Por volta do ano 1000, os índios tapuias que habitavam a região foram expulsos para o interior do continente devido à chegada de povos tupis procedentes da Amazônia. No século XVI, quando chegaram os primeiros europeus à região, a mesma era habitada pela tribo tupi dos tupinambás.
A cidade foi fundada em 1557 e cresceu sobre terraços ao lado do rio Subaé. Em 1559, a sesmaria que englobava o atual território de Santo Amaro foi doada a Fernão Rodrigues Castelo Branco. No ano seguinte, o mesmo a doou a Francisco de Sá, filho do governador-geral Mem de Sá. Francisco construiu o Engenho Real de Sergipe. Francisco morre antes do pai, que passa para sua filha Felipa de Sá.
Felipa de Sá vendeu aos monges beneditinos. Em 1667, monges beneditinos construíram a Capela de Santo Amaro. Felipa de Sá doou ainda ao colégio de Santo Antão de Lisboa o Engenho do Conde e nele os Jesuítas construíram a Igreja de Nossa Senhora da Purificação em 1608. Em 1678 este templo ruiu, em 18 de Outubro de 1700 foi realizada uma missa no local que em 1706, foi iniciada a construção da atual Igreja Matriz de Nossa Senhora da Purificação. Foi elevada a vila o município em 5 de janeiro de 1727. Tornou-se cidade em 13 de março de 1837, denominada de "Leal e Benemérita". Em 1847, foi estabelecida ligação marítima regular com a capital da província, Salvador, por navio a vapor. Em 1855, uma epidemia de cólera dizimou metade da população.