Durante il processo di rilevamento la membrana diventa il provino per la proteina d'interesse con un anticorpo modificato che è collegato a un enzima messaggero; quando esposto ad un appropriato substrato questo enzima crea una reazione colorimetrica e produce un colore. Per una serie di ragioni questo processo si svolge, tradizionalmente, in due fasi ("two-step"), anche se esistono metodi per processi a singola fase ("one-step") per determinate applicazioni.