Processos de transferência de genes entre bactérias - MIcrobiologia - transferência...
Introdução Sabemos que, embora as mutações sejam responsáveis pela expressão de várias novas características por uma célula, muitos dos fenótipos expressos pelos microrganismos procarióticos são decorrentes da aquisição de novos fragmentos de DNA, por meio de processos de transferência horizontal de genes. Três processos de transferência genética entre bactérias são bastante conhecidos: transformação, conjugação e transdução. Há ainda um quarto processo, a conversão lisogênica, que envolve a transferência de DNA de uma partícula viral para uma bactéria, sendo um evento importante na aquisição de genes muitas vezes associados à virulência.
Transformação - É definida como um processo de incorporação de DNA na forma livre, geralmente decorrente da lise celular. A partir de seu descobrimento, foi demonstrado formalmente que o DNA era a molécula envolvida na hereditariedade (experimentos iniciados por F. Griffith, 1928). Várias bactérias Gram positivas e negativas são naturalmente transformáveis, entretanto, dentro de um gênero, nem todas as espécies o são. Na natureza, o processo ocorre quando uma célula sofre lise, liberando seu DNA. Este, por ser de grande tamanho tende a sofrer quebras, originando centenas fragmentos de aproximadamente 15 kb (o equivalente a cerca de 15 genes, em Bacillus subtilis). Como uma célula absorve poucos fragmentos, apenas uma pequena proporção de genes podem ser transferidos. Inicialmente, para que o processo ocorra, é necessário que a cél. encontre-se competente, isto é, deve apresentar sítios de superfície para a ligação do DNA da célula doadora e apresentar a membrana em uma condição que permita a passagem deste DNA. Esta propriedade é, provavelmente, uma característica inerente de certas linhagens e, ao que parece, envolve o mecanismo de quorum sensing. O estabelecimento da competência é um fenômeno controlado, envolvendo a participação de diferentes proteínas (proteína de ligação ao DNA, presente na membrana, autolisinas, nucleases), sendo um processo variável entre os microrganismos. Aparentemente, o número de sítios disponíveis para a ligação do DNA é limitado. Esta captação parece estar relacionada a uma pequena sequência, de 10 a 12 pares de bases, presente no DNA exógeno. Em Haemophilus, foi demostrada a presença de uma proteína que reconhece e liga-se a uma sequência 5' - AAGTGGGTCA - 3', muito comum no genoma deste microrganismo, garantindo que somente ocorrerá a captação de DNA de espécies muito similares. A competência é um processo que depende de várias condições distintas nos diferentes microrganismos. Sabe-se que a fase de crescimento e as condições ambientais desempenham um papel de extrema importância no processo. Além destes, a temperatura e a concentração de cátions também influenciam a eficiência do processo. A captação do DNA também é diferente entre Gram positivos (G+) e Gram negativos (G-): Nas G+ o DNA é captado como dupla hélice e absorvido como fita simples, sendo uma das fitas degradadas. Nas G-, o DNA é absorvido como fita dupla, embora apenas uma das fitas participe do processo de recombinação. Independente do tipo celular, a ligação do DNA à célula é mais eficiente quando está como fita dupla. Ligação do DNA: inicialmente é reversível, tornando-se irreversível depois. As células competententes ligam o DNA com muito mais eficiência que células não competentes (1000 vezes mais). Streptococcus pneumoniae é capaz de ligar apenas cerca de 10 moléculas de DNA de dupla fita, de 15 a 20 kb. Quando são absorvidas, como DNA de fita simples, estas passam para cerca de 8 kb. Em Haemophilus influenzae, é necessário que o DNA tenha uma sequência específica de 1 pb, para que haja a ligação irreversível e o DNA seja captado. Integração do DNA: O DNA liga-se a proteínas na superfície celular, sendo em seguida absorvido ou tendo uma de suas fitas degradadas por nucleases antes da absorção. À medida que o DNA é absorvido no interior da célula, este se associa a proteínas de ligação ao DNA de fita simples, protegendo-o de degradação. A proteína RecA também participa deste processo, associando-se à fita e promovendo a recombinação. Há então a degradação do que resta da fita simples e formação de um DNA híbrido, que na replicação originará uma molécula parental e outra recombinante.
Esquema dos eventos envolvidos na transformação em Streptococcus, um organismo Gram positivo. O autoindutor (1) ao encontrar o receptor (2) interage com este, promovendo a ativação de vários genes (3, 4 e 5) dentre eles as autolisinas, nucleases e proteína de ligação ao DNA. Uma das fitas do DNA passa a ser captada pela célula, enquanto a outra é degradada (6). Ao penetrar na célula a fita simples é protegida por proteínas. Caso este DNa encontre uma região complementar, a proteína RecA auxiliará sua recombinação com o DNA endógeno (7).
Conjugação - Processo de transferência de DNA de uma bactéria para outra, envolvendo o contato entre as duas células (descoberta por Tatum & Lederberg, 1946). A conjugação está associada à presença de plasmídeos de natureza F. Estes plasmídeos contêm genes que permitem a transferência do DNA plasmidial de uma célula para outra ou, em outras palavras, a capacidade conjugativa. Quando a célula porta um plasmídeo de natureza F é denominada F+, doadora, ou macho, enquanto células desprovidas de tais plasmídeos são denominadas F-, receptoras, ou fêmeas. A capacidade conjugativa está associada à presença de determinados genes localizados em um operon denominado tra. Estes genes conferem uma série de características envolvidas na conjugação tais como a síntese do pilus F, responsável pelo reconhecimento e contato entre as células, assim como a transferência do DNA plasmidial. Eventualmente, os plasmídeos podem ser integrados no cromossomo, sendo este processo mediado por pequenas seqüências de DNA denominadas IS (insertion sequences). As células apresentados tais plasmídeos integrados são denominadas Hfr (do inglês High Frequency of Recombination). Quando integrados, esses plasmídeos podem mobilizar a transferência de genes cromossomais também.
Exemplo de um plasmídeo do tipo F
Em gram negativos, a conjugação pode ser de dois tipos: entre células F+ e F-, resultando em duas células F+ e entre células Hfr e F-, resultando em uma célula Hfr e outra F-. Nos dois processos, acredita-se que o mecanismo provável de transferência do DNA seja pelo círculo rolante, onde apenas uma das fitas é transferida, sendo a fita complementar sintetizada pela célula receptora. Provavelmente, o estímulo para o disparo do processo seja o contato das células. Assim, a conjugação envolve a passagem de DNA de uma célula F+ para outra F- , que torna-se então F+ também.
Quando o plasmídeo encontra-se incorporado ao cromosso, a conjugação passa a envolver a transferência de genes cromossomais, sendo que nestes casos, a célula receptora permanece F- , porque a região tra é a última a ser transferida, o que raramente ocorre na natureza. Nestes casos, passam grandes blocos de DNA da célula Hfr para a receptora, promovendo extensas recombinações.
Esquema dos eventos associados à conjugação entre células F+ e F-.
Eventos associados à conjugação entre uma célula Hfr e outra F-. Observe que a célula F- permanece como receptora, uma vez que a região tra normalmente não é transferida.
Transdução: (Lederberg & Zinder, 1952) transferência mediada por vírus, podendo ser generalizada (qualquer fragmento de DNA) ou especializada (determinados genes, passados por fagos temperados).
Transdução generalizada: Descoberta em Salmonella typhimurium com o fago P22, embora este processo também ocorra em outras bactérias, tais como E. coli. Este tipo de processo requer a ocorrência de um ciclo lítico, onde eventualmente pode haver o empacotamento de fragmentos de DNA da célula hospedeira, gerando partículas denominadas partículas transdutoras, que correspondem ao capsídeo viral contendo em seu interior DNA bacteriano. Embora não possam ser descritas como vírus, as partículas transdutoras exibem a capacidade de adsorção à superfície de outras células bacterianas. A frequência com que um determinado gene é transferido é baixa uma vez que cada partícula transdutora leva apenas um determinado fragmento de DNA (1 em 106 ou 108 cél. recebem um determinado gene).
Transdução especializada: Evento raro, embora bastante eficiente. O exemplo melhor conhecido e primeiramente descoberto foi a transferência de um genes que codificam produtos envolvidos na degradação de galactose pelo fago de E. coli. A etapa inicial no processo corresponde à infecção e lisogenização do fago, que ocorre em sítios específicos do genoma. Neste caso, a integração do fago ocorre adjacente ao conjunto de genes envolvidos na utilização de galactose. Pela ação de algum indutor (ex: UV) há a separação do fago do genoma (integração reversa), que normalmente ocorre perfeitamente. Entretanto, em alguns casos, essa separação é defeituosa, promovendo a remoção de genes bacterianos e deixando parte do genoma viral na célula. Essas partículas podem ser de dois tipos: aquelas que carregam genes gal e outras que carregam genes bio. Aquelas partículas levando genes gal são denominadas dgal (defectivas, contendo o gene gal), porque são incapazes de formar partículas virais maduras (porque deixam no hospedeiro o gene que codifica a proteína integrase). Quando estas partículas infectam novas células, juntamente com fagos normais (helper), pode haver a transferência de genes gal, a partir da infecção e lisogenização dos dois fagos.
Transdução especializada: este processo é dependente da ocorrência de um ciclo lisogênico. O fago integra seu DNA ao DNA bacteriano e após um determinado período de tempo e de acordo com certos estímulos, este fago pode iniciar um ciclo lítico. Caso a excisão do DNA viral ocorra de maneira defeituosa, poderá haver a transferência de um pequeno fragmento de DNA bacteriano (porque parte do DNA viral ficará incorporado ao genoma bacteriano). Este vírus "defeituoso" poderá transferir o DNA bacteriano para outras células.
Conversão lisogênica: Transferência de genes de fagos para bactérias. A própria lisogenização torna a bactéria imune a outras infecções por este fago, mas além disso, outros fenótipos podem ser adquiridos. O exemplo mais clássico consiste na conversão de células atoxigênicas de Corynebacterium diphtheriae em toxigênicas, pelo fago ß. Assim, a bactéria recebe um gene que codifica uma toxina, sendo este gene de origem viral.