Precisamente nestas circunstâncias, a metade de maio, começaram a chegar em Roma os primeiros exemplares do Diálogo. Em um primeiro momento não aconteceu nada. Mas em dois meses, à metade de julho, se soube que o Papa estava muito enfadado com o livro, que tentava frear sua difusão, e que iria criar uma comissão para estudá-lo e julgá-lo.
A documentação que possuímos não permite saber o que provocou o enfado e a decisão do Papa. Galileu sempre atribuiu a isto a atuação de seus inimigos (que não eram poucos nem pouco influentes), que teriam informado ao Papa de modo tendencioso, predispondo-o contra. Por exemplo, além de denunciar que o livro defendia o copernicanismo, sendo contra o decreto de 1616, teriam colocado em relevo que um dos três personagens que intervinham no diálogo, Simplício, que sempre costumava perder, é quem expõe o argumento preferido do Papa sobre a onipotência de Deus e os limites de nossas explicações. Isto poderia parecer uma provocação deliberada, e parece que foi assim interpretado: vários anos depois, Galileu ainda enviava uma mensagem ao Papa, da sua vila de Arcetri, fazendo-se saber que jamais havia passado por sua mente tal coisa. Além disso, como foi assinalado, as circunstâncias pessoais de Urbano VIII naquele momento eram difíceis, e não podia tolerar que se publicasse um livro, que aparecida com a permissão eclesiástica de Roma e de Florença, em que se defendia uma teoria condenada pela Congregação do Índex em 1616 como falsa e contrária a Sagrada Escritura.
O Papa estabeleceu uma comissão para examinar as acusações contra Galileu e julgou que o assunto devia ser enviado ao Santo Ofício (ou Inquisição romana), de onde foi ordenado a Galileu, que vivia em Florença, que se apresentasse em Roma ante esse tribunal durante o mês de outubro de 1632. Depois de tentativas de prorrogação que duraram vários meses, em 30 de dezembro de 1632, o Papa com a Inquisição deu a conhecer que, se Galileu não se apresentasse em Roma, enviaria alguém que se certificasse de sua saúde e se visse que poderia ir a Roma, o levaria preso. O Papa aconselhou seriamente ao Grande Duque que se abstivesse de intervir, porque o assunto era sério. As autoridades toscanas decidiram aconselhar a Galileu que fosse a Roma. O Embaixador Noccolini, que conhecia bem ao Papa e falava com ele com freqüência, advertia que discutir com o Papa e contrariá-lo era o melhor caminho para arruinar a Galileu. Quando o Papa falava com Niccolini do problema causado por Galileu, em várias ocasiões encheu-se de cólera. Todos advertiram Galileu que o melhor era que fosse a Roma e que se mostrasse em todo o momento disposto a obedecer no que dissessem, porque se tomasse outra atitude as conseqüências seriam prejudiciais para ele.
Galileu chegou a Roma no domingo dia 13 de fevereiro de 1633, em um liteira facilitada pelo Grande Duque, depois de esperar na fronteira dos Estados Pontifícios por causa da peste que seguia em Florença. O embaixador de Toscana, Francesco Niccolini, se portou maravilhosamente com Galileu, intervindo continuamente em seu favor ante as autoridades de Roma, de acordo com as instruções do Grande Duque, Conseguiram que Galileu não estivesse na cárcere do Santo Ofício, como exigia a norma. Desde sua chegada à Roma até 12 de abril (dois meses), Galileu viveu no Palácio de Florença, onde se encontrava a embaixada de Toscana e a casa do embaixador. As autoridades o recomendaram que evitasse a vida social, de modo que não saía de casa, mas gozava de um tratamento excepcional por parte do embaixador e de sua esposa. Niccolini pedia ao Papa que o assunto fosse o mais breve possível, mas se alongava porque a Inquisição ainda estava deliberando sobre o modo de atuar. Como se descobriu nos arquivos do Santo Ofício o escrito de 1616 em que proibia Galileu de tratar de qualquer modo o copernicanismo, o processo se centrou completamente em uma única acusação: a desobediência desse preceito em 1616.
Galileu foi chamado a depor no Santo Ofício na terça-feira 12 de abril de 1633. Sua defesa pode nos parecer muito estranha: negou que, no Diálogo, defendesse o copernicanismo. Galileu sabia que o Santo Ofício pediu a opinião de três teólogos a respeito e que, em 17 de abril, os três informes concluiam sem lugar a dúvidas (como de fato assim o era) que Galileu, em seu livro, defendia o copernicanismo; neste caso, os teólogos tinham razão. Isto complicava a situação, pois um acusado que não reconhecia um erro comprovado devia ser tratado muito severamente pelo tribunal. Por outro lado, Galileu se defendeu mostrando uma carta que, a seu pedido, o cardeal Balarmino tinha escrito depois dos acontecimentos de 1616, para que pudesse se defender frente àqueles que o caluniavam; nesse escrito, Belarmino dava fé de que Galileu não teve que abjurar de nada e que simplesmente tinha sido notificada a proibição da Congregação do Índex. Mas isso podia ser interpretado também contra Galileu se fosse mostrado, como era o caso, que em seu livro argumentava a favor da doutrina condenada em 1616. O tribunal centrou-se em matizes da proibição feita a Galileu em 1616, que Galilleu dizia não se lembrar, porque tinha conservado o documento de Balarmino e aí não se incluiam esses matizes. Desafortunadamente, Balarmino havia morrido e não podia esclarecer a situação.
Estes dias Galileu seguia no Santo Ofício, ainda que tampouco tivesse estado na prisão. Por deferência com o Grande Duque de Toscana e frente a insistência o embaixador, Galileu foi instalado nas habitações do fiscal da Inquisição, traziam-lhe comidas da embaixada de Toscana, e podia passear. Esteve ali desde a terça-feira 12 de abril até o sábado 30 de abril: 17 dias completos.
Para desbloquear a situação, o Padre Comissário propôs aos Cardeais do Santo Ofício algo insólito: visitar Galileu em suas estalagens e tentar convencê-lo a reconhecer seu erro. Conseguiu depois de uma longa conversa com Galileu em 27 de abril. No dia seguinte, sem comunicar a ninguém mais, escreveu o que tinha feito e o resultado ao cardeal sobrinho do Papa, que encontrava-se nestes dias em Castelgandolfo com o Papa; através dessa carta se vê claramente que esta atuação estava aprovada pelo Papa: desse modo, o tribunal poderia salvar sua honra condenando a Galileu, e logo poderia usar clemência com Galileu deixando-o recluso em sua casa, tal como ( disse o Padre Comissário) sugeriu Vossa Excelência (o cardeal Francesco Barberini).