L'analisi quantitativa del cDNA, effettuata per valutare l'espressione del gene EphA3, è stata eseguita mediante l'utilizzo dello strumento iCycler (Bio-Rad Life Science, Hercules, CA, USA) utilizzando primers e sonda specifici (Assay on demand Applied Byosystems).Inoltre è stata utilizzata la TaqMan Universal PCR Master Mix (premiscela di tutti i componenti eccetto i primers, la sonda e la sequenza bersaglio), (Applera, Milano). Ogni campione è stato valutato in triplicato.La reazione di PCR sfrutta l'attività 5'-3' nucleasica dell'enzima termicamente stabile AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Applera, Milano), contenuto nella Master Mix, che degrada la sonda TaqMan durante la reazione. La sonda TaqMan è un oligonucleotide alle cui estremità sono legati covalentemente due differenti fluorocromi: un reporter al 5' ed un quencher all'estremità 3'; la sonda risulta complementare ad una sequenza specifica sul cDNA (sequenza bersaglio), di cui si vuole determinare la presenza o l'assenza, e la sua quantità.Quando la sonda è intatta, il reporter ed il quencher sono posizionati ad una distanza tale da permettere al quencher di assorbire la fluorescenza del reporter, schermandola; in queste condizioni lo strumento capta solo una fluorescenza (o rumore) di fondo, che viene rilevata a livelli non significativi. Durante la reazione di PCR, se la sequenza bersaglio è presente, la sonda specifica si va a posizionare sulla regione complementare, compresa fra il primer senso e quello antisenso. Nel corso della fase di allungamento della PCR, quando la Taq incontra la sonda, grazie alla sua attività 5'-3' nucleasica, la scalza frammentandola, liberando il reporter che, allontanandosi dal quencher, emette una fluorescenza rivelabile dallo strumento, che viene analizzata mediante algoritmi.Il punto in cui si ha l'inizio dell'incremento esponenziale, ovvero il primo ciclo in cui si sviluppa una fluorescenza significativa in grado di essere captata dallo strumento, viene definito come ciclo soglia (Ct).I livelli di espressione di EphA3 sono stati determinati mediante un'analisi quantitativa relativa, utilizzando il metodo del 2 ^-∆∆Ct .In breve, l'espressione del gene bersaglio (EphA3) è stata normalizzata in base ad un gene di riferimento (housekeeping) GUS: al valore di Ct del gene bersaglio dei campioni testati, è stato quindi sottratto il corrispondente Ct del gene di riferimento, ottenendo così il ∆Ct.Successivamente, al ∆Ct di ciascun campione è stato sottratto il valore del ∆Ct di un campione scelto come calibratore: in questo modo è stato possibile calcolare il ∆∆Ct. Tale operazione è stata eseguita anche per il calibratore, per il quale si è ottenuto un ∆∆Ct pari a zero. Infine per ciascun campione, compreso il calibratore, si è applicata la formula 2 ^-∆∆Ct , che costituisce il valore numerico finale di espressione. Il campione calibratore alla fine avrà un valore pari a 1, mentre i campioni testati avranno dei valori che riflettono il numero di volte di espressione del bersaglio in più o in meno rispetto a quello del calibratore.