L'analisi immunoistochimica effettuata su di una casistica pilota di 34 casi è stata eseguita analizzando diversi marcatori di tipo diagnostico (TTF1, CK7, CK20, CDX2), prognostico (Ki67 e p53) e predittivo (HER2, ALK, MET e TS) .Marcatori diagnostici. I marcatori diagnostici utilizzati sono stati quelli che convenzionalmente sono utilizzati nella pratica routinaria per la diagnosi dell'istotipo ADC. Infatti i marcatori di sede e istotipo utilizzati sono stati CK7 e TTF1 che più comunemente sono espressi nell'ADC polmonare; invece tra quelli che sono descritti essere espressi in maniera aberrante nella variante mucinosa, sono stati utilizzati CK20 e CDX2 che sono più comunemente espressi in ADC di derivazione intestinale. I risultati dell'espressione di tali marcatori è rappresentata nel Grafico 5.Nello specifico, CK7 è risultato sempre positivo in tutti i 34 casi analizzati, ma con una diversa intensità di reazione: 26/34 casi (76,5%) mostravano una intensità più elevata, pari a quella rilevabile a livello delle cellule normali dei bronchi (score 3), mentre 8/34 casi (23,5%) mostravano una più bassa intensità (score 2). La distribuzione di tale marcatore però era sempre omogenea in tutte le componenti del tumore, sia quelle invasive che quelle in situ, ove presenti.Il marcatore TTF1, valutato secondo lo score istologico (HS, vedi materiali e metodi) è risultato positivo intenso (HS>10) in 16/34 casi (47,1%), ha ottenuto una positività tra 1-10 HS in 7/34 casi (20,6%) con valori di HS medio di 53, mediano di 10 e con un range tra 1 e 235; mentre 11/34 casi (32,3%) sono risultati completamente negativi. La positività era distribuita significativamente a livello della componente non mucinosa associata (Test χ 2 p=0,005), infatti solamente 4/16 casi di ADC mucinoso puro sono risultati positivi soprattutto nella componente invasiva.Il marcatore CK20 invece è stato valutato come positivo in soli 13 casi (13/34 38,2%) mentre è risultato negativo in 21 casi (21/34 61,8%). Tra i campioni positivi si sono notati differenti pattern di espressione della citocheratina nella compagine delle cellule tumorali, infatti solo 2 campioni (2/13 15,4%) mostravano una positività omogenea e diffusa in tutte le cellule tumorali, mentre la maggior parte dei casi positivi mostrava o una marcatura in focolai multipli con distribuzione "clonale" in ampi gruppi di cellule (3/13, 23% monofocale clonale, 4/13, 30,8% multifocale clonale) oppure una marcatura a singole cellule sparse (4/13, 30,8% multifocale a singole cellule). La CK20 non è espressa nelle cellule normali dei bronchi, perciò tale positività è da ritenersi una espressione aberrante in cellule tumorali. Tra i casi positivi, solo uno aveva la componente di cellule ad anello con castone.Il marcatore nucleare CDX2 è risultato positivo nel 20,6% dei casi (7/34), di cui 2 erano ADC di tipo colloide e negativo nel restante 79,4% (27/34 casi) (Figura 3A-B-C-D).Dall'analisi della distribuzione dell'espressione dei vari marcatori si è registrata una elevata eterogeneità dei vari marcatori con deboli correlazioni tra di loro. (Grafico 5)Per quanto riguarda la correlazione dell'espressione immunoistochimica dei vari marcatori con le caratteristiche cliniche di età, sesso, abitudine tabagica, caratteristiche istologiche di coinvolgimento della pleura e stadio della malattia, nessuno ha mostrato una significativa correlazione statistica tranne una correlazione statisticamente significativa tra la negatività di CK20 e la negatività dell'interessamento pleurico (Test χ 2 , p=0,001).Invece, per quanto riguarda la correlazione con la sopravvivenza, si è registrata una interessante correlazione prognostica dell'espressione di TTF1: i pazienti con una elevata espressione di TTF1 (Cut-off = valore mediano di HS=10) presentavano una peggiore sopravvivenza rispetto a quelli con TTF1 basso o negativo, anche se la correlazione non raggiunge la significatività statistica probabilmente a causa di un basso numero di eventi nel gruppo dei lungo sopravviventi (Grafico 6).Marcatori prognostici. L'indice di proliferazione Ki67 è risultato basso con media di espressione dell'11% e una mediana del 5% (range da <1% a 40%). In generale la positività si è registrata nelle componenti di ADC invasivo, mentre le cellule con crescita di tipo lepidico mostravano una bassa attività proliferativa.(Figura 3M-N) Parimenti, anche l'espressione della proteina p53 presentava una media di espressione del 10% e una mediana del 5% con un range che andava da valori di 1% a valori di 40% (Figura I-L). Non si è registrata alcuna correlazione tra i due marcatori. Similmente, dalle analisi statistiche effettuate, nè Ki67 né p53 hanno mostrato un significato correlato alla prognosi. Una significativa correlazione è stata riscontrata tra l'indice di proliferazione Ki67 e la conta mitotica (Spearman r= 0,45 p=0,006); mentre l'espressione della proteina p53 ha mostrato una correlazione negativa con la conta mitotica (Spearman r= 0,34 p=0,04) (Grafico 7).Marcatori predittivi. Sono stati saggiati alcuni dei principali marcatori immunoistochimici possibilmente associati alla risposta ad una terapia specifica. Per il marcatore TS si veda paragrafo successivo (4.3).Il marcatore di membrana HER2 ha mostrato positività in un solo campione (1/34, 2,9%) con una distribuzione focale ma con pattern di membrana ben riconoscibile in un gruppo di cellule mucinose disposte lungo setti alveolari. Questo unico caso è risultato inoltre positivo per tutti i marcatori diagnostici quali TTF1, CK20, CK7 e CDX2; presentava un indice di proliferazione Ki67 pari al 20%, mentre p53 ha mostrato una positività pari all'1%; infine mostrava livelli bassi di TS sia a livello proteico (HS=2) che di mRNA (2,08).Il marcatore ALK è risultato positivo in due soli campioni (2/34, 5,9%) con una positività diffusa in tutte le cellule neoplastiche. Andando ad analizzare in questi due casi l'espressione degli altri marcatori effettuati, si è notata la contemporanea positività per TTF1 e CK7 e la negatività per CK20 e CDX2; Ki67 risultava <1% mentre p53 era iperespressa (25% e 40%). Dal punto di vista morfologico, come già detto, questi casi mostravano cellule ad anello con castone e scarsa crescita lepidica: avevano infatti una estesa quota di componente invasiva sia mucinosa che non mucinosa (acinare e micropapillare) . (Figura 3F-G)La proteina MET ha mostrato la tipica positività di membrana in 30 casi (30/34, 88,3%) di cui 11/30 (36,7%) a bassa intensità (score 1), 10/30 (33,3%) ad intensità intermedia (score 2) e 9/30 (30%) ad intensità elevata (score 3); 4 casi non hanno mostrato alcuna positività o una debole positività citoplasmatica e sono stati considerati negativi. (Figura 3E) Il marcatore risultava positivo anche in alcune cellule bronchiali non neoplastiche. Nessuna correlazione è stata riscontrata tra l'espressione di MET e i dati clinico-patologici raccolti (età, sesso, abitudine tabagica, caratteristiche istologiche di coinvolgimento della pleura e stadio della malattia). Al contrario, dividendo i casi di cui si disponeva di follow-up in base a MET con score 0 e 1 (14/34, 41%) contro quelli con score 2 o 3 (15/34, 44%), si è registrato un significato prognostico negativo per i casi con maggior espressione di MET (Log-rank test, p=0,03) (Grafico 8).