Il rilascio di INF-γ da parte dei CTL è stato valutato mediante l'ELISpot che consente di rilevare la secrezione di citochine da parte di cellule attivate in presenza di stimoli specifici (bersagli cellulari oppure citochine) e di correlarla al numero di cellule effettrici seminate in opportune piastre da 96 pozzetti con fondo di nitrocellulosa.Per effettuare l'ELIspot abbiamo utilizzato il kit EliSpot Interferon-γ Basis Kit (AID, Nanogen, Torino, Italy) ed abbiamo proceduto come segue.Le cellule effettrici, i CTL, sono state seminate in doppio (5x10 4 /pozzetto) in presenza o meno dei bersagli specifici (rapporto 1:2) oppure stimolate o meno con Phorbol Myristate Acetate (PMA) (50 ng/ml) (Sigma Aldrich) e Ionomicina (1 mg/ml) (Sigma Aldrich).La piastra è stata incubata 12-16 h a 37° C in presenza del 5% di CO 2 , lavata estensivamente e gli spots sono stati sviluppati come da istruzioni fornite dal produttore, quindi fatta asciugare. Gli spots (indicativi della reazione di secrezione da parte di una singola cellula effettrice) sono stati contati mediante sistema computerizzato di video imaging (CVIA) con AID ELISpot-Reader (Bioline Amplimedical, Milano, Italia). 