Tohti är en ekonomisk forskare som kritiserat Pekings politik gentemot den uiguriska minoriteten.
Han har häktats sedan januari, efter att ha fördömt regeringens reaktion på en självmordsattack på Himmelska fridens torg.
Förenta nationerna, EU och USA har alla krävt att Tohtis friges. Han förnekar anklagelserna mot honom.
Mr Tohti, 44, ställs inför rätta vid Intermediate People's Court i Urumqi, huvudstaden i Xinjiang.
Åklagare lade fram bevis för att Tohti förespråkade att Xinjiang skulle göras oberoende.
Deras bevis inbegrep vittnesmål från hans tidigare elever. Tohti undervisade vid universitetet i Beijing Minzu.
Tohti har avvisat bevisen, och hans advokater säger att hans elevers vittnesmål gjordes under tvång.
En av hans advokater, Li Fangping, berättade för Reuters nyhetsbyrå: "De flesta av eleverna sade att professor Tohti hade separatistiska mål eller avsikter... Vi tror att de inte var trovärdiga uttalanden, att de gjordes under press."
Sju av hans elever, som sades ha arbetat på en Uighur-webbplats som Tohti förvaltade, arresterades kort efter att han blivit häktad.
Guzaili Nu'er, Tohtis hustru, var med vid rättegången med flera av sina bröder och visade sig förtvivlad, enligt AFP:s nyhetsbyrå.
"Han har aldrig motsatt sig landet eller någon etnisk grupp", sade hon. "Han har aldrig gjort nåt sånt."
Human Rights Watch sade i ett uttalande att Tohti "konsistent, modigt och otvetydigt förespråkade fredligt större förståelse och dialog mellan olika grupper och med staten".
"Om detta är Pekings definition av "separatistiska" aktiviteter, är det svårt att se spänningar i Xinjiang och mellan samhällena minska," sade dess Kina direktör, Sophie Richardson.
Enligt rapporter var hovbyggnaden och omgivande gator avspärrade, och dussintals poliser stod vakt, några med upploppsredskap.
Utländska journalister tilläts inte in och medan vissa domstolar lämnar ut uppgifter om förfaranden via officiella mikrobloggkonton har Urumqi-domstolen hållit tyst.
Associated Press rapporterade att flera västerländska diplomater hindrades från att träda in i och bevittna rättegången. Polisen blockerade utsikten över domstolsbyggnaden med höga paneler för att främja ett kommande handelsevenemang i Xinjiang.
Rättegången fortsätter på torsdag.
Xinjiang, som gränsar till Centralasien, är hem för den muslimska minoritetsgruppen Uighur.
Under de senaste åren har regionen upplevt ökande spänningar mellan uigurer och hankinesiska migranter. Våldet har ökat under de senaste månaderna, med dödliga attacker på civila i Urumqi och den södra staden Kunming.
Förra året körde tre uigurer en bil in i fotgängare på Himmelska fridens torg och dödade två människor och sig själva.
Kina skyller dessa attacker på uiguriska separatister inspirerade av utländska terrorgrupper. Men uiguraktivister säger att allt mer förtryckande kinesiskt styre drar till sig spänningar och underblåser våld.
Det senaste våldet ägde rum i juli i Yarkant och dödade 96 personer.
Polisen sköt 59 angripare efter att en beväpnad grupp stormat regeringskontoret och dödat 37 civila. Aktivister säger att polisen öppnade eld mot människor som protesterade mot ett Ramadan-kupp mot muslimer.
Kritiker säger att åtalet mot Tohti riskerar att tysta ned måttliga röster och kommer att göra situationen i Xinjiang värre snarare än bättre, rapporterar BBC:s Martin Patience i Peking.
Framträdande uigur akademiker Ilham Tohti har gått på rättegång för separatism i Kinas långt västra regionen Xinjiang.