Bolivianerna ombads rösta om en ändring av landets konstitution. För närvarande är ordföranden och vice ordföranden begränsade till två mandatperioder på fem år.
Morales, som har haft makten sedan 2006, och hans anhängare ville att han skulle kunna ställa upp i en annan mandatperiod.
Med nästan alla röster räknade, hade "nej"-lägret en smal men oåterkallelig ledning över dem som förespråkade en annan term för Morales.
Detta innebär att det konstitutionella förbudet mot att avtjäna mer än två på varandra följande femårsperioder kvarstår.
Trots det konstitutionella förbudet mot att avtjäna mer än två på varandra följande mandatperioder tilläts president Evo Morales att ställa upp för en tredje mandatperiod 2014.
Författningsdomstolen hävdade att förbudet inte gällde Morales ursprungliga mandatperiod eftersom det hade ägt rum innan den nya konstitutionen trädde i kraft.
Mr Morales kommer nu inte att kunna ställa upp i presidentvalet 2019.
Men han förväntas fortsätta att avtjäna återstoden av sin mandatperiod, som slutar 2020.
När preliminära resultat föreslog en seger för kampanjen "Nej", sade Morales att "kampen kommer att fortsätta" och hans administration skulle fullfölja sina planer.
Kritiker inom sitt parti hoppas att han kommer att börja träna upp en potentiell efterträdare, medan oppositionspolitiker ser det som en chans att utmana de styrande partierna.
Morales sa att han hade förlorat en strid, men inte kriget.
Det firades i den östra staden Santa Cruz, ett motståndsfästen.
Många oppositionspolitiker och vissa inom Morales parti sade att resultatet var en seger för demokratin.
Tidigare president Carlos Mesa sa att det visade att "ingen är oumbärlig".
Samuel Doria Medina, som tre gånger förlorade till Morales i presidentvalet, sade att Bolivia hade vunnit.
"De [regeringen] kallade denna folkomröstning och folket sa nej", tweetade han.
Morales vann presidentvalet med 61 procent av rösterna förra året.
Det finns fortfarande ett brett stöd för Morales och hans ekonomiska program, men många ansåg att en ändring av konstitutionen var ett steg för långt.
Några inom hans eget partis led tyckte också att det var dags för nya, yngre politiker att få en chans att springa.
Presidentens godkännandesiffror skadades också av nyligen gjorda påståenden om att han använde sitt inflytande till att gynna ett kinesiskt byggföretag som anställer sin tidigare flickvän.
Morales avvisade anklagelserna och sa att han inte hade något att dölja. Han beställde en utredning om hur kontrakten tilldelades.
Bolivianerna röstade i en folkomröstning den 21 februari för att avgöra om president Evo Morales skulle kunna få en ny mandatperiod.