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  通常,一個獨立樣本的DNA首先被提取和純化。純化後的DNA可以用PCR反應擴增。隨後,用限制性核酸內切酶切成“限制性片段”,每種內切酶只能切除可被它識別的特定序列。隨後,限制性片段通過瓊脂糖凝膠電泳將不同長度的片段分開。得到的凝膠可以通過南方墨點法(Southern blotting)進行強化。  RFLP是第一種被用於作圖研究的DNA標記,它們一般有如下特徵:1.出於染色體上的位置相對固定;2.同一親本及其子代相同微點上的多型性片段特徵不變;3.同一凝膠電泳可顯示不同多型性片段,具有共顯性特點。

  每個個體的酶切位點之間的距離會有差距,這樣限制性片段的長度有區別,不同個體的某個條帶的位置也會不同(也就是“多型性”)。這樣就能從遺傳水平上區分不同個體。RFLP也可以揭示不同個體之間的遺傳關係,因為孩子從父母處繼承了染色體。這種技術也可以用來判斷各個種的生物之間的關係。

  T為terminal縮寫,即端點限制性片段長度多型性。如在16S rRNA分析中,利用一個或一對熒游標記的引物進行PCR擴增。隨後用高頻率的內切酶進行酶切。通過毛細管電泳將切開的片段分離,可檢測端部的限制性片段長度。這是快速鑑別菌株或者簡單群落的方法。
在分子生物學中,限制性片段長度多型性(英語:restriction fragment length polymorphism, RFLP)具有兩種涵義:一是DNA分子由於核苷酸序列的不同而產生的一種可以用來相互區別的性質;二是一種實驗技術,利用這種性質來比較不同的DNA分子。這種技術可以用於遺傳指紋和親子鑑定。