Ett e-postmeddelande till dem som undertecknade petitionen sade premiärministern och regeringen hade "var tydlig att detta var en gång i generation röst".
Det sades att beslutet "måste respekteras" och "vi måste nu förbereda oss för processen för att lämna EU".
Förenade kungariket röstade för att lämna EU med 52–48 % i folkomröstningen den 23 juni.
Samtidigt sade USA:s president Barack Obama att han trodde att Storbritannien skulle lämna Europeiska unionen trots spekulationer att omröstningen för Brexit på något sätt kunde vändas.
"Jag tror att vi måste anta att en folkomröstning har gått igenom med mycket uppmärksamhet, en lång kampanj och relativt höga deltagarsiffror kommer att hålla", berättade han en nyhetskonferens i slutet av ett Nato-toppmöte i Warszawa.
Begäran på nätet fick fler underskrifter än någon annan på parlamentets webbplats efter resultatet av EU:s folkomröstning.
Det hade inrättats av William Oliver Healey inför folkomröstningen och hade undertecknats av 22 personer vid tidpunkten för resultatet.
Det står: "Vi undertecknade uppmanar HM:s regering att genomföra en regel om att om kvarlåtenskapen eller avskedsomröstningen är mindre än 60 %, baserat på ett valdeltagande på mindre än 75 %, bör det hållas ytterligare en folkomröstning."
I folkomröstningen avgavs 17,4 miljoner (51,9%) röster för att lämna EU, jämfört med 16,1 miljoner (48,1%) kvar, med ett valdeltagande på 72,2 % enligt valkommissionen.
I sitt officiella svar till signatärerna sade utrikesdepartementet att den lag som hade fastställt reglerna för folkomröstningen inte angav minimivillkor för valdeltagande eller segermarginal.
Det tillade att folkomröstningen var "en av de största demokratiska övningarna i brittisk historia med över 33 miljoner människor som har sitt ord".
I e-postmeddelandet sades att framställningen skulle övervägas för en parlamentarisk debatt i utskottet för framställningar eftersom den hade fått mer än 100 000 underskrifter.
Utskottet består av 11 partiöverskridande parlamentsledamöter och "nästan alltid" debatterar framställningar som når 100 000 underskrifter.
Den undersökte tidigare framställningen om bedrägeri och tog bort 77 000 underskrifter som befanns vara falska.
Regeringen har avvisat en petition online som undertecknats av mer än 4,1 miljoner människor och som kräver att en andra EU-omröstning ska hållas.