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  今川氏家臣井伊直親的長男,永祿4年(1561年)2月19日於遠江國井伊谷(現在靜岡縣濱松市北區引佐町井伊谷)出生,幼名虎鬆。井伊氏先祖代代都是井伊谷的國人領主,當時的井伊家當主井伊直盛(直政的堂伯父)仕於今川義元,但在桶狹間之戰陣亡。父親井伊直親在永祿5年(1562年)因為遭誣陷涉嫌暗殺主君今川氏真關係,被氏真下令處死,失去了井伊谷的領地。當時虎鬆才2歳,當主由直親的未婚妻祐圓尼擔任(即井伊直虎)。後來生母改嫁給松下清景,跟著改名為「松下虎鬆」。不久生母逃到三河國,由於受到今川氏追殺,曾於三河及遠江兩地四處移居。1575年德川家康在松下城獵鷹遇上了虎鬆,虎鬆求仕家康,獲家康接納為小姓,獲得井伊谷的領地,姓氏改回井伊氏,幼名改為「萬千代」。

  萬千代開始在德川家的舞臺開始活躍,初次上戰場是高天神城之戰,後來立下了不少戰功,更擔任了家康的旗本手先鋒,與當時德川家的名將本多忠勝和榊原康政齊名,曾斬獲侵入家康房間進行暗殺的武田軍忍者。天正10年(1582年)22歳元服,改名為直政。同年迎娶家康的養女「花」(後來的唐梅院,鬆平康親的女兒)。該年2月武田氏滅亡,家康派遣直政與北條氏進行外交交涉,過程頗為順利。  後來爆發本能寺之變,因明智光秀謀反,當時在信長領地的直政陪伴家康等人安全地從堺重返三河國。後來直政從投降德川的武田遺臣當中,將武田家山縣昌景的赤備再次編成部隊,並引進武田軍的兵法,從此赤備成為井伊軍的象徵。後被加封井伊谷4萬石,時稱「兵部少輔」。井伊治軍極為嚴謹,而且作戰勇猛果敢,所以有人稱之為「赤鬼井伊」。在小牧長久手之戰初次以赤備隊參戰且表現出色,殺死池田恆興與森長可,獲秀吉高度評價。  1585年8月,德川家康跟北條同盟一起進攻北信濃和上野,派遣鳥居元忠為總大將帶領7000人,攻打背叛德川投向上杉氏的真田氏上田城。但鳥居元忠在第一次上田城之戰遭伏兵奇襲而退敗,家康震怒之下,在9月時命令井伊直政、大須賀康高、鬆平康重等帶5000人北上前往救援。在小諸城跟鳥居元忠會師穩定軍隊,此時井伊直政聽聞北條氏直率領的3萬人,已在沼田城被真田氏用同樣的戰術敗於真田與上杉聯軍之下。  在盟軍北條擅自退兵與上杉援軍趕到之後,直政判斷此時僅剩己方孤軍跟上杉真田聯軍纏鬥沒任何利益可言,於9月28日留下大久保忠世守備小諸城後亦帶主力回師,沒跟上杉、真田作任何交戰。不久德川家發生石川數正出奔事件,讓遭此變故的家康全面停止北信濃攻略。事後家康對直政回師儲存德川實力的判斷沒有異議,加封他至6萬石。當家康和秀吉於1586年10月和解後,11月23日直政就任官職從五位下侍從,獲賜豐臣姓。  1590年,德川家康參加小田原征伐,任命為井伊直政為總大將,當大軍包圍小田原城時,直政決定夜襲,併成功突圍,更是唯一成功突襲的武將。奧州仕置的九戶政實之亂,擔任仕置軍的先鋒。之後,跟隨家康進入江戶,家康獲封關東地區,而直政被分封於上野國的箕輪12萬石,是德川家家臣當中排行第一,德川家中超過10萬石以上的只有直政、本多忠勝及榊原康政3人。1598年,接獲家康命令,將箕輪城拆除,於箕輪城附近以南和田城地區改建高崎城(今群馬縣高崎市)作為居城。

  1598年,豐臣秀吉過世,埋藏已久的不和隨之爆發,主要的人物分別是德川家康及石田三成,後來家康決定討伐會津的上杉景勝,直政負責遊說各地大名加入東軍的工作,包括京極高次、竹中重門、加藤貞泰、稻葉貞通、關一政、相良賴房及犬童賴,後來家康折返江戶,並向近畿地方前進,在關原之戰中與本多忠勝擔任軍監,協助家康四男鬆平忠吉與小西行長、宇喜多秀家等軍隊激烈戰鬥,後來西軍潰敗,德川軍全軍追擊,當他們追擊島津義弘隊時,討取了義弘的侄子島津豐久,但被島津軍柏木源藤的鐵砲擊中肩部(一說為右肘關節)而墜馬受傷。  戰後,積極處理西軍大名的獎罰,與長宗我部氏交涉謝罪事宜,但長宗我部盛親後來聽信家臣久武親直的讒言將哥哥津野親忠殺害,領土遭到家康沒收,接收領土之際遭到長宗我部的家臣反抗,也順利敉平。後來與島津氏交涉(此工作其後交由本多正信處理)。此外,也為了真田昌幸及信繁的活命奔走盡力。他被家康分封於石田三成的舊領的佐和山城,石高18萬石,敘任從四位下,當時家康的重臣包括直政、大久保忠隣、本多正信、榊原康政、本多忠勝・及平巖親吉等6人。後來積極去除石田三成的政治風格,準備以彥根城取代原有的佐和山城。  慶長7年,1602年2月1日,因為關原之戰舊傷口破傷風復發的關係,早年病逝。法名為祥壽院殿清涼泰安大居士。墓所於滋賀縣彥根市祥壽山清涼寺。逝世後,井伊氏開始直政沒有實行的建造彥根城,因而同時間有佐和山藩和彥根藩同時存在。  他有兩名兒子。長男直勝因為多病體弱的關係,被分封至安中藩,而次男直孝則繼承了家督。德川幕府執政二百多年間,井伊氏共有五名子弟先後出任德川家大老,可見井伊氏在幕府的影響力。  剛投靠家康時,直政曾說:「願為德川家之厚恩而身死以為報答!」家康曾評價直政:「平時雖言少沉默,但心平穩重,肚裡想著不少計劃,也為實行這些計劃決不改移!」。由於並非三河譜代,加上家康特別信任,令本多忠勝及榊原康政等對直政大為嫉妒,但直政「言少,只做好自己的分內事,也從不到處炫耀。」曾有史家把直政與西國的藤堂高虎比較,也指出「德川家中,本多忠勝與榊原康政乃武事優秀,政治智略以本多正信為優,但兩者兼持者,只有井伊直政而已。」雖與本多正信同為外交役使,但直政仍為較重要的外交代表,也常得對方讚賞,作為一個武士出身而且年少的直政,實在不易,德川天下的成功,直政的貢獻及角色實在是不可多得的。

  井伊直政作戰時非常驍勇,穿著重型鎧甲並時常率領赤備騎兵隊深入敵陣,雖然取得勝利但常常負傷而歸,與愛穿輕型鎧甲卻從未受傷過的本多忠勝形成反差強烈的對比,家康也因此拿這個反差跟直政開過玩笑。四天王中井伊直政年紀最輕卻是第二早死的(僅次於酒井忠次),乃因征戰時常重傷所致,在當時醫療環境不佳的情況下多次重大傷口治療有細菌感染之嫌,令井伊直政難以長命。  井伊直政治軍極為嚴厲,稍觸軍法便要人頭落地,所以有段時間直政轄下的許多士卒或家臣紛紛轉投本多忠勝,連井伊家家老都有受不了直政的嚴酷而出奔的案例。
井伊直政(1561年3月4日-1602年3月24日、永祿4年2月19日-慶長7年2月1日)是日本戰國時代的武將,德川家家臣,父親是今川氏家臣井伊直親(遠江國人眾),幼名是「虎鬆」及「萬千代」,官位是從四位下、兵部大輔、侍從。德川四天王和德川十六神將之一。是彥根藩(佐和山藩)的藩祖,眾多譜代大名中,石高收入最多。