Den tidigare världsmästaren kommer att rikta in sig på tidsförhandlingen och kan också stödja Lizzie Armitstead i road race.
Pooley, 33, drog sig tillbaka från cyklingen efter att ha vunnit två silvermedaljer vid 2014 års samväldesspel för att koncentrera sig på triathlon och andra uthållighetsevenemang.
"Detta är en verkligt sällsynt möjlighet som jag inte kan motstå", sade hon.
Pooley vann silver i tid rättegång vid 2008 Peking OS innan hon avslutade sjätte i evenemanget i London 2012, där hon också hjälpte Armitstead vinna en silvermedalj i road race.
Den 29,8 km tid provbana i Rio har 1.2km, 7% genomsnittlig lutning Grumari klättring och den "impressivt kuperad natur" i terrängen övertalade Pooley, känd för sina klättra förmågor, att komma ut ur pensionen och rikta en guldmedalj.
"Jag har beslutat att det är värt ett seriöst försök att rikta den händelsen", sade hon i ett uttalande på onsdag.
"Om jag kan bevisa för både mig själv och GB laget valörer att jag har kapacitet att vinna tid rättegång i Rio, kommer jag att tävla om urval för OS-laget - Jag är glad att veta att jag inte kommer att bli vald om jag verkligen har potential att vinna.
"Jag har ingen önskan att gå till Rio Games, och offra några av de mest spännande triathlon tävlingar av säsongen, bara för upplevelsen av en annan OS - Jag är engagerad i att sikta på guld."
Efter att ha vänt sig till multi-sport evenemang i augusti 2014 vann Pooley världen långdistans duathlon titel vid första försöket en månad senare, bryta kursrekordet med 16 minuter.
Hon försvarade framgångsrikt sin krona i september och syftar till att göra det tre på varandra följande segrar nästa år, tillägger att långdistanstriathlon och duathlon förblir hennes "huvudfokus" 2016.
Ändå efter att ha studerat Rio kurser, brittiska Cycling teknisk direktör Shane Sutton säger att han närmade sig Pooley om en återkomst, tror att hon också kan förbättra världsmästaren Armisteads chanser att vinna guld i väg loppet.
"Jag är verkligen glad att Emma såg värdet av möjligheten och är tillbaka hos oss", tillade han.
"Att ha sin talang och erfarenhet i laget ökar våra medaljutsikter i tidsförhandlingen och Lizzie Armitsteads möjlighet att vinna road race.
"Kärleksfältet kommer troligen att falla bort bakifrån, men som en ren bergsbestigare ser jag inte Emma falla bort. Det skulle vara kul att se henne i road race stöd Lizzie."
Under tiden, före detta Tour de France mästare Sir Bradley Wiggins säger att han vill fortsätta rida efter denna säsong, efter att tidigare hävdat att han skulle gå i pension i slutet av 2016.
Den fyrafaldiga olympiska guldmedaljören, 35, är inställd på att tävla i lagjakten på banan i Rio och skulle kunna fortsätta tävla 2017.
"Jag kommer att se hur jag känner denna tid nästa år", sade han.
"Det kan finnas andra möjligheter. Om jag inte har ett jobb vid den här tiden nästa år kommer jag att fortsätta tävla."
Olympic silvermedaljör Emma Pooley är inställd på att återvända till det brittiska cykellaget för Rio OS 2016, efter att ha dragit sig tillbaka från sporten 2014.