Honan har bosatt sig på Loch i Lowes centrum nära Dunkeld, som var Ladys hem, och som ansågs vara världens äldsta raptor i 24 år.
Ett strikt skyddsprogram införs när ägg läggs i ett ospreybo.
Lowes bo Loch övervakas dygnet runt.
Personalen vid Loch of the Lowes fruktar att f.d. invånarfrun kan vara död, efter att hon misslyckats med att återvända till boet för första gången på ett kvarts sekel.
Den vördnadsbjudande ostprejen, som skulle vara 30 år i år, lade nästan 70 ägg och födde upp 50 kycklingar i reservatet.
Hennes äktenskapspartner under de senaste åren, Laddie, har parat sig med den nya kvinnan, och paret har förenats för att jaga bort två andra kvinnliga inkräktare som hade försökt flytta in i området.
Scottish Wildlife Trust Ranger Charlotte Fleming sa att det var "mycket spänning" i centrum när den nya honan lade sitt första ägg.
Hon sade: " Nu när det finns ett ägg på boet, kommer programmet för skydd av osprey att börja på allvar. Förtroendet har en 24-timmars vakt på boet plats för att säkerställa säkerheten för fåglarna och ägget.
"Förhoppningsvis under de kommande dagarna kommer det att finnas fler ägg, som ospreys kan lägga upp till fyra under en säsong."
Trust driver en live webcam vid boet, som lockade mer än en miljon tittare från 96 olika länder förra året.
En ny hona som har häckat i ett skotskt reservat i Perthshire har lagt sitt första ägg.