O ácido cítrico foi descoberto no oitavo século depois de Cristo pelo alquimista islâmico Abu Musa Jabir ibn Hayyan. Foi o primeiro ácido isolado em 1784, pelo químico sueco Carl Wilhelm Scheele, que o cristalizou a partir do suco do limão.
A produção comercial deste composto teve início na Inglaterra por volta de 1826, a partir do citrato de cálcio italiano derivado do suco de limão, porém o comércio era monopolizado por um cartel italiano com preço elevado. Em 1880, o ácido cítrico foi sintetizado a partir do glicerol e, mais tarde, a partir da dicloroacetona. Vários outros métodos de síntese foram estudados, utilizando-se diversos tipos de reações e substâncias, porém limitações técnicas e econômicas comprovaram a inviabilidade desses processos.
Em 1893, cientistas descobriram que uma espécie fúngica de Citromyces (atualmente denominada Penicillium) acumulava ácido cítrico em meio contendo açúcar e sais orgânicos. No entanto, esse processo industrial não teve êxito devido aos problemas de contaminação e longo período de fermentação. Em 1916, constatou-se que algumas linhagens de Aspergillus niger excretavam quantidades significativas de ácido cítrico quando cultivadas em meio com alta concentração de açúcar, sais minerais e pH de 2,5 a 3,5. Esse estudo foi a base para o sucesso da produção industrial desse ácido.
O ácido cítrico ou citrato de hidrogênio, de nome oficial ácido 2-hidroxi-1,2,3-propanotricarboxílico, é um ácido orgânico fraco, que pode ser encontrado nos citrinos. É um ácido orgânico tricarboxílico presente na maioria das frutas, sobretudo em cítricos como o limão e a laranja. Sua formula química é C6H8O7. As propriedades físicas do ácido cítrico estão resumidas na Tabela 1.
Decompõe-se a 175°C
O ácido cítrico é elaborado e excretado em meios de cultura cujo pH esteja próximo de 1,8 a 2,0. A degradação da glicose (glicólise, sequência de reações bioquímicas catalisadas por enzimas específicas) produz energia e metabólitos. O produto final da glicólise é o ácido pirúvico que, na presença de oxigênio, é metabolizado em acetil-CoA. Existem duas vias principais para obtenção da glicólise; a do monofosfato de hexose (HMP) e a de Embden Meyerhof-Parnas (EMP). Na fermentação com A. niger, ambas as vias são usadas durante todo o tempo. A de maior atividade durante a fase de crescimento, quando pouco ácido cítrico é produzido, é a HMP. Já a via EMP, cuja maior atividade ocorre durante a fase vegetativa, desempenha o principal papel na glicólise da fermentação cítrica, pois é através dela que a maior parte do citrato é formada. Em condições aeróbias, o piruvato gerado da glicose sofre descarboxilação oxidativa formando acetil-CoA. O acetil-CoA derivado da via EMP condensa-se com o oxalacetato para formar citrato. Acredita-se que a entrada desse composto no ciclo de Krebs seja abortada, não pela inativação das enzimas que catalisam essa passagem, mas devido à excessiva acidez do meio (pH próximo de 2). O ciclo do ácido cítrico é a via final comum para a oxidação de moléculas alimentares. A maioria das moléculas entram no ciclo como acetil CoA. O ciclo também fornece intermediários para a biossíntese. Em eucariontes, as reações do ciclo do ácido cítrico ocorrem no interior da mitocôndria, em contraste àquelas da glicólise, que ocorrem no citossol.
Atualmente, quase todo o ácido cítrico comercializado no mundo é produzido por fermentação, embora uma pequena parte ainda seja obtida de frutas cítricas, no México e na América do Sul. A fabricação de ácido cítrico pode ser realizada através de três processos: Koji, no qual o substrato é sólido, sendo utilizada uma linhagem específica de Aspergillus niger; fermentação em superfície, onde o micélio do fungo (Aspergillus niger) cresce sobre a superfície do meio de cultura estático, sendo o produto da fermentação recolhido do meio; e fermentação por cultura submersa, onde o fungo se desenvolve inteiramente submerso no meio de cultura líquido sob agitação, que serve para assegurar a homogeneidade tanto da distribuição dos microorganismos quanto dos nutrientes.
O Aspergillus niger é um gênero de fungos que apresenta coloração branca amarelada com formação de pedúnculos e uma ponta colorida. São importantes agentes decompositores de alimentos, sendo utilizados na produção de alimentos e produção comercial de ácido cítrico, glucônico e gálico.
O ácido cítrico é um dos ácidos orgânicos mais utilizados, com uma produção de aproximadamente 63,5 milhões de quilogramas. Os ácidos orgânicos como, por exemplo, o ácido fumárico, ácido maléico e ácido adípico podem ser usados para substituir o ácido cítrico. É fabricado pela fermentação aeróbica do açúcar bruto ou do açúcar de milho por uma casta especial de Aspergillus niger, exceto para pequenas quantidades (menos de 7%), onde a produção ocorre por meio de refugos de frutas cítricas.
A fermentação transforma o açúcar e a dextrose, compostos com cadeias lineares, em compostos com cadeias ramificadas. Um processo mais antigo, de fermentação em tanques rasos, foi abandonado em virtude do dispendioso processamento manual e do desenvolvimento do processo de fermentação submersa. Em linhas gerais, o processamento pode ser esquematizado da seguinte maneira: soluções contendo açúcares em dissolução são inoculadas com o microorganismo adequado para sintetizar ácido cítrico. As soluções açucaradas correspondem a mosto de sacarose, que é esterilizado e resfriado. Após o resfriamento, é inoculado com cultura pura de Aspergillus niger.
A bioconversão dos resíduos agrícolas e da indústria de alimentos está recebendo crescente atenção, uma vez que essas matérias residuais apresentam recursos possíveis e utilizáveis para a síntese de produtos úteis. Nesse contexto, a fermentação em estado sólido (FSS) desempenha um papel de destaque no aproveitamento de resíduos sólidos, pois, em virtude do crescimento microbiano, ocorre a síntese de diversos compostos, dos quais muitos apresentam grande interesse para segmentos industriais, além de elevado valor agregado. O termo fermentação em estado sólido, ou fermentação semi sólida, ou ainda, fermentação em meio semi sólido, aplica-se ao processo de crescimento de microorganismos sobre substratos sólidos sem a presença de água livre. A água presente nesses sistemas encontra-se ligada à fase sólida, formando uma fina camada na superfície das partículas. A fermentação em estado sólido também apresenta as seguintes características: a fase sólida atua como fonte de carbono, nitrogênio e demais componentes, além de servir como suporte para o crescimento das células microbianas; o ar, necessário ao desenvolvimento microbiano, deve atravessar os espaços vazios do meio a pressões relativamente baixas; o substrato não deve apresentar aglomeração das suas partículas individuais; e o crescimento microbiano ocorre em condições mais próximas às dos habitats naturais.
O meio apresenta alta heterogeneidade e os substratos não estão completamente acessíveis ao microorganismo. Os substratos para a fermentação em estado sólido são, em geral, resíduos ou subprodutos da agroindústria. Farelos, cascas, bagaços e outros são materiais considerados viáveis para a biotransformação. São recursos naturais renováveis e produzidos em grandes quantidades, o que, algumas vezes, faz com que se tornem um problema ambiental. A estrutura desses materiais tem como seus principais componentes celulose, hemicelulose, lignina, amido, pectina e proteínas, o que os caracteriza como materiais extremamente heterogêneos, e que servem tanto como fonte de carbono e energia quanto de suporte para o crescimento microbiano.
No Brasil há uma grande geração de resíduos ou subprodutos agroindustriais, devido seu grande potencial para a produção agrícola. Nesse sentido, a fermentação em estado sólido se apresenta como uma tecnologia capaz de propor caminhos alternativos para os resíduos gerados, diminuindo possíveis problemas ambientais. Além disso, agrega valor a essas matérias-primas, por meio da produção de substâncias de interesse econômico, como enzimas, hormônios, ácidos orgânicos, aromas, pigmentos e agentes de controle biológico de pragas, entre outros, e com isso contribuir para uma maior diversificação do agronegócio nacional.
Em escala comercial, uma das principais aplicações da fermentação em estado sólido é a produção de ácido cítrico a partir de farelo de trigo. Esse processo é também conhecido por Koji. Antes da esterilização, o pH do farelo é ajustado para ficar entre 4 e 5. Cuidados devem ser tomados para que a concentração final de água no farelo, depois da esterilização, seja de 70% a 80%. Quando o farelo estiver numa temperatura em torno de 30°C a 36°C, ele é inoculado em Koji (preparado prévio contendo amilases e proteases), que é feito com uma cepa apropriada de A. niger, não tão susceptível à presença de íons de ferro como as usadas em outros processos. A temperatura durante a fermentação não deve exceder os 28°C. A adição de 3% a 7 % de massa filtrada (filter cake) de fermentação de ácido glutâmico aumenta a produção. O amido originalmente presente no farelo é sacarificado pela amilase do A. niger. A adição de α-amilase ao farelo, depois de resfriado, também é proveitosa. O farelo inoculado é distribuído em bandejas com profundidade de 3 a 5 cm, ou disposto em camadas pouco espessas numa superfície plana. Depois de cinco a oito dias, o Koji é recolhido, colocado em percoladores e o ácido cítrico extraído como água. Os métodos de separação e purificação são essencialmente os mesmos utilizados nos outros dois processos.
O processo de fermentação em superfície foi o primeiro processo a fornecer ácido cítrico a baixo preço e ainda é utilizado por muitos fabricantes, mas é considerado segredo industrial. Uma única descrição detalhada desse processo foi publicada em 1950. O mosto inoculado é distribuído em bandejas rasas, feitas de alumínio com alto teor de pureza ou de aço inoxidável. Ar úmido é soprado sobre a superfície do mosto por cinco ou seis dias, passando-se, depois a utilizar ar seco. Os esporos germinam dentro de 24 horas e o micélio cobre a superfície do mosto. Oito ou dez dias depois da inoculação, a concentração de açúcar é reduzida de 20% a 25% (inicial) para 1% a 3 % (final). Quando a fermentação termina, o mosto pode ser drenado e substituído por outro novo. Nesse caso, devem ser tomados os cuidados necessários para garantir que o micélio continuará flutuando sobre a superfície (se ele for submerso, torna-se inativo). Isso faz com que o tempo do ciclo de fermentação seja reduzido (já que o período inicial de crescimento de três dias, no qual a produção de ácido cítrico é pequena, estará sendo eliminado). Contudo, é duvidoso que essa prática seja empregada em produção de larga escala. As fontes de carbono de escolha são a sacarose, e os melaços de cana e de beterraba (que são economicamente vantajosos, embora a produção de ácido seja ligeiramente menor). Melaços são subprodutos da indústria açucareira, que contém 50% a 60 % de sacarose, que não pode ser removida por simples cristalização. Como a concentração de íons metálicos interfere no rendimento da fermentação, eles devem ser removidos ou ter sua concentração reduzida quando esses íons estiverem presentes em quantidades indesejáveis no mosto (por adsorção com uma combinação de CaCO3, sílica gel, fosfato de cálcio e amido). O pH do meio de cultura para a produção de ácido cítrico é usualmente de 5 a 6 (faixa inicial), caindo na fase de germinação do esporo rapidamente para a faixa de 1,5 a 2,0, devido à remoção de íons de amônio do meio. Se aumentar ou for ajustado para 3,5 (aproximadamente) depois da mudança inicial, ocorre a formação de ácido oxálico no micélio que, às vezes, é excretado para o meio e dificulta a purificação do ácido cítrico. A produção nesse processo é de aproximadamente 80% a 85% da massa de carboidratos inicialmente fornecida.
Em 1930, o processo de fermentação por cultura submersa foi descrito usando Aspergillus niger japonicus (provavelmente A. japonicus Saito), borbulhando brandamente uma corrente de ar em um meio de cultura de 15 cm de profundidade, obtendo dessa forma o crescimento do micélio submerso e detectando a presença de ácido cítrico no meio, mas em quantidades inferiores à produção observada na fermentação de superfície. Em 1933, foram descritos os experimentos com um meio sendo agitado; em 1938, aplicou-se também para a fermentação submersa a idéia de deficiência de fosfato (nenhum dos dois reconheceu, no entanto, a influência da presença de traços de íons metálicos no rendimento da fermentação). Em 1944, foi obtida uma patente para a fermentação de cultura submersa por crescimento de A. niger em um meio rico em fosfato, com posterior transferência para outro meio sem fosfato, ou pelo método de crescimento do micélio em um meio no qual inicialmente não havia sido fornecida a quantidade adequada de fosfato. Supunha-se que o crescimento do micélio poderia remover todo o fosfato do meio, deixando-o livre dessa substância. Em 1953, descobriu-se que a adição de metanol nos meios de cultura resultava no aumento da produção de ácido cítrico. Todavia, não se obteve um processo comercialmente viável. Estudos conduzidos pelos laboratórios Miles não conseguiram demonstrar qualquer relação entre a quantidade de fosfato assimilável no meio de cultura e o rendimento do processo. Em 1947 e 1948, pesquisas demonstraram que quando íons de manganês ou de ferro estavam presentes em concentrações suficientes, pouco ou nenhum ácido cítrico era produzido no meio. Contudo, o A. niger crescia muito melhor quando esses íons eram fornecidos em quantidades menores.
A remoção dos íons metálicos indesejáveis do meio por troca iônica foi demonstrada em 1949, e o uso do íon cobre como um antagonista do ferro foi descoberto em 1957, tornando possível o uso comercial do processo. As vantagens do processo de fermentação submersa sobre o de superfície em termos de custos de investimento e operação induziram pesquisadores a procurar desenvolvê-lo para a obtenção de ácido cítrico. O meio de cultura no processo de fermentação submerso é esterilizado por meio rápido, ou ultra rápido, por passagem de vapor com fluxo turbulento através de tubos de trocadores de calor com camisas de vapor, e imediatamente resfriado até aproximadamente 30°C em outro trocador de calor. O inóculo habitualmente usado são esporos de uma cepa adequada de A. niger crescida em meio nutriente sólido. A composição do meio de cultura (além da fonte de carboidratos) é a seguinte: a concentração desses íons adicionados ao meio para neutralizar os íons de cobre e os íons de ferro varia de 0,1 a 50,0mg/l, dependendo da quantidade de ferro presente no meio.
O ácido cítrico é comercializado como anidro monohidratado e como sal sódico. Na indústria alimentícia é usado como aditivo (acidulante e antioxidante) na fabricação de refrigerantes, sobremesas, conservas de frutas, geléias, doces e vinhos. Também é utilizado na composição de sabores artificiais de refrescos em pó e na preparação de alimentos gelatinosos. Previne a turbidez, auxilia na retenção da carbonatação, potencializa os conservantes, confere sabor frutal característico, prolonga a estabilidade da vitamina C, reduz alterações de cor, realça os aromas e tampona o meio.
Cerca de 70% da produção deste ácido é utilizada pela indústria de alimentos, 12% pela indústria farmacêutica e 18% por outras indústrias. Algumas aplicações do ácido cítrico estão apresentadas na Tabela 2.
TABELA 2 – APLICAÇÕES INDUSTRIAIS DO ÁCIDO CÍTRICO
Aplicações Indústrias Funções
Bebidas Refrigerantes e xaropes Estimula o sabor natural da fruta. Atua como
acidulante em bebidas à base de carbonato e
Vinhos e cidras Previne a turbidez de vinhos e cidras e o
amarelamento de vinhos brancos. Efetua o ajuste
de pH e inibe a oxidação.
Alimentos Congelamento de frutas Protege o ácido ascórbico por inativação de
traços de metais.
Produtos lácteos Atua como emulsificante em sorvetes e no
processamento de queijos. Atua como agente
acidificante em queijos e também como
Agricultura Determina o valor de micronutrientes em
fertilizantes. Aumenta a disponibilidade de
A indústria de doces e geléias é outro exemplo da aplicação do ácido cítrico, onde é utilizado para fornecer acidez e controlar o pH na gelificação.