Francisco George Rodrigues de Andrade[1]
Para Burns & Bottino (1991), uma das mais importantes aplicações da clonagem molecular é a possibilidade de se ter fragmentos de DNA de todo o genoma de um organismo clonado em plasmídeos, o que constitui a chamada livraria gênica. Ela representa uma coleção de plasmídeos contendo fragmentos que é suficiente grande para garantir que todo o DNA genômico seja produzido pelo menos uma vez (fig. 02).
Depois das sucessivas reproduções das bactérias transformadas com os plasmídeos, os clones desses plasmídeos são então mantidos na população bacteriana. Algumas técnicas podem ser utilizadas para sondar a livraria para linhagens específicas de bactéria contendo um fragmento com determinada seqüência de interesse. Uma delas é o isolamento de mRNA transcrito de um tecido que esteja produzindo grande quantidades da proteína cujo gene está sendo procurado. Esse RNA é marcado radioativamente e, por capilaridade de Southern, é colocado para reagir com vários clones da livraria, em que se hibridiza apenas com os clones que possuem seqüências complementares de DNA.
Fig. 02 – Procedimento de clonagem "shotgem" e criação de uma livraria gênica[3].
Outra maneira de identificar clones que portam genes específicos é através da clonagem com cDNA. O mRNA transcrito do gene em questão pode ser isolado e feita uma cópia de DNA desse RNA com transcriptase reversa. O DNA cópia, ou simplesmente cDNA, pode ser inserido em um plasmídeo e clonado em uma bactéria. O cDNA clonado é então usado como sonda para identificar clones da livraria portadores desse gene específico. Por meio dessas e outras técnicas é hoje possível isolar e clonar qualquer gene cujo produto protéico seja conhecido (BURNS e BOTTINO, 1991).
Nas últimas décadas, a Tecnologia do DNA Recombinante tem sido aplicada em diversas áreas, em todas elas somando grandes benefícios. Segundo Pierce (2004), além de dar valiosas informações sobre os genes, sua estrutura, natureza e função, tem sido utilizada para produção de substâncias úteis (farmacêuticas ou não), cultivo de bactérias especializadas e melhoramento genético artificial de plantas e animais importantes sob ponto de vista econômico.
Sua aplicação também se estende à área médica, onde pode ser usada até mesmo para corrigir ates mesmo defeitos genéticos humanos. Uma das grandes novidades do uso da tecnologia é a sua utilização na perícia forense, onde tem sido um instrumento de investigação criminal e para identificação de restos humanos. Vejamos de forma mais detalhada sua efetiva aplicabilidade nas principais áreas consideradas de maior interesse humano (e comercial) no momento.
A Tecnologia do DNA Recombinante tem grande aplicação na fabricação de produtos farmacêuticos. Desde sua descoberta, já foram desenvolvidas diversas alternativas melhores e mais eficazes para o tratamento de doenças e distúrbios humanos. Um delas é a produção de insulina humana em escala comercial a partir de bactérias transformadas por plasmídeos portadores do gene humano codificador da referida proteína. Antes disso a insulina usada no tratamento de diabéticos era isolada do pâncreas de animais utilizados na pecuária de corte, mas não funcionava em todas as pessoas, pois algumas delas apresentavam incompatibilidade com a proteína exógena.
Outros fármacos que também são produzidos incluem o hormônio de crescimento humano (para crianças com problemas de crescimento), fatores de coagulação (para hemofílicos), ativador de plaminogênio (usado para dissolver coágulos sanguíneos em pacientes com ataques cardíacos).e atualmente estão sendo testadas drogas oligonucleotídicas para o tratamento de AIDS e câncer (PIERCE, 2004; BURNS e BOTTINO,1991)
Conforme Burns & Bottino (1991), uma das primeiras das técnicas do DNA Recombinante foi provavelmente a combinação de vários genes para metabolizar petróleo em um único plasmídeo e introduzi-lo em bactéria marinha, tornando este organismo capaz de limpar mancha de petróleo nos oceanos. Além disso, muitas bactérias podem ser modificadas por meio da engenharia genética de maneira que funcionem mais eficientemente em diversos processos industriais nos desempenham papel importante tais como a produção de etanol a partir de material vegetal, lixívia de minérios, tratamento de esgotos e detritos, dentre outros (PIERCE, 1994).
A engenharia genética tem sido utilizada no desenvolvimento de plantas e animais de grande valor comercial com características especiais. Sabendo que plantas infectadas com linhagens atenuadas de vírus são resistentes a infecções virulentas, os geneticistas, com base nesse conhecimento, já conseguiram criar resistência viral em plantas transferindo genes de proteínas virais para células vegetais. Como exemplo, um abóbora geneticamente modificada, chamada Freedom II, possui genes do mosaico 2 de melancia e o vírus do mosaico zucchini yellow que protege a abóbora de infecções virais.
Outra conquista da biotecnologia foi a possibilidade de manipular geneticamente a resistência a pestes em plantas para reduzir a dependência de pesticidas químicos. O gene codificador da toxina capaz de matar larvas de certas pragas de insetos foi isolado da bactéria Bacillus thuringiensis e transferido para o milho, tomate, batata e plantações de algodão. Assim, quando o gene é expresso produz a toxina inseticida, as larvas comem a planta morrem.
Mas outro problema freqüente na agricultura é o controle de ervas daninhas que competem com a planta do cultivo por água, luz solar e nutrientes. Em áreas de cultivo, os herbicidas são efetivos para matar as ervas, porém eles também podem danificar os cultivos das plantas juntamente com elas. Uma solução aplicável através da engenharia genética tem sido o desenvolvimento de resistência das plantas aos herbicidas. Genes que conferem resistência a herbicidas de amplo espectro foram transferidos para tomates, soja, algodão, semente oleaginosas e outros cultivos comercialmente importantes. Quando os campos contendo tais cultivos são pulverizados com herbicidas, as ervas daninhas morrem, mas as plantas geneticamente modificadas não.
Como se pode ver, o uso de cultivos geneticamente modificados apresenta vários benefícios potenciais. Além de aumentar a resistência a pestes, eles têm o potencial de reduzir o uso de substâncias prejudiciais ao meio ambiente e aumentar a produtividade, dando mais alimentos por hectare, o que reduz a quantidade de terra utilizada na agricultura.
No setor pecuário, as técnicas do DNA Recombinante têm sido utilizadas no melhoramento genético de animais para que produzam mais leite, para que desenvolvam maior massa corporal para produção de carne, ou mesmo para produção de carne com menos colesterol. Como exemplo, o gene para o hormônio de crescimento foi isolado de gado e clonado em Escherichia coli. Estas bactérias produzem grandes quantidades de hormônio do crescimento bovino, que administrado ao gado leiteiro para aumentar a produção de leite. Além disso, outros animais geneticamente modificados estão sendo desenvolvidos para levar genes codificadores de produtos farmacêuticos. Como exemplo, ovelhas transgênicas portadoras do gene humano que codifica o fator VIII de coagulação sangüínea produzem leite esta proteína que pode ser usado no tratamento de hemofílicos (PIERCE, 2004).
Terapia gênica é a transferência direta de genes em humanos para tratar uma doença, constituindo uma das aplicações mais recentes da técnica do DNA recombinante. Ela tornou-se uma realidade em 1990 quando W. Freench Anderson e seus colegas no U.S. National Institutes of Health (NIH) transferiram um gene funcional de adenosina desaminase para uma jovem com doença de imunodeficiência combinada grave, uma condição autossômica recessiva que produz prejuízo da função imunológica.
Atualmente milhares de pacientes já receberam terapia gênica, enquanto muitas tentativas clínicas estão em curso. A terapia gênica está sendo usada para tratar doenças genéticas, câncer, doença cardíaca e mesmo algumas doenças infecciosas tais como a AIDS. Todas essas tentativas dependem da habilidade de um gene introduzido produzir uma proteína terapêutica. Diferentes métodos para transferir genes para células humanas estão atualmente em desenvolvimento. Os vetores geralmente usados são os retrovírus geneticamente modificados, os adenovírus e os vírus adenoassociados, todos eles com suas vantagens e desvantagens.
Um método de transferência gênica é remover células (tais como glóbulos brancos) do corpo de uma paciente, adicionar vírus contendo genes recombinantes e então reintroduzir as células de volta ao corpo do paciente. Em outros casos, os vetores são infetados diretamente no corpo.
A terapia gênica feita hoje em dia trabalha apenas com células não-reprodutivas, as células somáticas. A correção de defeitos genéticas nessas células (terapia gênica somática) proporciona resultados positivos aos pacientes, porém não afeta os genes das gerações futuras. A terapia gênica que altera células reprodutivas (terapia gênica reprodutiva da linhagem germinativa) é tecnicamente possível, mas levante várias questões éticas significativas, uma vez que tem a propriedade de alterar o conjunto gênico das gerações futuras (PIERCE, 2004).
Os recentes avanços das técnicas de biologia molecular resultaram na capacidade de se determinar a presença de genes responsáveis por vários distúrbios humanos, habilidade essa conhecida como mapeamento gênico. O processo consiste na sondagem por meio de marcadores genéticos (seqüências de DNA radioativamente marcadas) que procuram em todo o genoma de uma célula uma seqüência alvo específica. Esta seqüência é um trecho de DNA imediatamente adjacente ao gene da doença em questão.
Ao se ligar à seqüência alvo, o marcador utilizado pode ser localizado pela sua marcação radioativa. Caso a seqüência alvo seja sempre herdada pelas vítimas da doença, então o gene defeituoso deve estar próximo dela. Um grupo de marcadores usado em mapeamento gênico são os polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP), em que a essência do enfoque é a mesma que a usada no Fingerprinting de DNA, que será discutida logo adiante (PIERCE, 2004; BURNS e BOTTINO,1991).
O fingerprinting de DNA consiste no uso de DNA para identificar uma pessoa, sendo um poderoso instrumento para testes de paternidade, investigações criminais e outras aplicações forenses. Seu funcionamento reside no desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante e permite um exame da seqüência única de DNA de um indivíduo. Numa aplicação típica, o fingerprinting de DNA pode ser usado para confirmar se um suspeito esteve presente na cena de um crime objeto de investigação.
A técnica funciona da seguinte forma: uma amostra de DNA do sangue, sêmen, cabelo ou outro tecido corpóreo é coletada do local do crime. Se a amostra for muito pequena, pode ser usada a PCR (reação em cadeia da polimerase) para amplificá-la, de modo a ter DNA suficiente para o teste. Amostras adicionais de DNA são coletadas de um ou mais suspeitos.
Cada amostra é cortada com uma ou mais enzimas e os fragmentos resultantes são separados por eletroforese em gel. Os fragmentos do gel são desnaturados e transferidos para o papel de nitrocelulose pela transferência de Southern. Uma ou mais sondas radioativas são hibridizadas com a nitrocelulose e detectadas por auto-radiografia. O padrão das bandas produzidas pelo DNA da amostra coletada no local do crime é comparado com os padrões produzidos com o DNA dos suspeitos (PIERCE, 2004).
Para determinação da paternidade, são comparados os fingerprintings da mãe, da criança e do suposto pai. Neste caso, metade das bandas da criança veio da mãe e a outra metade do pai. Todas as bandas de origem paterna no fingerprinting do DNA da criança devem se ajustar ao do suposto pai para que a identificação de paternidade seja positiva (BURNS e BOTTINO, 1991).
A TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE, SUAS IMPLICAÇÕES ÉTICAS E SEUS POSSÍVEIS IMPACTOS NA NATUREZA.
Apesar dos grandes avanços obtidos e dos inúmeros benefícios proporcionados, alguns obstáculos ainda precisam ser superados com a aplicação da tecnologia do DNA Recombinante em algumas áreas, tanto em experimentos que envolvem questões éticas, como em relação à falta de estudos conclusivos sobre os possíveis impactos negativos que possam causar ao homem e à natureza.
Uma implicação ética envolvendo o uso da biotecnologia é em relação aos testes genéticos para triagem de doenças para as quais ainda não existe cura ou tratamento, como o mal de Huntington, que é um distúrbio autossômico dominante que aparece na meia-idade, causando progressiva deterioração física e mental e depois a morte. Testes deste tipo poderão ser indevidamente utilizados para triagem de empregados quanto a distúrbios genéticos que possam apresentar e assim os empregadores podem não querer empregar ou promover alguém que possa desenvolver uma doença genética debilitante em um futuro próximo. Além do mais, ao saber que possui doenças desta natureza, muitas pessoas cometeram suicídio e outras tiveram que ser internadas por depressão.
A engenharia genética de produtos agrícolas é bastante controversa e já causou intensos debates nos governos de diversos países a respeito da liberação do cultivo dos tão falados transgênicos. Uma preocupação é que pode haver escape gênico de plantas geneticamente modificadas e conseqüente contaminação de plantas nativas, o que acarretar em desequilíbrio ecológico, mas a extensão e o efeito dessa transferência ainda são incertos.
Como exemplo, teme-se que a resistência a herbicidas construída em cultivospossa ser transferida para ervas daninhas, que por sua vez desenvolveriam resistência aos herbicidas hoje utilizados para seu controle. Outra preocupação abrange questões de saúde pública associadas à presença de produtos transgênicos em alimentos naturais, pois não se sabe quais são as conseqüências ao organismo humano que possam ocorrer a longo prazo. Alguns críticos defendem a rotulação de todos os alimentos geneticamente modificados que contenham DNA ou proteínas transgênicos. Tal rotulação já exigida em países da União Européia, mas não nos Estados Unidos (PIERCE, 2004; BURNS e BOTTINO,1991).
Como visto, a Tecnologia do DNA Recombinante tem proporcionado grandes benefícios, desde sua aplicação na agricultura à sua utilização em investigação forense. É um conhecimento ainda em construção. Embora já estejamos experimentando muitos desses benefícios, existe ainda um longo caminho a ser percorrido e muitos obstáculos a serem superados. São necessários estudos que estabeleçam os possíveis riscos que o uso dessa tecnologia no setor agropecuário, possa causar, a longo prazo, ao meio ambiente, à natureza e ao próprio homem. Mas vista sob o enfoque otimista, ela pode ser utilizadas para fins nobres, como melhorar a qualidade de vida das pessoas. O aumento da expectativa de vida através do tratamento mais barato e acessível de diabéticos é um exemplo disso.
A fascinante abrangência do uso desta tecnologia tem mudado a história da Ciência nos últimos 50 anos. A realização do projeto genoma e as técnicas de mapeamento genético são reflexos dessa grandiosidade. Com o progressivo desenvolvimento científico nesta área há a esperança de que se resolvam muitos dos problemas enfrentados pela humanidade atualmente como a erradicação da fome no planeta, através de melhores e mais eficazes técnicas de cultivos (transgênicos), e o tratamento de doenças que hoje são incuráveis, com a terapia gênica.
ARBIX, G. Biotecnologia sem Fronteiras. Disponível no site: <http://www.scielosp.org/scielo>. Acesso em: 16 ago. 2008.
BURNS, G. W. e BOTTINO, P. J. Genética. 6ª Edição. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan, 1991.
CANDEIAS, J. A. N. A engenharia genética. Rev. Saúde Pública , São Paulo, v. 25, n. 1, 1991 . Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo>. Acesso em: 16 ago. 2008.
GARCIA, E. S. e CHAMAS, C. I. Genética molecular: avanços e problemas. Disponível no site: <http://www.scielosp.org/scielo>. Acesso em: 16 ago. 2008.
GOMES, J. V. Engenharia Genética e Tecnologia do DNA Recombinante. Disponível no site: <http://www.libertaria.pro.br/tdna_recombinante_intro.htm>. Acesso em: 16 ago. 2008.
NASCIMENTO, A. A. C. et al. Tecnologia do DNA Recombinante. São Paulo: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (USP), 2003. Disponível no site:
< http://morpheus.fmrp.usp.br/td/download_apostila.php>. Acesso em: 16 ago. 2008.
PIERCE, A. B. Genética: Um Enfoque Conceitual. 5ª Edição. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan, 2004.
RODRIGUES, L. A. Z. Clonagem. Disponível no site: <http://www.ufv.br/dbg/BIO240/C003>. Acesso em: 16 ago. 2008.
SILVA, L. H. P. Ciências Biológicas e Biotecnologia: realidade e virtualidades. Disponível no site: <http://www.scielosp.org/scielo>. Acesso em: 16 ago. 2008.