Två mål från Swansea midfielder Gylfi Sigurdsson höll Island överst i Grupp A, sex poäng över Holländska, som kom trea vid 2014 års VM i Brasilien.
I Wales grupp B, Bosnien-Hercegovina och Belgien ritade 1-1, medan Omer Damari gjorde en hatt-trick som Israel slog Andorra 4-1.
Southamptons Graziano Pelle gjorde det enda målet när Italien besegrade Malta 1-0.
Pelle, 29 år, gjorde sin debut i en match som såg båda sidor reduceras till 10 män eftersom Maltas Michael Mifsud skickades iväg efter 27 minuter, innan italienska Leonardo Bonucci avskedades med 17 minuter kvar.
Det har varit en fruktansvärd start på Nederländernas kampanj för ny chef Guus Hiddink, som tog över den nationella sidan på sommaren efter Louis van Gaal lämnade för att gå med Manchester United.
Holländarna förlorade sin första Grupp A spel 2-1 i Tjeckien och behövde komma bakifrån för att slå Kazakstan 3-1 på fredag, innan de förlorade i Reykjavik.
På andra håll var den mest eftertryckliga vinsten Kroatiens 6-0-0 rivning av Azerbajdzjan i grupp H, med Ivan Perisic nät två gånger och f.d. Tottenham midfielder Luka Modric också på matchprotokollet.
I samma grupp slog Norge Bulgarien 2-1, där Martin Odegaard gjorde sin internationella debut för att bli den yngsta spelaren att delta i en EM kvalmatch, vid 15 år och 300 dagar.
Samtidigt, i Grupp A, Tjeckien slog Kazakstan 4-2 och Lettland drog 1-1 med Turkiet.
Matchen slutar, Island 2, Nederländerna 0.
Andra halvlek, Island 2, Nederländerna 0.
Försök missade. Arjen Robben (Nederländerna) vänster fotade skott från mitten av lådan är nära, men missar till vänster. Hjälpt av Leroy Fer.
Foul av Robin van Persie (Nederländerna).
Birkir Bjarnason (Island) vinner en frispark i defensiva halvan.
Nigel de Jong (Nederländerna) vinner en frispark i defensiva halvan.
Foul av Kolbeinn Sigthorsson (Island).
Gregory Van der Wiel (Nederländerna) vinner en frispark i defensiva halvan.
Foul av Kolbeinn Sigthorsson (Island).
Substitution, Island. Rurik Gislason ersätter Jon Dadi Bodvarsson.
Foul av Leroy Fer (Nederländerna).
Emil Hallfredsson (Island) vinner en frispark i defensiven.
Bruno Martins Indi (Nederländerna) vinner en frispark i defensiven.
Foul av Emil Hallfredsson (Island).
Hörnet, Nederländerna. Förföljd av Teddy Bjarnason.
Försök blockerat. Quincy Promes (Nederländerna) höger fotade skott från mitten av lådan är blockerad.
Försök missade. Daley Blind (Nederländerna) vänster fotade skott från utsidan av lådan missar till vänster.
Klaas-Jan Huntelaar (Nederländerna) vinner en frispark i anfallshalvan.
Foul av Kári Arnason (Island).
Försök missade. Jon Dadi Bodvarsson (Island) höger fotade skott från utsidan av lådan är nära, men missar till vänster. Hjälpt av Kári Arnason.
Nigel de Jong (Nederländerna) visas det gula kortet för en dålig foul.
Foul av Nigel de Jong (Nederländerna).
Jon Dadi Bodvarsson (Island) vinner en frispark i defensiven.
Försök missade. Emil Hallfredsson (Island) vänster fotade skott utanför lådan är för högt. Assisterad av Gylfi Sigurdsson.
Foul av Leroy Fer (Nederländerna).
Hannes Thór Halldórsson (Island) vinner en frispark i defensiven.
Ersättning, Nederländerna. Leroy Fer ersätter Ibrahim Afellay.
Hörnet, Nederländerna. Förföljd av Ragnar Sigurdsson.
Foul av Nigel de Jong (Nederländerna).
Emil Hallfredsson (Island) vinner en frispark i defensiven.
Försök missade. Bruno Martins Indi (Nederländerna) huvud från mitten av lådan är för högt. Hjälpt av Ibrahim Afellay efter en viss situation.
Klaas-Jan Huntelaar (Nederländerna) vinner en frispark i anfallshalvan.
Foul av Kári Arnason (Island).
Försöket räddades. Ragnar Sigurdsson (Island) höger fotade skott från utsidan av lådan sparas i toppen av målet. Assisterad av Gylfi Sigurdsson.
Ersättning, Nederländerna. Quincy Promes ersätter Jeremain Lens.
Gregory Van der Wiel (Nederländerna) vinner en frispark i defensiva halvan.
Foul av Birkir Bjarnason (Island).
Hörnet, Nederländerna. Förföljd av Teddy Bjarnason.
Hörnet, Island. Sammankallad av Stefan de Vrij.
Försök missade. Robin van Persie (Nederländerna) vänster fotade skott utanför lådan är för hög. Hjälpt av Klaas-Jan Huntelaar.
Nederländerna slogs på Island för att lida sitt andra nederlag i tre Euro 2016 kval.