I ett tal som markerar slutet på den islamiska heliga månaden Ramadan sade han att Iran fortfarande hade skarpa meningsskiljaktigheter med USA, framför allt i Mellanöstern.
Han sade att Iran skulle fortsätta att stödja Syrien, Irak, palestinierna och "undertryckta människor" i Jemen och Bahrain.
Överenskommelsen om Irans kärnenergiprogram kom efter år av förhandlingar.
Avtalet begränsar Irans kärntekniska verksamhet i minst tio år i utbyte mot ett gradvis upphävande av sanktioner som har hindrat landets ekonomi.
"Oavsett om [kärnkraftsavtalet] godkänns eller inte, kommer vi aldrig att sluta stödja våra vänner i regionen och folket i Palestina, Jemen, Syrien, Irak, Bahrain och Libanon", sade Ayatollah Khamenei.
"Inte ens efter detta avtal kommer vår politik gentemot det arroganta USA att förändras."
Den högste ledaren förnekade också att Iran hade för avsikt att skapa en kärnvapenbomb.
"Amerikanerna säger att de hindrade Iran från att skaffa sig ett kärnvapen", sade han i sitt tal vid Mosala moskén i Teheran.
"De vet att det inte är sant. Vi hade en fatwa [religiös dom] som förklarade kärnvapen vara religiöst förbjudna enligt islamisk lag. Det hade inget med kärnvapensamtalen att göra.
"Vi har upprepade gånger sagt att vi inte förhandlar med USA om regionala eller internationella frågor, inte ens om bilaterala frågor.
"Det finns några undantag som kärnkraftsprogrammet som vi förhandlade med amerikaner för att tjäna våra intressen... USA:s politik i regionen är diametralt motsatt Irans politik."
Den högste ledaren sade att det nu var nödvändigt för iranska politiker att granska kärnkraftsavtalet och se till att Irans nationella intressen bevarades.
Korrespondenterna säger att Ayatollah Khameneis åsikter står i kontrast till det erkännande som president Hassan Rouhani och utrikesminister Mohammad Javad Zarif har fått.
Irans inställning till "arrogant" USA kommer inte att förändras trots den kärnkraftsöverenskommelse som nåddes tidigare i veckan, högsta ledaren Ayatollah Ali Khamenei har sagt.