Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state ottenute mediante la metodica Ficoll Paque a partire da 40 ml di sangue periferico prelevato in litio-eparina come descritto in letteratura (18). Il siero è stato stoccato in congelatore a -80°C per l'esecuzione dei dosaggi citochinici previa centrifuga a 1500 G per 10 minuti a 4°C.La metodica Ficoll Paque consente di ottenere dal sangue venoso periferico le PBMC e prevede una diluizione di 1 a 1 tra sangue venoso prelevato e soluzione fisiologica, opportunamente portata a temperatura ambiente, al fine di ottenere la soluzione madre. Per stratificare le cellule si utilizza la soluzione Histopaque LSM ( Lymphocyte Separation Midium). Grazie a questo procedimento la separazione delle PBMC avviene per gradiente di densità, la prima centrifuga a 1200 G per 20 minuti accelera questo processo. L'anello delle PBMC ottenuto con la centrifuga viene prelevato, lavato con soluzione fisiologica e ulteriormente centrifugato per ottenere un pellet cellulare. Le PBMC vengono infine contate al microscopio ottico e sottoposte alle ulteriori indagini citofluorimetriche oppure messe in coltura.I precursori circolanti degli OC sono stati invece valutati su 500 µl di sangue intero, non sottoposto alla metodica Ficoll Paque.