Två homosexuella par nekade tillstånd har begärt att Rowan County Clerk Kim Davis ska hållas i förakt för rätten.
Men de bad en distriktsdomare att straffa miss Davis genom att bötfälla henne, i stället för att skicka henne i fängelse.
USA:s högsta domstol avvisade i måndags argumentet att hennes tro hindrade henne från att fullgöra sin plikt.
Trots domstolsbeslut om att fortsätta utfärda licenser avvisade Ann Davis två homosexuella par som ansökte om äktenskapslicenser på tisdagsmorgonen.
Ann Davis, som inte kan avsättas eftersom hon är vald tjänsteman, stannade inne på sitt kontor med persienner stängda som paren krävde att få träffa henne.
Hon kom så småningom ut, men hon sade att hon inte skulle utfärda några licenser.
"På vems order?" frågade man henne. "Under Guds auktoritet", sade hon.
Dussintals reportrar och aktivister, både anhängare och motståndare till homoäktenskap, fyllde vänteområdet vid Rowan County expedit kontor, alternativt mässande "gör ditt jobb" och "stå fast".
En av de män som sökte tillstånd, David Ermold, sade att han och hans partner inte skulle lämna kontoret förrän de var gifta.
"Då kommer du att få en lång dag", svarade miss Davis.
Sedan domstolen legaliserade homoäktenskap i hela landet för två månader sedan har Ann Davis vägrat att utfärda några äktenskapslicenser till någon.
Amerikanska medborgarrättsförbundet stämde henne på uppdrag av två homosexuella par och två heterosexuella par.
Expediten har beordrats att inställa sig i federal domstol på torsdag för att ta upp ett yrkande från en av paren om att hon ska åtalas för rättegång.
När Högsta domstolen avkunnade sitt avgörande på måndagen, avslog den sin begäran om vistelse medan hon överklagade.
En kristen tjänsteman har vägrat att utfärda äktenskapslicenser till samkönade par i Kentucky trots att hon uttömt alla sina lagliga möjligheter.