Professionell jägare Theo Bronkhorst och gårdsägare Ärliga Ndlovu, åtalades för tjuvjakt brott och för att inte ha det begärda jakttillståndet.
Paret beviljades borgen på $ 1000 vardera (638 pund) och beordrades att inställa sig i domstol igen den 5 augusti.
Walter Palmer, den amerikanska tandläkaren som sköt djuret Cecil, har lämnat Zimbabwe men kan också åtalas.
Mr Palmer sa att han betalade för jakten, men han kände inte till lejonets identitet.
Han sa att han ångrade att han sköt djuret och trodde att han var på laglig jakt. Han förlitade sig på professionella guider för att hitta ett lejon och få de nödvändiga tillstånden, sade han.
Bronkhorst och Ndlovu skulle kunna ställas inför upp till 15 års fängelse om de befanns skyldiga.
Cecil tros ha dött den 1 juli, men kadaver hittades inte förrän några dagar senare.
Mr Palmer sägs ha skjutit och skadat djuret med en rosett. Gruppen fann inte det sårade lejonet förrän 40 timmar senare, när han sköts med en pistol.
Separata domstolsprotokoll har visat att Palmer har ett brottsregister i USA efter att ha dödat en svart björn i delstaten Wisconsin 2006.
Tandläkaren fick en ettårig prövotid och bötfällde $3,000, efter att ha skjutit varelsen utanför en godkänd zon och sedan försökt passera den som om den hade dödats någon annanstans.
Uppgifter från Minnesota Board of Dentistry visar också att Palmer var föremål för ett klagomål om sexuella trakasserier som löstes 2006.
En receptionist påstod att han hade gjort oanständiga kommentarer till henne. Mr Palmer erkände inget orätt och gick med på att betala ut mer än 17.000 dollar.
Den amerikanska turisten tros ha betalat omkring 50.000 dollar för att jaga i Zimbabwe.
Mer än 265.000 människor har undertecknat en ansökan online "Rättvisa för Cecil" och uppmanar Zimbabwes regering att sluta utfärda jakttillstånd för utrotningshotade djur.
När nyheten om mordet och detaljer om gärningsmannen spreds på nätet, fanns det en massa kommentarer på sociala medier som fördömde Walter Palmer, med några människor som krävde att han skulle ställas inför rätta.
Hur internet sjönk på mannen som dödade Cecil lejonet
Mr Palmer insisterar på att han trodde att hans guider hade säkrat "alla riktiga tillstånd" för jakten.
"Jag förlitade mig på expertisen hos mina lokala professionella guider för att säkerställa en laglig jakt," sade han i ett uttalande på tisdag.
"Jag beklagar djupt att min strävan efter en aktivitet jag älskar och övar ansvarsfullt och lagligt resulterade i att ta detta lejon."
Han sade att han inte hade kontaktats av myndigheter i Zimbabwe eller USA utan skulle "bistå dem i alla undersökningar de kan ha".
Tandläkaren tros vara tillbaka i USA, även om hans exakta vistelseort är okänd.
Hans tandläkarmottagning stängdes på tisdagen och en lapp lades på dörren som hänvisade besökare till ett PR-företag.
Lejonet var skinnat och halshugget, enligt Zimbabwe Conservation Task Force (ZCTF), en lokal välgörenhet.
ZCTF sa att jägarna hade använt bete för att lura honom utanför Hwange National Park under en nattlig jakt.
35000
Maximal uppskattad lejonpopulation
12000
Max lejonpopulation i södra Afrika
665 Ca antal "trofilejon" som dödats för export från Afrika per år
49 Lejontroféer som exporterades från Zimbabwe 2013
0.29% Bidrag till Zimbabwes BNP från troféjakt
17% av Zimbabwes mark till troféjakt
Djuret hade en GPS-krage monterad för ett forskningsprojekt av UK-baserade Oxford University som gjorde det möjligt för myndigheter att spåra sina rörelser. Jägarna försökte förstöra den, men misslyckades, enligt ZCTF.
På måndagen berättade chefen för ZCTF för BBC att Cecil "aldrig störde någon" och var "ett av de vackraste djur att titta på".
Två män anklagade för att ha hjälpt en amerikansk turistjakt och dödat Zimbabwes mest kända lejon har släppts mot borgen.