Os animais foram anestesiados com Uretana (Urethanechloride, 0,3 ml/100 g, i.p., Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo, EUA), o coração foi rapidamente removido e colocado em solução de Krebs-Henseleit, previamente oxigenada com 100% de oxigênio e aquecida a 30ºC. O músculo papilar foi dissecado do ventrículo esquerdo, e suas extremidades tendínea e parietal foram presas por anéis de aço inoxidável ao transdutor de força. Posteriormente, o músculo papilar foi suspenso verticalmente na cuba de vidro, contendo a solução de Krebs-Henseleit (mM), composta por: 132 NaCl; 4,69 KCl; 1,5 CaCl; 1,16 MgSO4; 1,18 KH2PO4; 5,50 glicose e 20 HEPES, tamponado a pH 7,4.16 O anel da extremidade inferior do músculo foi conectado ao gancho fixo na cuba de vidro, e o anel superior foi ligado, via um fio de aço inoxidável, ao transdutor de força isométrica (model FT03E, Grass Instrument, Quincy, MA). O transdutor de força estava conectado ao micromanipulador que permitia o ajuste de comprimento do músculo. Paralelamente ao músculo papilar, estavam dois eletrodos de platina acoplados ao estimulador elétrico, que liberavam estímulos em onda quadrada de 5ms de duração, em frequência de 0,2Hz,16,17 e voltagem aproximadamente 20% maior que o mínimo necessário para provocar resposta mecânica máxima do músculo. Após 60 minutos em condição isotônica com pré-carga baixa (0,4 g) para estabilização da preparação, o músculo foi carregado para contrair isometricamente por 15 minutos e, em seguida, estirado até atingir o ápice da curva comprimento-tensão desenvolvida (Lmáx: comprimento diastólico do músculo associado com tensão isométrica desenvolvida máxima). Os testes foram realizados em Lmáx e a tensão isométrica foi avaliada pela força normalizada para a área da secção transversa (AST) do músculo (g.mm-2). A AST do músculo papilar foi calculada pela razão entre a sua massa (mg) e seu comprimento em repouso, verificado em Lmáx (mm), assumindo uniformidade cilíndrica e uma gravidade específica de 1,04.
Os parâmetros de função contrátil analisados foram: tensão desenvolvida (TD; g.mm-2), tensão de repouso (TR; g.mm-2), variação temporal da força na contração (+dT/dt; g.mm-2.s-1), variação temporal da força no relaxamento (-dT/dt; g.mm-2.s-1), tempo para atingir o pico da tensão desenvolvida (TPT; ms) e tempo para tensão desenvolvida decrescer 50% de seu valor máximo, como parâmetro temporal de capacidade de relaxamento (TR50%; ms). O comportamento mecânico dos músculos papilares foi avaliado nas seguintes condições: 1) Basal; 2) Relação Comprimento-Tensão (variação do comprimento muscular de 92% a 100% do Lmáx); 3) Potenciação Pós-Pausa (utilizando 10, 20, 30, 60 e 120 segundos de pausa); e 4) Resposta contrátil ao cálcio (Ca2+) (aumento da concentração de Ca2+ de 1,5 mM para 2,5 mM na solução nutridora).
As análises foram realizadas com auxílio do programa Statistica® (Stat Soft, Inc, versão 12.0). Para a análise descritiva dos dados, calcularam-se as medidas de tendência central. A normalidade dos dados foi verificada pelo teste de Shapiro Wilk. Os dados com distribuição paramétrica foram analisados pela análise de variância (ANOVA) one-way ou two-way, com teste post hoc de Duncan, enquanto os dados não paramétricos foram padronizados com Z-score e posteriormente avaliados pela ANOVA. Nas manobras/condições experimentais de relação comprimento-tensão e potenciação pós-pausa, foi realizada a regressão linear para comparação entre os slopes e a área abaixo da curva, respectivamente. Posteriormente, os valores relativos aos slopes e a área abaixo da curva de cada grupo foram analisados pela ANOVA, conforme descrito acima. A significância estatística adotada foi de α = 0,05.