Pink Dot har hållits varje år sedan 2009. Deltagarna bär rosa kläder och sätter sig ner för en masspicknick som slutar med bildandet av en rosa prick.
Men i år ligger det på tröskeln till Ramadan, vilket får en islamisk lärare att starta en Wear White-kampanj mot homosexualitet, som har fått stöd av en kristen organisation.
Gay sex är olagligt i Singapore.
Regeringsledare, liksom nationella organisationer som företräder moskéer och kyrkor, har under de senaste veckorna uppmanat både religiösa och homosexuella rättighetsgrupper att agera återhållsamt.
Rosa Dot-rallyt fortsatte fredligt på lördagskvällen utan tecken på anti-gay-kampanjer. Organisatörerna sade att 26.000 personer var med vid evenemanget.
Wear White utfärdade ett uttalande som säger att det avskräckte supportrar från att delta Pink Dot, som "det bör vara en händelse som ingen Muslim är associerad med".
Några valde att gå online istället för att protestera på evenemanget.
Omkring 4.000 personer har hittills deltagit i ett virtuellt rally som kallas FamFestSG. Dess Facebook-sida innehåller ett citat från premiärminister Lee Hsien Loong som definierar begreppet familj som "en man en kvinna gifter sig, har barn".
Motreaktionen har återupplivat frågan om homosexuella rättigheter i den till stor del konservativa stadsstaten.
Under de senaste åren har det förekommit två rättsliga försök att förklara att den lag som förbjuder homosexuellt sex är grundlagsstridig.
Singapores regering har tidigare sagt att även om den kommer att behålla lagen för att återspegla det konventionella samhällets ståndpunkt i frågan, kommer den inte att genomföras aktivt.
Ett årligt gaymöte i Singapore har dragit tusentals människor i en aldrig tidigare skådad motreaktion från religiösa grupper.