Det förekommer spekulationer om datumet i maj som övervägs av den brittiska regeringen.
En talesman för Labours förste minister Carwyn Jones hävdade att det skulle begränsa möjligheterna för EU-vänliga parter att ha en "äkta folkomröstningsstrategi".
Plaid Cymru kamrat Lord Elis-Thomas bröt leden med sitt parti på söndagen genom att säga flytten kan öka valdeltagandet.
Hans partiledare Leanne Wood, tillsammans med Jones, har tidigare sagt att folkomröstningen inte får kollidera med den walesiska församlingen och det skotska parlamentsvalet.
Första ministerns talesman sade i måndags: "Vår ståndpunkt i denna fråga är tydlig - en folkomröstning inom EU bör hållas på ett annat datum än det för valet till församlingen.
"Premiärministern kommer att skära av sig näsan till trots mot sitt ansikte om han pressade på för omröstningarna samma dag.
"Arbetet, Lib Dems och nationalisterna i Wales och Skottland står redo att spela en energisk roll i en ja-kampanj för ett reformerat EU.
"Med omröstningen samma dag som valen till Wales och Skottland kommer vi dock att begränsa vår förmåga att ha en verklig folkomröstningsstrategi.
"Vi vet att Tories är splittrade i EU och därför inte kommer att genomföra en trovärdig kampanj."
De konservativa lovade i sitt allmänna valmanifest att hålla en folkomröstning om EU-medlemskapet senast 2017, men ministrarna har spelat ut pratet om att det skulle kunna hållas innan dess.
En folkomröstning om Storbritanniens medlemskap i Europeiska unionen bör inte hållas samma dag som valet till församlingen 2016 har den walesiska regeringen sagt.