Figura 5. Processo di sequenziamento.Nel dettaglio 500 ng in 20 µl (25 ng/µl) di DNA per ogni campione è stato diluito con acqua e buffer di diluizione per aggiustare il pH della soluzione. Previa incubazione a 37°C per 15 minuti, è stato aggiunto il bisolfito di sodio ad ogni campione con successiva incubazione a 50°C per 16 ore al buio.Il DNA modificato così modificato è stato caricato su colonnine di silice dedicate, a cui è seguita una centrifugata a 13000 rpm per 30 secondi, per rimuovere la componente inorganica della soluzione mentre il DNA rimane adeso alla membrana per interazione ionica con la silice. Mediante soluzioni di etanolo a scalare (99%-65%) sono stati poi effettuati lavaggi per rimuovere sali e contaminanti organici, mediante centrifugate di 13000 rpm per 30 secondi. Infine il DNA è stato recuperato utilizzando un buffer di eluizione, che compete con l'interazione DNA-silice in seguito a centrifugazione a 13000 rpm per 30 secondi.Per valutare l'intero processo di conversione, amplificazione della regione di interesse e del sequenziamento diretto sono stati usati i controlli commerciali MethylatedCtrl DNA e Non-MethylatedCtrl DNA, provenienti da materiale di archivio (Horizon Discovery, Waterbeach, UK).