Nel 1557 si sposò per la seconda volta con una nobile goriziana, Girolama di Varmo, dalla quale ebbe due figli, Ferdinando nel 1562 e Massimiliano nel 1568, i cui nomi sono scelti chiaramente in onore della casa reale. Il 13 luglio 1562 Mattioli venne nominato da Ferdinando Consigliere Aulico e nobile del Sacro Romano Impero. Quando Ferdinando morì nel 1564 era da poco salito al trono Massimiliano II. Per un po' Mattioli restò al servizio del nuovo sovrano, ma nel 1571 decise di ritirarsi definitivamente a Trento. Due anni prima si era sposato per la terza volta, di nuovo con una donna trentina, una tale Susanna Caerubina.