Rättegången i en federal domstol i San Francisco hävdar att politiken är grundlagsstridig.
Kvinnor kan tjänstgöra i frontposition i USA:s militär, men de är utestängda från markstridsförband.
En talesman för Pentagon sade att 14 500 stridspositioner hade öppnats för kvinnor under nuvarande försvarsminister.
Han tillade att försvarsminister Leon Panetta hade "riktat tjänsterna för att undersöka möjligheten att öppna ytterligare roller för kvinnor i militären".
Men ACLU advokat Ariela Migdal sade att förändringarna hittills var "inte tillräckligt". Rättegången hävdar att fortsatta restriktioner kränker servicekvinnors konstitutionella rätt till jämställdhet.
En av målsägarna, marinkårens kapten Zoe Bedell, sade att befintliga regler hade blockerat hennes avancemang i marinkåren.
"Den militära är den sista plats där du får diskrimineras på grund av ditt kön", sade hon.
Kvinnorna står för cirka 14 procent av de 1,4 miljoner aktiva amerikanska militärerna.
Rättegången som inleddes på tisdagen säger att de är utestängda från 238.000 positioner, men också hävdar att de redan tjänar inofficiellt i stridsenheter.
Den amerikanska medborgarrättsunionen har på fyra amerikanska tjänstekvinnors vägnar väckt en utmaning mot ett förbud mot att kvinnor utplaceras i de flesta stridande roller.