Naturresurs Wales (NRW) sade inverkan på platser av särskilt vetenskapligt intresse (SSSI) "inte kunde helt minskas".
M4-förslaget på 1,1 miljarder pund skulle korsa fyra SSSI längs Gwent-nivåerna.
Den walesiska regeringens advokater hävdade att miljöhänsyn måste vägas mot andra intressen.
Undersökningen i Newport hörde att systemet skulle innebära cirka 105 hektar mark som avsatts för skydd av ryggradslösa vattendjur skulle förloras.
Gwents unika nätverk av diken, känt som renar, grävdes under romartiden och har sedan dess blivit en livsmiljö för en rad sällsynta arter.
Den walesiska regeringen har lovat att ersätta förlorade reenser med nya.
Dr Jessica Poole, naturresursorganet Natural Resources Wales (NRW), berättade för undersökningen diskussioner mellan tillsynsmyndigheten och den walesiska regeringen innebar att hon var nöjd med den föreslagna utformningen av de nya reens.
Men hon sade att det inte fanns någon garanti för att de skulle fungera, och det kan dröja ett tag innan de stödde de akvatiska insekterna som platserna är avsedda att bevara.
Replikering av en komplex ekologi som har utvecklats under århundraden skulle vara "kramande", sade hon.
NRW sade att den walesiska regeringen inte hade visat att projektet skulle uppfylla sin lagstadgade skyldighet att främja hållbar utveckling.
Om den alternativa blå rutten, som föreslås av transportexperten Prof Stuart Cole, skulle antas - motorvägens inverkan på SSSI mark skulle "betydligt minskas", sade Dr Poole.
Men undersökningen hörde flera frågor NRW hade tagit upp i brev som svar på projektets utkast planer hade behandlats och det var nu nöjda i frågor som vattenkvalitet, dränering och vissa skyddade arter som uttrar och fladdermöss.
Morag Ellis QC, som agerade på den walesiska regeringens vägnar, sade att det var walesiska ministrars sak att balansera eventuella effekter på SSSI:s mark med andra allmänna intressen i samband med den nya motorvägen.
Att hävda negativa effekter var "fullständigt mildrade" var att tillämpa en standard som inte var i enlighet med lagen, sade hon.
Hon beskrev de förändringar som NRW hade gjort i sina ursprungliga invändningar efter omfattande diskussioner med den walesiska regeringen som "ett stort steg framåt".
Omfattningen av förlusten av naturvårdsmark på grund av den föreslagna avlastningsvägen M4 skulle vara "oacceptabel", har en offentlig undersökning hört.