6. Microscopia Eletrônica.
Células gigantes multinucleadas Infiltração tumoral entre axônios Microvilos na membrana externa
'Fagocitose' de axônios e debris de mielina pelas células neoplásicas Alterações axonais regressivas Gotículas lipídicas
Vacúolos maiores Filamentos intermediários Mitoses
Considerações gerais. Esta amostra de tumor, colhida do material enviado a fresco para esfregaço e congelação, e fixada imediatamente em líquido de Karnovsky, revela detalhes da intimidade do glioblastoma multiforme e suas relações com os tecidos invadidos, principalmente os axônios mielínicos. Chamam a atenção prolongamentos digitiformes da membrana externa, e restos de mielina no citoplasma das células neoplásicas, sugerindo agressividade e até atividade fagocitária contra elementos do tecido nervoso. Havia vacúolos citoplasmáticos uniformes, pequenos, parecendo conter lípide, outros maiores e irregulares, que poderiam ser dilatações do retículo endoplasmático ou fagolisossomos. As células eram ricas em filamentos intermediários, retículo endoplasmático liso e rugoso, ribossomos livres e lisossomos, mas em proporções muito variáveis célula a célula, enfatizando a notável diversidade entre os elementos neoplásicos. Foram observadas duas figuras de mitose.
Aspecto panorâmico. Nestas imagens panorâmicas observam-se células neoplásicas com citoplasma abundante, rico em organelas e vacúolos, núcleos grandes, irregulares e/ou múltiplos, introduzindo prolongamentos citoplasmáticos entre os axônios mielínicos da substância branca. Os contornos celulares freqüentemente são difíceis de definir, devido à finura da membrana plasmática e escassez de espaço extracelular, o que não permite melhor individualização das células. Os axônios destacam-se pela eletrodensidade das baínhas de mielina. Muitos são anormais, pelos efeitos compressivos do tumor ou por artefatos de fixação ou manipulação.
As células tumorais variavam amplamente em forma, volume e quantidade de núcleos. Ao lado, célula multinucleada.
Comparação com células gigantes multinucleadas em HE e azul de toluidina (à direita, em cortes de 1 mm em Araldite). Notar, nesta última, a relação entre a célula neoplásica e os axônios mielínicos, que aparecem como pequenas argolas azuis. Clique para mais imagens de azul de toluidina, e para imunohistoquímica para neurofilamento, que também demonstra axônios no tecido infiltrado pelo tumor.
Esta célula tumoral
é favorável à observação por estar em uma área frouxa (com edema extracelular), o que permite individualizá-la. Notar contorno irregular com prolongamentos citoplasmáticos, riqueza de organelas e nucléolo proeminente.
Núcleos irregulares.
Muitos apresentam contorno caprichoso, com projeções ou subunidades periféricas ('satélites') presas apenas por um filete de cromatina.
Notar também gotículas lipídicas.
Infiltração neoplásica entre axônios. As células neoplásicas insinuam-se entre os axônios mielínicos e se misturam com eles, havendo imagens sugestivas de englobamento de axônios e/ou debris de mielina pelas mesmas.
Células do glioblastoma avançam entre os axônios mielínicos da substância branca.
Os axônios destacam-se pelas baínhas de mielina eletrodensas.
A célula ao lado é volumosa, com citoplasma abundante e pequenos vacúolos regulares que, presumivelmente, continham lípide. O núcleo é parcialmente visível à esquerda.
Correlação entre invasão da substância branca em imunohistoquímica para neurofilamento e em microscopia eletrônica. Neurofilamento marca axônios e os mostra comprimidos e divulsionados pelas células neoplásicas. Os mesmos axônios destacam-se em microscopia eletrônica pela eletrodensidade das baínhas de mielina. Para mais imagens da IH para neurofilamento, clique.
Microvilos na membrana plasmática.
Uma feição proeminente, observada em muitas células, foram projeções digitiformes da membrana plasmática, lembrando microvilos ou pequenos pseudópodos.
Projeções digitiformes.
Apesar das projeções citoplasmáticas lembrarem pseudópodos de macrófagos, a abundânica de filamentos intermediários, outras organelas e os núcleos demonstram a natureza glial e neoplásica destas células.
Microvilos são observados em células ependimárias e em ependimomas. Contudo, a pesquisa de EMA e AE1AE3 resultou negativa no presente caso.
Infiltração entre axônios utiliza os microvilos.
As células neoplásicas invadem entre os axônios da substância branca, aparentemente divulsionando-os pela introdução dos microvilos da membrana externa. Ao lado, há axônios na periferia de uma célula e capturados entre duas células neoplásicas vizinhas.
Comparação com uma imagem de azul de toluidina, mostrando axônios mielínicos (em azul escuro) divulsionados pelas células neoplásicas. Para mais imagens deste preparado, clique.
'Fagocitose' de axônios pelas células neoplásicas.
Outra feição notável deste tumor foi o encontro de perfis de axônios ou restos de baínhas de mielina no citoplasma de células incontestavelmente neoplásicas, sugerindo que as células tumorais englobam axônios ou debris à medida que crescem.
entre corte de 1 mm corado por azul de toluidina e microscopia eletrônica de uma célula neoplásica contendo no citoplasma um axônio degenerado, restrito à baínha de mielina.
Neste campo, é possível comparar três axônios, um à esquerda, aparentemente envolto pelo citoplasma da célula tumoral, e dois à direita, livres no interstício. Os da direita têm aspecto normal, observando-se microtúbulos e neurofilamentos no axoplasma, bem como mitocôndrias, indicando estrutura viável. No da esquerda, o espaço delimitado pela baínha de mielina é opticamente vazio, sem filamentos ou organelas, sugerindo degeneração (morte) do axônio. Abaixo, mais exemplos de axônios degenerados ou debris de mielina no citoplasma de células neoplásicas.
Alterações axonais regressivas.
Alguns axônios no interstício (não 'fagocitados' como os do grupo acima) mostravam alterações estruturais à custa de acúmulo de organelas, especialmente mitocôndrias, corpúsculos eletrodensos (lisossomos?) e material filamentoso no axoplasma.
É possível que a compressão dos axônios pelas células neoplásicas cause alterações do fluxo axonal, levando a tais anormalidades. A mielina dos mesmos axônios estava intacta.
Estes pequenos vacúolos eletrolucentes, de contorno quase sempre circular, diâmetro regular e não delimitados por membrana, foram interpretados como contendo lípides. Contudo, não foram realizadas colorações especiais para lípides para testar esta suposição.
Células com gotículas citoplasmáticas em HE e em azul de toluidina. As gotículas são tão diminutas que sua visualização em microscopia óptica é precária. É mais fácil vê-las no preparado de Araldite com azul de Toluidina devido à menor espessura do corte (1 mm) em comparação com a parafina (5 mm). Para mais imagens de HE e azul de toluidina, clique.
Aqui são vistas em um prolongamento celular, em meio a feixes compactos de filamentos intermediários, que podem corresponder a GFAP, vimentina ou ambos.
Vacúolos maiores.
Além das diminutas gotículas que parecem conter lípides, várias células apresentavam vacúolos grandes e de variados tamanhos no citoplasma, redondos ou ovalados, limitados por membrana única, cuja natureza ficou obscura. Alguns parecem cisternas dilatadas do retículo endoplasmático liso.
Esta célula multinucleada apresenta um prolongamento com vários compartimentos eletrolucentes (opticamente vazios) que não parecem conter lípide, lembrando cisternas do retículo endoplasmático liso.
Comparação com células vacuoladas em HE e em cortes de Araldite de 1 mm corados por azul de toluidina. Em microscopia óptica fica evidente a grande variação de tamanho dos vacúolos, os maiores chegando a superar o diâmetro de um núcleo. Para mais imagens de HE e AT, clique.
Vacúolos grandes têm freqüentemente conteúdo floculento ou granuloso, sugerindo natureza proteica, ou com vesículas. (Comparar com os de lípide, que são menores e opticamente vazios, pois o lípide dissolve-se durante a desidratação em acetona para ME).
A organela fortemente eletrodensa e limitada por membrana na margem superior deste vacúolo pode ser um lisossomo.
Dilatações do retículo endoplasmático.
Nesta célula, o citoplasma com grande quantidade de filamentos intermediários mostra dilatações do retículo endoplasmático liso na forma de canais tortuosos e de diâmetro irregular. Alguns parecem estar em relação com os vacúolos eletrolucentes, sugerindo que alguns vacúolos pudessem representar dependências do RE.
Como as células tumorais têm natureza astrocitária, é compreensível a riqueza em filamentos do citoesqueleto, não raro densamente arranjados em feixes que se entrecruzam. Com imunohistoquímica para GFAP e vimentina, praticamente todas as células são positivas, exceto raras.
Filamentos intermediários têm espessura de cerca de 11 nm e aparecem delicados e eletrodensos, arranjados em feixes que cruzam o citoplasma em todas direções.
Diferenças na expressão de filamentos intermediários.
Ao lado temos parte do citoplasma de duas células vizinhas em contato. O prolongamento ao centro é riquíssimo em filamentos intermediários, mas estes são escassos na célula que o envolve. Células do mesmo tumor podem expressar ou não proteínas, com ampla variação célula a célula. Este aspecto já havia sido mostrado em GFAP e vimentina, onde a maioria das células é fortemente positiva, mas há outras pobres ou negativas para estas proteínas.
Para mais imagens com GFAP e vimentina, clique .
Como a atividade mitótica do tumor era alta, foi possível identificar em microscopia eletrônica duas células em divisão.
Ao lado, correlação entre mitoses em azul de toluidina e em ME (não necessariamente a mesma célula). O citoplasma é amplo e de limites bem definidos (em ME notam-se microvilos). Os cromossomos estão a caminho dos polos celulares (portanto, em anáfase).
Na mitose, a membrana nuclear (carioteca) dissolve-se e os cromossomos condensados viajam através do citoplasma guiados por microtúbulos. Estes são melhor vistos na outra mitose abaixo, em que os cromossomos ainda se encontram em metáfase (no equador da célula).
Outra mitose (metáfase).
Esta célula mostra no citoplasma, além dos cromossomos condensados (estruturas eletrodensas no meio), extenso complemento de organelas citoplasmáticas, como canais do retículo endoplasmático, mitocôndrias e vacúolos. A superfície celular está decorada por numerosos microvilos.
São estruturas rígidas com cerca de 20 nm de diâmetro e comprimento indefinido, formados por polimerização da proteína tubulina. Como são os elementos fundamentais do fuso mitótico, inserem-se nos cromossomos condensados e os arrastam para os polos da célula.
A abundância de citoplasma, riqueza de organelas e microvilos na superfície dão idéia da intensa atividade metabólica destas células tumorais.