Il frazionamento subcellulare e l'analisi in Western Blot sono stati condotti come segue: le cellule sono state staccate dalle piastre di coltura utilizzando uno scraper poi omogeneizzate in un omogeneizzatore di vetro a mano con una soluzione contenente 10 nM di Tris-HCl a pH 7.4, 0.33 M di saccarosio, 1 mM di EDTA, 1 mM di ditiotreitolo, 1 mM di fenilmetilsolfonil fluoruro (PMSF), 1 mM di inibitori delle proteasi Cocktail set III (Calbiochem), 1 nM di Na3VO3 e 1 mM di NaF. Un'aliquota è stata prelevata per le analisi proteiche (estratto totale) prima che i lisati venissero sottoposti a centrifugazioni differenziali, la prima a 200 g per 10 minuti a 4°C per eliminare i detriti cellulari, la seconda a 1,000 g per 10 minuti per isolare la frazione nucleare e la terza a 14,300 g per 20 minuti a 4°C per ottenere la frazione solubile come surnatante e la frazione mitocondriale come pellet. Quest'ultimo e le proteine della frazione nucleare sono state risospese in un tampone denaturante portato ad alta temperatura (Sample Buffer 1X: 100 mM Tris-HCl a pH 6.8, 2% di SDS, 15% di glicerolo e 1 mM di DTT). Inoltre, la frazione nucleare e la frazione totale sono state sonicate.Il contenuto proteico degli estratti totali e delle frazioni subcellulari è stato quantificato usando il protocollo proteico DC (Bio-Rad, Hercules, CA, USA); 50µg di lisati totali e 30µg della frazione mitocondriale e di quella nucleare sono stati separati mediante SDS-PAGE al 10% e analizzati con il Western Blot. Le analisi del citocromo C sono state ottenute dopo SDS-PAGE al 12%. Le proteine sono state marcate con un anticorpo primario, posto in incubazione con il filtro per un'ora a temperatura ambiente, e la rilevazione delle proteine di interesse è stata eseguita usando un anticorpo secondario coniugato alla perossidasi (Pierce, Rockford, IL, USA), seguito dalla rilevazione ECL (ECL detection kit, Perkin Elmer Life Science, Foster City, CA USA). Gli anticorpi murini anti-VDR (sc-13133), anti-actina (sc-8432), anti-PCNA (sc-56), e l'anticorpo di coniglio anti-PARP (sc-7150) sono stati comprati dalla Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). L'anticorpo monoclonale anti-VDAC (anti-porin 31HL) è stato comprato dalla Calbiochem (La Jolla, CA, USA). L'anticorpo murino anticitocromo C (65981A) è stato comprato dalla BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA, USA). Per analizzare i dati è stato usato il metodo 2 -ΔΔCt .