Avgiften på 16 euro ($17.80; £11.60) kommer sannolikt att avskräcka resenärer från att slutföra bokningar av tjänster inklusive Expedia, Opodo och ebookers.
Det markerar den senaste satsningen från flygbolagens sida att styra kunderna mot sina egna webbplatser.
En expert sade att detta inte bara bidrog till att minska flygbolagens kostnader utan också tillät dem att främja tilläggstjänster.
Bokningstjänsterna antyder dock att deras egna plattformar ofta är lättare att använda och bidrar till att hålla priserna låga.
Lufthansa Groups flytt kommer att påverka biljetter som köpts för själva Lufthansa samt Austrian Airlines, Brussels Airlines och Swiss från och med den 1 september.
Det finns två typer av prisjämförelse platser på nätet:
Lufthansas flytt förväntas skada den förra, samtidigt som dess egen webbplats verkar vara det mest attraktiva alternativet på den senare.
"Distributionskostnaden kommer att driva upp kostnaden för biljetter bokade via så kallade online resebyråer som Expedia eller Opodo," Martin Riecken, en talesman för det tyska flygbolaget, berättade BBC.
"Men det handlar inte om att försöka avskräcka någon från att jämföra priser.
"Vi strävar snarare efter större öppenhet. Vårt resonemang är tvåfaldigt.
"För det första att fördela de höga distributionskostnaderna för globala distributionssystem [flyginventering och prisdatabaser som används av resebyråer online] - vi talar om en hög tresiffrig miljon euro per år för Lufthansagruppen - till dem som faktiskt använder tjänsterna, i stället för att jämnt fördela dessa kostnader till alla passagerare.
"För det andra, att dra nytta av större frihet i vår försäljningsverksamhet, vilket ger kunderna den exakta skräddarsydda service som de letar efter."
Opodo sade online resebyråer var emot flytten och advokater vid European Travel Agents' och Tour Operators' Associations (ECTA) undersökte frågan.
"[Detta] är en global fråga som påverkar alla länder och globala resebyråer, traditionella eller online, företag och fritid, och som redan granskas juridiskt av sammanslutningar av europeiska byråer," sade en talesman för företaget.
"Lufthansa Group kommer helt klart att vara den som påverkas mest av detta beslut.
"Det faktum att de inte har tillhandahållit något automatiserat alternativ till de globala distributionssystemen kommer att leda till att Lufthansa, Austrian Airlines, Brussels Airlines och Swiss drabbas av en allvarlig brist på konkurrenskraft mot andra företag som finns i dessa kanaler och inte har en extra kostnad för resenärerna."
En branschvakare sade Lufthansa kan ha känt sig tvungen att agera för att öka sina intäkter.
Företaget rapporterade nyligen 55 miljoner euro i nettovinst för sitt senaste räkenskapsår, vilket motsvarar en minskning med 82 % jämfört med föregående period.
Dess tjänster har också störts av en rad pilotstrejker och kraschen av en av dess Germanwings flygningar i mars.
"Om du tittar på Lufthansas senaste prestation, de har varit genom svårigheter," sade Laurie Price, en oberoende flygbolag konsult.
"Så de har tittat på alla sätt att öka sin bottenlinje. Det finns bara så mycket skärande du kan göra.
"Ett bättre sätt är att generera intäkter. Och om du kan få försäljning direkt och erbjuda tillägg, då är det ett mycket bättre sätt. "
Lufthansa Group aktie handlas något högre efter tillkännagivandet.
Men aktier i Amadeus - det spanska resebokning teknikföretaget som betjänar Expedia, Opodo och andra - avslutade dagen 10% lägre.
Lufthansas agerande är det senaste i en rad sammandrabbningar mellan flygbolag och prisjämförelsebokningstjänster.
I augusti förra året, American Airlines tog kort bort sina flygningar helt från online resebyrån Orbitz i en rad över avgifter.
Nyligen klagade USA Travel Technology Association att Delta Air Lines hade tagit bort sin tidtabell och prisinformation från mer än ett dussin online resebyråer, inklusive TripAdvisor, Fly.com och Hipmunk.
Det tillade att den brittiska metasearch-tjänsten Skyscanner hade förlorat tillgång till Deltas flygningar som en följd av detta tidigare i år.
Skyscanner pekar nu kunderna direkt till Deltas webbplats, vilket gynnar flygbolaget.
"Förhöjda försök att leda resenärer bort från online resebyråer och metasearch resesajter kommer sannolikt att leda till högre genomsnittliga flygresor, öka konsumenternas sökkostnader, göra inträde i städer-par rutter av mindre flygbolag svårare, minska insynen, och stärka marknadsstyrka de stora flygbolagen," en rapport som utarbetats av en Yale professor för Travel Technology Association sade.
Delta svarade att det hade rätt att avgöra vem det gjorde affärer med.
Lufthansa Group ska införa en avgift för kunder som köper sina flygningar via tredje parts webbplatser.