Ao percorrer o andar basal, intermédio e superior da Serra, o trilho apresenta uma enorme variedade de vegetação e fauna. O salgueiro-branco, o plátano-bastardo, o cervum, a consolda-vermelha, o jacinto dos campos, a faia, o castanheiro e o carvalho-negral compõem parte do conjunto da vegetação. Realça-se o valor da tramazeira, do zimbro e do vidoeiro, devido à sua raridade em Portugal. Também é possível encontrar a caldoneira que detém o estatuto de conservação pela Directiva Habitats.
O leque de espécies animais é imenso e extremamente variado. Neste traçado habitam o javali, a raposa, a toupeira, o ouriço-cacheiro e a lebre. Quanto aos répteis, o sardão e a lagartixa-do-mato estão presentes. As linhas de água fomentam a existência de anfíbios como a rã-iberica, a rã-verde e o lagarto-de-água. O peneireiro, a coruja das torres e o tartaranhão-caçador são as aves que dominam os altos céus da Rota do Carvão. Com menor porte, temos o melro-azul, o melro das rochas, o andorinhão-preto e o guarda-rios.