Skolan, 21, vann på en olympisk rekordtid på 50,39 sekunder.
Singaporeanen hade alltid kontroll och vann med 0,75 sekunder från trion Phelps, Sydafrikas Chad le Clos och Ungerns Laszlo Cseh.
Phelps, 31, kunde vinna sitt 23:e guld i 4x100m medley relä på lördag.
Amerikanen var inte en del av hans lands lag som kvalificerat sig för finalen efter att ha tagit av eftermiddagen efter att ha vunnit hans 22: a guld i 200m enskilda medley på torsdag.
Phelps, som nekades en fjärde på varandra följande guld i 100m fjärilen av Skolning, kommer att avsluta sin olympiska karriär genom att tävla i den slutliga tävlingen i Rio pool.
"Här är det. Jag gör det inte. Jag svor i London att jag inte skulle komma tillbaka men det här är slutgiltigt, sa han.
Skolan sade om hans seger: " Jag är bara extatisk. Jag tror inte att den har kommit in än. Det är helt galet.
"Jag hoppas att Michael kan stanna så länge att jag kan tävla mot honom igen. Det skulle jag gärna vilja."
Singapores Joseph Schooling vann sin nations första olympiska guldmedalj någonsin med seger i 100m fjärilen som Michael Phelps var en av tre män att avsluta gemensamma sekunden.