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  1960年代,由於氣相色譜對高沸點有機物分析的侷限性,為了分離蛋白質、核酸等不易氣化的大分子物質,氣相色譜的理論和方法被重新引入經典液相色譜。20世紀60年代末,科克蘭(Kirkland)、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、裡普斯克等人開發了世界上第一臺高效液相色譜儀,開啟了高效液相色譜的時代。高效液相色譜使用粒徑更細的固定相填充色譜柱,提高色譜柱的塔板數,以高壓驅動流動相,使得經典液相色譜需要數日乃至數月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鐘內完成。  1971年,科克蘭等人出版了《液相色譜的現代實踐》一書,標誌著高效液相色譜法(HPLC)正式建立。在此後的時間裡,高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測手段,在有機化學、生物化學、醫學、藥物開發與檢測、化工、食品科學、環境監測、商檢和法檢等方面都有廣泛的應用。高效液相色譜同時還極大的刺激了固定相材料、檢測技術、資料處理技術以及色譜理論的發展。  20世紀60年代前,使用的填充粒大於100μm,提高柱效面臨著困境,後來的研究人員便採用微粒固定相來突破這一瓶頸。科克蘭、荷瓦斯製備成功薄殼型固定相,這種在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄殼,實現了高速傳質,為高效液相色譜技術的發展奠定了穩固的基礎。隨著填料粒徑的降低,更高的柱效也得以實現。60年代研製出氣動放大泵、注射泵及低流量往復式柱塞泵,但後者的脈衝訊號很大,難以滿足高效液相色譜的要求。1970年代,往復式雙柱塞恆流泵,解決了這一問題。  1970年代後,科克蘭製備出全多孔球形矽膠,平均粒徑只有7μm,具有極好的柱效,並逐漸取代了無定形微粒矽膠。之後又製造出的鍵合固定相使柱的穩定性大為提高,多次使用成為可能。1970年後,適合分離生物大分子的填料又成為研究的熱點。1980年後,改善分離的選擇性成為色譜工作者的主要問題,人們越來越認識到改變流動相的組成是提高選擇性的關鍵。

  高效液相層析儀根據各種各樣的相互作用力來分離混合物。這種相互作用力通常是分析物及分析管柱之間的一種非共價性質。使用高效液相色譜時,液體待檢測物在不同的時間被注入色譜柱,通過壓力在固定相中移動,由於被測物中不同物質與固定相的相互作用不同,不同的物質順序離開色譜柱,通過檢測器得到不同的峰訊號,每個峰頂都代表一個另外化合物的種類,最後通過分析比對這些訊號來判斷待測物所含有的物質。  以液體為流動相而設計的色譜分析儀器稱為液相色譜儀。採用高壓輸液泵,高效固定相和高壓靈敏檢測器等裝置的液相色譜儀成為高效液相色譜儀。高效液相色譜儀種類繁多,但不論何種型別的高效液相色譜儀,基本上都分為4個部分:高壓輸液裝置,進樣系統,分離系統和檢測系統。

  高效液相色譜作為一種重要的分析方法,廣泛的應用於化學和生化分析中,常用於醫藥品、化學、環保、生命科學、與食品工業的研究上。  高效液相色譜從原理上與經典的液相色譜沒有本質的差別,它的特點是採用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相,可將液體混合物中的成分分離、成分定性及定量分析。適於分析高沸點不易揮發、分子量大、不同極性的有機化合物。例如:可檢測分析食品中的三聚氰胺的含量。
高效液相色譜法(英語:high performance liquid chromatography,縮寫 HPLC),又譯高效液相層析法,以前曾指高壓液相層析法(high pressure liquid chromatography),是一種色譜分析技術,用來分離混合物,以確認並量化各個成分的比例。它依賴泵加壓樣品以令其通過填充有吸附劑的壓力柱,導致樣品的各個成分因而分離。高效液相色譜法常用於生物化學和分析化學。