La listeriosi va sospettata in tutti i soggetti a rischio. Per la diagnosi si procede con un'emocoltura seguita da una rachicentesi al fine di esaminare il liquor cefalorachidiano sotto il profilo chimico-fisico, sottoponendolo a colorazione di Gram e a coltura. Per diagnosticare la patologia nel feto si può prelevare il liquido amniotico. In tutti i pazienti immunocompromessi, in caso di convulsioni o del sospetto di patologia occupante spazio, prima della rachicentesi e dopo aver impostato una terapia antibiotica empirica, va effettuata una risonanza magnetica o una TC encefalo. Alla microscopia ottica "L. monocytogenes" appare sotto forma di coccobacillo singolo, in coppia o disposto in corte catene a localizzazione intracellulare o extra-cellulare e con un caratteristico movimento "a capriola". In molti campioni di liquor, tuttavia, non si riesce ad identificare alcun microrganismo poiché la carica batterica è di norma bassa (< 104 CSF/mm3) rispetto a quella di altre meningiti batteriche. 