O programa de triagem foi altamente eficaz na detecção de alguns casos que não seriam clinicamente reconhecidos antes da triagem. Nesse sentido, atipias genitais leves (casos 3, 4 e 11) e aumento do tamanho do pênis em meninos (casos 6 e 15) não foram detectados antes da avaliação especializada. Mesmo naqueles com genitália ambígua, a HAC não foi diagnosticada antes da triagem, a designação sexual incorreta foi feita em dois casos (2 e 10). De fato, observamos que mais de 50% das meninas tiveram uma avaliação clínica incorreta das características de virilização, o que foi identificado de maneira similar em estudos anteriores.9,15,22 Isso reforça a importância da triagem neonatal universal para hiperplasia no Brasil.
Em relação à grande diferença observada nos valores de corte de 17‐OHP usados para as categorias de peso ao nascer,9,11 é importante observar que os lactentes das categorias de menor peso são comumente internados em unidades de terapia intensiva e continuamente monitorados, inclusive para distúrbios eletrolíticos. De fato, como observado anteriormente durante o primeiro ano de triagem, a maioria dos falso‐positivos era de recém‐nascidos com peso < 2.000g.18 Uma segunda amostra que mostrou níveis mais baixos de 17‐OHP em casos assintomáticos é geralmente suficiente para elucidar os casos falso‐positivos, especialmente em bebês prematuros e recém‐nascidos de baixo peso. Além disso, como relatado anteriormente, as taxas de consanguinidade são maiores entre os casos de HAC.18,23 Dessa forma, essa informação adicional pode ser útil para distinguir os casos reais dos casos falso‐positivos. Da mesma forma, informações sobre o uso de corticoide pela mãe no fim da gestação são relevantes. Nesse caso, a coleta de uma segunda amostra após 15 dias de vida do recém‐nascido ajuda a diagnosticar casos como o do paciente 11, que apresentou virilização leve não reconhecida anteriormente e posterior desenvolvimento da HAC‐PS.22
Altos níveis de 17‐OHP podem estar presentes em recém‐nascidos prematuros e criticamente doentes, o que reforça a triagem estratificada pelo peso ao nascer.9–11 Além disso, o genótipo foi recomendado para melhorar o diagnóstico da precisão da triagem neonatal. Ele ajuda a diferenciar os casos reais de falso‐positivos, esclarece casos limítrofes e, eventualmente, permite que portadores de HAC‐NC sejam diagnosticados.7,13,15 Nos casos confirmados, valores elevados de 17‐OHP corresponderam à gravidade de cada grupo genotípico.14,15,22 Curiosamente, quando os níveis de 17‐OHP foram estratificados de acordo com a gravidade do grupo de mutações na segunda amostra, foi observada uma melhor diferenciação das formas VS (mutações do grupo B) da HAC‐NC (mutações do grupo C), heterozigotos e WT (figs. 2 e 3). Esses três últimos grupos apresentam níveis de 17‐OHP significativamente menores, o que justifica a estratégia de retestar esses pacientes e, quando ainda houver dúvidas, fazer a análise do genótipo.22
A eficácia do programa de triagem também pode ser demonstrada quando formas graves, como portadores de mutações do grupo Null, são identificadas.15 Deleção e grandes conversões gênicas que caracterizaram o grupo Null foram observadas em 20% da nossa amostra, o que está de acordo com um recente e grande estudo de correlação genótipo‐fenótipo.24 O grupo de mutações Null em homozigose foi observado em 26,67% de nossa amostra (4/15 pacientes) e nos grupos Null e A em heterozigose composta, o que caracterizou a HAC‐PS, em outros três pacientes. No paciente 11, não houve correlações fenótipo‐genótipo claras como resultado da manifestação de um fenótipo de HAC‐PS leve. Quando as mutações dos grupos Null e B estão em heterozigose composta, inclusive a p.Ile173Asn em um alelo, a HAC‐VS é esperada na maioria dos casos.6,15 Essa observação foi relatada por outros grupos,24,25 inclusive uma associação muito rara da mutação p.Ile173Asn com uma HAC‐NC.24 A HAC‐PS associada à p.Ile173Asn é mais comum quando uma segunda mutação mais grave está associada em heterozigosidade.25,26
No Brasil, um estudo de Bachega et al. determinou a frequência de mutações de ponto em 130 pacientes com HAC‐C e HAC‐NC e estabeleceu uma correlação genótipo‐fenótipo.27 As mutações mais frequentes foram a IVS2‐13A/C>G, em 55% dos alelos dos pacientes com a forma PS, a p.Ile173Asn, em 42% das HAC‐VS, e a pVal282Leu, em 70% dos indivíduos com HAC‐NC. A frequência da mutação IVS2‐13A/C>G em nossa amostra não foi, portanto, surpreendente para a população brasileira (53% em homo e/ou heterozigose na HAC‐C). Em uma amostra brasileira de São Paulo14 e em um estudo de coorte maior na Argentina, a IVS2‐13A/C> G correspondeu a 21% na frequência alélica e a 20% das mutações em homozigose,28 respectivamente. O Brasil e a Argentina (AR) apresentam taxas muito semelhantes dessa mutação.14,28 O Estado do Rio Grande do Sul está próximo da AR e a população compartilha origens étnicas comuns. Esse grupo também descreve a associação dos alelos IVS2‐13A/C>G com as formas VS,8 o que pode explicar o fenótipo‐genótipo não concordante no caso 32.
A nova variante IVS2‐13A/C>T foi identificada em dois pacientes. O alelo T foi observado nos casos em heterozigose com o alelo C benigno, como descrito anteriormente.19 Como a paciente do sexo feminino apresentou clitoromegalia ao nascimento, mesmo em casos heterozigotos, esse achado não pode ser negligenciado e requer estudos genéticos adicionais. A descrição dos três casos com clitoromegalia transitória em nossa amostra é digna de estudo adicional. Tem sido relatado que alguns pacientes heterozigotos apresentaram níveis mais elevados de andrógenos, especialmente os portadores da mutação pVal282Leu com adrenarca precoce.1,29 Espera‐se que os pacientes com HAC‐NC e pacientes heterozigotos sejam assintomáticos ao nascimento, mas nossa hipótese é que possíveis elevações androgênicas transitórias podem ocorrer. Estudos futuros com vistas a esclarecer esse fenômeno podem usar a genotipagem expandida pelo sequenciamento completo do gene CYP21A2 para excluir outras mutações não detectadas pelos ensaios SNaPshot e MLPA. Em nossa amostra, um melhor entendimento dessa nova variante pode fornecer informações mais específicas.
Um dos pontos fortes deste estudo foi que os diagnósticos e exames de acompanhamento foram feitos pelo mesmo endocrinologista pediátrico. Portanto, a avaliação clínica adequada dos pacientes feita neste estudo é apropriada para a caracterização clínica e molecular dessa amostra na triagem neonatal da HAC. Outro ponto forte foi o fato de os dados terem sido coletados a partir de um programa de triagem populacional, o que favoreceu a avaliação de um grande número de indivíduos. Nesse contexto, nosso estudo foi o primeiro programa de triagem neonatal/genotipagem com o uso da metodologia SNaPshot.19 Essa estratégia permite detectar simultaneamente as 12 mutações mais comumente associadas à HAC de forma rápida e ágil e agrega qualidade ao programa de triagem neonatal. Esse grupo de mutações de ponto representa 89% das mutações detectadas em nossa coorte do sul do Brasil.19