Stephen O'Brien sade att byråerna hade blivit tillsagda att lämna på fredag, och flera internationella icke-statliga organisationer (NGO) på lördag.
Luhansks separatister hade tidigare förbjudit tio internationella humanitära organisationer med hänvisning till "våld".
Proryska rebeller beslagtog delar av Luhansk- och Donetskregionerna förra året.
Nästan 8 000 människor har dödats sedan striderna bröt ut i östra Ukraina i april 2014, en månad efter att Ryssland annekterade södra Krimhalvön.
I ett uttalande sade O'Brien att "de faktiska myndigheterna" i Luhansk hade beordrat FN:s organ och icke-statliga organisationer att lämna området.
Han sade också att alla FN-operationer hade avbrutits i de rebelliska delarna av Donetsk.
O'Brien uppmanade separatisterna i "både Luhansk och Donetsk att se till att FN:s och internationella icke-statliga organisationers verksamhet omedelbart återupptas".
Han varnade för att restriktioner för humanitära transporter hade förhindrat leverans av omkring 16.000 ton livsviktiga förnödenheter.
"Hospitaler kan inte utföra operation eftersom de saknar anestesi. Omkring 150 000 människor inte får månatliga livsmedelsdistributioner, sade O'Brien.
På torsdag vägrade Luhansk-rebellerna att registrera 10 av 11 utländska icke-statliga organisationer på grund av "våld".
De anklagade en av de förbjudna icke-statliga organisationerna - läkare utan gränser - för "olagligt lagra psykotropa läkemedel".
Den icke-statliga organisationen förnekar påståendet.
Ukraina och väst anklagar Ryssland för att beväpna separatisterna och även skicka sina reguljära trupper i östra Ukraina.
Moskva förnekar detta, men medger att ryska "volontärer" kämpar tillsammans med rebellerna.
EU och USA har infört egna sanktioner mot ryska tjänstemän och toppallierade till president Vladimir Putin.
Ett eldupphör i östra Ukraina har hållits under de senaste två veckorna, även om det har förekommit rapporter om enstaka beskjutningar.
FN:s ledare för humanitärt bistånd har uttryckt oro över att FN-organen beordrades att lämna de rebelliska delarna av Luhanskregionen i östra Ukraina.