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  樣品被照射特定波長(或波段)的光,其被熒光團吸收,導致它們發出更長波長的光(例如,和被吸收的光不同的顏色)。通過使用光譜發射濾片,該照明光被從弱得多的發射熒光中分離出來。  近年來在生物學研究中,熒游標籤被廣泛地使用來標定生物分子,使熒光顯微鏡變得更加重要。它以水銀燈或氙氣燈為光源,搭配具激發濾片,發散濾片濾片組的光學儀器。  目前被普遍使用的熒光顯微鏡,是屬於落射熒光顯微鏡(Epi-Fluorescence Microscopes,見右圖),是指激發光的來源和觀察的位置(接目鏡),皆位於樣品的同方,通過相同的光路。這些顯微鏡被廣泛應用於生物學,並且是更先進的顯微鏡設計的基礎,例如共聚焦顯微鏡或全內反射螢光顯微鏡(TIRF)。

  熒光顯微鏡要求強烈的,近乎單色光的照明,這是一些普遍的光源,比如鹵素燈泡不能提供的。四種主要型別的光源的使用,包括氙氣燈或帶有激發濾片(Excitation Filter)的水銀燈,鐳射,超連續光譜光源,和高功率發光二極體(LED)。鐳射被最廣泛地用於更復雜的熒光顯微技術,像共聚焦顯微鏡或全內反射螢光顯微鏡(TIRF)。而氙氣燈,水銀燈,和發光二極體(LED)與分色激發濾片通常被用於廣角落射熒光顯微鏡(Epi-Fluorescence Microscopes)。
熒光顯微鏡是一種使用熒光或磷光物質的光學顯微鏡,或除此之外使用反射和吸收用於研究的有機或無機物質的特性。“熒光顯微鏡”是指使用熒光來產生一個影象的任何顯微鏡,無論是更簡單的設定像落射熒光顯微鏡,或更復雜的設計如共聚焦顯微鏡,其使用光學切片,以獲得更好的解析度的熒光影象。