Dufner sköt en andra på varandra följande sju-under-par runda av 65 för en turnering rekord 36-hål totalt 14 under par.
Rickie Fowler sköt sex under för dagen att flytta tredje och inom ett slag av andra amerikanska Daniel Summerhays, med Jordan Spieth fortfarande på sex under.
Skottlands Martin Laird är en stroke längre tillbaka på fem under par.
Dufner, som började sin andra runda den 10:e, hål från 176 meter vid 18 när hans närmar sig baksidan av det gröna rullade nerför sluttningen och in i koppen för en örn.
"Vi har två ronder kvar. Vi får se hur kursen förändras, om vinden går upp, går snabbt, spelar det annorlunda. Vi får se, sa 40-åringen.
Världen nummer sex Spieth var ett skott från ledningen efter en öppningsrunda på 66, men tre bogeys på den främre nio såg honom falla till bundna fjärde.
Under tiden missade Dustin Johnson snittet på 8 över par.
Amerikanska Jason Dufner kommer att ta en fem-shot bly in i den tredje omgången av Memorial Tournament efter att ha kort på en örn på 18: e hålet på fredag.