No cinema, Hayden iniciou no filme Remember the Titans (br: Duelo de Titãs), em 2000, e Joe Somebody (br: Super Pai), no ano seguinte. Participou de vários filmes de animação como, em 1998, A Bug's Life (br: Vida de Inseto, voz de Dot, a formiga filha mais nova da Rainha), em seguida, Dinosaur (Dinossauro). Esteve também em Racing Stripes (br: Deu Zebra) onde atuou junto com personagens de animação.
Ela atuou no papel de "Sarah Roberts", em seguida veio o papel de Lizzie Spaulding, na novela da CBS, Guiding Light. Em Guiding Light, Panettiere interpretou uma personagem que sofria de leucemia, para chamar a atenção dos telespectadores e melhorar a consciência nacional quanto à doença, a Leukemia and Lymphoma Society, ofereceu um prêmio especial à novela, em reconhecimento a seus esfrorços.
Panettiere aparece como Claire Bennet na série da NBC, Heroes uma líder de torcida com poderes de regeneração. Graças ao seu papel em Heroes, ela se tornou presença constante em convenções de ficção científica por todo o mundo em 2007, incluindo GenCon, New York Comic-Con, e Fan Expo Canada.
Apareceu em mais de uma dúzia de longas-metragens, fez vários filmes para televisão e já emprestou a voz para a personagem "Dot" em Vida de Inseto. Ela desempenhou o papel da filha do treinador, "Sheryl Yoast" em Duelo de Titãs de 2000. Além disso, ela expressou "Kairi" em Kingdom Hearts, série de jogos de vídeo game para o PlayStation 2. Panettiere apareceu na série da FOX, Ally McBeal como a filha de Ally McBeal, e teve um papel recorrente na série Malcolm in the Middle além de estrelar em Law & Order: Special Victims Unit. Ela também estrelou em As Apimentadas: Tudo ou Nada como uma líder de torcida e teve um papel coadjuvante/secundária como Adelaide Bourbon no filme independente de 2007 Shanghai Kiss (br: O Amor em Beverly Hills). Atuou em filmes da Disney Channel, como Tiger Cruise, Raising Helen (br: Um Presente Para Helen), no papel da sobrinha adolescente de Kate Hudson, e em Ice Princess (br: Sonhos no Gelo), como uma popular estudante e patinadora rival.
Participou do filme de drama Fireflies in the Garden (br: Um Segredo Entre Nós) como Jane Lawrence, uma versão mais nova da personagem de Emily Watson. Em junho de 2007, ela assinou com a William Morris Agency, após ser previamente representada pela United Talent Agency. A Forbes estimou que ela ganhou U$2 milhões em 2007.
No início de 2007 Panettiere apareceu na MTV no programa Punk'd, de Ashton Kutcher. Em dezembro de 2007 Panettiere foi indicada pela revista GQ como "obsessão do ano".