Mecanismos de acção, reacções adversas e novos agentes antifúngicos | National Box
Sumário (Português)
Este texto completo é a transcrição editada e revista do Curso de Actualização em Micologia Médica, Infecções Fúngicas Invasivas e Nosocomiais, organizado pelo Instituto de Ciências Biomédicas (ICBM) da Universidade do Chile de 29 de Novembro a 1 de Dezembro de 2004.
Director do Curso: Dr. Víctor Silva, MSc,PhD.
Coordenador do Curso: Dra. Lily Contreras.
Editor Científico: Dr. Víctor Silva.
h6>Introdução
Os mecanismos de acção de um ponto de vista microbiológico serão discutidos a seguir. Ao compreender como funcionam os fungos e quais as estruturas antifúngicas alvo, é possível deduzir as reacções adversas que eles geram.
Site de acção dos antifúngicos
Yeast são eucariotas; portanto, diferem muito das bactérias em termos da sua estrutura, que tem vários sítios onde os antifúngicos podem actuar (ver Figura 1).
Na maioria dos casos, o antifúngico actua sobre a membrana citoplasmática do fungo, especificamente sobre a síntese do ergosterol; isto ocorre, por exemplo, com a família do polietileno, à qual pertencem a anfotericina B e a nistatina, e com a família do azole, que são os fármacos mais utilizados na clínica. A família das alilaminas, incluindo a terbinafina, também bloqueia a síntese do ergosterol.
A poucos anos atrás, a griseofulvina era amplamente utilizada, que actua na divisão nuclear e inibe a mitose, inibindo microtubos, razão pela qual a sua toxicidade é significativa nas células da corrente sanguínea; por esta razão, a sua utilização teve de ser rigorosamente controlada com hemograma. Por outro lado, existe a fluorocitosina, um análogo nucleósido que é capaz de inibir a síntese de ADN e RNA.
Durante anos houve uma procura de uma droga selectiva para células fúngicas, que não actuava sobre células humanas, de modo a reduzir reacções adversas, até que as equinocandinas fossem descobertas, o que inibia a síntese da parede celular fúngica, que falta às células de mamíferos, sendo as drogas muito mais selectivas.
Figure 1. local de acção dos antifúngicos.
Ergosterol é um componente lipídico da membrana em que actua a maioria dos antifúngicos. É o esterol predominante nas células fúngicas e, entre as suas funções, dá fluidez e integridade à membrana, permite o funcionamento adequado de muitas enzimas ligadas à membrana e, ao promover a função da quitina sintetase, permite o crescimento e divisão celular. As leveduras e os fungos filamentosos têm geralmente células em crescimento ou filhas, por isso a membrana precisa de ser bastante dinâmica. A síntese do ergosterol, cujo precursor é o squalene, é composta de uma série de passos, como mostra a Figura 2.
Antifúngicos como os azoles e a amorolfina, que é amplamente utilizada em micoses de unhas como tratamento tópico, actuam em certas fases da síntese do ergosterol; inibindo especificamente certas enzimas, por exemplo, as allylaminas bloqueiam a epoxidase de squalene e os azoles bloqueiam 14 alfa lanosterol demetilase. Estas enzimas são codificadas por uma família de genes que podem sofrer mutações e gerar uma resistência secundária aos antifúngicos.
A parede celular é outro local de acção importante. É uma estrutura muito complexa, composta por 90% de polissacáridos e 10% a 20% de lípidos e glicoproteínas. Do ponto de vista morfológico, determina as diferentes formas que os fungos têm; também lhes permite interagir com o ambiente e protege-o contra a lise osmótica, é um local de ligação das enzimas e tem propriedades antigénicas, que são utilizadas para o diagnóstico.
As principais características dos antifúngicos serão revistas abaixo.
Os polenos mais importantes são a nistatina, que é utilizada topicamente, e a anfotericina B, que é administrada por via intravenosa. Têm uma estrutura lipídica, o que os torna difíceis de entregar, e mesmo quando são realizados testes in vitro têm de ser dissolvidos com solventes específicos, razão pela qual também são difíceis de utilizar no tratamento de pacientes.
Esta família liga-se aos componentes da membrana plasmática e interage com o ergosterol, mas sem inibir a sua síntese. Ao ligar-se ao ergosterol, forma-se um grande poro através do qual se perdem iões, açúcares e outros compostos, até que a célula finalmente rebenta. Por esta razão, e também porque a ligação é irreversível, a anfotericina é uma droga fungicida.
Como para a especificidade dos polenos, as bactérias não têm ergosterol, mas outros compostos, pelo que são insensíveis a estes compostos, contudo, este fármaco, poderia interagir com a membrana das células eucarióticas, razão pela qual a anfotericina B é bastante tóxica. A estrutura química da anfotericina B é semelhante à do colesterol, pelo que tem afinidade com a membrana, adere a ela e provoca a sua ruptura.
Os diferentes antifúngicos que compõem a família do polietileno têm afinidades diferentes para os lípidos; por exemplo, a anfotericina B tem uma afinidade maior para o ergosterol do que para o colesterol. Existiam alguns antifúngicos, como os filipinos, que tinham uma maior afinidade com o colesterol. Quanto mais afinidade uma droga tem com o colesterol, mais tóxica é para os seres humanos.
Anfotericina B é bastante tóxica, causando reacções febris, gastrointestinais e azotémicas devido à nefrotoxicidade; portanto, sempre que este medicamento é administrado, os níveis de potássio, função renal e reacções febris devem ser monitorizados, e devem ser usados antipiréticos quando necessário; também pode causar anemia normocítica normocrómica. Para reduzir os efeitos adversos, foram desenvolvidas formulações lipossómicas ou emulsões lipídicas nas quais a anfotericina, que é insolúvel na água, está contida na emulsão. Estes produtos apenas melhoram a tolerância, porque a potência é muito semelhante à da droga pura.
Em termos do seu espectro, os fungos mais oportunistas são inibidos por concentrações relativamente baixas de anfotericina B. No passado, foi sugerido que isto ocorria abaixo de 1 ug/ml, mas é muito difícil estabelecer pontos de corte tão baixos ao medir a susceptibilidade a este agente. Em algumas espécies tem sido sugerido que acima de 0,5 ug/ml pode haver algum grau de resistência. Por conseguinte, este valor MIC é actualmente utilizado mais como ponto de referência.
alguns agentes, tais como o Trichosporon, o Scedosporium e alguns fungos demáceos (feofomicose) são inerentemente resistentes à anfotericina B, devido às suas características estruturais. É por isso importante fazer sempre um bom diagnóstico micológico, porque se um doente tiver um quadro clínico característico e um fungo preto ou feofomicose for isolado, o tratamento com anfotericina B não será eficaz, uma vez que muitas destas espécies são intrinsecamente resistentes.
Resistência primária à anfotericina B não é muito comum; a resistência secundária começou a ser vista, mas muito pouco, porque é tão eficaz como fungicida que o fungo é incapaz de fazer alterações que lhe permitam adaptar-se a esta droga. No entanto, verificou-se que algumas espécies são capazes de substituir a sua componente ergosterol por precursores mais próximos do lanosterol e de se defenderem desta forma.
Estirpes resistentes também foram induzidas por mutagénese, luz química ou ultravioleta, quando são administrados tratamentos quimioterápicos. A célula fúngica é capaz de receber este mesmo tóxico ou noxa, e, secundariamente, começa a defender-se contra as citotóxinas, gerando alterações no seu conteúdo de ergosterol. O facto de a componente ergosterol da sua membrana mudar nem sempre significa que a célula será resistente, mas pelo contrário, muitas vezes a célula resultante é mais vulnerável a outras mudanças ambientais.
Em geral, os isolados resistentes ao polietileno têm quantidades mais baixas de ergosterol. Este fenómeno foi observado em algumas estirpes de Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus spp. e Neurospora crassa. Contudo, alguns mutantes aumentam a quantidade de ergosterol e são resistentes, como se viu com estirpes de Candida albicans e C. neoformans; ou seja, não há nenhuma regra que determine se a alteração do conteúdo de ergosterol conduzirá à resistência.
Como conclusão, a modificação ou ausência de esterol na membrana não é a única explicação bioquímica para a resistência; por exemplo, em S. cerevisiae 6 genes envolvidos na resistência ao polietileno foram identificados, mas o estudo desta resistência não está muito desenvolvido, porque é rara.
5 fluorocitosina (5FC) é uma pirimidina fluorada, cuja molécula tem um átomo de flúor que actua inibindo a síntese de ADN e RNA na célula fúngica. É uma droga bastante específica, que não actua sobre a síntese de nucleótidos em células humanas. Este antifúngico não está disponível no Chile, mas noutros países foi amplamente utilizado em combinação com anfotericina B e alguns fármacos azóicos.
5 a fluorocitosina pode entrar na membrana fúngica graças à enzima citosina permease, que não está presente na célula do mamífero, pelo que é específica. Quando entra na célula, esta molécula sofre modificações e vai em direcção à síntese de RNA, mas dá origem a uma fluorouridina aberrante, ou seja, gera um RNA mutante, que irá afectar a síntese de proteínas, uma função essencial nas células. Por outro lado, pode inibir a enzima que permite a passagem da uridina para a timidina, ou timidilato sintetase, porque o ADN é constituído por timidina e não por uracilo, o que também afecta a síntese de ADN (ver Figura 3).
Embora este medicamento seja altamente tóxico para a célula fúngica, o fungo defende-se mutando certas enzimas envolvidas na sua acção, tais como a permease da citosina, cuja mutação impede a entrada do antifúngico, para que não tenha qualquer efeito; também pode alterar enzimas que fazem parte do percurso de modificações que o medicamento sofre na célula, tais como a urodina monofosfato pirofosforilase. Este medicamento gera rapidamente resistência secundária, ou seja, uma vez que a célula fúngica tenha estado em contacto com ele começa a gerar todas estas mutações e a resistência ocorre.
Esta tem uma correlação muito boa in vitro/in vivo, por isso quando aparece uma concentração inibitória mínima elevada, igual a 32 ug/mL ou superior, o fungo é bastante resistente à terapia. Os níveis de plasma recomendados são de 40 a 60 ug/mL para evitar a toxicidade.
As espécies de Candida albicans são sensíveis a 5FC (MIC = 0,12-2 ug/mL), com excepção de C. krusei (MIC> 8 ug/mL), que também é resistente a drogas azóicas. Uma grande vantagem é que pode ser absorvida oralmente e os níveis de plasma são geralmente atingidos com relativa facilidade. Este antifúngico é activo contra Candida albicans, Cryptococcus e alguns fungos demáceos, mas tem a desvantagem de gerar rapidamente uma resistência secundária. Outra vantagem da 5-fluorocitosina é que é sinérgica com polietilenos e fármacos azólicos como a anfotericina B, cetoconazol e fluconazol, o que diminuiria a dose de anfotericina B e diminuiria a toxicidade para o doente.
Estes medicamentos mudaram a história da medicina, e os antifúngicos sistémicos derivados de imidazol e triazol são considerados o avanço mais importante nos últimos anos no tratamento das micoses oportunistas sistémicas. O aparecimento do fluconazol, após a anfotericina, permitiu reduzir a toxicidade dos tratamentos antifúngicos. Os imidazoles são bastante tóxicos, mas os triazoles são utilizados para tratar algumas micoses sistémicas que antes eram intratáveis, com muito boa tolerância do paciente.
O grupo azole é composto por duas famílias: os imidazoles e os triazoles, que partilham mecanismos de acção e resistência. Entre os imidazóis encontram-se o coagrimazol, o miconazol e o cetoconazol; este último era uma das drogas mais utilizadas na onicomicose, mas a sua toxicidade hepática é muito importante.
Os triazóis são mais bem tolerados; entre eles estão o fluconazol e o itraconazol, que são os triazóis de primeira geração; recentemente foram desenvolvidos os triazóis de segunda geração, incluindo o voriconazol, ravuconazol e posaconazol, cujo espectro de acção melhorou contra outros fungos. O mais estudado tem sido o voriconazol, com muito bons resultados em termos de morte celular.
Em comparação com os medicamentos mais antigos, estes medicamentos são activos contra mais espécies de Candida albicans e são também activos contra Aspergillus, ao contrário dos azoles de primeira geração, com excepção do itraconazol, que era anteriormente utilizado em aspergilose invasiva. O Voriconazol melhorou o prognóstico da aspergilose invasiva e o seu perfil de segurança é muito semelhante ao dos triazóis, com poucas reacções adversas. O aparecimento destes novos azoles deve-se ao trabalho científico que tem sido feito para minimizar a toxicidade das drogas e melhorar a potência das drogas com o mesmo mecanismo de acção.
Os azoles podem ser administrados oralmente e parenteralmente, estão relativamente bem distribuídos e dissolvem-se facilmente. Quanto aos seus mecanismos de acção, inibem a biossíntese do ergosterol na etapa de desmetilação do lanosterol, no carbono 14; portanto, o seu alvo é o lanosterol-14-alfa-dimetilase, que é uma das espécies do citocromo p450, localizada no retículo endoplasmático. A diminuição do ergosterol mais a acumulação de esteróis metilados provoca uma alteração da membrana celular, que se torna mais permeável e vulnerável a danos.
Esta é a razão da toxicidade destes medicamentos, porque alguns dos azoles são menos selectivos e tendem a actuar sobre as enzimas hepáticas e causam hepatite fulminante, porque o mecanismo descrito compromete as funções dependentes da membrana, nas quais outras enzimas podem estar presentes. Assim, o transporte de nutrientes e a síntese de quitina são prejudicados, o que pode inibir o crescimento.
Azoles nem sempre são fungicidas; depende do seu tipo. Os imidazóis tendem a ser fungicidas em concentrações elevadas, mas é geralmente aceite que são fungicidas e o seu efeito é limitado, embora a situação tenha mudado com drogas mais recentes porque são mais potentes nas células. O facto de ser fungistatico está directamente relacionado com a capacidade de desenvolver resistência secundária, porque há sempre populações que não morrem com a droga e começam a gerar mecanismos para se defenderem contra esta droga.
Toxicidade apresenta uma diferença importante entre os dois grupos de azóis, devido à sua selectividade. Consequentemente, os imidazoles são mais tóxicos. Por exemplo, o cetoconazol inibe a síntese de testosterona em concentrações 100 vezes inferiores ao fluconazol; por sua vez, há menos actividade intrínseca dos triazóis contra os Candida albicans e são necessários MICs mais elevados; por conseguinte, muitos destes medicamentos, tais como o coagrimazol, são utilizados em formulações tópicas e podem ter um efeito fungicida no local da infecção.
Os efeitos adversos incluem náuseas, anomalias endócrinas (irregularidade menstrual, ginecomastia nos homens) e alterações nos testes hepáticos, o que é um dos efeitos mais comuns. O Ketoconazol é o mais tóxico. Quando estes medicamentos são administrados, os testes hepáticos devem ser monitorizados e a dose ajustada em doentes com danos hepáticos ou que estejam a usar outros medicamentos que possam interferir. Actualmente, recomenda-se a utilização de azóis menos tóxicos (triazóis).
O espectro de actividade é amplo, tanto em triazóis como em imidazóis, que actuam sobre leveduras, dermatófitos, Aspergillus e outros fungos filamentosos; o fluconazol é a excepção, uma vez que lhe falta actividade sobre algumas leveduras (C. krusei) e sobre Aspergillus, Sporotrix, Rhizopus e outros fungos filamentosos.
Por conseguinte, as espécies de Candida albicans devem ser sempre identificadas e quando ocorre uma infecção importante e invasiva, na qual apenas o género foi determinado, o tratamento não pode ser iniciado com um azole; idealmente, começar sempre com anfotericina B e depois, dependendo da espécie, mudar para um azole. Na ausência de testes de susceptibilidade, a decisão é tomada com base em dados locais ou publicados, embora na realidade a maioria dos Candida albicans sejam susceptíveis.
Outros fungos que mostram resistência intrínseca, ou primária, aos azóis são Scedosporium prolificans e algumas espécies de Candida albicans, que são fungos ambientais, mas que, pela mesma razão, estão em estreito contacto com tóxicos e estruturalmente mostram resistência intrínseca. Candida glabrata e Candida guillermondii são leveduras haplóides; isto é, têm um alelo para um gene, ao contrário de Candida albicans, que tem dois, de modo que se um dos alelos sofrer uma mutação, o outro pode assumir a função do mutante.
Resistência secundária não foi descoberta até aos anos 80, quando pacientes com candidíase mucocutânea crónica (devido à alteração da sua resposta imunitária inata) necessitaram de tratamento periódico com alguns fármacos azólicos, especialmente cetoconazol, e tiveram falhas terapêuticas e recaídas com o uso profilático prolongado de antifúngicos, como no caso da candidíase orofaríngea na SIDA.
Em 1986, foi descrito o primeiro caso de resistência secundária de Candida albicans ao ketoconazol, que era o medicamento mais utilizado na altura num doente com SIDA.
Como para os mecanismos de resistência, os códigos do gene ERG11 para a enzima alvo azole; portanto, um dos mecanismos de resistência do fungo é a mutação deste gene. Não são necessariamente mutações devidas ao contacto com o agente tóxico; sabe-se que certas populações de Candida albicans normalmente sofrem alterações, mas quando surge a pressão de selecção, estas alterações são aceleradas e surgem algumas populações que se defendem melhor contra o agente.
Outro mecanismo de defesa é modificar o alvo por alterações genéticas que aumentem a expressão genética ou amplifiquem o gene, ou realizar a conversão ou recombinação mitótica, que são mecanismos mais complexos, mas o importante é que podem aumentar a produção de lanosterol e competir com o antifúngico.
Também, em todas as células e bactérias eucarióticas existem transportadores ou bombas de efluxo, que são proteínas relativamente conservadas em todas as espécies e, quando confrontadas com certas toxinas, são capazes de expulsá-las para o exterior das células (por exemplo, existe uma bomba de expulsão de azole). Estas estruturas foram encontradas ao analisar células de pacientes que não responderam à quimioterapia e foi determinado que pertencem ao grupo dos transportadores de ABCT, codificados por genes CDR. O gene MDR1 codifica uma proteína da principal família de facilitadores, um tipo de bomba que ocorre na membrana celular.
Por exemplo, num paciente com SIDA, foram analisadas cepas de diferentes episódios de infecção e descobriu-se que, numa cepa que tinha uma certa concentração inibitória mínima, este parâmetro aumentou num segundo episódio, embora correspondesse à mesma população clonal. Analisaram então quais as mutações realmente relevantes neste caso e encontraram algumas mutações que só estavam presentes nas células que tinham a maior concentração inibitória mínima.
Para que as mutações causem resistência, têm de ocorrer em locais activos da enzima, ou seja, nos locais de ligação de antifúngicos; estas são as chamadas mutações quentes, que ocorrem onde o efeito ocorre in vitro. Por outro lado, para determinar se um gene era mais expresso, mediu-se o RNA mensageiro para o gene das bombas de efluxo ou ERG11, usando o RNA ribossómico, que está sempre a ser expresso numa quantidade constante, como controlo; verificou-se que, em algumas estirpes cuja concentração inibitória mínima foi aumentada, foi sintetizado mais RNA mensageiro para estes genes (ver Figura 4).
Figure 4. Manchas de RNA total de Candida albicans isolados analisados com sondas radiolabeladas específicas para ERG11, MDR1, CDR, CDR1 e CDR2 (Antimicrob Agents Chemoter, 2001; 45: 2676-2684).
No modelo de resistência secundária visto na Figura 5 observa-se que o fármaco azole entra na célula e um pequeno número de bombas exporta-o para fora, mas o fármaco consegue atingir a enzima alvo, 14 alfa colesterol demetilase. Quando a administração do tóxico é constante, o fungo sintetiza mais RNA mensageiro, exagera as bombas e começa a expelir o fármaco, mas também pode mutilar o ERG11; diferentes estudos tentaram ver qual é o mecanismo determinante, e não conseguiram observar a predominância de nenhum; em geral, todos estão a funcionar.
Figure 5. Modelo de resistência secundária ao azole (Clin Microbiol Rev, 1998; 11: 382-402).
O significado clínico da resistência ao azole reside no seguinte:
Em candidíase vaginal, estão a surgir espécies menos sensíveis, C. tropicalis e C. glabrata, das quais esta última é uma das mais importantes. Alguns estudos mostraram que a candidíase recorrente está associada a estirpes que têm estes mecanismos de resistência.
li>O uso profilático de fluconazol em pacientes neutropenicos e pacientes com pancreatite resultou num aumento das infecções por C. krusei não responsivas. Havia uma tendência para o uso profilático de fármacos azóicos na pancreatite devido ao risco de infecção, mas esta prática levou à selecção de estirpes resistentes.A candidíase superficial em doentes imunossuprimidos é crónica e, por conseguinte, tais doentes recebem tratamento prolongado, o que pode levar a estirpes resistentes de Candida albicans.
O aparecimento de resistência secundária forçou uma mudança nas indicações de profilaxia; o tratamento profilático é cada vez menos utilizado e é reservado apenas a doentes com risco muito elevado e com doses mais elevadas, para evitar que as populações de leveduras sobrevivam e mais tarde gerem resistência secundária e falha terapêutica.
O mecanismo de acção da griseofulvin é inibir a mitose fúngica com a produção de células multinucleadas. Este fármaco rompe o fuso mitótico e interage com microtúbulos polimerizados. É fungistático in vitro para várias espécies de dermatófitos. Não tem qualquer efeito sobre bactérias ou outros fungos, leveduras, Actinomyces ou Nocardia, mas em tempos foi em geral muito bem sucedido no tratamento da dermatomicose. Tem a desvantagem de ter de ser administrado por períodos muito longos, de seis meses a um ano. Além disso, como não é muito selectiva, a sua utilização deve ser controlada com hemograma. Por estas razões, está agora fora de uso.
Allylamines: terbinafina
Terbinafina actua inibindo a enzima squalene epoxidase na membrana da célula fúngica, pelo que também altera a síntese de esterol, levando à deficiência de esterol e à acumulação de squalene causando a morte da célula fúngica. É por isso que é tão eficaz na onicomicose; três meses de tratamento são suficientes para erradicar o fungo, o que não acontecia antes com outros antifúngicos.
Está demonstrado que a onicomicose tem efeitos psicológicos significativos nos doentes, que não ousam usar sandálias; é uma doença muito irritante. Em baixas concentrações, a terbinafina é fungicida contra dermatófitos, bolores e alguns fungos dimórficos; em leveduras, dependendo da espécie, pode ser fungicida ou fungistática. Na realidade, também tem sido utilizado noutras terapias.
Terbinafina é também relativamente selectiva e não tem tantos efeitos adversos como outros antifúngicos, porque a enzima que inibe não está relacionada com o sistema do citocromo p450. Não influencia o metabolismo hormonal e geralmente não é afectada por outros medicamentos do metabolismo hepático. Pode ser administrado por via oral ou tópica, mas em qualquer caso é necessário ajustar a dose em doentes com patologia hepática ou renal. É bem tolerada e permite que o tratamento da onicomicose seja encurtado.
h6>Equinocandinas
Em geral, a maioria dos medicamentos antimicrobianos vem do ambiente e são sintetizados por fungos e bactérias como as Streptomyces. Muitos fungos estão constantemente em contacto com estes agentes e por isso alguns são intrinsecamente resistentes. Em Espanha, foi encontrada uma equinocandina no ambiente: a caspofungina, que mudou a história da aspergilose invasiva em termos de mortalidade, diminuindo-a de 100% para 50%.
Esta droga actua na parede celular fúngica, inibe a síntese de glucanos, componentes que não se encontram na célula eucariótica humana, pelo que é relativamente selectiva. As principais indicações para a administração são a candidíase e a aspergilose invasiva; não são descritas muitas reacções adversas. Também no mercado estão disponíveis micafungina e anidulafungina.
Novos medicamentos que actuam sobre factores de alongamento na síntese do ARN e inibem a síntese de proteínas, tais como a sordarina; outros inibem a síntese de quitina, tais como a nikkomycin e alguns peptídeos antimicrobianos. medida que se avança na compreensão da estrutura do fungo, novos alvos podem ser selectivamente visados.
Em resumo, o objectivo desta apresentação foi incorporar o conceito do sítio de acção dos antifúngicos, porque é diferente do de outros antimicrobianos.