DPK-104S Fast-n-Easy Plasmid Mini-Prep Kit - S Pack 50 preparações
DPK-104L Fast-n-Easy Plasmid Mini-Prep Kit - L Pack 250 preparações
Isolamento de DNA baseado em adsorção em coluna de sílica
Fast-n-Easy Plasmid Mini-Prep Kit foi desenvolvido para o isolamento de DNA plasmidal ou cosmidial com elevada pureza a partir de células bacterianas, para subsequente amplificação, sequenciamento, digestão por enzimas de restrição ou transformações. O procedimento de dois passos, lise alcalina e ligação em coluna fornecem uma maneira rápida, fácil e eficiente de isolar DNA sem danos e perdas significativas do produto. O sistema permite a eluição em pequena volume de tampão com baixo teor salino. Etapas de extração por fenol-clorofórmio ou precipitação por etanol não são requeridas. O Lysis Buffer contém um indicador de pH integrado que facilita o controle do pH ótimo para ligação. A ligação eficiente do DNA na coluna ocorre com pH 7.5, o que é indicado pela mudança de cor do indicador para a coloração amarelo brilhante. O kit pode ser usado tanto em microcentrífugas quanto em sistema de bomba vácuo. Ele permite a extração de plasmídeos de DNA de até 10 kb e rendimentos de até 20 µg por preparação. O DNA eluído de altíssima qualidade está pronto para uma variedades de aplicações subsequentes.
Lysis Buffer com indicador de pH
Neutralization Buffer (antes de usar, adicionar RNAse A e armazenar à 4 °C)
RNase A (armazenar à 20 °C)
96-99% Etanol
Buffer DPK-104XS
10 preps DPK-104S
50 preps DPK-104L
RNase A 0.8 mg 2 x 4 mg 10 x 4 mg
Neutralization Buffer 3.2 mL
adicione 0.8 mg RNAse 16 mL
adicione 1 x 4 mg RNAse 80 mL
adicione 5 x 4 mg RNAse
A purificação do DNA acontece por simples procedimento de ligação, lavagem e eluição. A etapa de lavagem opcional (secundária) minimiza o conteúdo salino do produto purificado. Antes de iniciar, adicione os seguintes componentes nos respectivos frascos:
Adicione RNase A no Neutralization Buffer, conforme indicação na tabela acima e misture bem. O Neutralization Buffer contendo RNAse A deverá ser armazenado à 4 °C.
A atividade da RNAse A dissolvida no Neutralization Buffer pode diminuir após vários meses e quantidades pequenas de RNA podem ser co-purificadas. Se houver detecção de RNA após a purificação do plasmídeo, adicione a RNAse A remanescente para reestabelcer a atividade.
Adicione Etanol 96-99% (não incluído no kit) no Washing Buffer conforme indicação do frasco. Note que a concentração do Etanol no Washing Buffer poderá diminuir durante o armazenamento prolongado e uma redução no rendimento de DNA poderá ser observada.
1 Recuperação das células e lise
Recupere as células a partir de uma cultura celular (1-3 mL) por centrifugação
Ressuspenda o pellet bacteriano em 300 µL de Lysis Buffer por pipetagem ou vortex - 1 min
2 Neutralização
Adicione 300 µL do Neutralization Buffer (contendo RNase) na amostra e misture gentilmente por inversão do tubo 4-6 vezes (não vortex!);
Centrifugue a 10.000 g por 5 min.
A cor da mistura de ligação deverá mudar para amarelo brilhante, indicando um pH de 7.5 (requerido para a ligação ótimo do DNA na coluna). A coloração laranja ou violeta indica que o pH > 7.5 e implicará numa adsorção do DNA ineficiente. Neste caso, é recomendado o ajuste do pH pela adição de pequeno volume de acetato de sódio 3M (pH 5.0) antes de prosseguir com as demais etapas.
3 Ativação da coluna
4 Carregamento da coluna
Aplique o sobrenadante da etapa 2 na coluna ativida por decantação ou pipetagem
5 Lavagem coluna
Adicione 500 µL de Washing Buffer na coluna;
6 Eluição
Armazenada à temperatura ambiente (exceto RNase (- 20 °C) e Neutralization Buffer após adição da RNAse (4 °C))