La differenziazione in senso odontoblastico delle SHED è stata ottenuta utilizzando un terreno favorente la deposizione di matrice calficificata. Iniziando la supplementazione con 50 g/mL acido ascorbico, 10 mM -glicerofosfato e 10 nM di desametasone in piastre aventi confluenza di circa l'80% è stato cambiato il terreno ogni due giorni. A 7, 14 e 21 giorni dal differenziamento è stato estratto l'RNA dalle colture cellulari mediante apposito kit commerciale (RNA Easy Kit, Invitrogen). Come controllo sull'espressione basale delle cellule in coltura sono state invece utilizzate piastre senza agenti pro-differenziativi. L'acido ribonucleico così ottenuto, trattato con DNAsi, è stato successivamente retrotrascritto ed amplificato mediante PCR (Tabella 1).-33 -Come è dimostrato chiaramente dalla Figura 3, il mezzo di coltura pro-differenziativo induce l'espressione di OCN e DSPP, marcatori di un fenotipo odontoblastico, in linea con la letteratura.La presenza di DSPP è stata riscontrata anche a livello proteico ripetendo nei medesimi a partire dalla seconda settimana di differenziazione, estraendo la componente proteica dalle colture cellulari. Sono stati quindi caricati 50 microgrammi di estratto cellulare su gel di acrilamide al 10%. Terminata la corsa elettroforetica (2h e 30 minuti a 100V) il contenuto proteico del gel è stato trasferito su un foglio di nitrocellulosa mediante applicazione di una corrente di 45 mA per 1 h. Per saturare la nitrocellulosa è stato impiegato TBS 5% BSA per un'ora a 42°C. Per marcare DSPP si è fatto ricorso al surnatante dei subcloni 5B6 di un ibridoma generato precedentemente con proteina ricombinante DSP-GST, lasciandolo incubare O.N. a 4°C. La detezione dell'anticorpo primario è avvenuta mediante ricorso a secondario antimouse perossidato, che reagendo con il luminol impressiona la pellicola radiografica (Figura 4). 