Direct organogenesis of rice (Oryza sativa L.) mesocoptiles
Maristela dos Santos ReyI,*; Daiane Schmidt de PinhoII; Anieb Prestes VieiraIII; Eugenia Jacira Bolacel BragaIV; Carlos Roberto PierobomI; José Antônio PetersIV
IPrograma de Pós-graduação em Fitossanidade, Universidade Federal de Pelotas, Caixa Postal 354, 96010-900, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
IIPrograma de Pós-graduação em Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
IIIUniversidade Federal de Pelotas, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
IVDepartamento de Botânica, Instituto de Biologia, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
VPrograma de Pós-graduação em Fisiologia Vegetal, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
Palavras-chave: cultivo in vitro, regeneração, regulador de crescimento.
Key words: in vitro culture, regeneration, growth regulator.
As respostas in vitro da maioria dos cereais, vêem sendo pesquisadas intensamente já há alguns anos. O arroz é uma das culturas mais estudadas, já que é fonte importante de alimento para grande parte da população mundial (SAHRAWAT; CHAND, 2001). A técnica de cultivo in vitro é de suma importância, já que é uma ferramenta para muitos trabalhos que envolvam biotecnologia, visto que técnicas de regeneração tornam-se indispensáveis para o sucesso em trabalhos que envolvam introdução de DNA exógeno (SALLAUD et al., 2003). Entretanto, a aplicação dos cultivos in vitro em engenharia genética depende da disponibilidade, repetibilidade e alta eficiência dos sistemas de regeneração de células, tecidos ou orgãos (SHARMA et al., 2007).
A capacidade de regeneração de inúmeros explantes tem sido investigada em arroz e outros cereais, envolvendo principalmente embriões (AL-FORKAN et al., 2004; TINJUANGJUN et al., 2000), e tecidos basais (YOOKONGKAEW et al., 2007). Dentre estes explantes estão os embriões imaturos (SALLAUD et al., 2003) que são dependentes do ciclo da cultura para a sua obtenção, dificultando sua utilização o ano inteiro, tornando difícil ou às vezes, até impossível a realização de alguns estudos. Para superar este inconveniente, atualmente têm-se utilizado explantes oriundos da região basal e meristemática de ápices caulinares obtidos a partir de sementes recém germinadas, que podem ser obtidos em qualquer época, sem a dependência do ciclo da planta (TAVARES et al., 2004).
A regeneração de plantas está intimamente ligada ao uso de reguladores de crescimento no meio de cultura, e na grande maioria das vezes, quando o objetivo é a regeneração de gemas e brotos e quebra da dominância apical, utiliza-se uma citocinina (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). O Thidiazuron (TDZ) é um regulador de crescimento, utilizado inicialmente como um desfolhante em algodão (ARNDT et al, 1976 apud CHAUHAN et al., 2007), que tem sido utilizado positivamente na morfogênese in vitro (KHURANA et al., 2005). O TDZ é reportado como uma citocinina que facilita a proliferação de múltipolos brotos em algumas culturas (GAIRI; RASHID, 2004; SRIVATANAKUL et al., 2000), incluindo o arroz (YOOKONGKAEW et al., 2007) e outras espécies como feijão (MOHAMED et al., 2006), cevada (SHARMA et al., 2005) e trigo (SHAN et al., 2000). Em trabalho realizado por Ganesham et al. (2003) foi evidenciado o efeito positivo do TDZ na regeneração de brotações oriundas de embriões maduros, porém a citocinina não demonstrou efeito positivo na emissão de brotos oriundos de escutelos, ratificando a ocorrência de respostas adversas dependendo do tipo de explante utilizado em trabalhos de regeneração de plantas.
Este estudo tem por objetivo verificar o efeito deste regulador de crescimento sobre a taxa de regeneração, através de organogênese direta, e comprimento das brotações a partir de mesocótilos de duas cultivares de arroz, visando sua utilização em trabalhos de transformação genética.
Como material vegetal foram utilizadas duas cultivares de arroz, BRS Taim e BRS Querência, oriundas da Embrapa Clima Temperado. Sementes destas cultivares, previamente descascadas, foram desinfestadas com álcool 70%, durante 3 min., solução de hipoclorito de sódio 3% por 25 min., seguido de três lavagens em água destilada estéril.
Após a desinfestação, as sementes foram inoculadas, em meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) semi-sólido acrescido de 7 g L-1 de ágar, suplementado com 2 mg L-1 de ANA (ácido α-naftalenoacιtico) e mantidas no escuro, à temperatura de 25 ± 1ºC, por 3 a 4 dias. Após a germinação das sementes, as plântulas foram seccionadas, retirando-se os coleóptilos e as bases dos tecidos meristemáticos, e isolando-se somente os mesocótilos com 0,3 a 0,5 cm de comprimento, os quais foram utilizados como explantes.
Para os experimentos de regeneração os explantes foram inoculados em meio MS em frascos de vidro de 100 mL, contendo 100 mg L-1 de mio-inositol, 30 g L-1 de sacarose e Thidiazuron (TDZ) nas concentrações 0, 2, 3, 4 e 5 mg L-1. O pH dos meios foi ajustado para 5,8 antes da adição de 2 g L-1 de gelrite (agente geleitificante) e posteriormente esterilizados em autoclave a 121ºC e 1,5 atm. Após a inoculação dos explantes nos meios de cultura, estes foram transferidos para sala de crescimento com temperatura de 25 ± 1 ºC, fotoperíodo de 16h e densidade de fluxo de fótons de 42 µmol m-2 s-1.
Sete a dez dias após o inicio dos experimentos, quando se observava o desenvolvimento de uma única brotação, realizou-se o corte da região apical da mesma, deixando-se o explante com 0,5 a 1,0 cm de comprimento, possibilitando assim uma melhor multiplicação das brotações basais. Quarenta e cinco dias após a inoculação dos mesocótilos nos diferentes meios de cultura foram realizadas as avaliações, sendo as brotações primárias, previamente separadas e cortadas na parte apical. Após, estas foram novamente inoculadas em meio MS contendo 3 mg L-1 de TDZ, nas mesmas condições de incubação e procedimentos citados acima. No primeiro experimento, foi determinado o número de brotações por explante inoculado, bem como o comprimento de cada brotação, utilizando-se para tal fim uma régua milimetrada. Já, para o segundo experimento foi avaliado apenas o número de brotações originadas por broto primário. O delineamento foi inteiramente casualizado contendo quatro repetições e 10 plantas por parcela (frascos de vidro de 100 mL). Para interpretação dos dados foi aplicado uma regressão polinomial para análise da regeneração e comprimento das brotações, calculados por meio do programa estatístico SANEST.
Conforme resultados obtidos, a regeneração de brotações ocorreu através de organogênese direta dos mesocótilos, isto é, não houve formação de calo. Analisando-se a Tabela 1 verifica-se para a variável regeneração de brotos que apenas o fator doses de TDZ foi significativo. Já com relação ao comprimento dos brotos verificam-se diferenças estatísticas entre as doses de TDZ, bem como uma interação entre estas e as cultivares estudadas.
A Figura 1 comprova que a taxa de regeneração ajustou-se em uma regressão quadrática para as duas cultivares, sendo que a emissão dos brotos obteve seu ponto máximo na dose 3,58 mg L-1, ocorrendo a partir desta concentração uma queda na regeneração de brotações.
A maior taxa de regeneração da cultivar BRS Taim ocorreu com 3 mg L1 , com média de 25,57 brotos por explante. Já, para o cultivar BRS Querência, o melhor comportamento com relação a esta variável foi obtido com 4 mg L-1 do regulador, com 24,35 brotações/explante (Figura 2). Entretanto, para os dois genótipos não ocorreu diferença estatística com relação às doses do regulador, porém estas diferiram significativamente da testemunha (0 mg L -1).
A Figura 2 demonstra o comportamento das cultivares em relação a variável comprimento dos brotos, na qual os dados se ajustaram em regressões quadráticas. As linhas de tendência evidenciam que o comprimento de brotos foi drasticamente reduzido já com 2 mg L-1 do regulador de crescimento, ocorrendo uma diminuição de 85,5% para BRS Taim e 93,7% para BRS Querência, desta concentração em relação ao tratamento testemunha.
No entanto, a concentração que mais afetou esta variável foi com 4 mg L-1, obtendo-se médias de 1,54 cm e 0,96 cm para as cultivares BRS Taim e BRS Querência, respectivamente.
Os resultados obtidos discordam de Tavares et al. (2004), que trabalhando com mesocótilos como explante, relataram resultados negativos de regeneração, quando utilizaram meio de cultura contendo TDZ, ANA, caseína, sorbitol e sacarose em regeneração da cultivar de arroz BRS Taim. Porém, em trabalho realizado por Gairi e Rashid (2004) foi evidenciado que cariopses de arroz cultivadas em meio de cultura MS contendo ANA e subsequente passagem para MS com 10 µM de TDZ, resultou em 50% de regeneração de brotos. Harshavardhan et al. (2002) relataram que 1 mg L-1 de TDZ, utilizado juntamente com BAP e ANA induziu a formação de múltiplos brotos em sorgo. Já Kishore et al. (2006) relatam bons resultados de regeneração na mesma cultura, empregando apenas 0,5 mg L-1 de TDZ.
Alguns trabalhos são reportados sobre o benefício do TDZ na regeneração de diferentes espécies, porém quando usado associado a outro regulador de crescimento (GAIRI; RASHID 2004; SHARMA et al., 2005; SHARMA et al., 2007; CARAMORI et al., 2001). Entretanto, conforme dados deste estudo, obtiveram-se altos índices de regeneração quando o TDZ foi usado isoladamente no meio de cultura, promovendo altas taxas de regeneração por organogênese direta a partir de mesocótilos e sem formação de calo (Figura 3).
Diferentemente dos dados deste estudo, muitos trabalhos com o uso do TDZ reportam resultados de regeneração de gramíneas via organogênese indireta, incluindo culturas como trigo, cevada e triticale (GANESHAN et al., 2006; SHAN et al., 2000; GANESHAN et al., 2003) e alguns em arroz (TAVARES et al., 2004).
O TDZ evidenciou uma maior taxa de regeneração de brotações que o regulador de crescimento BAP (dados não mostrados). No entanto, o efeito do regulador pode ser tóxico para a regeneração de brotos em doses elevadas. Os dados deste trabalho indicaram que o TDZ reduziu em 20 e 20,78% a regeneração de brotos dos genótipos BRS Taim e BRS Querência, respectivamente, quando utilizou-se concentrações mais elevadas deste regulador de crescimento (4 e 5 mg L-1), denotando um efeito possivelmente tóxico do mesmo (Figura 2). Isto pode ser confirmado em estudo realizado por Chauhan et al. (2007) quando concentrações mais elevadas de TDZ tornaram-se deletérias para a regeneração de embriões imaturos de trigo. Em contrapartida, os autores afirmam ainda que o regulador em concentrações menores pode potencializar a regeneração de brotos.
Com relação a redução do comprimento das brotações, uma hipótese seria que, doses menores que 2 mg L-1 pudessem reduzir esta porcentagem de inibição da altura das brotações. Esses dados concordam com Perez e Kerbauy (2004) quando estes mencionam que, quando se usa uma citocinina, o hormônio de crescimento concentra-se nas gemas laterais, promovendo seu desenvolvimento e consequentemente reduzindo a dominância apical.
No segundo experimento foi estudada a capacidade de regeneração dos brotos primários, oriundos dos mesocótilos. Sendo seus produtos de regeneração denominados brotos de primeira passagem (BPP). Com relação as doses do TDZ na regeneração dos BPP, observou-se que ocorreu diferença estatística entre as cultivares e entre os tratamentos, ocorrendo, também, uma interação entre esses fatores (Tabela 2).
A Figura 4 indica que o comportamento distinto das duas cultivares ajustou-se em duas regressões cúbicas. As curvas demonstraram que a regeneração de BPP para as duas cultivares não manteve um aumento constante de regeneração, havendo uma queda significativa a partir do tratamento 4 mg L-1, para as duas cultivares.
A concentração 4 mg L-1 originou os maiores resultados de emissão de BPP, com médias de 11,83 e 16,00 brotos para BRS Taim e BRS Querência, respectivamente (Figura 4), a partir daí ocorre uma redução nos resultados desta variável. Husain et al. (2007) estudando o efeito do TDZ em uma espécie florestal, concluíram que doses maiores que 0,4 mg L-1 do regulador, reduzem em até 40% sua regeneração de brotos.
Um fator a ser mencionado, é a ocorrência de explantes com brotos vitrificados e com as pontas enroladas nas duas etapas do experimento (dados não apresentados), em todas as doses estudadas. Também ocorreram explantes com brotações, na sua grande maioria atrofiados, senescidos, aglomerados ou com aspecto de queima (Figura 3). Este efeito provavelmente seja consequência de algum efeito fitotóxico da concentração de TDZ no meio de cultura. O surgimento de vitrificação com uso de TDZ também foi verificado por Chun-Lai et al. (2001) estudando seus efeitos na regeneração de beterraba.
Este trabalho demonstrou que o uso de TDZ, favorece a regeneração de brotos, porém, este pode ser nocivo aos explantes, quando manipulado em doses elevadas. Assim, estudos devem ser realizados para se estabelecer um protocolo de regeneração que envolva doses do regulador de crescimento que não afetem a qualidade dos explantes.
O TDZ é eficiente na regeneração de brotos a partir de mesocótilos de sementes recém germinadas das cultivares BRS Taim e BRS Querência, embora induza, com o aumento das concentrações utilizadas, brotações vitrificadas.
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