Os resultados do ELISA com MSP5 truncada estão demonstrados no Quadro 1 e serviram como base para o cálculo dos parâmetros (sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e precisão) para avaliar o desempenho do ensaio (Quadro 2). O ELISA indireto com MSP5 recombinante truncada foi capaz de detectar bovinos experimentalmente infectados com A. marginale com uma sensibilidade de 96,97%. A sensibilidade deste ELISA foi superior ao encontrado nos ELISAs indiretos com antígeno bruto de Nielsen et al. (1996) (87,3%), Montenegro-James et al. (1990) (93%) e no ELISA competitivo desenvolvido por Torione de Echaide et al. (1998) (96%). No entanto, foi inferior ao ELISA indireto com antígeno bruto reportado por Madruga et al. (2000) (100%). Duas explicações para este resultado podem ser: i) maior diversidade de epítopos presente no antígeno com corpúsculo inicial e ii) o teste padrão utilizado por Madruga et al. (2000) para determinar o estado de infecção dos animais que foi a imunofluorescência indireta, com sensibilidade e especificidade inferior à PCR. Baseado nestas observações, verifica-se que um teste de diagnóstico em desenvolvimento, deve sempre ser comparado a outro de maior sensibilidade e especificidade.
A especificidade do ELISA com MSP5 foi superior ao ELISA competitivo de Torione de Echaide et al. (1998) (95%). Resultado este que pode ser devido à utilização de proteína de ligação à maltose (maltose binding protein - MBP) fusionada à MSP5 como antígeno no ELISA competitivo. A MBP pode induzir reações falso-positivas decorrentes de interações inespecíficas entre anticorpos anti-MBP e MBP-MSP5, bloqueando a ligação do anticorpo monoclonal ANAF16C1, mesmo depois de realizar uma pré-adsorção do soro à MBP (Torione de Echaide et al. 1998). A especificidade deste ELISA também foi superior aos ELISAs com corpúsculo inicial desenvolvido por Montenegro-James et al. (1990) (96%), Nielsen et al. (1996) (99,6%) e Madruga et al. (2000) (96%). Nesses ensaios, provavelmente ocorreram contaminação dos antígenos com proteínas de eritrócitos, as quais podem reagir inespecificamente com anticorpos presentes no soro, resultando assim em reações falso positivas, que interferem diretamente na especificidade do teste (Barry et al. 1986).
Com relação ao acompanhamento dos animais experimentalmente infectados, o ELISA com MSP5 truncada recombinante detectou anticorpos específicos a partir do 12º dia após inoculação até o 37º quando foi realizada a última análise (Fig.4), enquanto que a PCR começou a detectar riquetsemia a partir do 9º dia, uma diferença pouco importante, ao considerar que a PCR é sabidamente uma técnica alta sensibilidade (Corona et al. 2000).
Os ELISAs com MSP5 e MSP1a detectaram 166 animais infectados e 1.428 não infectados, o que correspondeu a alta concordância de 95,67% definido pelo índice k de 0,81 (Quadro 3) (Ansari-Lari 2005). Os ELISAs foram capazes de detectar bovinos infectados em todas as regiões brasileiras estudadas (Rio Grande do Sul, Mato Grosso do Sul, Pernambuco, Bahia e Minas Gerais), assim como do Uruguai e da Costa Rica. A concordância entre os ELISAS e o reconhecimento destas proteínas pelo soro de bovinos de diferentes regiões deveu-se provavelmente ao uso de proteínas com epítopos conservados, pois as proteínas MSP1a e MSP5 utilizadas neste estudo são baseadas no fragmento do gene msp1a e msp5 respectivamente, que codificam para o domínio hidrofílico da região C-terminal de MSP1a e N-terminal de MSP5, que são conservados. Este resultado também ressalta o bom desempenho do ELISA com MSP5, uma vez que apresentou alta concordância com um ensaio de 99% de sensibilidade e 100% de especificidade (Araújo et al. 2005).
Em relação aos resultados discordantes entre os ELISAs com MSP1a e MSP5 recombinantes, encontrou-se um número significativamente maior (p <0,001) de soros negativos no ELISA com MSP5 truncada e positivos no ELISA com MSP1a, evidenciando que, como soros de animais naturalmente infectados, ocorre uma maior sensibilidade nesse último teste. No entanto, é provável que essa diferença de sensibilidade não reflita em alterações na interpretação da situação epidemiológica.