Le emocolture costituiscono un passo fondamentale nella diagnosi e dovrebbero essere effettuate su tutti i pazienti con febbre e soffio cardiaco e nei pazienti a rischio con sintomi aspecifici, ma compatibili con endocardite infettiva. Vengono usualmente raccolte in occasione del rialzo termico in prossimità del picco febbrile, nonostante la batteriemia ad andamento costante tipica dell'endocardite permetta di ottenere emocolture in qualsiasi momento.Si consiglia di eseguire colture su almeno 3 prelievi ematici ottenuti ad 1 ora di distanza l'uno dall'altro e non attraverso linee di infusione continua, che possono essere contaminate e, in caso di precedente antibioticoterapia di breve o lunga durata, è possibile che la positivizzazione si manifesti a distanza di 6 -7 giorni 2 .L'emocoltura standard prevede l'utilizzo di un contenitore per i microrganismi aerobi e di uno per gli anaerobi (Figura 34), ognuno dei quali contenente circa 50 ml di medium; ad ogni contenitore deve essere aggiunto un quantitativo di sangue venoso pari a circa 10 ml 168,169 . Sono considerate -criterio maggiore‖ se contengono microrganismi tipici (altamente predittivi di endocardite infettiva) o se sono persistentemente positive. Staphylococcus aureus e gli Enterococchi (solo in assenza di un focolaio primario). La presenza di emocolture negative, tuttavia, non esclude la malattia poiché la letteratura riporta una probabilità che le emocolture siano negative compresa tra il 5% e il 10% 2 . Le reali cause di emocolture negative possono essere la recente somministrazione di antibiotici, l'infezione da parte di germi inusuali che crescono male nei terreni di coltura tradizionali o da parte di germi a lenta crescita (HACEK) 92,98,99,170 .Al fine di determinare con più esattezza la reale eziologia delle endocarditi ad emocoltura negativa, sono stati testati una serie di test sierologici per quei microrganismi intracellulari obbligati o che richiedono speciali terreni colturali come Brucella e Coxiella burnetii (la positività di una singola emocoltura o un titolo anticorpale IgG contro l'antigene di fase 1 ≥ 800 associato a un titolo anticorpale IgA ≥ 100 è altamente predittivo di malattia e per questo sono stati inclusi fra i criteri maggiori 171,172,173 ).Reazioni polimerasiche a catena (PCR) 174,175 e test sierologici sono stati anche utilizzati per individuare altri microrganismi a difficile coltura, come Bartonella quintana 176,177 e Tropheryma whippelii 178,179 , ma la loro inclusione come criteri maggiori necessita di una maggior standardizzazione e di essere testata su un numero sufficiente di casi 92,180,181, .Nel caso in cui le emocolture siano positive ma senza soddisfare le due condizioni presentate nei criteri maggiori (agenti tipici o emocolture persistentemente positive), vengono considerate come criterio minore.L'ecocardiografia è una tecnica non invasiva che utilizza gli ultrasuoni emessi da una sonda per valutare gli aspetti morfologici, funzionali ed emodinamici del sistema cardiovascolare. Le metodiche usate per la diagnosi dell'endocardite infettiva sono sia quella trans-toracica (TTE), in cui la sonda è posta a diretto contatto con la parete toracica, sia quella trans-esofagea (TEE), in cui la sonda è introdotta all'interno dell'esofago, con una maggiore sensibilità e specificità poiché vi è una maggior vicinanza del trasduttore alle strutture cardiache, minori ostacoli anatomici tra trasduttore e strutture e possibilità di utilizzare frequenze di ultrasuoni e frame rates più alti.I tre segni fondamentali che permettono all'ecocardiogramma di essere considerato come criterio maggiore sono: la presenza della vegetazione (cioè di una massa mobile ecodensa impiantata su una valvola, sull'endocardio murale, o su materiale protesico), la presenza di ascessi e la presenza di un nuovo distacco protesico (Figura 35).La sensibilità per le vegetazioni su valvole native è < 65% con ecocardiografia trans toracica (TTE) e 82-100 % con ecocardiografia transesofagea (TEE), mentre la specificità raggiunge il 98-100% con TEE 182,183,184,185,186 . Anche per quanto riguarda il valore predittivo negativo, la TEE assicura valori molto alti (nell'ordine del 95-98%) 187 , tuttavia un risultato negativo non elimina del tutto la possibilità che vi sia una endocardite in corso.  Adattata da [39, pag 944].La sensibilità per PVE è di 16-36% con TTE e 82-96% con TEE, con lievi variazioni a seconda della localizzazione protesica; la superiorità della TEE si rende ancora più evidente nell'analisi delle complicanze (deiscenza protesica, rocking protesico, ascesso dell'anulus, ascesso settale con interessamento del sistema di conduzione, tragitti fistolosi, pericardite) 188,189,190,191 .Figura 37: Endocardite su protesi tubulare aortica (Prosth), ascesso periprotesico (Absc): sezione transesofagea 132° A) diastole: presenza di voluminoso ascesso posteriore alla protesi. All'ingresso della cavità ascessuale (testa di freccia) si evidenzia una vegetazione endocarditica (VE) fissa. B) sistole: si evidenzia come l'afflusso di sangue nella cavità ascessuale comporti dilatazione della stessa, con schiacciamento (in direzione anteriore) della parete posteriore della protesi tubulare e deformazione (in direzione posteriore) della parete anteriore della cavità ascessuale. Adattata da [39, pag 945].Figura 38: Severa endocardite protesica con grossa cavità ascessuale attorno all'anello di sutura della protesi mitralica. Adattata da [40, pag 337].Oltre al notevole contributo offerto nella diagnosi, la ripetizione dell'ecocardiografia risulta molto utile nella gestione di malattia e nella valutazione dell'evolversi delle vegetazioni 192 (specie nelle forme di EI da St.aureus, con compromissione emodinamica, coinvolgimento aortico, febbre o batteriemia persistente, deterioramento clinico 193 ): dopo terapia antibiotica efficace, circa un terzo delle vegetazioni non sono più identificabili, dei restanti due terzi la metà presenta dimensioni invariate, un quarto dimensioni ridotte e un quarto aumentate 138 . Diverso è il discorso quando la terapia medica non risulta completamente efficace, poiché in questo caso si è evidenziato a distanza di 4-6 settimane l'aumento o la mancata riduzione di diametro e/o l'estensione ad altre valvole o strutture cardiache, che peraltro risulta essere associato a maggior incidenza di complicanze 194 .L'uso appropriato delle due metodiche, TEE e TTE, andrebbe valutato basandosi sulla probabilità clinica pretest di malattia (Figura 39):un'ecocardiografia andrebbe sempre eseguita in un sospetto di endocardite, ma quando il sospetto clinico è relativamente basso e c'è la possibilità di ottenere immagini a buona risoluzione, è ragionevole eseguire un TTE, mentre invece quando il sospetto clinico è molto elevato -pazienti con valvole protesiche, batteriemia stafilococcica, anziani con degenerazioni valvolari che possono mascherare vegetazioni con TTE -o c'è il rischio che la metodica transtoracica non fornisca immagini a buona risoluzione, è bene eseguire un TEE 193,148 ,195 .Anche nel caso in cui l'iniziale TTE sia negativa, ma la diagnosi di endocardite rimane l'ipotesi più plausibile, è opportuno eseguire una TEE il prima possibile 193 .In un recente studio è stato calcolato che l'assenza di cinque condizioni, quali la presenza di protesi valvolare, l'uso di droghe per via endovenosa, il riscontro di emocolture positive, la presenza di cateteri venosi centrali e segni/sintomi di embolizzazioni sistemiche riduce quasi a zero la probabilità pretest di avere endocardite 196 .Tuttavia, nonostante alcuni studi di cost/effectivness abbiano suggerito che la TEE andrebbe eseguita in prima battuta in un sospetto clinico di endocardite -soprattutto in caso di possibile eziologia stafilococcica 197,198 non tutti i pazienti sono candidati a ricevere una TEE immediatamente. L'ecocardiografia è senza dubbio una metodica di grande potenza, ma presenta alcuni limiti: per prima cosa bisogna tener conto della variabilità interosservatore (in quanto esame operatore-dipendente); inoltre la semplice identificazione di vegetazioni non può da sola condurre a diagnosi di endocardite perché necessita sempre di conferma clinica o anatomopatologica (l'ecocardiografia non è, infatti, in grado di distinguere le vegetazioni infette dalle vegetazioni endocarditiche trombotiche non batteriche o da altre strutture che possono rappresentare falsi positivi 199,200 ); con le attuali apparecchiature le vegetazioni con diametro < 2 mm sono difficilmente identificabili 201 ; infine, un aspetto generalmente poco discusso e considerato in letteratura, è rappresentato dall'aspettativa pre-test dell'esaminatore (un'accentuata aspettativa può aumentare la sensibilità dell'esame, ma può indurre in falsi positivi, con perdita di specificità) 39 .