Pcr - Reação da polimerase em cadeia
Wesley Carlos da Silva | comentários
Arquivado no curso de Ciências Biológicas na FAFICOP
REAÇÃO DA POLIMERASE EM CADEIA - PCR
É uma metodologia que se baseia na amplificação exponencial seletiva de uma quantidade reduzida de DNA de uma única célula, sem o uso de um organismo vivo.
Karys Mullis descreveu a PCR no final da década de 1980.
Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou este processo .
O Prêmio Nobel da Química foi atribuído à Karys Mullis pelo seu trabalho em 1993.
Atualmente, método PCR é usado habitualmente nos laboratórios de investigação médica e biológica para uma variedade de tarefas.
PARA QUE SERVE A PCR?
Mapeamento genético;
Clonagem de genes;
Testes de paternidade;
Criação de organismos transgênicos;
pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaços de cabelo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada em uma impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo método de fingerprinting.
Devem ser realizados com o maior cuidado para evitar contaminações que possam alterar o resultado.
Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem danificá-lo.(Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras aplicações).
Após a extração do DNA, adiciona-se uma mistura (conhecida como pré-mix) que contém:
Primers (ou iniciadores)
Solução Tampão.
Enzima Taq DNA polimerase
A Taq DNA polimerase, também denominada Taq polimerase ou apenas Taq, é uma DNA polimerase termoestável, utilizada na amplificação de fragmentos de DNA através da técnica de PCR. O seu nome é devido a ter sido identificada pela primeira vez na bactéria Thermus aquaticus, encontrada em fontes hidrotermais. A Taq polimerase suporta as elevadas temperaturas usadas em PCR, tendo uma semi-vida enzimática de 40 minutos (a 94ºC).
Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado).
O Ciclo da PCR, no termociclador, ocorre em três fases:
Fase de Desnaturação (94-96ºC)
Fase de Hibridização ou Anelamento (50-54ºC)
Fase de Extensão do DNA (72-76ºC)
Fase de Desnaturação
a temperatura é elevada de 94 a 96ºC por pouco tempo para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação) através da quebra das pontes de hidrogênio, dando origem a duas fitas simples de DNA sobre as quais a síntese posteriormente vai ocorrer
Fase de hibridização ou anelamento
a temperatura é reduzida entre 50 a 60ºC dependendo da quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers se anelem (pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento).
Fase de Extensão do DNA
a temperatura é elevada a 72ºC para que a enzima taq-polimerase possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado.
O ciclo é repetido,em torno de 30 vezes.
Duas cadeias são sintetizadas a partir de cada cadeia molde em cada ciclo completo de PCR, o que dá um crescimento EXPONENCIAL, havendo ao fim de n ciclos 2n vezes mais cópias do que no início.
O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente.
Capacidade de amplificar uma sequência precisa de DNA.
Simplicidade, rigor, elevada sensibilidade e especificidade.
Não é necessário isolar o DNA que se pretende amplificar, mesmo que se encontre misturado com o DNA de outras espécies, uma vez que os primers definirão a especificidade.
Técnica rápida, barata e segura.
Necessidade de conhecer a sequência de DNA a amplificar para sintetizar primers específicos.
Relativa facilidade com que ocorre a contaminação por DNA estranho.
Limitada extensão da sequência.
Incorporação errônea de bases durante a replicação.
VARIAÇÕES DA TÉCNICA BÁSICA DE PCR
Para melhorar a especificidade e a eficiência da reação, o segmento genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo seqüências localizadas fora dela, e utilizando-se este primeiro produto, segue-se à amplificação da real sequência-alvo.
Variação da PCR onde a reação de amplificação é iniciada a temperaturas elevadas.
Atividade da Taq DNA polimerase é inibida durante a preparação da reação
evitando a amplificação de produtos inespecíficos,aumentando a especificidade e melhorando o rendimento da reação.
PCR em tempo real compreende uma amplificação convencional de DNA, porém a detecção do resultado é feita a longo dos ciclos através de marcadores.
O risco de contaminação se torna menor.
Consiste na amplificação randômica do DNA, por um par de iniciadores de baixa especificidade para com o DNA molde, gerando assim anelamentos inespecíficos.
Essa técnica permite a tipagem do genoma de microorganismos, possibilitando sua comparação entre isolados de amostras clínicas.