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  在糖酵解的放能階段,底物水平磷酸化生成了四分子的腺苷三磷酸:其中兩分子是在1,3-二磷酸甘油酸轉變為3-磷酸甘油酸的過程中被磷酸甘油酸激酶將磷酸基轉到腺苷二磷酸上的;另外兩分子是在磷酸烯醇式丙酮酸轉變為丙酮酸的過程中被丙酮酸激酶將磷酸基轉到腺苷二磷酸上的。第一步是在3-磷酸甘油醛與一分子的無機磷酸被磷酸甘油醛脫氫酶轉變為1,3-二磷酸甘油酸之後發生的。在接下來獨立的步驟(區別於氧化磷酸化的重要步驟)中,通過磷酸甘油酸激酶的作用,將1,3-二磷酸甘油酸分子上的高能磷酸基團轉移到腺苷二磷酸上,生成3-磷酸甘油酸。因為腺苷三磷酸從無機磷酸基團中生成出來,此步驟導致了糖酵解過程中的能量收穫。第二個底物水平磷酸化在之後發生:在丙酮酸激酶的作用下通過磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)反應而生成丙酮酸。此反應重新生成了在糖酵解準備階段用於將葡萄糖活化為葡萄糖-6-磷酸以及將果糖-6-磷酸活化為果糖-1,6-二磷酸而耗去的腺苷三磷酸。  一旦糖酵解的產物丙酮酸進入線粒體基質,丙酮酸就被轉變為乙酸酯並結合到輔酶A上以生成乙醯輔酶A並進入三羧酸迴圈。然而三羧酸迴圈是需氧呼吸,底物水平磷酸化的另一個例子就發生在琥珀醯輔酶A轉換為琥珀酸時,鳥苷二磷酸通過被轉上一個磷酸基團而生成了鳥苷三磷酸(GTP)。此磷酸基團在另一個底物水平磷酸化事件中被轉移到腺苷二磷酸上。催化此反應的酶是琥珀醯輔酶A合成酶。

  在工作的骨骼肌和大腦中,磷酸肌酸作為一種便利現成的高能磷酸鹽供應被儲存起來,肌酸磷酸激酶將磷酸基團從磷酸肌酸轉移到腺苷二磷酸上而生成腺苷三磷酸。接著腺苷三磷酸釋放所匯存的化學能。這有時被錯誤地認為是底物水平的磷酸化,儘管它是轉磷酸化。  除此之外,底物水平磷酸化亦在發酵過程中見得到,例如異質乳酸發酵、丁酸發酵與丙酸發酵等。
底物水平磷酸化(英語:substrate-level phosphorylation)是指一類ADP或其他核苷二磷酸的磷酸化作用與底物的脫氫作用直接相偶聯的反應過程。