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  反轉錄酶在反轉錄病毒裡是用來在複製以及編碼的反應過程中。反轉錄RNA病毒像是反轉錄病毒,利用該酵素將他們的RNA基因組轉換成DNA,再將該DNA送至宿主細胞中,並且和宿主細胞的基因組一起進行復制。反轉錄DNA病毒,像是嗜肝DNA病毒,可以在組裝時,將RNA當作模板製造出DNA。HIV藉由此酵素感染人類。若是沒有反轉錄酶,這些病毒的基因組就不能和宿主細胞結合,進而導致複製失敗。

  反轉錄酶從RNA模板中製造出單股DNA。在缺乏DNA-dependent DNA聚合酶的病毒中,雙股DNA的製造可以經由宿主編碼DNA聚合酶δ完成,過程中可能會將病毒的DNA-RNA引子誤認並且藉由和引子去除類似的機制合成出雙股DNA,而在新的合成的DNA即取代了舊有的RNA模板。反轉錄的過程的錯誤率很高,因此在整個步驟中突變有很大的機會會發生。這種突變的現象可能會形成病毒的抗藥性。

  反轉錄病毒,或稱VIssRNA-RT病毒,是用DNA當作中間產物的RNA反轉錄病毒。他們的基因組通常由兩個正感知且有5’端帽和3’端聚線苷酸尾的單股RNA。反轉錄酶如人類免疫缺乏病毒(HIV)和人類T淋巴細胞病毒HTLV。在細胞質中製造雙股DNA的過程有以下步驟  製造雙股DNA也牽涉到股的轉移,即從一開始的RNA dependent DNA合成出來較短的DNA轉移至其他基因組模板中的受體,而此受體接下來會藉由反轉錄酶進行DNA-dependent DNA的活化。  反轉錄病毒的RNA在5’端和3’端被重新排列。引子黏接在RNA病毒的位置的區域稱為引子結合區(PBS)。PBS區的5’端稱為U5,而PBS的3’端稱為領先區。tRNA的引子在14和22區的核苷酸被解開且和病毒的RNA與PBS形成鹼基對。事實上PBS在病毒的RNA的5’端上是不正常的,因為反轉錄酶是從3’端合成出DNA,方向是5’到3’(相對於RNA模板)。因此引子和反轉錄酶必須位在病毒的RNA的3’端。為了成功的將之重新定位,需要許多的步驟以及酵素,包含DNA聚合酶,RNAse H以及已解開的的聚合苷酸來參與反應。  HIV的反轉錄酶也有核糖核苷酸酶用來活化,目的是將在合成cDNA的過程中將病毒的RNA降解,如同DNA dependent DNA聚合酶將cDNA股合成為無意義的DNA來組成病毒的雙股DNA中間產物(vDNA)。

  自行復制真核細胞的延長基因組稱為反轉錄轉座子,藉由反轉錄酶去移除RNA的其中一個位置。他們在植物和動物中的基因組中大量發現。端粒酶是另外一種反轉錄酶,在許多真核生物,像是有自己的RNA模板的人類中發現,這些RNA會被用來當作DNA複製的模板。

  反轉錄酶亦從細菌的Retron msr RNAs,一種特殊的片段,由反轉錄酶編碼,且拿來合成msDNA。合成DNA時需要引子。在細菌裡,引子的合成是在複製的過程中製造。

  反轉錄酶包含RNA-dependent DNA聚合酶和DNA-polymerase DNA聚合酶,兩者一起用來表現轉錄的過程。在一開始轉錄因子中,反轉錄病毒的反轉錄酶有RNase H家族的重要區域。

  反轉錄病毒的生活史中有三種不同的複製系統。第一種,反轉錄酶從病毒的RNA合成出病毒的DNA,進而製造出新的互補DNA。第二種複製方式則是在宿主細胞的DNA聚合酶開始複製黏合上去的病毒DNA後,RNA聚合酶II就會將原病毒的DNA轉錄成之後和病毒顆粒包裝在一起的RNA。因此,突變可以在這些步驟中發生。 反轉錄酶在將RNA變成DNA時有很高的錯誤率,不像其他的DNA聚合酶,他沒有校正的功能。這種較高的錯誤率相對於有校正的複製過程,可以促進突變的累積。一般市面上由Promega購買到的反轉錄酶,說在AMV中有每17000個鹼基就有一個是突變的,而在M-MLV中每30000個鹼基就有一個是突變的。  除了創造單核甘酸的基因多樣性外,反轉錄酶也在一些步驟初級產物融合或外顯子重組並且做出人造的反義RNA轉錄產物。這種“模板的切換”被推測,這種可以完整的在體內中進行反應的反轉錄酶,通常有著可以找出在模式生物中數千個未註明的轉錄產物。

  

  更多有關抗病毒藥物的細節,請參照反轉錄酶抑制劑。當HIV利用反轉錄酶將基因的物質複製並且產生出新的病毒(部分反轉錄病毒的增殖圈),特殊的藥物被設計成用來阻斷反轉錄酶反應的過程,並且抑制反轉錄病毒的生長,這些藥物被稱作反轉錄酶抑制劑且包含核甘以及核甘酸相似的物質,齊多夫定(多夫),拉米夫定(博路定),和非核甘抑制劑奈韋拉平(維樂命)。

  更多有關分子生物學的細節,請參照反轉錄聚合酶鏈反應。反轉錄酶常用來應用在聚合酶鏈反應這種研究方式中,以RNA為主的技術稱作反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)。典型的PCR技術只能用來用在DNA上,但是有著反轉錄酶的幫助下,RNA亦可以被反轉錄成DNA,因此使PCR可以分析RNA分子。反轉錄酶也同時被應用在從MRNA製作cDNA基因庫,市面上買的到的反轉錄酶通常在分子生物界裡都是被改良過的。其他酵素可被科學家用來進行復制或者定義RNA。  反轉錄酶也被拿來用在胰島素的製作。藉由將真核細胞的胰島素的mRNA和反轉錄酶注入細菌中,mRNA就可以插入原生生物的基因組裡,大量的胰島素就可被製造,可用來取代從豬隻的胰島萃取等的傳統方式 直接將真核細胞的DNA注入到細菌的染色質裡。在真核細胞mRNA的生產過程中,去除內含子,並且提供一個適當的模板。反轉錄酶將RNA重新編成DNA,因此可以拿來和基因組黏合。
逆轉錄酶是一類存在於部分RNA病毒中具有逆轉錄活性、能以單鏈RNA為模板合成DNA的酶。由逆轉錄酶催化逆轉錄合成的DNA稱為互補DNA(cDNA)。