Bolsa 14/05902-5 - Cinética enzimática, Fluorescência - BV FAPESP
Determinação das constantes cinéticas da redução de peroxirredoxinas por tiorredoxinas através de alterações de fluorescência em diferentes estados redox
Processo: 14/05902-5
Beneficiário: Felipe Maciel Zurlo
Assunto(s): Cinética enzimática Fluorescência Peroxirredoxinas Química de macromoléculas Tiorredoxinas Oxirredução
2-Cys Peroxirredoxinas (2-Cys Prx) são enzimas antioxidantes capazes de decompor uma grande variedade de hidroperóxidos (R-OOH) utilizando um resíduo de cisteína, denominada de cisteína peroxidásica (CP-SH), a qual no processo de decomposição de peróxidos é oxidada à cisteína ácido sulfênico (CP-SOH). As 2-Cys Prx possuem uma segunda cisteína denominada de cisteína de resolução (CR), que forma um dissulfeto durante o ciclo catalítico com CP, que frequentemente é reduzido pela enzima tiorredoxina (Trx). Adicionalmente à redução das Prx, as Trx estão envolvidas em diversos processos biológicos como crescimento celular, inibição de apoptose, ativação de transcrição e síntese de DNA. Estudos iniciais envolvendo cinética de estado estacionário indicaram que as 2-Cys Prx apresentavam baixas taxas de decomposição de hidroperóxidos, 104-5 M-1s-1, entretanto novas metodologias envolvendo alterações de fluorescência ou cinética competitiva com HRP revelaram que estas enzimas possuem uma reatividade sobre hidroperóxidos na ordem de 107-8 M-1s-1. Em condições de elevado estresse oxidativo, pode ocorrer a superoxidação de CP, formando espécies superoxidadas como a cisteína ácido sulfínico (CP-SO2H) e sulfônico (CP-SO3H). Em eucariotos, a superoxidação de CP ocasiona a perda de atividade peroxidásica, uma vez que estas espécies não são reduzidas por Trx. Entretanto, a superoxidação resulta na alteração da estrutura quaternária das Prx, levando a formação de estruturas de alto peso molecular com propriedade de chaperona molecular. Neste contexto, a relação das Prx com Trx aparentam ter elevada importância uma vez que em linhagens Dtrx de eucariotos a oligomerização das Prx é altamente comprometida. Em Saccharomyces cerevisiae, há duas isoformas citosólicas de Prx (Tsa1 e Tsa2) que apresentam grande similaridade e são altamente relacionadas às isoformas humanas Prx1 e Prx2 (67% de identidade e 77% similaridade). Tsa1 e Tsa2 apresentam atividade de chaperona, sendo que ambas as enzimas podem ser reduzidas pelas tiorredoxinas citosólicas, Trx1 e Trx2, as quais compartilham elevada semelhança nas suas estruturas primárias (78% de identidade e 89% de similaridade). Estudos recentes envolvendo cinética competitiva com HRP revelaram que as enzimas Tsa1 e Tsa2 apresentam taxas na de composição de H2O2 e NOO- de 107-8 M-1s-1. Adicionalmente, foi demonstrado que Trx1 e Trx2 são reduzidas por TrxR1 em taxas 107 M-1s-1. Entretanto, quando se avalia a atividade peroxidásica da tiorredoxina dependente das enzimas utilizando o sistema Trx (NADPH®TrxR®Trx ®Prx®R-OOH) na ordem de 104-5 M-1s-1. Neste contexto, as taxas de redução para a Trx1 ou Trx2 parecem ser limitantes para a redução das Prx, entretanto, nenhum estudo até o momento atentou para verificar se as taxas de redução de Tsa1 e Tsa2 são equivalentes ou distintas quando se utiliza Trx1 ou Trx2. Adicionalmente, demonstramos recentemente que os resíduos E50 e R146 de Tsa1 estão relacionados com a interação com Trx, uma vez que mutantes Tsa1E50A e Tsa1R146Q apresentam grande queda na atividade de peroxidase dependente de Trx, entretanto não foi possível quantificar de forma acurada o decaimento das taxas de redução. Este projeto tem por objetivo a determinação das taxas de redução de Tsa1 e Tsa2 e mutantes Tsa1E50A e Tsa1R146Q por Trx1 e Trx2, por meio da alteração da fluorescência intrínseca das Prx utilizando mutantes Trx1W29F e Trx2W30F pela técnica sttoped flow. Também serão realizados esforços para determinar as taxas de redução de Prx1 e Prx2 por Trx de humanos. Uma vez que as taxas de redução das Prx por Trx estão relacionadas com manutenção da homeostase redox e também com a troca de função peroxidase-chaperona, acreditamos que os resultados deste projeto possam dar importantes contribuições para um melhor entendimento da biologia destas enzimas.