix Primer Forward Primer reverse Sonda TaqMan® H2O Estéril
50 M 50 µM 10 µM N/A
0.com.9 µL 1. Solicitação de primers e sondas TaqMan® Dúvidas técnicas quanto às sondas e primers TaqMan® podem ser feitas ao Suporte Técnico da Applied Biosystems pelo e-mail suporte@appliedbiosystems.25 µL
900 µM 900 µM 250 µM N/A
Observe que todos os componentes estariam na concentração final adequada quando 40 µL do reagente do PCR fosse misturado a 10 µL de DNA em cada poço de amostra.5 µL 68.
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