Invandring, hälso- och sjukvård och utåtriktad verksamhet till latinamerikanska väljare dominerade debatten, som upplöstes i långa perioder av skrik och personliga förolämpningar.
Mr Trump har vunnit tre av de fyra första tävlingarna hittills.
Nästa veckas omröstning i 11 delstater hålls om vad som kallas Super Tuesday.
De tre männen vill bli utnämnda till republikansk kandidat i presidentvalet i november.
Äntligen de republikanska kandidaterna har kommit till insikt om att Donald Trump faktiskt kan vinna denna tävling, men det kan vara för sent.
I mer än två timmar turades senatorerna Marco Rubio och Ted Cruz om att slå New Yorker. De angrep honom i hans affärsregister; de nämnde hyckleri; de ifrågasatte hans konservativa meriter; och de kritiserade bristen på detaljer i hans politik och hans tillit till bluster.
"Vi har mycket roligt här uppe, eller hur?" Främre löparen slog till vid ett tillfälle. Men sanningen är att Mr Trump var på hälarna för mycket av kvällen.
Men utmaningen för de män som skulle avsätta ledaren är att den bästa tiden att slå en kandidat är innan det är uppenbart att omständigheterna tvingar dig att agera. I en kampanj där autenticitet framför allt dyrkas kan torsdagsfyrverkerier ge intryck av den typ av politisk lämplighet som många förknippar med traditionella politiker.
Både Cruz och Rubio drog blod med sina attacker, men Trump kommer sannolikt att framträda obebokat.
Hur Cruz och Rubio dubbel-teamed Trump
Vad är det som gör Super Tuesday super? - Den långa dagen av omröstning förklarade
Republikanerna som hatar Trump - Livslånga medlemmar av partiet tala ut
Rubio, som har kommit tvåa i flera senaste tävlingar, satte i gång en serie attacker mot Mr Trump.
"Om han inte hade ärvt 200 miljoner dollar, vet du var Donald Trump skulle vara?" Rubio sade i ett spänt utbyte. "Säljer klockor på Manhattan."
Rubio kritiserade också Trumps misslyckade utbildningsprojekt online, Trump University, och anföll honom för att anställa utländska arbetstagare snarare än amerikaner i hans byggprojekt.
Trump sköt tillbaka: " Jag anställde tiotusentals människor. Du har inte anställt någon."
Miljardären fastighetsmogulen fann sig allt mer på defensiven om hans affärer och hans konservativa meriter.
Andra slag, med runt tvärsnitt, av järn eller stål
Deras livs fruktsallad är vad jag ska titta på.
Trump på Rubio: "Den här killen är en kvävning artist [inte kan leverera på scenen]."
Rubio till Trump: "Du är en usel affärsman."
"Om han inte hade ärvt 200 miljoner dollar, vet du var Donald Trump skulle vara just nu, sälja klockor på Manhattan."
Trump till Cruz: "Den här killen är en lögnare."
Cruz svar: "Att anklaga någon för att ljuga är i sig själv en lögn, och det är något Donald gör dagligen."
Trump till Cruz: "Du kommer överens med ingen. Du har inte en republikansk senator som stöder dig. "Du borde skämmas över dig själv."
"Jag vet att du skäms."
Rubio till Trump: "Du är den enda personen på denna scen som någonsin har bötfällts för att anställa människor att arbeta på dina projekt olagligt."
Trump svar: "Jag är den enda på scenen som är anställd människor. Jag har hyrt tiotusentals människor över mitt jobb. Du har inte anställt nån. Du har bara haft problem med dina kreditkort."
Trump har varit mycket populär trots sina kontroversiella kommentarer om att deportera miljontals papperslösa arbetare och förbjuda muslimer att resa till USA.
Han är för närvarande ledande i 10 av 11 stater håller tävlingar på Super Tuesday när en fjärdedel av det totala antalet delegater som behövs för att säkra den republikanska nomineringen kommer att vara upp för grip.
Han har 82 republikanska partidelegater, Cruz har 17 och Rubio har 16. För att bli det republikanska partiets kandidat måste en kandidat ha 1 237 totala statsdelegater.
På den demokratiska sidan tävlar Hillary Clinton och Bernie Sanders om 1 004 delegater på Super Tuesday.
Clinton har en tydlig ledning med 505 delegater, men majoriteten är superdelegater som kan ändra sig under kampanjens gång. Mr Sanders har säkrat 71 delegater i de tre första loppen.
Varje parti tillkännager formellt sin presidentkandidat vid konventioner i juli, fyra månader före presidentvalet.
27 februari - South Carolina förnämsta (Demokratiska)
1 mars - "Super tisdag" - 15 stater eller territorier besluta
18-21 juli - Republikansk kongress, nominerad
25-28 juli - Demokratiskt konvent, nominerad
8 november - Förenta staternas presidentval
I detalj: Primär kalender
Hur fungerar valet i USA?
Republikanska presidenten hoppas Ted Cruz och Marco Rubio har släppt lös en spärreld av attacker på front-runner Donald Trump i den senaste debatten innan nästa tisdags centrala amerikanska primaries.