Mediauppspelning stöds inte på den här enheten
Jed Wallace bröt nästan dödläget halvvägs genom första halvan av reprisen men hans lysande volley räddades av Shotskeeper Phil Smith.
Molesley slösade bort en bra chans för värdarna efter pausen när han gick bred medan Dan Holman hade ett skott sparat.
Men Molesley buntade bollen hem efter en stor röra från ett hörn.
Målet kom med 10 minuter kvar och tände firandet inne i en atmosfärisk Electric Services Stadium.
Mediauppspelning stöds inte på den här enheten
Det var ett otroligt risigt mål, med Portsmouth sporrar flera möjligheter att rensa hörnet.
Den sista av dessa föll till Alex Wynter, som var ur balans på linjen och kunde inte lyckas sparka bollen i säkerhet.
Den första slipsen hade slutat 2-2, med Molesley också på matchprotokollet på Fratton Park.
Och efter segern på onsdag sade mittfältaren: " Man kan se vad det betyder för alla. FA Cup ger en livlina till så många klubbar och pojke behöver det. Det var ett grymt uppträdande, en blodig och åskdunderslips och det passade oss."
Resultatet innebär att Pompey fortfarande letar efter sin första seger i FA Cup eftersom de besegrade Tottenham i semifinalen av 2010 års tävling.
Skotten kan nu se fram emot att testa sig mot en League One sida när Rochdale besöker den 7 december.
Aldershot Town manager Andy Scott berättade för BBC Surrey:
"Det är fantastiskt - vi har spelat två matcher mot en stor klubb som Portsmouth och varit den bättre sidan över dessa två spel.
"Det har varit en fantastisk insats från grabbarna och det är bra att ha en annan ren lakan. Vi är på god väg och det är helt lysande.
"De har alltid trott på sig själva och vi har haft en tuff tid men de fortsätter att arbeta så hårt i träningen och de är ett bra gäng att vara med."
Matchen slutar, Aldershot Town 1, Portsmouth 0.
Andra halvlek, Aldershot Town 1, Portsmouth 0.
Försök missade. Danny Hollands (Portsmouth) vänster fotade skott utanför lådan är för hög. Hjälpt av Nigel Atangana.
Foul av Danny Hollands (Portsmouth).
Nabi Diallo (Aldershot Town) vinner en frispark på högerkanten.
Hörnet, Aldershot Town. Förföljd av Alex Wynter.
Försöket räddades. Miles Storey (Portsmouth) höger fotade skott från höger sida av lådan sparas i nedre högra hörnet. Hjälpt av Jed Wallace.
Foul av Jed Wallace (Portsmouth).
Jordan Roberts (Aldershot Town) vinner en frispark i defensiva halvan.
Jaydon Gibbs (Aldershot Town) visas det gula kortet för en dålig foul.
Ricky Holmes (Portsmouth) vinner en frispark på vänsterkanten.
Foul av Jaydon Gibbs (Aldershot Town).
Försök missade. Ricky Holmes (Portsmouth) höger fotade skott från utsidan av lådan är för högt från en direkt frispark.
Danny Hollands (Portsmouth) vinner en frispark i anfallshalvan.
Foul av Mark Molesley (Aldershot Town).
Ersättning, Portsmouth. Miles Storey ersätter Craig Westcarr.
Ersättning, Portsmouth. Patrick Agiemang ersätter Ryan Taylor.
Mål!  Aldershot Stad 1, Portsmouth 0. Mark Molesley (Aldershot Town) vänster fotade skott från mycket nära håll till mitten av målet efter ett hörn.
Försök blockerat. Glenn Wilson (Aldershot Town) höger fotade skott från mycket nära håll är blockerad.
Försök blockerat. Joe Oastler (Aldershot Town) höger fotade skott från mitten av lådan är blockerad.
Försök blockerat. Brett Williams (Aldershot Town) header från mycket nära håll är blockerad. Hjälpt av Jordan Roberts med ett kors.
Hörnet, Aldershot Town. Förföljd av Paul Jones.
Försöket räddades. Dan Holman (Aldershot Town) höger fotade skott från utsidan boxen sparas i det övre högra hörnet. Hjälpt av Jaydon Gibbs.
Försök missade. Manny Oyeleke (Aldershot Town) höger fotade skott utanför lådan missar till höger. Hjälpt av Kieran Forbes.
Hörnet, Aldershot Town. Förföljd av Paul Robinson.
Ersättning, Portsmouth. Ben Chorley ersätter Jack Whatmough.
Försöket räddades. Dan Holman (Aldershot Town) höger fotade skott från mycket nära håll sparas i nedre högra hörnet. Hjälpt av Joe Oastler.
Jack Whatmough (Portsmouth) visas det gula kortet för en dålig foul.
Foul av Jack Whatmough (Portsmouth).
Dan Holman (Aldershot Town) vinner en frispark på vänsterkanten.
Försök blockerat. Nigel Atangana (Portsmouth) höger fotade skott utanför lådan är blockerad.
Försök blockerat. Jed Wallace (Portsmouth) höger fotade skott från höger sida av lådan är blockerad.
Försök missade. Manny Oyeleke (Aldershot Town) höger fotade skott från utsidan av lådan missar till vänster. Hjälpt av Kieran Forbes efter ett hörn.
Hörnet, Aldershot Town. Förföljd av Paul Jones.
Försöket räddades. Brett Williams (Aldershot Town) vänster fotade skott från utsidan rutan sparas i nedre högra hörnet. Hjälpt av Nabi Diallo med ett nyckelkort.
Danny Hollands (Portsmouth) vinner en frispark i defensiva halvan.
Foul av Manny Oyeleke (Aldershot Town).
Joe Oastler (Aldershot Town) visas det gula kortet för en dålig foul.
Ricky Holmes (Portsmouth) vinner en frispark på högerkanten.
Foul av Joe Oastler (Aldershot Town).
Icke-league Aldershot Town kommer att spela Rochdale i den andra omgången av FA Cup efter Mark Molesley slog en sen vinnare mot League Two Portsmouth.