Amnesti skulle ha tillämpats på brott som begicks under den politiska turbulensen efter den thailändska kuppen 2006, som drev bort Thaksin.
Lagförslagets passage i nedre huset utlöste stora gatuprotester.
Och på måndagen, när lagförslaget gick till senaten, tog tiotusentals demonstranter ut på gatorna i Bangkok.
Premiärminister Yingluck Shinawatra - som är Thaksins syster - har lovat att respektera senatens beslut.
Lagförslaget, som föreslogs av det styrande partiet Pheu Thai, gällde brott som begicks under omvälvningen efter det att Thaksin avsatts från ämbetet.
Yinglucks regering hade hävdat att lagstiftningen var ett nödvändigt steg mot försoning efter flera år av politisk oro.
Denna turbulens omfattade ockupationen av Bangkoks huvudflygplats 2008 och sedan två månaders gatuprotester i Bangkok 2010 som lämnade omkring 90 personer - mestadels civila demonstranter - döda.
Men kritiker sade att det skulle tillåta kränkningar av de mänskliga rättigheterna - som till exempel mord på civila demonstranter - att gå ostraffade.
Huvudoppositionens demokratiska parti ansåg också att det syftade till att låta Thaksin återvända till Thailand utan att behöva avtjäna ett fängelsestraff.
Thaksin har varit i självförvisad exil sedan han dömdes för korruption på grund av en egendomsaffär. Han hävdar att anklagelserna är politiskt motiverade.
Underhuset stödde lagförslaget, trots en oppositionsbojkott. Men när protesterna blev starkare drog regeringspartiet tillbaka sitt stöd från lagförslaget och alla 141 senatorer som var närvarande röstade emot det.
"Detta hus avvisar detta lagförslag för övervägande", sade vice senatens talman Surachai Lengboonlertchai.
Eftersom tiotusentals regeringsmotståndare stannade kvar på gatorna i delar av Bangkok på måndag kväll, sade en talesman för det Pheu Thai-partiet att den styrande koalitionen inte skulle återföra amnestilagen till parlamentet.
"Vi tror från och med i morgon att den politiska krisen kommer att börja lätta eftersom det inte finns några skäl att upprätthålla protesten", sade Pormpong Nopparit.
Men oppositionen har uppmanat sina anhängare att observera en tredagars nationell strejk, med början på onsdag, i vad korrespondenterna säger har förvandlats till en kampanj för att störta regeringen.
Tidigare ledare Thaksin Shinawatra är en djupt polariserande figur i thailändsk politik.
Han fick stort stöd från Thailands fattiga landsbygd men starkt motstånd från andra sektorer i samhället, och splittringen från 2006 års statskupp fortsätter att dominera det politiska landskapet.
Thailands senat har avvisat en kontroversiell amnestiproposition som kunde ha lett till att f.d. premiärminister Thaksin Shinawatra återvänt.