Sem diretoria durante o período de abril de 1964 a julho do ano seguinte, a UNE elegeu nova direção no seu XXVII Congresso, procurando mobilizar os estudantes na defesa de seu espaço político ameaçado pela Lei Suplicy e pelo Decreto Aragão — que proibiu a organização estudantil em nível nacional, só permitindo-a em diretórios por universidade e escola —, e, ao mesmo tempo, no combate ao regime político instituído em 1964. Em julho de 1966, a UNE realizou seu XXVIII Congresso em Belo Horizonte. Nesse encontro, os estudantes concentraram suas críticas no acordo firmado pouco antes entre o governo federal e a United States Agency for International Development (USAID), conhecido como Acordo MEC-USAID, que entre outros pontos visava estimular a privatização do ensino superior brasileiro através da transformação das universidades mantidas pelo Estado em fundações.
O XXIX Congresso da UNE foi realizado em agosto de 1967, num mosteiro beneditino perto de Campinas (SP), sempre na ilegalidade. Pouco antes do encontro, haviam ocorrido conflitos de rua entre policiais e estudantes na capital paulista. Na reunião, as maiores críticas dirigiram-se contra a política educacional do governo, que admitia a interferência de organismos estrangeiros em sua orientação, e contra a contenção geral dos salários colocada em prática pelos militares. Ainda em 1967, a UNE rompeu com a União Internacional dos Estudantes (UIE), com sede em Praga, alegando que a entidade era pró-soviética, enquanto a direção da UNE era mais próxima da linha política chinesa.
O nível de tensão entre o governo e o movimento estudantil ganhou nova dimensão em 28 de março de 1968, quando o estudante secundarista Edson Luís Lima Souto, de 18 anos, foi morto a bala pela polícia no Rio de Janeiro, durante uma manifestação contra o fechamento do restaurante Calabouço, que atendia sobretudo a estudantes pobres oriundos de outros estados. Cerca de 20 estudantes saíram feridos da agressão policial. A morte de Edson Luís foi imediatamente denunciada pelo Movimento Democrático Brasileiro (MDB), partido de oposição ao regime militar, na Assembléia Legislativa do então estado da Guanabara, para onde o corpo do estudante foi levado.
No dia 29 de março, cerca de 60 mil pessoas participaram do cortejo fúnebre até o cemitério São João Batista, em Botafogo. A manifestação transcorreu normalmente, sem intervenção policial. No resto do país, entretanto, ocorreram demonstrações e marchas de protesto. Em Salvador, Belo Horizonte, Goiânia e Porto Alegre, estudantes e populares entraram em choque com as forças policiais. A UNE decretou greve geral dos estudantes.
Ainda em 1968, a entidade promoveu passeatas em quase todas as cidades do país onde havia um número significativo de estudantes em escolas superiores, às quais se juntaram professores, escritores, artistas, religiosos e outros setores das camadas médias, como, por exemplo, na Passeata dos Cem Mil, que paralisou o Rio de Janeiro durante quase todo o dia 26 de junho de 1968 e marcou o momento de maior amplitude do movimento estudantil brasileiro desde 1964. Ao mesmo tempo em que se desenvolviam as tentativas dos estudantes de manter a UNE funcionando, enfrentando restrições governamentais, ela foi se tornando cada vez mais uma bandeira de luta (“A UNE somos nós”) do que propriamente uma entidade.
Em outubro de 1968, a UNE sofreu uma de suas maiores derrotas, com a prisão do presidente eleito, Luís Travassos, de várias lideranças estudantis, tais como Vladimir Palmeira, José Dirceu, Franklin Martins e Jean Marc van der Weid e de mais de setecentos delegados ao XXX Congresso da entidade, realizado clandestinamente em Ibiúna (SP). Na ocasião, a maioria dos estudantes foi enquadrada na Lei de Segurança Nacional. Ainda assim, embora cada vez mais afastado das bases e enfrentando forte repressão depois da edição do Ato Institucional nº 5 (AI-5), o movimento estudantil tentou manter uma direção para a UNE com a posse de mais dois presidentes substitutos — Jean Marc van der Weid, preso em 1969, e, posteriormente, Honestino Guimarães, desaparecido em 1973 —, mas efetivamente não havia condições políticas de atuação. Abriu-se, então, um período de paralisação das atividades da UNE, que se estenderia até 1979.
Para isso muito contribuiu o Decreto-Lei nº 477, baixado pelo presidente da República, general Artur da Costa e Silva, em 26 de fevereiro de 1969, dois meses depois da promulgação do AI-5. O decreto previa as infrações disciplinares de cunho político dos professores, alunos e funcionários de estabelecimentos de ensino, bem como as penas, bastante severas, a eles aplicáveis. Os professores e funcionários seriam demitidos, não podendo ser contratados por outros estabelecimentos de ensino durante o prazo de cinco anos. Os estudantes seriam desligados dos cursos que estivessem fazendo e proibidos de se matricular em qualquer outro estabelecimento de ensino durante os três anos seguintes. O Decreto-Lei nº 477 foi aplicado mais intensamente até 1973, período em que atingiu 263 pessoas, quase todas estudantes.