Wipe Test. Controlo de contaminação. Kit de teste para a deteção de contaminação numa base genética molecular REF PDF
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Tiago Lopes Abreu
1 PT Instruções de utilização Wipe Test Controlo de contaminação Kit de teste para a deteção de contaminação numa base genética molecular REF reacções 1. Descrição do produto O uso da Polymerase Chain Reaction (PCR) na tipificação de HLA tornou-se rotineiro. Como a PCR é um método muito sensível, é essencial tomar precauções para evitar contaminações que possam levar a reações falso positivas. Para evitar contaminações e assegurar a qualidade em laboratório, os materiais de trabalho, áreas de laboratório ou reagentes únicos (p. ex., Taq Polimerase) devem ser monitorizados regularmente relativamente ao DNA ou amplificados (a cada 2 meses, de acordo com a norma EFI L1.2200). O Wipe Test é adequado para a deteção de contaminações com DNA genómico ou amplificação dos genes de HLA de classe I e II. O procedimento de teste baseia-se nos Sequence Specific Primers (SSP)-PCR (ver Fig. 1) [2, 3]. Este método utiliza o facto de a extensão do iniciador, e por conseguinte, a PCR bem-sucedida dependerem de uma correspondência exacta na extremidade de 3' de ambos os iniciadores. Por conseguinte, apenas se os iniciadores corresponderem totalmente à sequência alvo é que é obtida uma amplificação que é subsequentemente visualizada por eletroforese em gel de agarose. Correspondência perfeita Amplificação (alelo-específica) Sem correspondência Sem amplificação (não alelo-específica) Fig. 1: Princípio de SSP-PCR Versão: 4/2013
2 2. Material 2.1 Conteúdo do Wipe Test 5 tiras de PCR (8 tubos de PCR de espessura fina) suficientes para 40 reações (13 wipe tests). As misturas de reação pré-aliquotadas e secas consistem num conjunto de iniciadores específicos de alelos, iniciadores de controlo interno (específicos para o gene humano G3PDH) e nucleótidos. 1 x tampão 10x de PCR de 1,1 ml 5 x tiras de 8 tampas Instruções de utilização 2.2 Material complementar Taq Polimerase (5 U/µl), (p. ex., HISTO TAQ, REF 70975) Não use uma Taq Polimerase de arranque a quente! BAG EXTRA-GENE I Kit (REF 7059) (opcional) para a extração de DNA de sangue/linfócitos/leucócitos ou material para outros métodos de extração de DNA pipetas operadas por pistão (0,5-250 µl) pontas esterilizadas com filtro integrado papel forrado a lã Ciclador de DNA (p. ex., PTC 200 com uma cobertura aquecida e ajustada, MJ Research/BioRad; para uma lista dos cicladores validados, consulte a página 4) Dispositivos e material para eletroforese em gel DNA por agarose Tampão0,5x TBE (45 mm de Tris, 45 mm de ácido bórico, 0,5 mm de EDTA) Brometo de etídio (EtBr) unidade de eletroforese submarina com escovas abastecimento energético ( V, 200 ma) DNA com comprimento padrão (REF 7097) Dispositivos de interpretação e documentação Fonte UV ( nm) câmara (p. ex., sistema Polaroid) com rolos (Polaroid tipo 667) ou sistema de vídeo com papel térmico (ex. Typ KP65HM-CE) 2.3. Armazenamento e estabilidade O kit é entregue sem arrefecimento. Armazene todos os reagentes a -20 Cou 2 8 C no escuro em dispositivos com monitorização de temperatura (Evite a troca frequente da temperatura de armazenamento!). O prazo de validade é indicado no rótulo de cada reagente e também é válido para reagentes abertos. A estabilidade, conforme indicada no rótulo exterior, refere-se ao reagente com a estabilidade menor contido no kit. 2 de 7
3 3. Procedimento de teste 3.1 Condições de segurança A PCR é um método particularmente sensível. Respeite as medidas de segurança especiais de forma a evitar a contaminação e consequentes reações falsas: Use luvas durante o trabalho (sem pó, se possível). Use novas pontas com cada passo de pipetagem (com filtro integrado). Use áreas de trabalho separadas para pré-amplificação (isolamento de DNA e preparação das reações) e pós-amplificação (eletroforese em gel, documentação). De preferência, use duas salas separadas. Use dispositivos e outros materiais apenas nos locais respetivos e não os troque. 3.2 Isolamento de DNA Para o controlo positivo, é necessário o ADN dos leucócitos. Ex.: o BAG EXTRA-GENE I kit é o mais adequado para o isolamento do DNA pois o DNA puro pode ser obtido sem a utilização de químicos tóxicos ou solventes. Adicionalmente, os métodos comerciais baseados em colunas ou contas ou outros métodos descritos na literatura são adequados para providenciar um DNA de pureza suficiente. A presença de heparina inibe potencialmente a PCR [6]. Por conseguinte, recomenda-se EDTA ou citrato de sangue para a tipificação do grupo sanguíneo. O DNA deve ter os seguintes índices de pureza: OD 260 /OD 280 = contaminação com RNA: >1,5 e <2,0 OD 260 /OD 230 = contaminação com sal, hidrato de carbono ou solventes orgânicos: >1,8 A avaliação e controlo de qualidade do Wipe Test foram efetuados com DNA, extraído através do EXTRA GENE I ou Kits Qiagen. 3.3 Amplificação A mistura de reacção pré-aliquotada e seca já contém um conjunto de iniciadores aleloespecíficos, iniciadores de controlo interno e nucleótidos. Os parâmetros de reacção são optimizados a um volume final de 20 µl. Para cada teste, são usadas três reações. A avaliação e controlo de qualidade do Wipe Test foram feitos com HISTO TAQ (REF 70975) ou Taq polimerase da Qiagen Procedimento de teste para o Wipe Test 1. Osrecipientes de reação de 1,5 ml estão identificados com o nome das áreas examinadas (p. ex., bancada de trabalho, maçaneta da porta, etc.) e enchidos com 200 µl de água destilada esterilizada. 2. Para cada área de teste, é mergulhado um pedaço de lã no respectivo recipiente de reacção e a área de teste é limpa com a lã molhada. 3. Coloque a lã no respectivo recipiente de reação e incube durante 2 horas à temperatura ambiente em 200 µl de água destilada. Após este tempo, a lã é eliminada. 3 de 7
4 4. Retire o número necessário de recipientes de PCR e o tampão 10x de PCRdo kit. Rotule um recipiente com "área de teste", um com "controlo positivo" e o terceiro com "controlo de inibição". 5. Prepare a pré-diluição da Taq (mínimo de 5 reacções) e agite brevemente a mistura com uma depuração centrífuga. Preparação de pré-diluição da Taq para o número de reações + 2 : 1 reacção 5 reacções 8 reacções Tampão 10x de PCR 2 µl 10,0 µl 16 µl Taq polimerase (5 U/µl) 0,12 µl 0,60 µl 0,96 µl 6. Pipete as seguintes misturas de reação nos recipientes de PCR rotulados: área de teste controlo positivo controlo de inibição água destilada esterilizada 14 µl 17 µl 13 µl amostra da área de teste 4 µl - 4 µl DNA genómico (40 ng/µl) - 1 µl 1 µl Pré-diluição da Taq 2 µl 2 µl 2 µl 7. Feche bem os tubos com as respetivas tampas. Assegure que não toca na parte interior das tampas nem nas extremidades superiores dos tubos com os dedos para evitar contaminação. O pó das luvas é um forte inibidor da PCR! Agite ligeiramente a placa para baixo para dissolver os grânulos azuis no fundo da placa. Toda a solução da PCR deve fixar-se no fundo. 8. Coloque os tubos de reacção no termociclador e aperte a tampa para que os recipientes da reacção não se deformem com o calor. Inicie o programa de PCR. Sobrepor as misturas de reação com óleo mineral não é necessário se for usada uma cobertura aquecida e ajustada! Parâmetros de amplificação: Programa-passo Tempo Temp. N.º de ciclos Primeira desnaturação 5 min. 96 C 1 ciclo Desnaturação 20 seg. 96 C 5 ciclos Hibridização+Extens 60 seg. 68 C ão Desnaturação 20 seg. 96 C 10 ciclos Hibridização 50 seg. 64 C Extensão 45 seg. 72 C Desnaturação 20 seg. 96 C 15 ciclos Hibridização 50 seg. 61 C Extensão 45 seg. 72 C Extensão final 5 min. 72 C 1 ciclo Tipos de cicladores validados: PTC 100/200/C1000 (MJ Research/BioRad), GeneAmp PCR-System 9600 / 9700 (use taxa de aquecimento de 9600) (ABI), Mastercycler epgradient S (use função simular gradiente Mastercycler ) (Eppendorf) e Tprofessional (Biometra) 4 de 7
5 Ao usar termocicladores com uma taxa de aquecimento e arrefecimento muito rápida, recomenda-se o uso de uma taxa de aquecimento e arrefecimento mais lenta (~2,5 ºC/seg.). Como os cicladores de diferentes fabricantes têm um desempenho diferente e até máquinas individuais de um tipo podem ser calibradas de forma diferente, pode ser necessário otimizar os parâmetros de amplificação. Para optimizar a sua máquina, use o seguinte guia: Com reações falso-positivas (bandas não específicas, determinações adicionais): Aumente a temperatura de hibridização em passos de 1 ºC. Com reações falso-negativas (bandas em falta): Diminua a temperatura de hibridização em passos de 1 ºC e/ou aumente os períodos de hibridização em passos de 5 segundos e/ou aumente os períodos de desnaturação em passos de 5 segundos. Recomenda-se usar apenas cicladores calibrados regularmente. Para isto, o BAG CYCLER CHECK kit é bastante apropriado (REF 7104). Os testes de controlo de qualidade foram feitos em PTC-200 resp. C1000 (MJ Research / BioRad), 9700 (ABI), Mastercycler epgradient S (Eppendorf) e Tprofessional (Biometra). 3.4 Eletroforese em gel A separação dos produtos de amplificação é feita por eletroforese através de um gel horizontal de agarose. Como tampão de eletroforese, recomenda-se tampão 0,5x TBE (45 mm de tris, 45 mm de ácido bórico, 0,5 mm de EDTA). A concentração de gel deve ser de 2,0-2,5% de agarose. Deixe o gel polimerizar pelo menos 30 minutos antes de carregar as amostras. Depois de a amplificação ter sido concluída, retire as amostras do termociclador e coloque as misturas de reação completas cuidadosamente em cada ranhura do gel. Adicionalmente, aplique 10 µl do DNA de comprimento padrão para a comparação de tamanhos. A separação da eletroforese é feita a V/cm (com 20 cm de distância entre os elétrodos, aprox V), durante min. Após o funcionamento ter sido concluído, todo o gel é tingido numa solução de brometo de etídio (EtBr) (aprox. 0,5 µg/ml de EtBr em H 2 O ou tampão TBE) durante min. Como alternativa, pode também ser adicionado EtBr (0,5 µg/ml) ao tampão de eletroforese ou ao gel de agarose. Se necessário, o excesso de EtBr pode ser removido imergindo o gel em H 2 O ou tampão 0,5x TBE durante minutos. 3.5 Documentação e interpretação Para documentação, visualize a amplificação de PCR usando um transiluminador UV ( nm) e fotografe-a com uma máquina, rolo e filtros adequados (p. ex., Polaroid, rolo tipo 667 ou sistema de vídeo, papel térmico KP65HM-CE). Escolha o tempo de exposição e a abertura de forma a que as bandas sejam esticadas ao máximo e se destaquem contra o fundo preto (abertura aproximada de 11, tempo de exposição de 1 segundo). 5 de 7
6 Se a área de teste não for contaminada, nenhuma banda deve ser visível na amostra da área de teste. As contaminações são indicadas pelas seguintes bandas: Contaminação com amplificado: Contaminação com DNA genómico: 78 bp e/ou 104 bp e/ou 282 bp 282 bp e possivelmente 78 bp, 104 bp, 176 bp, aprox. 580 bp O controlo positivo e o controlo de inibição devem mostrar um padrão de banda de acordo com o esperado com DNA genómico. Se não houver amplificações no controlo positivo, não tiver ocorrido nenhuma reação de PCR e o teste não puder ser interpretado. Se o controlo positivo mostrar o padrão correto de banda, mas não houver bandas visíveis no controlo de inibição, os inibidores devem ter estado presentes na área de teste. Neste caso, uma amostra de "área de teste" limpa não comprova que não há contaminação na área de teste. 4. Avisos e precauções O brometo de etídio é um mutagénio poderoso. Use luvas quando manusear géis ou soluções que contenham EtBr! Note as instruções de utilização e os avisos e precauções do fabricante! O transiluminador irradia uma luz UV de onda muito curta que pode causar queimaduras na pele e na retina. Use uma máscara facial de proteção contra UV! Tudo o que é utilizado para a extracção de DNA usa material biológico, p. ex., sangue ou tecido humano, e deve ser manuseado como sendo potencialmente infeccioso. Quando manusear material biológico, recomenda-se tomar precauções de segurança apropriadas (não pipetar com a boca, usar luvas descartáveis quando manusear material biológico e desempenhar o teste, desinfetar as mãos quando tiver acabado o teste). O material biológico deve ser desativado antes de ser eliminado (p. ex., por autoclave). Os descartáveis devem ser autoclavados ou incinerados após a utilização. O derrame de material potencialmente infeccioso deve ser imediatamente removido com papel absorvente e as áreas contaminadas limpas com um desinfectante padrão adequado ou com uma solução de 70% de álcool. O material usado para limpar derrames, incluindo luvas, deve ser inactivado antes de ser eliminado (p. ex., por autoclave). 5. Referências 1. Bodmer, J., Immunogenetics 37: Olerup, O., Zetterquist H., Tissue Antigens 39: Olerup, O., Zetterquist H., Tissue Antigens 41: Lu, Y.H. and Négre, S., Trends in Genetics 9: Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbour Laboratory 6. Beutler, E. et al., BioTechniques 9: Bunce, M., Tissue Antigens 46: de 7
7 6. Explicação dos símbolos usados nos rótulos Temperatura de armazenamento Prazo de validade Consulte as instruções de utilização Suficiente para "n" ensaios CONT CONTROL CC IFU LOT OR PCRBUF 10x PCRCAP PCRSTRIP REACTIONMIX REF RTU Conteúdo, contém Controlo de contaminação Instruções de utilização Código do lote ou Tampão de PCR, concentração de 10x Tampas de PCR Tiras de PCR Misturas de reacção Referência de catálogo Pronto a usar Para instruções de utilização noutros idiomas, consulte: ou ligue para: +49 (0) Encomenda: Assistência ao cliente: BAG Health Care GmbH Tel.: +49(0)6404/ Tel.: +49(0)6404/ Amtsgerichtsstraße 1-5 Tel.: +49(0)6404/ Fax: +49(0)6404/ Fax: +49(0)6404/ Lich/Alemanha Fax: +49(0)6404/ de 7