Curva de calibração - RELATORIO DE PRATICA QUANTO A CURVA DE CALIBRAÇÃO DO...
Relatório de Aulas Práticas de Bioquímica Clínica
Poleana de Almeida
Para medidas de absorção de luz visível e ultravioleta na pesquisa bioquímica a indústria especializada fabrica vários tipos de aparelhos, comumente chamados de espectrofotômetros.
A análise quantitativa em espectrofotometria é realizada através da medida da absorbância, a qual se relaciona linearmente com a concentração dentro de uma faixa de concentração, seguindo a lei de Lambert- beer.
O espectrofotômetro é um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa solução. Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda. Pode-se assim fazer passar através da amostra um feixe de luz monocromática (de um único comprimento de onda, ou quase). O espectrofotômetro permite-nos saber que quantidade de luz é absorvida a cada comprimento de onda, sendo que esta relação de absorbância e comprimento da onda varia de substância pra substância.
Costuma-se chamar de dosagem colorimétrica a qualquer método no qual, por obra de reações químicas, haja a produção de um composto colorido, o qual absorve luz em determinado comprimento de onda. Se houver proporcionalidade entre a intensidade da cor e a concentração da substância, pode-se determinar a concentração da substância em amostras de concentração não conhecida com base numa curva de calibração, que relaciona absorbância e concentração.
A partir destes dados pode-se construir a curva de calibração. Ao observarmos esta curva é possível perceber, por intermédio dos resultados, a formação de uma 'reta' que condiz com a linearidade, passando o significado de confiança. A curva-padrão corresponde à relação gráfica entre os valores de absorbância e os de concentração. Com base na análise gráfica é possível verificar a linearidade da reação e calcular um fator de conversão de valores de absorbância em concentração.
O objetivo desta prática foi determinar a curva de calibração do Permanganato de Potássio.
Preparou-se uma solução a 20mg/dl de Permanganato de Potássio. Esta foi diluída a fim de chegar-se as seguintes concentrações: 0,5 mg/dL; 1 mg/dL; 1,5 mg/dL; 2 mg/dL e 2,5 mg/dL em tubos numerados de 1 a 5 contendo, respectivamente.. Também utilizou-se um quinto tubo nomeado como "Branco", este tubo continha apenas solvente, sem a substância que se desejava de fato medir.
Antes de medir a absorbância foi feita a "zeragem" do aparelho, para eliminar a luz refletida, a turbidez da amostra e a absorbância causada por substâncias interferentes.
Após, as demais amostras foram colocadas no compartimento, uma a uma, para se obter a absorbância de cada concentração conhecida, a fim de poder-se gerar a curva de absorbância do Permanganato de Potássio.
A lei de Lamber-Beer diz que deve haver uma relação linear entre a concentração e a absorbância. Esta linearidade vale dentro de certos limites, a partir de certa concentração deixa de haver proporcionalidade entre concentração e absorbância.
Conforme o Gráfico 1, pode-se observar que entre as concentrações de 0,5 mg/L e 1 mg/L de Permanganato de Potássio houve linearidade entre a concentração e absorbância, porém nas seguintes concentrações entre 1 mg/L e 2,0 mg/L já não houve mais linearidade, o gráfico gerou uma curva, já não estando mais no limite de confiabilidade. Além disso, não se pôde medir a absorbância na concentração de 2,5 mg/L por esta estar muito concentrada.
Concluiu-se que entre as concentrações de 0,5 mg/L e 1 mg/L de Permanganato de Potássio houve linearidade entre a concentração e absorbância, porém, entre 1 mg/L e 2,0 mg/L já não há confiabilidade de um resultado, sendo necessário uma nova diluição da amostra.