Dunfermline gjorde en stark start och gick två gånger nära genom Joe Carle och Michael Moffat.
Men Ayr tog ledningen med en Ross Docherty header som smög över Pars mållinjen, hans första mål för säsongen.
Ayr klängde sig fast och försvarade desperat för att göra anspråk på alla tre punkterna.
Cardle hade ett tidigt skott av Conrad Balatoni innan Moffat knäckte posten med en glänsande huvud.
Ayr såg skakig ut i försvaret, men de släpade sig tillbaka in i spelet efter att ha sett ut som om de skulle bli överhopade av Pars virvelvind start.
Docherty sköt brett från kanten av 18-yard linjen, vrida och svepa skottet förbi stolpen.
Dunfermline fortsatte dock att hota och John Herron drev ett header strax förbi inlägget efter en vispad kors från Callum Higginbotam till höger.
Dunfermline gjorde en flygande start på andra halvan och Moffat tvingade omedelbart väktare Greg Fleming att tippa sin bil över baren.
Men Ayr det var som slog först när Docherty drev en rubrik ner som undvek en skog av ben för att korsa linjen.
Det stärkte dem och Michael Rose och Alan Forrest tog med sig bra räddningar från Pars-vaktmästaren Sean Murdoch i snabb följd.
Dunfermline's Joe Cardle slösade sedan bort en fin chans, klaff hans skott bred av mål, innan ersätta David Hopkerk tvingade Fleming i en full längd dykning spara.
Resultatet håller Ayr United ovanför St Mirren, och flyttar dem bara tre poäng bakom åttonde placerade Dumbarton med ett spel i handen.
Matchändar, Dunfermline Athletic 0, Ayr United 1.
Andra halvlek, Dunfermline Athletic 0, Ayr United 1.
Lee Ashcroft (Dunfermline Athletic) vinner en frispark i anfallshalvan.
Foul av Craig Moore (Ayr United).
Försök missade. Nicky Clark (Dunfermline Athletic) huvudet från mitten av lådan är nära, men missar till höger.
Hörnet, Dunfermline Athletic. Conrad Balatoni är här.
Michael Paton (Dunfermline Athletic) vinner en frispark i defensiva halvan.
Stöld av Patrick Boyle (Ayr United).
Hörnet, Dunfermline Athletic. Conrad Balatoni är här.
Försök blockerat. Jason Talbot (Dunfermline Athletic) vänster fotade skott utanför lådan är blockerad.
Försök blockerat. David Hopkerk (Dunfermline Athletic) höger fotade skott utanför lådan är blockerad.
Jason Talbot (Dunfermline Athletic) vinner en frispark på höger vinge.
Foul av Michael Rose (Ayr United). Foul av Michael Rose (Ayr United).
Hörnet, Dunfermline Athletic. Förföljd av Greg Fleming.
Försöket räddades. David Hopkerk (Dunfermline Athletic) höger fotade skott från utsidan boxen sparas i nedre högra hörnet.
Ersättning, Dunfermline Athletic. Gavin Reilly ersätter Joe Cardle.
Substitution, Ayr United. Gary Harkins ersätter Alan Forrest.
Försök missade. Brian Gilmour (Ayr United) höger fotade skott från utsidan lådan är nära, men missar den övre högra hörnet.
Försöket räddades. Michael Paton (Dunfermline Athletic) huvud från mitten av rutan sparas i mitten av målet.
David Hopkerk (Dunfermline Athletic) vinner en frispark i anfallshalvan.
Foul av Daryll Meggatt (Ayr United).
Försöket räddades. Alan Forrest (Ayr United) höger fotade skott från mitten av lådan sparas i mitten av målet.
Substitution, Ayr United. Craig Moore ersätter Farid El Alagui.
Substitution, Ayr United. Craig McGuffie ersätter Ross Docherty på grund av en skada.
Försök missade. Joe Cardle (Dunfermline Athletic) vänster fotade skott från mitten av lådan är nära, men missar till vänster.
Callum Morris (Dunfermline Athletic) vinner en frispark i defensiva halvan.
Foul av Farid El Alagui (Ayr Förenade).
Ersättning, Dunfermline Athletic. Michael Paton ersätter Kallum Higginbotam.
Ersättning, Dunfermline Athletic. David Hopkerk ersätter Michael Moffat.
Callum Morris (Dunfermline Athletic) vinner en frispark på vänster flygel.
Foul av Farid El Alagui (Ayr Förenade).
Ryan Williamson (Dunfermline Athletic) vinner en frispark i den defensiva halvan.
Foul av Daryll Meggatt (Ayr United).
Hörnet, Ayr United. Förföljd av Sean Murdoch.
Försöket räddades. Alan Forrest (Ayr United) höger fotade skott från en svår vinkel till höger sparas i mitten av målet.
Hörnet, Ayr United. Förföljd av Jason Talbot.
Hörnet, Ayr United. Förföljd av Sean Murdoch.
Försöket räddades. Michael Rose (Ayr United) höger fotade skott från utsidan boxen sparas i det övre högra hörnet.
Foul av Callum Morris (Dunfermline Athletic).
Farid El Alagui (Ayr United) vinner en frispark i den defensiva halvan.
Ayr överlevde obevekligt tryck i en modig prestation att ta tre enorma poäng i sin kamp för mästerskapsöverlevnad.