O processo aterosclerótico em artérias de coelhos submetidos a dieta suplementada com gema de ovo: modelo experimental de baixo custo
http://dx.doi.org/10.1590/S1677-54492006000400003
Atherosclerotic lesion formation in rabbits fed on egg yolk-supplemented diet: an inexpensive experimental model
Rodrigo Gibin JaldinI; Hênio Arruda Falcão FilhoI; Júlio Lopes SequeiraII; Winston Bonetti YoshidaIII
IAcadêmicos de Medicina, Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB), Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, SP.
IIDoutor. Professor assistente, Disciplina de Patologia Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ), UNESP, Botucatu, SP.
IIIProfessor adjunto livre-docente, Disciplina de Cirurgia Vascular, Departamento de Cirurgia e Ortopedia, FMB, UNESP, Botucatu, SP.
OBJETIVO: Verificar a aterogenicidade do modelo de hipercolesterolemia por suplementação alimentar com gema de ovo em coelhos e seu uso como modelo de aterosclerose experimental de baixo custo.
MATERIAL E MÉTODO: Foram utilizados 14 coelhos divididos em dois grupos de sete animais: grupo controle (G1), que recebeu ração comercial ad libitum, e grupo tratado (G2), que foi alimentado com dieta suplementada com gema de ovo. Ambos os grupos foram alimentados por 90 dias. Foram realizadas dosagens do perfil lipídico dos animais nos momentos 0, 30, 60 e 90 dias. Ao término do período experimental, os animais foram submetidos a eutanásia e retirada da aorta e de seus ramos diretos para realização de estudo anatomopatológico.
RESULTADOS Apenas no grupo G2 houve aumento significativo nos níveis de colesterol total e frações. Ao exame macroscópico, foram observadas estrias gordurosas no arco aórtico e aorta abdominal e, à microscopia, acúmulos lipídicos discretos na íntima da aorta abdominal, renal, carótida, transição toracoabdominal e femoral. Portanto, a dieta com gema de ovo provocou aterosclerose leve no animal de experimentação e alterações equivalentes àquelas provocadas pelo colesterol purificado comercial quando fornecido em baixa dosagem. Assim sendo, a gema de ovo pode ser utilizada como fonte de colesterol alimentar de baixo custo em modelos de aterosclerose experimental.
Palavras-chave: Aterosclerose, colesterol, aorta, coelhos, dieta, dislipidemias.
OBJECTIVE: To observe whether an inexpensive dietary-induced hypercholesterolemia model in rabbits using a chow diet supplemented with egg yolks can be used to develop atherosclerotic lesions in animals.
MATERIAL AND METHOD: Fourteen rabbits were divided into two groups of seven animals: control group (G1), in which the rabbits were fed standard chow diet; and experimental group (G2), in which the rabbits were fed standard chow supplemented with egg yolks. Both groups were fed for 90 days. The lipid profile of all animals was measured at 0, 30, 60 and 90 days. At the end of the experimental period, euthanasia was performed and the aorta and its direct branches were excised to perform the histopathological examination.
RESULTS: There was a significant increase in plasma total cholesterol and cholesterol fractions only in group G2. The macroscopic examination showed fatty streaks in the aortic arch and abdominal aorta. Histological analyses revealed minimal lesions consisting of macrophages foam cells in the abdominal, renal, carotid and diaphragmatic aorta and femoral arteries. Therefore, the egg yolk diet developed mild atherosclerosis in rabbits and induced the same characteristics and extent of the lesions obtained by low-dosage purified cholesterol. Thus, egg yolk can be used as an inexpensive source of cholesterol in models of experimental atherosclerosis.
Key words: Atherosclerosis, cholesterol, aorta, rabbits, diet, dyslipidemias.
A aterosclerose é a principal causa de morte e incapacitação nos países ocidentais1,2. Consiste em processo crônico, progressivo e sistêmico, caracterizado por resposta inflamatória e fibroproliferativa da parede arterial, a qual é causada por agressões à superfície arterial2. O distúrbio da função do endotélio vascular é passo inicial para aterogênese3-5, sendo a hipercolesterolemia um dos seus principais desencadeantes6. A lesão aterosclerótica pode acometer vários e importantes territórios arteriais, sendo responsável por 95% das coronariopatias, 85% das claudicações intermitentes dos membros inferiores e 75% dos acidentes vasculares encefálicos7, além de ser um fator importante no desenvolvimento do aneurisma de aorta abdominal8.
Frente à importância dessa doença para o ser humano, houve, por parte dos pesquisadores, uma busca incessante de modelos experimentais que pudessem melhor caracterizá-la. Com a descoberta de que uma dieta rica em colesterol, por si só, era aterogênica, as atenções voltaram-se para modelos baseados em suplementação com colesterol purificado e perdeu-se o interesse em pesquisar dietas compostas por outros elementos indutores de aterosclerose experimental, como proteínas animal e vegetal9,10. Em levantamento sobre as características dos métodos empregados em aterosclerose experimental, verificou-se que o coelho é a espécie mais estudada e que a hipercolesterolemia alimentar é a via mais prática de sua indução11.
Tem-se induzido aterosclerose em coelhos através do fornecimento de ração contendo 1% de colesterol por aproximadamente 12 semanas12,13. Esse método permite não apenas a formação de lesões ateroscleróticas nas aortas torácica e abdominal12,13, como também se mostrou efetivo no estudo da aterosclerose carotídea em coelhos15. Bocan et al. forneceram a coelhos uma dieta composta por níveis variáveis de colesterol, mostrando que a extensão e o tipo de lesão aterosclerótica eram proporcionais à concentração de colesterol plasmático, o qual, por sua vez, aumentava de acordo com a porcentagem de colesterol na dieta15. Entretanto, o colesterol purificado disponível no mercado tem alto custo, o que limita seu amplo emprego no estudo da aterosclerose experimental (Tabela 1).
As lesões ateroscleróticas ficam aparentemente mais evidentes associando-se colesterol, gorduras saturadas e proteínas animais, produtos estes presentes e abundantes na gema de ovo. Em estudos prévios realizados em nosso laboratório, verificou-se significativo aumento na concentração de colesterol plasmático de coelhos alimentados com ração suplementada com gema de ovo16. A sobrecarga de colesterol através da gema de ovo, embora seja um modelo pioneiro de aterosclerose experimental, não teve avaliação sistemática da distribuição e da intensidade do comprometimento vascular. Por conseguinte, propõe-se avaliar se a dieta em questão induz aterosclerose de maneira eficaz nas principais artérias do animal de experimentação (aorta, carótidas, renais, ilíacas comuns e femorais) e se pode ser usada como modelo experimental de baixo custo.
O protocolo experimental deste estudo seguiu os princípios éticos na experimentação animal adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal e foi aprovado pela comissão de ética em experimentação animal da Faculdade de Medicina de Botucatu-UNESP. O experimento foi realizado em 14 coelhos machos da raça Norfolk. Os animais foram recebidos no biotério de coelhos dos laboratórios experimentais com peso aproximado de 1.200 g e idade aproximada de 80 dias. Para fins de adaptação, ganho de peso e alcance da idade ideal para o início do tratamento, os animais foram mantidos em gaiolas individuais com água ad libitum e ração comercial (Nutricoelho, Purina®) durante 14 dias, à temperatura e luz ambientes, além de o biotério ser equipado com sistema de ventilação e exaustão. Após esse período, os coelhos foram randomizados em dois grupos de sete animais: grupos G1 (controle) e G2 (com dieta suplementada com gema de ovo). Foram, então, alojados em gaiolas individuais numeradas e tatuados na orelha esquerda com as respectivas numerações das gaiolas, minimizando, assim, a possibilidade de extravio.
Preparo da ração
Os animais do grupo G2 foram alimentados com dieta contendo uma gema de ovo acrescida de 13,5 ml de óleo de milho para cada 150 g de ração comercial para coelhos (Nutricoelho, Purina®) por 3 meses. Esta dieta era preparada semanalmente, na quantia de 10 kg por vez, no dietário dos laboratórios experimentais da Faculdade de Medicina de Botucatu. A ração comercial era moída em triturador e então misturada com as gemas de ovo, água e óleo de milho em equipamento batedor-misturador (Marconi®). A massa era submetida a peletização em picador de carne (CAF®, modelo 10, ciclagem 60 Hz) e secada em estufa de secagem e esterilização (Fanem®, modelo 320-SE) a 55 °C por 24 h. A ração foi conservada em equipamento de refrigeração até o consumo. Considerou-se que cada gema de ovo continha 225 mg de colesterol, 1,8 g de gorduras saturadas, 2,16 g de ácidos graxos monoinsaturados e 0,72 g de ácidos graxos poliinsaturados17. O Grupo G1 recebeu ração habitual de mesma marca e lote pelo mesmo período de tempo, e a água foi oferecida ad libitum.
Controle de peso e dosagens bioquímicas
Os animais foram pesados mensalmente a partir do dia anterior ao início do tratamento. Após jejum de 14 h18, coletou-se sangue venoso da veia marginal da orelha direita em frascos de 6 ml com anticoagulante para a dosagem do perfil lipídico. Foram coletadas amostras no tempo zero e ao final de cada mês de tratamento. Terminada a coleta, as amostras eram centrifugadas a 3.000 rpm por 10 min, e as dosagens dos níveis plasmáticos de colesterol total, HDL-colesterol (HDL-c) e triglicérides eram realizadas no Laboratório de Bioquímica da Seção de Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu-UNESP pelo método de química seca em equipamento autoanalyzer (Johnson & Johnson®, modelo Vitros 950). Os valores da fração LDL-colesterol (LDL-c) foram obtidos por meio da fórmula de Friedewald18.
Os coelhos foram anestesiados com o etil-1 metil-butil-barbiturato de sódio (Nembutal®) por via intravenosa. Foram então tricotomizados desde a região cervical anterior até a eminência púbica e heparinizados (400 mg/kg, IV). Através de um acesso venoso, foram submetidos a eutanásia por excesso do mesmo anestésico.
As aortas torácica e abdominal foram retiradas após toracotomia mediana, laparotomia mediana e dissecção cuidadosa das artérias renais e da bifurcação ilíaca da aorta. Foi realizada a dissecção do pescoço, para a exposição das artérias carótidas em seu trajeto cervical, e retirada dessas artérias desde sua emergência na aorta. Dissecou-se, ainda, o trígono femoral, isolando-se as artérias femorais. Após a exérese das artérias em estudo, a gordura adventicial foi delicadamente removida. A aorta foi dividida nos seguintes segmentos: arco, aorta torácica, aorta abdominal e aorto-ilíaco. Esses segmentos, juntamente com as artérias carótidas e femorais, foram abertos em sua parede posterior, analisados em sua superfície luminal e então fixados em solução de formol tamponado a 10% por 24 h. Posteriormente, foram corados em solução de Sudan IV (solução de Hexheimer), padronizada por Holman et al.19. Após a coloração, as superfícies luminais das artérias foram novamente inspecionadas, a olho nu e em microscópio para anatomia (D.F. Vasconcellos S.A®., São Paulo) em aumento de 10 x. Verificou-se a presença (áreas sudanofílicas) ou ausência (áreas não sudanofílicas) de placas ateroscleróticas, bem como a distribuição destas ao longo da luz vascular. Os rins, fígado e coração foram pesados em balança analítica (Chyo®, JS-110; máx: 110 g/d = 0,0001 g) e seccionados longitudinalmente para análise estrutural. O coração foi pesado após a abertura de suas câmaras para que se considerasse apenas sua estrutura, livre de sangue ou coágulos.
Amostras das artérias e dos órgãos em estudo foram colocadas em frascos contendo solução de formol 10%, para processamento em autotécnico (Leica®, TP102) e montagem em blocos de parafina. Realizaram-se cortes seriados de 5 µm em micrótomo (Leica®, RM 2155) e coloração por hematoxilina-eosina (HE) e picrossírius. Com a HE, obteve-se a morfologia geral da parede arterial e estrutural dos órgãos. O picrossírius visou a identificar espessamento fibroso da íntima. Foram retiradas amostras de todas as artérias em estudo, independente da formação de placas, e verificaram-se as alterações gerais da parede vascular (processo inflamatório, integridade das lâminas elásticas, proporção de colágeno e fibras elásticas) e alterações por camadas da parede. As avaliações foram feitas por patologista sem conhecimento prévio dos grupos.
Classificação das lesões encontradas
As lesões ateroscleróticas encontradas no estudo macroscópico foram graduadas visualmente usando uma escala de 0-320,21, segundo a quantidade de áreas sudanofílicas presentes na luz arterial (0 = ausência; 1 = discreta, restrita aos óstios; 2 = moderada; 3 = intensa). Somadas as informações macro e microscópicas, utilizou-se a classificação padronizada pelo comitê de lesões vasculares da American Heart Association22.
As comparações entre os grupos foram feitas utilizando o teste de Mann-Whitney. Os dados foram expressos em mediana com os quartis 25 e 75, e os resultados foram considerados estatisticamente significantes se P < 0,05.
Variáveis corporais dos animais
O grupo que recebeu dieta suplementada teve peso corporal maior que o grupo controle (P < 0,001) ao final de 90 dias de seguimento. Com exceção do coração (P < 0,05), os demais órgãos estudados não apresentaram diferença significativa quanto aos seus pesos (Tabela 2)
Os níveis plasmáticos de colesterol total, LDL-c, HDL-c e triglicérides estão descritos na Figura 1. Houve aumento nas concentrações de colesterol total e frações no grupo que recebeu dieta suplementada com gema de ovo, porém não se observou diferença nos níveis de triglicérides entre os grupos.
Não se observou qualquer alteração macroscópica nos segmentos arteriais estudados dos animais do grupo controle, antes ou depois da histoquímica para gordura. Por outro lado, as artérias dos animais do grupo G2, depois da coloração, apresentaram áreas sudanofílicas correspondentes a lesões do tipo estrias gordurosas predominantemente na superfície luminal anterior do arco aórtico (Figura 2) e aorta abdominal (Figura 3 e Tabela 3).
Não foram encontradas alterações arquiteturais nas artérias de animais do grupo controle. Nos animais que receberam gema de ovo, as alterações observadas concentravam-se na camada íntima e correspondiam a acúmulos lipídicos discretos no interior de células espumosas ou formando vacúolos subendoteliais (Figura 4). Essa alteração estava presente nas amostras de aorta abdominal (3/7), renais (2/7), carótidas (2/7), transição toracoabdominal (2/7) e femorais (2/7). Em apenas um animal, foi observado o espessamento de íntima em grau moderado, na transição toracoabdominal da aorta.
Os modelos experimentais são importantes ferramentas para o estudo da aterosclerose e deram origem à maior parte dos conhecimentos atuais sobre sua etiologia, fisiopatologia e tratamento. A primeira investigação nutricional em aterosclerose coube a Ignatowski, entre 1908 e 1909. Acreditando que um metabólito tóxico da proteína animal levaria à aterosclerose, esse autor alimentou coelhos adultos com carne e coelhos recém-desmamados com leite e gema de ovo, obtendo aterosclerose em ambos. Stuckey, entre 1910 e 1911, observou que a gema de ovo era aterogênica e, em 1912, concluiu que havia um componente não-protéico na gema que funcionava como agente aterogênico. Wesselkin, em 1913, testou se o colesterol ou a lecitina poderiam ser o agente aterogênico do experimento de Stuckey. Obteve aterosclerose apenas nos coelhos alimentados com gema de ovo e concluiu que o colesterol era o fator aterogênico presente na gema23.
Os modelos baseados na hipercolesterolemia induzida por via alimentar são os mais práticos e difundidos para o estudo da aterosclerose experimental11. O papel deste tipo de dieta na aterogênese é bem determinado. Lesões precursoras podem ser percebidas em apenas 1 semana de exposição à dieta hipercolesterolêmica24. Aikawa et al. mostraram que os lipídeos da dieta, provocando hipercolesterolemia, eram responsáveis por estresse oxidativo e lesão endotelial na aorta de coelhos, de forma que apenas a redução lipídica na dieta reduzia os mecanismos lesivos à superfície arterial25.
Procurou-se estudar os efeitos aterogênicos da dieta em estudo da forma mais natural possível, ou seja, adotaram-se a via alimentar ad libitum e a gema de ovo como fonte de colesterol. Houve significativo aumento do peso dos animais que receberam ração suplementada. Houve também aumento nas concentrações plasmáticas de colesterol total e frações no grupo que recebeu dieta suplementada com gema de ovo em relação aos controles. Este aumento ocorreu de maneira expressiva nos primeiros 30 dias de oferta de ração suplementada, sendo que, nos momentos subseqüentes, houve queda inicial seguida de estabilização.
Os níveis de colesterol obtidos com dieta suplementada com 0,15% de colesterol proveniente da gema de ovo foram inferiores aos atingidos com a dieta padrão contendo 1% de colesterol purificado12,13,15. Por outro lado, houve comportamento temporal e valores de colesterolemia equivalentes aos de coelhos que receberam entre 0,1 e 0,25% de colesterol purificado por 60 dias15. Ao comparar o aumento da colesterolemia entre as fontes de aterosclerose experimental, a gema de ovo foi menos efetiva que o ácido linoléico conjugado21. Também elevou menos a colesterolemia de coelhos que a caseína somada ao óleo de soja parcialmente hidrogenado por 6 meses9,10, porém o menor tempo de exposição e o custo da fonte de material aterogênico respaldam o uso da gema de ovo. Por outro lado, a hiper-homocisteinemia é também efetivo indutor de aterosclerose, mas sem interferir com o perfil lipídico do animal de experimentação26.
Os níveis plasmáticos de LDL-c e HDL-c ao final do experimento foram muito próximos daquele atingidos pelo fornecimento de 0,1% de colesterol purificado por 60 dias15, denotando certa equivalência nos resultados obtidos. A gema de ovo parece ter sido ineficaz na elevação dos triglicérides plasmáticos, tal qual a dieta com colesterol purificado a 1%13. A caseína somada ao óleo de soja parcialmente hidrogenado por 6 meses9 e o ácido linoléico conjugado21 parecem ser mais efetivos na elevação desse parâmetro.
Destaque deve ser feito quanto à formação de lesões macroscópicas utilizando apenas a via alimentar de indução, reafirmando que a hipercolesterolemia é suficiente para a aterogênese. A maioria dos estudos que utilizam modelos experimentais em aterosclerose associa via alimentar e lesão mecânica da superfície endotelial15,27,28, fazendo com que a hipercolesterolemia seja o intensificador do processo, e não seu promotor. Isso porque, mesmo na ausência de hipercolesterolemia, há formação de lesões ateroscleróticas nas artérias de-endotelializadas15.
Bocan et al.15 observaram que animais alimentados com dieta a 0,1 e 0,25% de colesterol purificado desenvolveram lesões mínimas nas artérias que não sofreram denudação, e apenas níveis maiores que 0,5% de colesterol alimentar provocaram estrias gordurosas, isoladas ou confluentes. Entretanto, o método proposto neste estudo evidenciou que é possível desenvolver tanto lesões microscópicas mínimas quanto lesão do tipo estria gordurosa isolada em artérias com superfície endotelial preservada, mesmo com baixa proporção alimentar de colesterol. As lesões provocadas por este modelo experimental, por suas características macro e microscópicas, podem ser classificadas como tipos I e II da American Heart Association22, ou seja, são compatíveis com as alterações iniciais do processo aterosclerótico.
Este estudo foi proposto no intuito de viabilizar o amplo uso da aterosclerose experimental em investigações fisiopatológicas e terapêuticas. A dieta testada mostrou-se efetiva na indução de hipercolesterolemia no animal de experimentação, porém provocou apenas alterações iniciais do processo aterosclerótico. Por outro lado, pode-se considerar que a gema de ovo como fonte de colesterol alimentar a 0,15% provocou alterações arteriais e nos níveis plasmáticos de colesterol equivalentes àquelas provocadas pelo colesterol purificado comercial quando fornecido em baixa dosagem. Dessa forma, abrem-se perspectivas para testar se maior oferta de gema de ovo diária desenvolveria lesões arteriais e colesterolemia mais expressivas, dados o baixo custo e a acessibilidade a essa fonte alimentar de colesterol. Em conclusão, a dieta com gema de ovo provocou aterosclerose leve no animal de experimentação e alterações equivalentes àquelas provocadas pelo colesterol purificado comercial quando fornecido em baixa dosagem. Portanto, a gema de ovo pode ser utilizada como fonte de colesterol alimentar de baixo custo em modelos de aterosclerose experimental.
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