Il test cardine per la diagnosi biochimica è la dimostrazione dell'ipoglicemia mediante test del digiuno protratto o delle 72 ore. Il paziente viene invitato a non alimentarsi per un massimo di 3 giorni e, qualora dovesse verificarsi una ipoglicemia, vengono dosati i livelli di insulina e C-peptide presenti nel sangue. Qualora essi dovessero essere inappropriatamente elevati viene posta la diagnosi.