En talesman för den australiske invandringsministern Peter Dutton bekräftade att mannen och hustrun hade lämnat Kambodja.
Nu återstår bara två av de fem flyktingar som Australien överfört till Sydostasien.
Australien har lovat att ge Kambodja 40 miljoner dollar i bistånd och 15 miljoner dollar i vidarebosättningskostnader för att ta in sina avvisade flyktingar.
Detta kommer att betalas oberoende av antalet personer som bosätter sig där.
Den australiska regeringen upprätthåller en politik där asylsökande som anländer med båt skickas till bearbetningscentraler i offshore platser, inklusive Stilla havet nationen Nauru och Manus Island i Papua Nya Guinea.
De som befinns vara verkliga flyktingar får inte bosätta sig i Australien och skickas i stället till ett annat land.
Det iranska paret ingick i den första gruppen på fyra personer som gick med på att resa från Nauru till Kambodja i maj 2015.
En Rohingya man som var en del av denna grupp återvände till Myanmar i oktober 2015 eftersom han var hemlängtan.
En iransk man från gruppen stannar kvar i Kambodja, tillsammans med en femte flykting som överfördes dit i slutet av förra året.
Duttons talesman sade i ett uttalande på tisdagen: "Regeringen står fast vid sitt åtagande att stödja Kambodjas regering för att genomföra bosättningar i Kambodja och uppmuntrar flyktingarna tillfälligt i Nauru att undersöka denna lösning.
"Regeringen håller fast vid vår policy att om du anländer med båt kan du antingen återvända till ditt ursprungsland eller vidarebosättas i ett tredjeland."
Oppositionens immigrations talesman Richard Marles berättade för den australiska Broadcasting Corps att Kambodja affären var ett "dyrt skämt".
"Det står som symbolen för hur denna regering har helt misslyckats med att förhandla om alla alternativ för vidarebosättning i tredjeländer som är trovärdiga", sade han.
Papua Nya Guineas premiärminister Peter O'Neill varnade förra veckan för att hans land inte hade resurser att vidarebosätta flyktingar och asylsökande på Manus Islands fångläger.
Två iranska flyktingar som överfördes till Kambodja under en A$55m ($41m; £29m) affär med Australien har återvänt till Iran frivilligt.