Ogni esperimento è stato condotto in triplicato. Le linee cellulari di carcinoma mammario sono state coltivate in terreno base a ridotta concentrazione di FBS (5%) e in assenza di Fungizone, per via della sua nota interferenza con il meccanismo d"azione dell"elastasi [91] . Per ciascuna linea cellulare sono state allestite due piastre Petri da 100x200 mm con 5x10 6 cellule ciascuna (contate con camera di Burker), aggiungendo 5 ml di terreno senza elastasi nel controllo e 5 ml totali di terreno con l"aggiunta di elastasi neutrofila (Calbiochem Brand, St. Diego, CA) alla concentrazione finale di 20 μg/ml nel test. L"enzima ha un"attività specifica ≥20 unità/mg di proteina; un"unità è definita come la quantità di enzima in grado di idrolizzare 1.0 µmol di MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA al minuto, alla temperatura di 25°C e a pH 8.0.Le piastre così allestite sono state mantenute per 24 ore a 37°C in incubatore.Al termine dell"esperimento le cellule sono state utilizzate per l"allestimento di blocchetti cito-inclusi e per le analisi di gene expression profiling.La durata a lungo termine dell"effetto dell"elastasi è stata valutata ogni 24 ore circa per registrare eventuali cambiamenti di carattere morfologico e proliferativo. L"incubazione secondaria per EMA è stata effettuata al buio utilizzando un anticorpo anti-mouse Alexa-Fluor 568 (diluizione 1:700; Invitrogen, San Diego, CA) coniugato con Texas-Red, un fluorocromo con spettro di assorbimento massimo intorno a 610 nm ed emissione nello spettro della luce rossa, con un massimo intorno a 630 nm.