La vitamina D svolge un ruolo fondamentale in molte funzioni fisiologiche grazie alla sua attività nelle cellule dei vari tessuti; una qualsiasi alterazione del suo signaling è coinvolta in molte condizioni patologiche, come ad esempio tumore, asma, infertilità, patologie autoimmuni, diabete e patologie metaboliche [24]. L'importanza dell'attività del recettore della vitamina D (VDR) e i suoi effetti pleiotropici sono stati studiati e ben descritti in modelli murini knockout, i quali hanno mostrato un diverso fenotipo in molti tessuti, come nell'osso, nell'intestino [25], nella pelle [26], nei polmoni [27],nei muscoli [28], nell'endotelio [29], nel tessuto adiposo e nel metabolismo [30]. Sebbene i modelli animali knockout siano molto utili per studiare quali siano i pathways generali regolati dalla vitamina D, a livello cellulare hanno un grande difetto: infatti, nei modelli animali knockout si originano delle cellule che, fin dalla loro formazione e dal loro sviluppo embrionale, non hanno mai sentito l'influenza del VDR e pertanto non si sono mai affidate a questo recettore per il controllo trascrizionale e la regolazione del metabolismo. Per analizzare l'importanza dell'attività del VDR e per stabilire se questo sia essenziale per le attività cellulari, un altro approccio è quello di abbattere il recettore in una popolazione di cellule che esprime il VDR e se ne serve per modulare crescita, differenziazione e molte altre funzioni. Quando si studia un'alterazione del signaling della forma attiva della vitamina D (1,25(OH) 2 D 3 ), si deve tenere presente che la carenza di vitamina D e la perdita del relativo recettore hanno alcune conseguenze sovrapponibili ma parzialmente distinte. Il fenotipo ipocalcemico, comune sia a modelli carenti di vitamina D che a modelli VDR knockout, può diventare un fenotipo normale semplicemente con una dieta ricca di calcio [31]. Bisogna poi considerare che a livelli molto bassi di calcitriolo (1,25(OH)2D3) il VDR può ancora svolgere alcune sue funzioni attraverso un meccanismo ligando-indipendente [32] oppure rispondendo ad altre molecole, come la curcumina contenuta nella curcuma [33] e l'acido litocolico [34]. Quindi la carenza della vitamina D o la carenza dell'attività del VDR daranno risultati diversi. Pertanto, al fine di analizzare in modo completo e inequivocabile l'alterazione del signaling della forma attiva della vitamina D (1,25(OH)2D3), l'approccio migliore è quello di eliminare l'espressione del recettore in diversi modelli cellulari in vitro; abbiamo quindi seguito questa linea di indagine.La prima scoperta importante di questo lavoro è stata che l'ablazione del recettore della vitamina D ha comportato un aumento dell'attività della catena respiratoria, favorendo così la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) a livello intracellulare. È molto interessante notare che abbiamo dimostrato che in tutti i tipi di cellule il VDR controlla sia la trascrizione mitocondriale (COX2 e MT-ATP6) che la trascrizione nucleare (COX4 e ATP5B) delle proteine coinvolte nell'attività respiratoria e nella sintesi dell'ATP: questo duplice controllo è giustificato dalla necessità della cellula di coordinare la trascrizione nucleare e quella mitocondriale dei componenti della catena respiratoria. È noto che proprio la catena respiratoria è una delle principali fonti di ROS; in particolare, i complessi I, III e IV sono coinvolti nella biosintesi dei radicali liberi [35]. Entro certi limiti, la produzione di ROS è fondamentale per le funzioni cellulari ed è coinvolta nella progressione del ciclo cellulare [36], ma un suo eccessivo aumento può essere nocivo e può causare danni alle cellule. In tutti e tre i modelli cellulari che abbiamo silenziato, abbiamo riscontrato un notevole aumento dei livelli di ROS, soprattutto nei fibroblasti primari, che abbiamo considerato come modello di cellule sane; in presenza di questi elevati livelli di ROS, le difese antiossidanti potrebbero non essere sufficienti ad evitare un danno cellulare. Infatti, mentre l'effetto iniziale del silenziamento del recettore è stato l'arresto della crescita e la modulazione del ciclo cellulare, l'effetto a lungo termine della perdita del VDR è stato il danno cellulare, misurato come rilascio di LDH. Poiché abbiamo osservato una produzione di ROS e una tossicità minori nelle cellule MCF7 silenziate, che abbiamo considerato come modello di cellule tumorali maligne, e un maggiore effetto del silenziamento nei fibroblasti primari, possiamo dire che la tossicità è direttamente proporzionale all'aumento dei livelli di ROS. La differenza tra i vari tipi di cellule è ragionevolmente spiegata da alcune caratteristiche tipiche delle cellule tumorali. Infatti, è noto che le cellule trasformate sfruttino una segnalazione intracellulare mediata dai ROS per indirizzare la cellula verso la proliferazione ed altri eventi necessari per la progressione del tumore; di conseguenza le cellule tumorali producono grandi quantità di specie radicaliche ma senza subirne gli effetti negativi poiché i livelli elevati di ROS sono bilanciati da una maggiore attività degli enzimi antiossidanti [37]. Di conseguenza, il ruolo protettivo del VDR è risultato essere particolarmente evidente nei fibroblasti sani, che sono più sensibili ai danni ossidativi, anche se con i nostri esperimenti abbiamo dimostrato che il VDR difende dallo stress ossidativo anche le cellule MCF7 più trasformate.In un nostro lavoro precedente avevamo dimostrato l'importanza metabolica del VDR e il suo effetto sulla proliferazione: infatti, il recettore della vitamina D rallenta l'attività respiratoria e consente l'indirizzamento degli intermedi metabolici verso la biosintesi, sostenendo così la proliferazione [11]. I risultati di questa ricerca rivelano un nuovo ruolo del VDR nella fisiologia cellulare, ovvero la protezione dall'eccessiva attività respiratoria e la conseguente limitazione della produzione di ROS, i quali se in eccesso danneggiano la cellula.In questo studio, abbiamo osservato gli effetti negativi dell'alterazione del controllo metabolico esercitato dal VDR; infatti, abbiamo visto che nel lungo periodo l'eccessiva produzione di ROS, conseguente alla mancata espressione del VDR, ha effetti deleteri sulla funzione mitocondriale e sulla sopravvivenza cellulare. Una delle conseguenze del danno causato dall'eccesso di ROS è la variazione della permeabilità della membrana mitocondriale, che provoca il rilascio di citocromo C nel citoplasma e conseguente attivazione della via intrinseca e morte cellulare per apoptosi [38]. Abbiamo allora dimostrato che, dopo due settimane di assenza del recettore, si perde l'integrità mitocondriale e le cellule mostrano i segni di un destino apoptotico. L'interazione tra il complesso vitamina D-VDR, il signaling mediato da ROS e il sistema antiossidante è piuttosto complesso; se da un lato è stato dimostrato che la vitamina D e i suoi analoghi possono aumentare la citotossicità mediata da ROS [39], dall'altro lato alcuni studi hanno dimostrato che il complesso vitamina D-VDR è in grado di inibire l'apoptosi innescata da stress ossidativo [40,41]. In tutti i lavori precedenti, l'effetto della vitamina D è stato valutato in un modello cellulare sottoposto a stimolo tossico che scatena una via di segnalazione nella quale il VDR si può inserire con risultati contrastanti; è da sottolineare che, invece, in questo nostro studio, per la prima volta, abbiamo dimostrato il ruolo protettivo esercitato dal VDR stesso, senza fattori di stress aggiuntivi. In aggiunta, la nostra ricerca ha studiato un nuovo meccanismo coinvolto negli effetti antiapoptotici del VDR, effetti che precedentemente erano attribuiti soltanto alla sua attività trascrizionale [42]. Infatti, la perdita del VDR non solo altera i pathways tradizionali regolati dal suo controllo trascrizionale [42], ma, come abbiamo dimostrato, il silenziamento del VDR porta ad un metabolismo deregolato responsabile della citotossicità. Anche se abbiamo mostrato un ruolo essenziale del VDR nel metabolismo, nella fisiologia e nella sopravvivenza delle cellule, i nostri dati e le nostre conclusioni non sono necessariamente in contrasto con il fatto che il fenotipo degli animali VDR knockout non è letale: sicuramente, le cellule dei tessuti privi di VDR fin dal loro sviluppo embrionale hanno trovato dei meccanismi alternativi compensatori per cercare di bilanciare gli effetti della delezione di questo recettore.Dunque, nel presente studio, abbiamo scoperto un nuovo ruolo importante per il VDR nella fisiologia delle cellule. Abbiamo dimostrato che gli effetti mitocondriali del recettore non solo regolano l'attività della catena respiratoria, ma proteggono anche dal danno ossidativo, preservando l'integrità mitocondriale e la sopravvivenza cellulare. È interessante notare che, poiché i nostri dati sono stati ottenuti in diversi tipi cellulari, sia cellule tumorali sia cellule primarie di individui sani, le nuove funzioni e caratteristiche descritte del complesso vitamina D-VDR possono essere applicate in molti tessuti del corpo umano.Un'altra interessante considerazione tratta da questo nostro studio si basa sul fatto che il fenotipo ottenuto dal silenziamento sperimentale del recettore della vitamina D potrebbe mimare le situazioni patologiche in cui l'espressione di VDR è down-regolata (ad esempio mediante meccanismi epigenetici [15,16]) o la sua attività è compromessa (ad esempio dai polimorfismi [18,19,21,22]). È importante evidenziare che molte disfunzioni della catena respiratoria e la deleteria sovrapproduzione di ROS sono temi ricorrenti in numerose patologie umane, che vanno dalle malattie neurodegenerative [43] al cancro [44], e possono essere di fondamentale importanza anche nell'invecchiamento [45]. L'importante ruolo protettivo del VDR dimostrato in questo studio fa pensare alla possibilità che in tali malattie umane la perdita di funzionalità del VDR possa essere parzialmente responsabile o almeno essere un evento avverso nel determinare il danneggiamento mitocondriale.Come possibile applicazione futura dei risultati di questa ricerca, sarebbe molto interessante andare ad analizzare il livello di espressione e lo stato di attività del VDR nelle patologie umane caratterizzate da una disfunzione della catena respiratoria; quando la ridotta produzione è dovuta ad un determinato polimorfismo, questo andrebbe innanzitutto tipizzato, in modo da identificare il tipo di alterazione del VDR connessa a tale variante. L'alterata attività del VDR rende l'individuo resistente alla somministrazione della vitamina D, e in effetti studi recenti hanno rivelato che la popolazione umana ha diversi gradi di sensibilità all'ormone [46].Mentre poco si può fare per aumentare l'attività di un recettore difettoso, in caso di ridotta produzione di VDR a causa di modificazioni epigenetiche si potrebbe pensare di utilizzare delle molecole in grado di agire sulla metilazione del DNA, in modo da ripristinare la normale espressione del VDR. A quel punto la somministrazione del ligando classico (vitamina D) o alternativo (curcumina) produrrebbe il suo effetto benefico. Non si propone quindi un trattamento alternativo a quello classico per la cura delle patologie mitocondriali, ma i dati del nostro studio suggeriscono che il ripristino dell'azione vitamina D/VDR rappresenterebbe una terapia adiuvante in grado di migliorare le condizioni metaboliche mitocondriali delle cellule malate, favorendo una più veloce ripresa del paziente o un rallentamento della progressione della malattia. Questo stesso utilizzo potrebbe essere pensato a scopo preventivo in individui predisposti su base genetica o ambientale alle malattie mitocondriali.