Protestörer hängde en skylt över stadens berömda Rialtobron och några bar resväskor för att symbolisera att behöva lämna.
Lokalbefolkningen säger att de tvingas ut av höga hyror, bostadsbrist och en ökning av antalet lägenheter som hyrs ut till besökare till höga priser.
Befolkningen i Venedig har sjunkit till under 55.000, från omkring 175 000 år 1951.
Några av demonstranterna togs emot av stadshuset och sade senare att de blev uppmuntrade av mötet.
Antalet människor i den pittoreska och bilfria lagun-side staden sväller på dagtid, särskilt under högsäsong när så många som 60.000 turister kan besöka.
Tidigare i år försökte människor på små båtar stoppa ett kryssningsfartyg från att docka.
Stadens borgmästare har föreslagit att man ska beskatta dagsutvandrare för att hjälpa till med problemet.
"Venice förlorar 1000 invånare varje år", sade Matteo Secchi, chef för föreningen venessia.com som organiserade rallyt.
"Vi håller på att förvandlas till Pompei, en stad som folk kommer för att besöka och säga att det är magnifikt, men ingen bor där."
Hundratals invånare i Venedig har protesterat mot den snabba avfolkningen av den italienska staden.