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  1454年伊莎貝拉的父親卡斯提爾國王胡安二世死後,她的同父異母兄長恩裡克四世繼承王位。1469年她和堂弟亞拉岡王儲費爾南多聯姻。  1474年,恩裡克四世去世,只有一個女兒胡安娜·拉·貝爾特蘭尼哈,恩裡克被指無法生育,而胡安娜是他親信和王后的孩子。當時胡安娜已經嫁給了葡萄牙國王阿方索五世。伊莎貝拉迅速繼承了王位。葡萄牙的阿方索五世發兵聲稱胡安娜應該繼承王位,但1476年在託羅一役徹底失敗。阿方索五世被迫簽署阿爾卡索瓦什和約,放棄對卡斯提爾王位的一切要求。1478年伊莎貝拉在天主教教宗的批准下成立西班牙宗教裁判所,迫害非天主教人士並大力提升了王權。1479年費爾南多的父王去世,費爾南多二世和伊莎貝拉成為亞拉岡和卡斯提爾的國王、女王。1480年這對夫婦召叢集臣和34位平民代表制定了一系列法律、為未來的西班牙奠定了法理基礎。  伊莎貝拉任內時常召開名為「科提斯」的國家議會,並且將大部分的行政權託付給「卡斯蒂利亞會議」。卡斯蒂利亞會議的成員由王室任命,是推行專制政治的有力新工具。她與中產階級聯手對抗貴族階級,並以城鎮的民兵為其軍事力量的後盾,她又將傳統封建貴族的三大軍團交由丈夫費爾南多掌管、壓制,解除了貴族的軍事威脅。她對於牧羊業老闆所組的「馬士達」公會則較為縱容,因為政府的稅收主要來自牧羊業,這種情形一直持續到新大陸的財富大量輸入西班牙之前。

  1492年1月2日,伊莎貝和費爾南多的軍隊攻下了統治伊比利亞半島南部七個世紀的摩爾人的最後一個重鎮格拉納達,完成在伊比利亞半島基督教勢力對伊斯蘭勢力數個世紀的征戰收復失地運動。  同年,在對克里斯托弗·哥倫布向西航海去印度的計劃三次拒絕之後,伊莎貝終於同意資助哥倫布的探險。由於財政吃緊,伊莎貝拉拿出一個自己的裝滿首飾的首飾盒給哥倫布作為資助,同時答應哥倫布的條件:他和他的後代做為西班牙開拓的殖民地的總督,並獲得一成的利潤。8月3日哥倫布啟航。次年攜帶著一些印第安人和黃金凱旋,西班牙從此進入了海外冒險和殖民的黃金時代。1494年,伊莎貝和費爾南多通過《託德西利亞斯條約》和葡萄牙瓜分了世界。伊莎貝曾經試圖為了保護印第安人免受西班牙殖民者的虐待而組建了一個印第安事務處。但後來的西班牙征服者並沒有遵守女王的規定,反而極力迫害印地安人。  1492年3月31日,伊莎貝和費爾南多頒佈阿罕布拉法令,把西班牙的猶太人和穆斯林驅逐。大約有20萬人被迫離開家園,剩下的被迫皈依基督教,並在日後再次遭到迫害。

  伊莎貝拉和斐迪南在統一西班牙之後試圖利用西班牙宗教裁判所在精神層面把全國統一在天主教之下。1502年,西班牙的穆斯林被迫在接受洗禮皈依基督教和離開西班牙之間作選擇。他們還試圖通過聯姻和歐洲其他列強聯合,以達到制衡法國和統一伊比利半島的目的。  伊莎貝拉死後把所有稱號給了女兒胡安娜。胡安娜的丈夫菲利普一世在伊莎貝拉死後和斐迪南反目,但在內戰爆發前病死。菲利普一世的兒子卡洛斯成為西班牙王位的繼承人,其治下的西班牙帝國達到空前的強大。  伊莎貝拉被安葬在格拉納達的王家教堂。

  伊莎貝拉和斐迪南育有五個子女:
伊莎貝拉一世(;1451年-4月22日-1504年-11月26日)是卡斯提爾的女王。她及丈夫斐迪南五世(亞拉岡的斐迪南二世)完成了收復失地運動,為日後他們的外孫卡洛斯一世統一西班牙帝國奠定了基礎。其支援克里斯托弗·哥倫布開拓美洲新大陸,為開拓發展西方文明作出重大的貢獻。另外他重用的德·西斯內羅斯樞機大力提升王權並壓制了貴族的跋扈,讓王權藉由「宗教裁判所深入到基層民眾,讓人民成為教會的順民,以及王室的順民。」