Lee Novak satte Spireiterna framför, nicka i Gboly Ariyibis kors, för hans 14: e mål för säsongen innan Adam Hammills avböjda equalizer.
Jamal Campbell-Ryce avskedades för två gula kort, en för att sparka bollen bort, men Ollie Banks side-footed hem för att återställa Chesterfields ledning.
Hamill slog sedan inlägget som Barnsley inte kunde hitta en sent leveler.
Besegra i deras första liga spel sedan vinna Johnstones Paint Trophy innebär Barnsley är nu sex poäng från League One play-off positioner.
Chesterfield har nu öppnat en fyrpunktsklyfta mellan sig själva och nedflyttningsplatserna.
Ten-man Chesterfield kantade ut Barnsley att öka sina egna överlevnadschanser och buckla sina värdars play-off ambitioner.