P.R.L. Soares1
A.L.C. Andrade1
M.R.S. Cadena1
P.G. Cadena* 1
Palavras-chave: comportamento animal; etograma; complexo de inclusão; sobrevivência
Keywords: animal behavior; ethogram; inclusion complex; mortality
Devido às características químicas dos hormônios esteroides como a hidrofobicidade, a indústria farmacêutica vem utilizando substâncias químicas para superar essa limitação, sendo possível complexar esses hormônios a ciclodextrinas (CDs) (Oishi et al., 2008). CDs são oligossacarídeos cíclicos, constituídos por um número variável de unidades de glicose, unidas por ligações glicosídicas α-(1,4). São estruturas troncocônica e se caracterizam por possuírem cavidade de natureza apolar, que contrasta com o exterior hidrofílico (Del Valle, 2004; Brewster e Loftsson, 2007). Devido a isso, podem formar complexos de inclusão hospedando moléculas hidrofóbicas em seu interior. São utilizadas com o objetivo de melhorar as características farmacocinéticas de substâncias, aumentando a biodisponibilidade, a estabilidade e diminuindo a volatilidade (Brewster e Loftsson, 2007). Seus efeitos tóxicos são conhecidos em humanos devido a sua ampla utilização na farmacêutica, na indústria alimentícia e de cosméticos, onde apresenta nefrotoxicidade por via parenteral, mas não foram relatados efeitos tóxicos por via oral (Del Valle, 2004; Brewster e Loftsson, 2007). Porém, os efeitos desses complexos de inclusão como poluente ambiental e seus efeitos em animais são pouco descritos na literatura. Adicionalmente, hormônios esteroides, quando complexados a CDs, podem se apresentar como disruptores endócrinos (DEs). Os DEs são persistentes e passíveis de sofrerem biomagnificação, principalmente em animais dulciaquícolas (Wu et al., 2016), que são sensíveis a baixas concentrações em níveis subletais. Nesses casos, foram observadas principalmente alterações comportamentais e reprodutivas, que podem levar a desequilíbrios populacionais em ambientes aquáticos (Santos et al., 2016; Denslow e Sepúlveda, 2008). Isso destaca a necessidade de maiores estudos dos efeitos de toxicidade decorrente da disposição desses complexos de inclusão entre CDs e fármacos na biota aquática.
Contaminantes naturais e sintéticos presentes em concentrações na faixa de pg/L a ng/L apresentam um risco à saúde dos ecossistemas, pois existe uma carência na avaliação dos seus efeitos fisiológicos, no conhecimento de suas fontes, no comportamento no ambiente e nos níveis tóxicos de concentração (Fernandes et al., 2011). Entre esses contaminantes, os DEs têm despertado atenção científica por causa de sua distribuição generalizada e de seus efeitos potencialmente nocivos para a saúde (Wu et al., 2016). Estes são capazes de mimetizar os efeitos moleculares de hormônios endógenos ou de causar desequilíbrio hormonal, por interferirem na sua síntese, na secreção, no transporte, no metabolismo e na excreção, consequentemente, na reprodução, no desenvolvimento e no comportamento de espécies animais (Denslow e Sepúlveda, 2008). Estrógenos como o 17β-estradiol (E2) regulam e sustentam o desenvolvimento sexual feminino e suas funções reprodutivas, pois deles depende a formação dos ovários nas fêmeas (Guiguen et al., 2010). Esse hormônio possui conformações reconhecidas pelos receptores e, portanto, é considerado responsável pela maioria dos efeitos disruptores, quando dispostos nos efluentes, como redução do tamanho das gônadas, feminização de peixes machos e problemas no desenvolvimento do sistema imune (Tilton et al., 2005; McLachlan et al., 2006; Seemann et al., 2015).
Anteriormente, Santos et al. (2016) haviam estudado os efeitos de DEs presentes em contraceptivos orais combinados sobre o comportamento agressivo de Betta splendes. Hoje, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos tóxicos do 17β-estradiol livre e complexado à ciclodextrina sobre o comportamento e a fisiologia de tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus). Trata-se de um peixe de ampla aceitação pelo mercado consumidor, com produção mundial em 2014 de quase quatro milhões de toneladas (Species..., 2016), o qual apresenta agressividade natural, sendo assim um bom modelo animal para avaliar alterações comportamentais provenientes da exposição ao 17β-estradiol livre e complexado à CDs.
Para a construção do etograma e análise comportamental comparativa, 14 animais, sendo sete alevinos (9,7±1,1g, 3,8±0,2cm) e sete juvenis (38,0±1,3g, 14,3±0,6cm) foram separados e alocados em aquários de 85L cada. O etograma foi construído pelo método ad libitum (Altmann, 1974) por 30 dias, a uma distância preestabelecida (2,5m), de modo a não influenciar na exibição comportamental. Foram utilizados indivíduos em estágios de desenvolvimentos distintos (alevinos e juvenis) para que houvesse a possibilidade de comparação do padrão comportamental em diferentes estágios de desenvolvimento. A coleta dos dados comportamentais com o etograma foi realizada pelo método de scan sampling (Altmann, 1974), por 30 minutos, com um minuto de observação e um minuto de intervalo.
Para os testes de exposição química, os animais foram submetidos a concentrações dos hormônios em teste de toxicidade crônica, em sistema semiestático por 90 dias, e divididos em três grupos de peixes juvenis alocados em aquários de 85L, com sete animais cada, sendo quatro machos e três fêmeas por grupo, identificados mediante sexagem manual, por meio do exame da papila urogenital (Ávila e Romagosa, 2005). Os grupos foram: controle (grupo C) sem adição do hormônio, 17β-estradiol (grupo E) na concentração de 10ng/L, com adição de solução aquosa do complexo de inclusão β-ciclodextrina - 17β-estradiol (β-CD:E2), na proporção de 1:1 em mol/L, mantendo-se a concentração de E2 em 10ng/L (grupo BE). A técnica de coprecipitação (Del Valle, 2004; Oishi et al., 2008) foi utilizada para formação dos complexos de inclusão entre a β-CD e o hormônio E2 em meio aquoso. A β-CD foi primeiramente solubilizada em água, e o E2 dissolvido em etanol (10%), com posterior evaporação do álcool. A solução de E2 foi adicionada sob agitação à solução de CD para permitir a complexação deles. Os complexos de inclusão formados foram armazenados sob refrigeração (4°C) para posterior uso. Houve renovação completa da água dos aquários semanalmente e reposição das concentrações hormonais utilizadas.
Durante os testes de exposição química com os animais, foi mensurado o comportamento animal conforme descrito anteriormente. Os dados comportamentais foram agrupados a cada 30 dias, somando três períodos de exposições distintos (zero a 30, 30 a 60 e 60 a 90 dias). O consumo médio de ração foi avaliado diariamente conforme descrito por Zuanon et al. (2009). Após a determinação do tempo para a saciedade, os restos de ração foram removidos dos aquários para evitar contaminação. Para a avaliação do ganho de peso, foi mesurada a diferença entre os pesos inicial e final dos animais. A mortalidade foi verificada diariamente. Os resultados foram expressos na forma de média e desvio-padrão e comparados por análise de variância simples (One Way ANOVA). Quando o resultado foi significativo, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey, utilizando-se o software Origin Pro Academic 2015 (Origin Lab. Northampton, MA USA). As diferenças foram consideradas significativas quando P<0,05.
Entre os dados obtidos a partir do método ad libitum (Altmann, 1974) para a elaboração do etograma, foram identificados 24 comportamentos, agrupados nas categorias: Alimentação, Locomoção, Social e Resposta ao estresse, que podem ser observados na Tab. 1.
Os comportamentos observados em O. niloticus são característicos do gênero, devido à semelhança aos observados em outros ciclídeos, como Geophagus surinamensis (Acará-corró), Astronotus ocellatos (Apaiari) e Pterophyllum scalare (Acará-bandeira) (Carvalho, 2009). Por ser uma espécie territorialista, O. niloticus apresentou uma hierarquia de dominância e submissão estabelecida por confrontos entre os indivíduos. Tais comportamentos agonísticos foram decorrentes de agrupamentos sociais, nos quais foi observada uma hierarquia de dominância e submissão em que os animais maiores geralmente são dominantes, e os menores submissos (Merighe et al., 2004). Em relação à comparação dos comportamentos exibidos entre alevinos e juvenis, com base no etograma desenvolvido, foi observada uma maior frequência de comportamentos ativos nos alevinos, o que pode estar relacionado à maior atividade locomotora destes. Larvas e alevinos de peixes diurnos (como a tilápia) apresentam maior atividade metabólica nessas fases de desenvolvimento (Vera et al., 2009), o que poderia justificar essa diferença observada no presente estudo.
Em relação aos estudos de exposição química, os parâmetros abióticos foram mensurados para comprovar que as modificações nos parâmetros biológicos analisados foram decorrentes da exposição ao estradiol livre (E2) e complexado à ciclodextrina (β-CD:E2) e não decorrentes de variações nos parâmetros físico-químicos da água. Esses resultados obtidos, de acordo com Kubitza (2000), estão na faixa ideal de conforto para a espécie. Diante disto, as alterações comportamentais exibidas pelos animais estão relacionadas à exposição química aos hormônios. Os resultados produzidos no presente estudo demonstraram que o E2 livre assim como a β-CD:E2 interferiram no comportamento animal, alterando a exibição dos comportamentos ao longo do tempo nos animais juvenis de O. niloticus. Em relação ao efeito do E2 complexado à β-CD, foi observado um aumento na exibição de comportamentos agressivos (Tab. 2) no grupo BE comparado aos grupos E e C, o que pode provocar maior estresse entre os indivíduos. Essas respostas biológicas ao estresse, provocadas por poluentes, podem ser utilizadas para identificar sinais iniciais de danos aos peixes (Lupi et al., 2007). De acordo com Brewster e Loftsson (2007), as CDs apresentam baixa toxicidade, mas, devido ao fato de alterarem as propriedades físico-químicas das moléculas complexadas, podem também alterar-lhes a toxicidade. Isso foi observado no presente trabalho, pois houve diferenças significativas na exibição dos comportamentos (P<0,05) entre os grupos BE e E. Em peixes, existem poucos estudos sobre os efeitos tóxicos de moléculas complexadas à CDs. Estudo utilizando a hidropropil-β-ciclodextrina não complexada foi realizado em Danio rerio. O desenvolvimento de larvas foi afetado com concentrações acima de 1% (p/v), e testes de toxicidade com peixes adultos não foram relatados (Maes et al., 2012). É possível que a complexação do 17β-estradiol com a ciclodextrina tenha causado a maior absorção do hormônio pelos animais, devido a sua capacidade de manter moléculas hidrofóbicas mais biodisponíveis, como visto no trabalho de Paula et al. (2007), no qual, em estudos de solubilidade, a complexação de β-CD a 17β-estradiol aumentou a solubilidade aquosa deste, assim como a retenção do fármaco na pele. O autor atribuiu esse efeito à maior biodisponibilidade do hormônio quando complexado. Observou-se, ao longo do experimento (90 dias), devido ao aumento de exibição dos comportamentos agressivos, um aumento de lesões em alguns indivíduos do grupo BE. No último intervalo de tempo analisado (60-90 dias), também foi observado que os peixes não respondiam mais aos comportamentos agressivos, como visto pela redução significativa (P>0,05) no ato Afastar (Tab. 2C) dos animais submissos. O comportamento de Nadar rápido para os indivíduos dominantes do grupo BE apresentou maior frequência (Tab. 2), o que pode estar relacionado ao fato de os outros animais não reagirem ou não serem considerados uma ameaça.
Já no grupo exposto ao 17β-estradiol (E2) livre, houve diminuição da agressividade (zero - 60 dias), conforme visto em alguns comportamentos, como: Perseguição, Fuga e Ataque frontal (Tab. 2), com frequências de exibição inferiores ao grupo controle. Os peixes do grupo E apresentaram o ato de Ficar parado superior se comparado aos demais grupos. Esse mesmo efeito já foi observado em estudo anterior do presente grupo (Santos et al., 2016), em que ocorreu diminuição dos comportamentos agressivos, assim como aumento da inatividade em peixes machos de Betta splendens expostos ao E2 . Esses resultados corroboram os de Shappell et al. (2010), que também observaram que o E2, diminuiu a agressividade de Pimephales promelas. Adicionalmente, durante as observações, notou-se o escurecimento corporal dos peixes submissos em todos os grupos experimentais, o que pode estar relacionado a situações de estresse (Volpato et al., 1989). Os mesmos autores relataram ainda outros fatores, como a posse prévia do território e a condição hierárquica anterior, como possíveis explicações para o escurecimento corporal. Esses dois fenômenos também foram observados no presente estudo.
Quanto aos parâmetros zootécnicos, a exposição hormonal não alterou o ganho de peso e o comprimento dos animais. Foi observado que, durante todo o experimento, os animais se alimentaram normalmente, não havendo diferença estatística (P<0,05) entre os grupos experimentais. Em relação à sobrevivência dos animais, observou-se uma maior taxa de mortalidade no grupo controle. Raju et al. (2008) sugeriram que o E2 pode apresentar propriedades imunoprotetoras, o que poderia justificar o observado no presente trabalho. Ainda, a menor taxa de mortalidade foi observada no grupo β-CD:E2. A complexação com a ciclodextrina aumenta a estabilidade (Del Valle, 2004; Brewster e Loftsson, 2007) da molécula hospedeira, o que poderia ter potencializado o efeito imunoprotetor do estradiol.
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