Desnutrição neonatal e microbiota normal da cavidade oral em ratos
http://dx.doi.org/10.1590/S1415-52732007000600005
Desnutrição neonatal e microbiota normal da cavidade oral em ratos1
Neonatal malnutrition and normal microbiota of the oral cavity in rats
Solange Maria Magalhães da Silva PortoI; Marcelo Tavares VianaI; Karla Melo Ferreira da SilvaII; Maria de Fátima Alves DinizIII; Célia Maria Machado Barbosa de CastroIV, *
IUniversidade Federal de Pernambuco, Centro de Ciências da Saúde, Departamento de Nutrição. Recife, PE, Brasil
IIEstagiária de Iniciação Científica, Graduanda de Ciências Biomédicas, Universidade Federal de Pernambuco, Centro de Ciências Biológicas. Recife, PE, Brasil
IIIUniversidade Federal de Pernambuco, Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami. Recife, PE, Brasil
IVUniversidade Federal de Pernambuco, Centro de Ciências da Saúde, Departamento de Medicina Tropical, Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami, Setor de Microbiologia. Campus Universitário, s/n., Cidade Universitária, 50670-420, Recife, PE, Brasil
OBJETIVO: Avaliar a influência da desnutrição neonatal sobre o padrão e o crescimento de bactérias aeróbias, da microbiota normal da cavidade oral, em ratos Wistar adultos.
MÉTODOS: O material da cavidade oral foi coletado através de swabs embebidos em 40µL de solução salina estéril e colocados em tubos estéreis contendo 960µL de brain heart infusion. Posteriormente, fez-se homogeneização de cada uma amostra. Então, destes 1.000µL, retirou-se 1µL e este foi semeado em placas de Petri contendo Agar-sangue e Levine para isolamento e identificação de bactérias Gram+ e Gram-, respectivamente. Essas placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37ºC, 48 horas, e as unidades formadoras de colônias que cresceram foram contadas e seus percentuais calculados. Para a bacterioscopia foram confeccionadas lâminas coradas pelo método de Gram.
RESULTADOS: Do 5º ao 21º dia de vida os pesos corporais do grupo desnutrido (33,6g:42,8g, desvio-padrão=27,2g) foram menores (p<0,001) que os do grupo nutrido (52,5g:56,3g, desvio-padrão=24,0g). Dos 60 aos 120 dias de vida os pesos foram reduzidos no grupo desnutrido (248,2g:290,2g, desvio-padrão=220,2g), quando comparados aos do grupo nutrido (306,2g:319,4g, desvio-padrão=219,5g) teste Mann Whitney, p<0,05. A microbiota foi composta de menor número de bactérias no grupo nutrido (4,2x106 unidades formadoras de colônias, desvio-padrão=1,2x106 unidades formadoras de colônias de bactérias/mL), comparado ao grupo desnutrido (7,4x106 unidades formadoras de colônias, desvio-padrão=1,0x106 unidades formadoras de colônias de bactérias/mL) teste "t", (p=0,026). Das bactérias isoladas em culturas, observou-se um padrão bacteriano semelhante nos dois grupos, com 70% de bactérias gram-positivas e 30% de bactérias gram-negativas.
CONCLUSÃO: A desnutrição neonatal foi efetiva em reduzir o peso corporal e aumentar o crescimento bacteriano. Embora o padrão bacteriano não tenha sido alterado, o aumento do crescimento bacteriano pode induzir a um desequilíbrio na microbiota oral desfavorecendo assim, o hospedeiro.
Termos de indexação: bactérias aeróbias; boca; desnutrição neonatal; ratos Wistar.
OBJECTIVE: To evaluate the influence of neonatal malnutrition on the pattern and growth of aerobic bacteria of the normal bacterial flora of the oral cavity in adults Wistar rats.
METHODS: In the present study, the material of the oral cavity was collected through swabs soaked in 40µL of sterile saline solution. After the collection, each swab was placed in a sterile tube containing 960µL of brain heart infusion. Later, the samples were homogenized. Then, from the 1.000µL, 1µL was collected with a gauged loop to be sowed in Petri dishes containing Agar-blood and Agar-Levine, for the isolation and identification of the Gram-positive and Gram-negative bacteria respectively. The plates were placed into a bacteriological incubator, 37ºC, for 48 hours and the colony-forming units that grew were counted and their percentages were calculated. For bacterioscopy, slides were stained with the Gram method.
RESULTS: From the 5th to the 21st day of life, body weight of the undernourished group (33.6g:42.8g, standard deviation=27.2g) was smaller (p<0.001) than that of the nourished group (52.5g:56.3g, standard deviation=24.0g). From the 60th to the 120th days of life the body weight of the undernourished group (7.4.x.106 colony-forming units, standard deviation=1,0x106 colony-forming units bacteria/mL) decreased when compared to that of the nourished group (306.2g:319.4g, standard deviation=219.5g), Mann-Whitney test, p<0,05. The microbiota was composed of a smaller number of bacteria in the nourished group (4.2 x106 colony-forming units, standard deviation=1.2x106 colony-forming units bacteria/mL) when compared with the undernourished group (7.4x106 colony-forming units, standard deviation=1.0x106 colony-forming units bacteria/mL), Student's "t" test (p=0.026). From the bacteria isolated in cultures, a similar bacterial pattern was observed in both groups, with 70% of Gram-positive bacteria and 30% of Gram-negative bacteria.
CONCLUSION: Neonatal malnutrition was effective in decreasing body weight and increasing bacterial growth. Although the bacterial pattern was not altered, the increase in bacterial growth may induce an imbalance of the oral microbiota, being a threat to the host.
Indexing terms: bacteria, aerobic; mouth; neonatal malnutrition; rats Wistar.
A enorme variedade de organismos que causam doenças infecciosas pode ser agrupada em seis categorias principais: vírus, bactérias, fungos, protozoários, helmintos e artrópodes. Cada uma das categorias apresenta características distintas, que determinam maneiras de interação com os hospedeiros e, portanto, contribuem para as características das doenças que os organismos causam. Entre estas propriedades estão a cons-tituição estrutural e molecular, as estratégias metabólicas e os processos reprodutivos. Algumas espécies, entretanto, são positivamente benéficas à saúde do hospedeiro. A microbiota normal, da qual fazem parte os organismos que vivem no nosso corpo sem causar doença, é imprescindível para a proteção contra o estabelecimento de micróbios patogênicos1.
A microbiota endógena inclui todos os microorganismos (bactérias, fungos, protozoários e vírus) que residem no interior ou na superfície corporal dos seres sadios2. Quando o número habitual de microorganismos residentes está muito reduzido, os invasores oportunistas podem, então, se estabelecer mais facilmente3.
A cavidade oral, por exemplo, apresenta uma das mais concentradas e variadas populações microbianas, cuja localização principal está no dorso da língua, no sulco gengival e na placa dental coronariana4. Estima-se que a saliva contém 108 bactérias/mL e as placas dentais, 1011 bactérias/mL. Participam desta flora numerosos gêneros, como: Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria, Bacteróides, Actinomyces, Treponema, Mycoplasma e outros5-7. Isogai et al.8 isolaram mais de 15 bactérias na cavidade oral de ratos, dentre estas os tipos predominantemente isolados na saliva, no dorso da língua, na mucosa bucal e no sulco gengival foram: Streptococcus ssp., Lactobacillus ssp., Veillonella ssp e Neisseria ssp.
Não existem estudos, até o presente momento, relacionando a desnutrição neonatal com a microbiota oral. Nessa situação é possível haver modificações dos microorganismos, tanto em quantidade como em qualidade na cavidade oral, já que a desnutrição contribui para menor resis-tência, ou seja, maior vulnerabilidade às doenças e às altas taxas de infecções com elevado risco de mortalidade5.
Assim, este estudo pretende avaliar o impacto da desnutrição no período de aleitamento sobre a microbiota da cavidade oral, após recuperação nutricional em ratos adultos. O estudo desses aspectos em animais tem importância do ponto de vista experimental e clínico, devido à diversidade de reações do organismo, particularmente, às eventuais seqüelas sobre os mecanismos de defesa orgânicos, ocasionadas por agressões nutricionais sofridas no período neonatal, por ser um período de grande vulnerabilidade em decorrência da formação dos diversos sistemas orgânicos.
Foram utilizados 36 ratos machos, albinos, da linhagem Wistar, provenientes do biotério do Departamento de Nutrição, da Universidade Federal de Pernambuco. Os animais foram mantidos a uma temperatura de 23ºC, com variação de 1ºC, em ciclo claro/escuro invertido de 12h (claro-21 a 9h; escuro-9 às 21h), com acesso livre à água e à ração.
Os animais foram obtidos acasalando-se machos e fêmeas adultos, na proporção de um macho para três fêmeas, por um período de 16 dias9. O diagnóstico da prenhez foi feito pela observação do crescimento do ventre. Um dia após o nascimento, a ninhada foi padronizada em seis filhotes machos por mãe. Esse número parece conferir maior potencial lactotrófico9. Nesse mesmo dia, adotado como primeiro dia de vida do animal, as ninhadas foram divididas nos grupos: nutrido (N) - constituído por 18 filhotes amamentados por mães submetidas à dieta contendo 17% de proteína (caseína), e desnutrido (D) - constituído por 18 filhotes amamentados por mães submetidas à dieta contendo 8% de proteína (caseína).
Os animais dos dois grupos foram amamentados durante os primeiros 21 dias após o nascimento9. Nesse período foram registrados diariamente (em balança eletrônica digital - Marte, modelo S-4000-com sensibilidade de 0,1g) os pesos corporais (PC) de cada animal. A partir do 22º dia de vida até o final do experimento, o peso corporal era aferido uma vez por semana, objetivando acompanhar a recuperação nutricional dos animais. Após o desmame, no 22º dia de vida, os animais foram separados de suas mães e mantidos em gaiolas coletivas contendo 3 ratos em cada gaiola, com dieta Labina, adotada como padrão no Biotério, contendo 23% de proteínas mistas, até o final do experimento.
Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, e seguiu as normas sugeridas pelo Comitê Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
Realizou-se coleta da cavidade oral de todos os animais dos grupos N e D, aos 60-120 dias de vida. Cada animal foi segurado na posição vertical de modo que suas patas fossem imobilizadas. Em seguida, a flora bacteriana oral foi coletada através de swabs embebidos em 40mL de solução salina de NaCl 0,9%, estéril.
Após coleta do swab, este foi colocado em tubo estéril contendo 960µL de Brain Heart Infusion (BHI), meio líquido enriquecido que permite o crescimento bacteriano. Posteriormente, fazia-se a homogeneização das amostras e lâminas foram confeccionadas para a realização da coloração de Gram. Além disso, destes 1.000µL retirava-se, com o auxílio de alça calibrada, 1µL, que foi semeado em placas de Petri contendo Agar-sangue e Agar-Levine, para isolamento das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, respectivamente. Essas placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37ºC, por 48 horas, e as unidades formadoras de colônias (UFC) que cresceram foram quantificadas e seus percentuais calculados. A identificação da espécie foi realizada em sistema automatizado MicroScan®.
Nos primeiros dias de vida, os pesos (g) corporais dos grupos N e D, expressos em mediana, valores máximos e mínimos, foram semelhantes. A partir do 5º dia até o 21º dia pós-natal, os valores dos pesos corporais do grupo D (33,6g:42,8g, desvio-padrão - DP=27,2g) foram menores (p<0,001) do que os do grupo N (52,5g:56,3g, DP=24,0g) (Figura 1).
Aos 60-120 dias de vida os pesos corporais dos animais dos grupos N e D foram expressos por mediana mediana, valores máximos, mínimos e comparados. Houve redução dos pesos no grupo D (248,2g:290,2g, DP=220,2g) em comparação ao grupo N (306,2g:319,4g, DP=219,5g), segundo o teste Mann Whitney, p<0,05 (Figura 2).
Após análise do material coletado nos dois grupos de ratos, observou-se que a microbiota oral foi composta por um menor número de bactérias, no grupo N (4,2UFCx106, DP= 1UFCx106) comparativamente ao grupo D (7,4UFCx106, DP= 1,2UFCx106), teste t, (p=0,026) (Figura 3).
A ordem das freqüências das bactérias aeróbias encontradas foi a seguinte: Bacillus sp., Corynebacterium sp., Enterococcus sp., Staphylococcus aureus, Streptococcus viridans, Staphylococcus coagulase negativo, Staphylococcus saprophyticcus, Citrobacter, Escherichia coli e Pseudomonas. Destas 70% foram de bactérias gram-positivas e 30% de bactérias gram-negativas.
O padrão de bactéria encontrado foi o mesmo nos dois grupos.
No presente estudo, utilizou-se modelo de desnutrição imposta no período de aleitamento, seguida de recuperação nutricional, com as avaliações sendo realizadas na vida adulta do animal. Assim, neste estudo, a desnutrição ocorrida precocemente causou déficit no peso corporal, levando ao retardo da evolução ponderal no período de aleitamento. Estes dados corroboram aqueles obtidos por Medeiros et al.10, Porto et al.11 e Barros et al.12, que empregaram a dieta básica regional (DBR), deficiente em todos os seus constituintes13, como modelo experimental de desnutrição. Apesar dos diferentes modelos experimentais de desnutrição usados, neste estudo, a deficiência de proteínas (caseína) utilizada foi suficiente para causar desnutrição. A dieta de caseína a 8% é caracterizada como hipoprotéica, e provoca alteração no teor protéico do leite de lactantes que a ingerem. Esse parece ser um fator determinante na gênese de seus efeitos deletérios observados na prole.
A desnutrição ocorrida nesse período também afetou o peso corporal dos animais na idade adulta. Oferta da dieta equilibrada (Labina) a partir do desmame, parece não ter sido eficiente para recuperar a deficiência de peso originada ainda na amamentação. Esses resultados estão em con-cordância com aqueles de Barros et al.12, que também encontraram redução do peso corporal verificada, inclusive, até a idade adulta.
Portanto, o uso de dieta hipoprotéica à base de proteína animal (caseína), na concentração de 8%, por lactantes durante o período de aleita-mento, modificou o teor protéico do leite materno e levou ao déficit ponderal dos filhotes, tanto no período de lactação quanto na idade adulta após recuperação.
Os estudos relacionados à desnutrição precoce são escassos, sobretudo aqueles que avaliam os efeitos da restrição protéica no período de lactação14. Alguns autores relatam alteração na concentração protéica do leite por restrição do suprimento de aminoácidos necessários para a síntese de proteína do leite15. Neste estudo, o período no qual a agressão nutricional foi conduzida é caracterizado por um intenso processo de crescimento e desenvolvimento orgânicos, o que demanda aumento das necessidades de energia e proteínas15. Os efeitos da restrição protéica durante o período de aleitamento foram demonstrados em ratos desde o quarto dia de vida pós-natal16. De modo similar, os resultados obtidos neste trabalho também demonstraram redução do ganho de peso durante o aleitamento a partir do quinto dia de vida pós-natal, quando as mães receberam dieta experimental hipoprotéica.
É conhecido de longa data que a desnutrição prejudica as defesas orgânicas. Porém, não existem estudos conduzidos com desnutrição ocorrida no período de aleitamento, seguida de recuperação nutricional, e na vida adulta do animal, sobre a microbiota oral. Essa microbiota sofre alterações significativas decorrentes de modificações sofridas nos fatores externos, ou daqueles relacionados ao hospedeiro e ou às bactérias2,4,5,17-20. Neste estudo, a análise da microbiota oral obtida da cavidade oral dos animais, revelou que o grupo Desnutrido apresentou uma microbiota com um maior número de bactérias, quando comparada ao grupo Nutrido. Esse aumento pode ter sido conseqüente à manipulação nutricional sofrida no período de aleitamento.
A desnutrição precoce sofrida no grupo de animais pesquisados pode ter sido um dos fatores que levou a essa alteração. A maioria desses microorganismos, que compõem a microbiota, pode ser encontrada na cavidade oral de indivíduos saudáveis. Portanto, em conseqüência às alterações de determinados fatores, como a nutrição, pode ocorrer um desequilíbrio entre a microbiota e o hospedeiro. Tal fato predispõe a instalação de processos inflamatórios e/ou infecciosos6,21-24. Apesar de neste trabalho ter havido manutenção qualitativa do padrão de normalidade da microbiota, foi observada uma maior quantidade de bactérias nos animais desnutridos precocemente, e isto pode proporcionar um desequilíbrio entre as bactérias da microbiota e o hospedeiro. Totti et al.17, Darby-Curtis19, Yao et al.25 e Beckers & van der Hoeven26 afirmaram que são vários os fatores que contribuem para mudanças na composição da microbiota como: determinadas características genéticas e raciais, idade, maturidade do sistema imune, dieta, puberdade, erupção dos dentes decíduos e permanentes, higiene oral, cárie, enfermidade periodontal ou infecção, diminuição do fluxo salivar e uso de medicações.
Neste estudo, pela ordem das freqüências, as bactérias aeróbias encontradas foram: Bacillus sp., Corynebacterium sp., Enterococcus sp., Staphylococcus aureus, Streptococcus viridans, Staphylococcus coagulase negativo, Staphylococcus saprophyticcus, Citrobacter, Escherichia coli e Pseudomonas. Destas, 70% foram de bactérias gram-positivas e 30% de bactérias gram-negativas. Tais percentuais indicam que a prevalência encontrada para as bactérias foi a mesma encontrada na microbiota normal para os dois grupos. Esses dados são concordantes com outros estudos18,27,28 que se referem a até 80% de bactérias gram-positivas na microbiota normal da cavidade oral. Quanto ao número de eventos, as bactérias mais freqüentes foram: Bacillus sp. e Streptococcus viridans, que apresentaram 57 eventos, e a menos freqüente foi a Enterococcus, com 4 eventos. Estes dados são semelhantes aos observados em outros trabalhos2,6,20,23,24. De acordo com Burton & Engelkirk3, a microbiota da cavidade oral é muito diversificada e se estima que a saliva contém em torno de 108 bactérias/mL. Neste estudo, os resultados encontrados sobre o crescimento bacteriano foram menores, na ordem de 106 bactérias/mL e esse achado, provavelmente, pode ser explicado pelo fato de não terem sido incluídas na pesquisa as bactérias anaeróbias.
Conclui-se que, nas condições deste trabalho, a desnutrição no período de lactação, seguida de recuperação nutricional, acarreta redução do peso corporal a partir do 5º dia de vida pós-natal, mantendo-se até a vida adulta. Ocorre, também, uma alteração da microbiota oral consistindo em aumento na quantidade de bactérias, porém, não houve interferência na qualidade das bactérias, já que prevaleceram o mesmo padrão e os mesmos eventos referentes às bactérias aeróbias, presentes nos animais com nutrição adequada. O aumento da quantidade de bactérias da microbiota oral, mesmo mantendo o mesmo padrão bacteriano, pode desencadear um desequilíbrio acarretando prejuízo na resposta de defesa do hospedeiro.
S.M.M.S. PORTO participou da elaboração do projeto de pesquisa, da estratégia experimental, da coleta de dados, da tabulação e da discussão dos resultados e da elaboração do artigo. M.T. VIANA participou da tabulação dos dados e estudo estatístico. K.M.F. SILVA participou da preparação dos grupos experimentais, manutenção dos animais no biotério e da coleta das amostras. M.F.A. DINIZ participou da preparação das amostras e coleta dos dados. C.M.M.B. CASTRO participou da elaboração do projeto de pesquisa, tabulação e discussão dos resultados e elaboração do artigo.
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Recebido em: 2/8/2006
Versão final reapresentada em: 9/8/2007
Aprovado em: 14/9/2007
* Correspondência para/Correspondence to: C.M.M.B. CASTRO. E-mail: <ccastro@lika.ufpe.br>
1 Artigo elaborado a partir da dissertação de S.M.M.S. PORTO, intitulada "Desnutrição neonatal e treinamento físico moderado em mecanismos de defesa de ratos adultos". Departamento de Pós-Graduação em Nutrição, Universidade Federal de Pernambuco; 2006.