Maria da Glória da Costa Carvalho & Marcelo Soares da Mota e Silva
A) Extração de DNA:
1. O material biológico (e.g. obtido por biópsia) é incubado, por duas horas, a 56°C, em presença de 500 μl de tampão de lise celular (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; EDTA 10mM; NaCl 10mM; SDS 2%) e 15 μl de proteinase K, a 10 mg/ml, em tubo tipo eppendorf de 1,5 ml.
2. Após a incubação, são acrescentados 500 μl de Fenol:Clorofórmio:Álcool Isoamílico (25:24:1) e o tubo agitado, por um minuto, seguido de centrifugação a 8.000 rpm, durante 5 minutos.
3. Em seguida, a fase aquosa é retirada (fase superior), transferida para outro tubo e acrescentados 15 μl de NaCl 5M e 1ml de etanol a 95%. Mistura-se o conteúdo do tubo por inversão.
4. O material é, então, incubado a -20°C, por 12 horas e, posteriormente, centrifugado, por 20 minutos, a 8.000 rpm.
5. Após a centrifugação, o sobrenadante é aspirado e o tubo mantido aberto para secagem à temperatura ambiente.
6. O sedimento de DNA é solubilizado em volume entre 15 a 200 μl de água Milli-Q (dependendo do tamanho do sedimento), determinada a sua concentração e estocado a -20°C, para uso posterior.
B) Teste da funcionalidade do DNA por reação em cadeia pela polimerase (PCR):
1) Para verificar se o DNA extraído é funcional, amplifica-se qualquer região de um gene constitutivo. Por exemplo, pode-se usar amplificação do exon 5 do gene codificante da proteína p53. Para isto, utilizam-se:
a) 0,05 μg de DNA;
b) 0,2 μM de iniciadores:
[direto (D): 5'GCAACCAGCCCTGTCGTGTCTCCA-3' e reverso (R): 5'GGAATTCTGTTCACTTGTGCCCTGACTTTCAAC-3'];
c) 0,2 mM de cada dNTP;
d) 1,5 mM MgCl2;
e) 1,0 unidade de Taq polimerase e
f) 5 μl de 10X tampão da enzima para um volume de reação de 50 μl.
2) As condições de amplificação são:
a) desnaturação a 94ºC, por 5 minutos,
b) seguidos de 30 ciclos de 95ºC, por 1 minuto; 64ºC por 1 minuto; 72ºC por 1 minuto; extensão final de 72ºC, durante 5 minutos.
3) Resultado: O tamanho do produto amplificado é de 274 pb (pares de base), que pode ser determinado por eletroforese em gel de poliacrilamida.
TRIS = Tris(hidroximetil)aminometano.
HCl = Ácido clorídrico.
EDTA = Ácido etilenodiaminotetraacético.
NaCl = Cloreto de sódio.
SDS = Dodecilsulfato de sódio.
Proteinase K = Endopeptidase K, protease sérica, cliva ligações peptídicas. Capaz de digerir a queratina (keratin) natural, daí o nome proteinase K.
DNA = Ácido desoxirribonucléico.
Água Milli-Q = Água deionizada, ultrapurificada em um sistema Milli-Q.
dNTP = Desoxirribonucleotídeo trifosfato.
MgCl2 = Cloreto de magnésio.
Taq polimerase = Taq DNA polimerase ((identificada pela primeira vez na bactéria Thermus aquaticus, extremófila, por suportar altas temperaturas).
Princípios e Finalidades da Reação em Cadeia da Polimerase:
A dupla hélice de DNA é constituída por duas fitas complementares, antiparalelas (uma fita com sentido 5'-3' e a outra com sentido 3'-5'). Cada fita é uma cadeia de desoxirribonucleotídeos (desoxirribonucleotídeo = desoxirribose unida a uma base nitrogenada e a um grupo fosfato) unidos por ligações fosfodiéster, onde cada carbono 5' de uma desoxirribose é unido ao carbono 3' da desoxirribose seguinte por um grupo fosfato. As fitas complementares unem-se por pontes de hidrogênio entre as suas bases nitrogenadas, purinas (Adenina e Guanina) e pirimidinas (Timina e Citosina): A-T; G-C.
A reação em cadeia pela polimerase permite fazer milhões de cópias de uma sequência específica de DNA, ou seja, em quantidade suficiente para que possa ser facilmente detectada. É utilizada para demonstrar a presença ou a ausência de um dado gene, detectar mutação, amplificação ou rearranjos de um gene, assim como o DNA de um vírus ou bactéria ou outro micro-organismo, podendo-se citar, como exemplos, as detecções de:
1. Rearranjos de genes de Receptor de Células T (TCR) para determinar a clonalidade de proliferações linfocitárias T ou B.
2. Transcritos quiméricos devido à translocação cromossomial em várias neoplasias primárias ou remanescentes.
3. Mutação pontual em proto-oncogenes, transformando-os em oncogenes, ou em genes supressores de tumores, inativando-os, em várias neoplasias.
4. Amplificações de genes, como MYCN no neuroblastoma e HER2 em carcinoma mamário.
5. Instabilidade microssatélite em pacientes com síndrome do câncer colorretal não-polipose hereditário.
6. Perda da heterozigose, significando a perda de um alelo de gene supressor de tumor.
7. DNA de bactérias (Mycobacterium tuberculosis, etc), vírus [vírus do papiloma humano (HPV) no carcinoma epidermoide, vírus Epstein Barr (EBV) em linfomas, vírus Herpes Humano tipo 8 (HHV8) no sarcoma de Kaposi, etc)] e de outros micro-organismos.
8. Células tumorais circulantes no sangue pela identificação de RNAm (ácido ribonucléico mensageiro) de tireoglobulina no carcinoma de tireoide, da tirosinase em melanoma, do PSA (antígeno prostático específico) no adenocarcinoma de próstata, etc.
9. Erro de pareamento do DNA pela análise de microssatélites.
10. Hipermetilação do DNA, resultando na inativação transcricional.
A reação em cadeia da polimerase, automatizada, depende da ação de uma Taq DNA polimerase, na presença de uma mistura de dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), que faz as cópias de uma fita de DNA, usando-se um fragmento de DNA complementar como molde iniciador, em vários ciclos, com diferentes temperaturas (promovendo-se repetidas separações das fitas de DNA), de modo que, em cada ciclo, dobram-se as cópias da sequência de DNA alvo. A análise do produto amplificado é feita em eletroforese em gel ou capilar.
Esta técnica também amplifica o RNA (ácido ribonucléico), permitindo a análise da expressão de um gene. Nesta, o RNA é primeiramente extraído e convertido em DNA complementar de fita dupla (DNAc), por meio de uma transcriptase reversa retroviral, fazendo-se, a seguir, as cópias do DNAc pela PCR.
Tecidos fixados em formalina e parafinados podem ser usados para a análise do RNA e do DNA, assim como os cortes de tecidos provenientes de microdissecções. Nestes casos o sucesso da técnica da PCR é garantido se os fragmentos de DNA iniciadores tiverem menos do que 300 pares de bases, considerando-se que a qualidade do DNA ou do RNA é subótima, devido às quebras pela fixação em formol.
A Reação em Cadeia da Polimerase é muito sensível à contaminação da amostra, especialmente por DNA amplificado previamente. Assim, a manipulação das amostras deve ser feita em sala diferente da onde se faz a análise dos produtos amplificados; deve-se usar um conjunto de equipamentos separado para cada atividade; mudar de luvas antes de entrar na sala de PCR, utilizar pipetas, ponteiras e pipetadores específicos, "sem DNA," na elaboração das soluções, estabelecer controles negativos rigorosos e ter extremo cuidado na extração do DNA.
Reid, A.H. - Polymerase Chain Reaction. In: Mikel, U.V. - Armed Forces Institute of Pathology. Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology. Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994, pp. 77-110.
Rosai, J. (ed.) - Chapter 3 - Special Techniques in Surgical Pathology. In: Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. Vol. 1 e 2. 10th ed. Edinburg, Mosby/Elsevier, 2011, pp. 70-71.