Coloração - Bacteriana
Dariorow
Dario Porto | comentários
Arquivado no curso de Biologia na UNIMONTES
TORTORA, Gerard. Microbiologia. 6ed. Guanabara Koogan.
Os microorganismos são quase todos incolores na observação ao microscópio óptico, assim necessita-se preparar a amostra para ser observada, uma das formas mais comuns é por coloração, de modo que o corante vai ressaltar determinadas estruturas celulares.
O Esfregaço
Para serem corados os microorganismos precisam ser primeiramente fixados em lâminas, estes então são mortos e fixados, dando uma duração significativa para a amostra.
Deve-se formar um filme delgado com a amostra sobre a lâmina, que se denomina esfregaço, que pode ser secado ao ar livre ou em lamparina ou bico de Bunsen. Quando se utiliza o calor para secar a lâmina deve observar que o lado do esfregaço deve ficar para cima, ou seja, com contato indireto com a chama. Desta forma a amostra já está fixada.
Coloração Positiva e Negativa
Quando o cromóforo a parte carrega da molécula do corante se une a determinadas estruturas celulares tornando assim colorida. Comumente a corantes básicos (íon positivo é que dará cor) tendem a corar as estruturas negativas, pois em pH 7 as estruturas bacterianas tendem a ficar carregadas negativamente. Assim a coloração da célula se dá de forma direta. Contudo em corantes ácidos (é o íon negativo que dará cor) não há atração com as estruturas negativas que repelirá o corante, e assim haverá a coloração do fundo. Esta técnica de coloração do fundo é valida para analisar forma geral da célula, tamanho e cápsula pois a célula se torna bem visível contra um fundo escuro.
Violeta de Genciana;
Safranina;
Nigrosina;
Tinta nanquim;
O objetivo da coloração simples é destacar todo o organismo, assim ficando nítida a forma celular e estruturas básicas. Faz um esfregaço, aplica-se a solução corante por determinado tempo, lava-se em água corrente e depois se seca suavemente a lâmina. É comum colocar um mordente na solução, para intensificar a coloração.
"Coloração Primária" Recobrir um esfregaço por calor por um corante básico púrpura (violeta genciana);
Lava-se o esfregaço e recobri-lo com um mordente (Iodo). Pois todas as bactérias (Gram positivas e negativas se coram em violeta escuro ou púrpura);
Lava-se a lâmina com álcool-acetona (Agente descolorante);
Lava-se o álcool e cora-se com safranina, o contra-corante (corante básico vermelho)
Lave-se o esfregaço e seque-o;
As gram-negativas são perdem ao corante púrpura após a lavagem com álcool e são sensíveis a safranina. E as gram-positivas não perdem essa coloração e assim não são afetadas pela safranina. Isto ocorre porque as bactérias gram-positivas possuem uma parede mais espessa de peptideoglicano do que as gram-negativas que possuem uma camada de lipopolisacarídeos. Assim o complexo violeta-iodo (CV-I) é formado dentro da parede celular, pois o violeta de genciana não pode mais sair de lá, devido o seu tamanho. Contudo já nas bactérias gram-negativas por haver a camanda de lipopolisacarídeos, este é rompido pela lavem com álcool e assim o CV-I é removido da camada delgada de peptideoglicana, permanecendo assim incolor. Por isso é que se faz necessário o contra-corante de safranina.
O método de coloração Gram é útil para a clínica médica, pois as bactérias gram-positivas tendem a serem mais susceptíveis a antibióticos como penicilinas e cefalosporina. Já as bactérias gram-negativas tendem a ser mais resistente a antibióticos, pois não conseguem atravessar devido a sua camada de lipopolisacarídeos.
Coloração Alcool-Ácido Resistente (Ziehl-Neelsen)
Este tipo de coloração é usado principalmente pelos microbiologistas para corar bactérias do gênero Mycobacterium e identificar cepas patogênicas de Nocardia.
O corante carbolfucsina é aplicado no esfregaço e aquecido lentamente por vários minutos, resfria-se a lâmina e lavada em água, depois tratado com um descolorante (álcool-ácido). Assim as bactérias não álcool-ácida resistentes são descoradas, permanecendo só as coradas de vermelho. Após, aplica-se azul de metileno que corará as bactérias não álcool-ácido resistentes em azul.
Coloração Negativa para Cápsulas
Alguns microorganismos possuem um revestimento gelatinoso denominado cápsula que se pode determinar a virulência do organismo.
Esta coloração é mais difícil, pois a materiais capsulares são solúveis em água, que podem ser desalojados ou removidos durante a lavagem. Assim, pode-se fazer uma solução coloidal fina de partículas coradas (tinta nanquim ou nigrosina) para fornecer um fundo escuro e depois corar por coloração simples, por safranina, por exemplo. Devido a composição química, a cápsula nega a maioria dos corantes biológicos, como a safranina, e o uso do nanquim faz uma coloração negativa, evidenciando o contraste entre o fundo, circundante, e a cápsula.
Coloração para Endosporos
Em condições ambientais adversas, forma-se dentro da célula, uma estrutura resistente, dormente, o Endosporo (Esporo). Os esporos não podem ser corados por métodos comuns, de forma que é usado a técnica de Schaeffer – Fulton, onde o verde malaquita é aplicada em esfregaço por calor e aquecido por 5mim (aproximadamente), lava-se por 30 segundos e em seguida aplica-se a safranina para corar as partes da célula que não é endósporo.
Coloração para Flagelos
Cora-se por carbolfuscina para aumentar os flagelos até uma proporção desejada, pois o numero e o arranjo de flagelos servem para o auxilio em diagnósticos.