La sua funzione fisiologica è l'immagazzinamento intra-cellulare di ossigeno in cellule specializzate (fibrocellule muscolari) che per espletare al meglio la loro funzione contrattile in condizioni aerobiche richiedono che grosse quantità di ossigeno siano convogliate verso i mitocondri per le necessità della catena respiratoria. La mioglobina, in pratica, favorisce una rapida diffusione dell'ossigeno in queste cellule ed il suo meccanismo di azione è alquanto diverso da quello della emoglobina. Pertanto, si trova in grande quantità nei muscoli a cui conferisce il caratteristico colore rosso dovuto all'eme.