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  透過同時將兩個反向的物鏡聚焦在同一個位置上可以提軸向的解析度。且調整通過物鏡的兩道光的光程差,使其最小。透過這個方法,在兩物鏡共同聚焦處的分子可以被相干地照亮,且可以收到相干地反射光或是穿透光,例如:偵測器可以接收到發射光地相干疊加。用於照明與偵測的體角 formula_1也增加並接近理想狀態(樣品同時照射和檢測到來自各方向的光)。  在圖中顯示4Pi顯微鏡的操作模式。 鐳射由一分光鏡 (BS)分光並透過鏡子打在兩個相反的物鏡。在共同焦點處,兩道聚焦光束會疊加。 激發的分子在這個位置發出熒光,且被兩個物鏡收集,由同一分光鏡收集,最後被分色鏡 (DM)偏折至接收器。  在理想情況下,每個物鏡可以收集立體角 formula_2的光線。 因此,有兩個物鏡可以收集所有方向方向的光(立體角 formula_3)。 名此顯微鏡也是得名於其最大可激發和偵測光的角度。實際上,物鏡最多隻可達到約140°的孔徑角,其對應 formula_4。
4Pi顯微鏡是改進軸向解析度的鐳射掃描螢光顯微鏡 。解析度由原本的500至700 奈米提高到100-150 奈米,幾乎相當於降低5至7倍焦顯微鏡的球狀焦點體積。