En känslomässig kanadensisk handelsminister Chrystia Freeland lämnade samtalen i Bryssel och sade att EU "inte kunde" underteckna ett handelsavtal.
Belgien, det enda land som blockerade avtalet, behövde samtycke från det regionala parlamentet i Vallonien.
Det omfattande avtalet, sju år på väg, skulle undertecknas nästa vecka.
I ett tal utanför den vallonska regeringens säte sade Freeland till journalisterna: "Det verkar uppenbart för mig och Kanada att Europeiska unionen nu inte kan ha en internationell överenskommelse ens med ett land som har värderingar som är lika europeiska som Kanada."
Hon tillade: "Kanada är besviken, men jag tror att det är omöjligt."
Det var oklart om EU skulle fortsätta att förhandla med Vallonien under de kommande dagarna för att lösa dödläget.
Europaparlamentets information om Ceta
Det övergripande avtalet om ekonomi och handel, Ceta, förväntades öka den bilaterala handeln, men Vallonien ser avtalet som ett hot mot jordbrukare och välfärdsnormer.
Regionen har en stark socialistisk tradition. Dess rädsla påminner om antiglobaliseringsaktivisterna, som säger att Ceta och handlar som det ger för mycket makt till multinationella företag - makt att till och med skrämma regeringar.
Det har också förekommit stora demonstrationer i flera EU-länder mot Ceta och handelssamtalen med USA om TTIP.
Handelsavtalet mellan Kanada och EU var sju år på gång, men det tog mycket mindre tid att reda ut.
Kanada har försökt hålla ihop Ceta efter det att den vallonska regionala församlingen i Belgien förra veckan röstade för att förkasta det.
Överenskommelsen slutfördes under Kanadas tidigare konservativa regering men är en viktig prioritering för liberalerna, som är pressade att öka landets ekonomi.
De skickade ett särskilt sändebud Pierre Pettigrew, en före detta minister med stor erfarenhet av internationell handel, för att hjälpa till att rädda avtalet.
Den federala handelsministern Chrystia Freeland har flera gånger under de senaste månaderna träffat europeiska ledare för att ta hand om den, men med ingen tur.
Att Ceta-avtalet mellan EU och Kanada har misslyckats är en skam för EU. Vallonien, en region på bara 3,6 miljoner människor, har allt annat än skippat ett handelsavtal som påverkar 508 miljoner européer och 36,3 miljoner kanadensare.
Europeiska kommissionen säger att detta slag inte betyder att Ceta är över, men vägrar också att plocka upp den massiva text som man kom överens om med Kanada 2014.
Alla frihandelsavtal mellan EU och USA, Kina och Indien ser nu avlägsna ut. Antiglobaliseringsgrupper, som är angelägna om att skydda EU:s välfärds- och miljönormer, kan känna att de vinner argumentet.
För närvarande har eventuella Ceta-ökningar för små företag och arbetstillfällen skjutits upp. Misslyckandet ger oss en känsla av hur hårda Brexitsamtalen kommer att bli, trots Förenade kungarikets nuvarande anpassning till sina EU-partner.
En mycket uppenbar lärdom från denna återvändsgränd är att det kommer att bli svårt för Europeiska unionen att genomföra handels- och investeringsavtal, kanske med vem som helst.
För Förenade kungariket efter Brexit tyder det på två kontrasterande konsekvenser. Att förhandla fram ett handelsavtal som ger brittiska exportörer hinder för fritt tillträde till EU:s inre marknad skulle kunna vara en enorm utmaning.
Det kommer säkert att finnas några viktiga skillnader. För EU är Storbritannien en viktigare exportmarknad än Kanada, så vissa EU-stater kommer att ha en hel del att förlora på att inte gå med på det. Men det är inte lätt att få dem alla att komma överens.
Å andra sidan bör det bli lättare att förhandla fram ett avtal med andra länder utanför EU. För att uttrycka det rakt på sak behöver den brittiska regeringen inte bry sig om vad det vallonska parlamentet till exempel tycker.
Ett handelsavtal mellan EU och Kanada håller på att kollapsa eftersom en belgisk region med en befolkning på bara 3,6 miljoner föremål.