Tjänstemän i staden Novosibirsk slog fast att Parnas, den största oppositionskoalitionen, hade misslyckats med att samla in tillräckligt med giltiga underskrifter för att kunna delta.
Den ryske oppositionsledaren Alexei Navalny kallade flytten en "blow till den demokratiska friheten för ryssarna".
Den regionala omröstningen ses av Rysslands opposition som ett nyckeltest inför nästa års parlamentariska omröstning.
De tre hungerstrejkarna fängslades av polisen och bötfälldes för att de protesterade.
De och andra aktivister i den sibiriska staden hade tillbringat veckor med att samla in de tusentals underskrifter som krävdes för att registrera sig för val.
Men valkommissionen i Novosibirsk - Rysslands tredje största stad - hittade fel med mer än 1.000 av de 11.000 underskrifter de lämnade in.
aktivisterna insisterar på att de var giltiga, och sade att myndigheterna använde föråldrade databaser för att kontrollera dem.
I ett fall uteslöts en kvinnas namnteckning eftersom hennes mellannamn kom upp i register som Timurovich, en mans namn, i stället för Timurovna.
De tre - Leonid Volkov, Sergey Boyko och Yegor Savin - har sagt att de inte kommer att äta någonting och bara dricka vatten förrän deras fall har granskats.
Navalny varnade för att den "surrealistiska" åtgärden skulle kunna upprepas i andra val, både regionala och nationella. Han är en våldsam kritiker av president Vladimir Putin och anklagar regeringen för storskalig korruption.
"Det finns en politisk order att inte låta oppositionen delta i val", berättade han Moskva Echo radiostation.
Tre ryska oppositionsaktivister har hungerstrejkat efter att de hindrats från att ställa upp i lokala val.