Georgien säger att ryska trupper installerade skyltar som markerar "statsgränsen" i utbrytarregionen Sydossetien längre in i georgiskt territorium.
Flyttningen har lämnat en liten del av oljeledningen Baku-Supsa under Rysslands effektiva kontroll.
Ryssland har avfärdat anklagelserna om sin roll.
Dess trupper har patrullerat den administrativa gränsen sedan kriget mellan Ryssland och Georgien 2008 över Sydossetien.
En talesman för EU:s utrikespolitik sade att installationen av nya skyltar "hade lett till spänningar i området, med potentiellt negativa effekter på lokalbefolkningen, deras utkomst och rörelsefrihet".
"Steg som kan uppfattas som provokativa måste undvikas", sade EU:s utrikespolitiska chef Federica Mogherini i ett uttalande.
"EU bekräftar sitt fulla stöd för Georgiens territoriella integritet inom sina internationellt erkända gränser."
Enligt rapporter har markörer placerats minst 300 meter längre söderut på georgiskt territorium. Den nya gränsen ligger nu bara 500 meter från Georgiens huvudväg som förbinder Svarta havet med Azerbajdzjan.
I tisdags fördömde Georgiens utrikesminister Tamar Beruchashvili gränspassaget som en fortsättning på "krämande rysk annektering".
Den lämnar ett 1,6 km stort segment av en BP-driven Baku-Supsa-ledning utanför Georgiens territorium.
Men Georgiens energiminister Kakha Kaladze och BP talesperson Tamila Chantladze säger att BP inte har haft tillgång till den delen av rörledningen sedan 2008 kriget.
Chantladze betonade att rörledningen fungerar som vanligt.
Samtidigt har en flagga rests av georgiska demonstranter nära byn Khurvaleti, strax söder om skiljelinjen, tagits bort av vakter på södra Ossetian sidan, Georgiens Rustavi-2 TV-kanal rapporteras på torsdag.
I augusti 2008 trappades spänningarna mellan Georgien och Ryssland upp till en fullfjädrad militär konflikt när Georgien försökte återta Sydossetien efter en rad sammandrabbningar på lägre nivå med rysk-understödda rebeller.
I efterdyningarna av kriget förklarade Sydossetien sig självständigt från Georgien och erkändes av Ryssland, även om endast ett fåtal andra länder följde efter.
I april 2009 stärkte Ryssland sin ställning i Sydossetien genom att underteckna ett femårigt avtal om att formellt kontrollera sina gränser mot Georgien.
Det har länge funnits farhågor för att spänningarna kring Rysslands inflytande i regionen skulle kunna påverka Georgiens strategiska infrastruktur.
EU har varnat för ökade spänningar bland påståenden om att Ryssland har dragit om en del av Georgiens de facto-gräns mot Sydossetien.