In letteratura vengono riportate alcune metodiche che trovano tuttavia un impiego limitato e non convalidato in ampie casistiche:• Acridine orange leucocyte cytospin (AOLC) (99 e 100): si tratta di un rapido ed economico test microscopico che richiede solo 30 minuti per la sua esecuzione. Si preleva 1 ml di sangue attraverso il CVC (per l'indagine sono in realtà necessari due campioni di soli 50 µl di sangue, motivo per cui il test potrebbe essere ideale per i bambini più piccoli) che viene successivamente centrifugato, strisciato su vetrini, colorato con arancio di acridina e quindi osservato al microscopio ultravioletto.Per tale tecnica sono state riportate una sensibilità dell' 87% ed una specificità del 94%, valori che possono essere aumentati se a questa prima colorazione viene fatta seguire quella di Gram; all'elevata accuratezza si aggiunge anche un importante guadagno di tempo e di costi, che lo renderebbe un esame molto utile. Tuttavia, prima di essere proposto come esame di routine, necessita di essere valutato in modo più approfondito.• Brush endoluminale (100 e 101): una piccola spazzola di nylon viene fatta passare su una guida metallica all'interno del lume del catetere, quindi viene ritirata ed immediatamente posizionata in un contenitore che viene sottoposto ad un processo di agitazione con vortex e sonicazione; al termine del processo la soluzione ottenuta viene seminata su una superficie di Agar Sangue.Viene considerata diagnostica una conta superiore alle 100 CFU/ml. Il razionale di tale tecnica è basato sul fatto che la fibrina presente sulla superficie interna del catetere, alla quale aderiscono i microorganismi, rimane inviluppata nelle setole della spazzola.Viene riportata una sensibilità del 95% ed una specificità dell'84%.La procedura è stata tuttavia criticata in quanto spesso impraticabile e rischiosa: sono infatti possibili rari, ma severi effetti collaterali, tra cui il rischio di aritmie, di embolizzazione e di provocare una batteriemia secondaria alla distruzione del biofilm e alla conseguente dismissione in circolo dei microorganismi; per tali motivi non è ancora stata ampiamente utilizzata e richiede ulteriori studi. Nello specifico è stato testato un test ELISA per evidenziare la presenza di anticorpi diretti contro dei nuovi antigeni (una nuova catena di acido lipoteicoico) identificati sulla membrana di tali microorganismi.Il test è stato eseguito in due gruppi di pazienti, uno con e l'altro senza evidenza (clinica e microbiologica) di sepsi CVC correlata, ed è stato considerato positivo quando mostrava una conta di IgG sieriche > 20.000/µl (con una sensibilità del 75% ed una specificità del 90%) e di IgM sieriche maggiori di 5.000/µl (con una sensibilità del 52% ed una specificità dell'85%); il risultato meno positivo per le IgM testimonia la difficoltà nello stabilire l'esatto esordio dell'evento infettivo, del quale l'aumento delle IgM è prova.Oltre i vantaggi rappresentati dalla rapidità e dal basso costo (comuni anche alle due tecniche appena descritte), con tale metodica si elimina anche il problema della contaminazione del sangue utilizzato per la coltura o per le colorazioni. Gli svantaggi consistono invece nei problemi di interpretazione che possono insorgere nei pazienti in terapia immunosoppressiva, i quali presentano una risposta anticorpale limitata in caso di infezione.Anche questa tecnica deve essere tuttavia ulteriormente studiata ed approfondita per poter diventare un esame di routine nel sospetto di infezione CVC correlata. Nella seguente tabella sono riassunti i valori di sensibilità e specificità delle procedure illustrate finora. In definitiva è importante sottolineare come la diagnosi di un'infezione CVC correlata (in particolare delle sepsi) non sia un processo semplice soprattutto nel bambino; la difficoltà è legata a diversi elementi, tra i quali:-la frequente necessità di dover mantenere il CVC in situ per poter continuare la terapia (sono quindi raramente disponibili le colture della punta del CVC se non quando sussistono le indicazioni alla rimozione del catetere).-l'impossibilità di eseguire tutte le tecniche prima descritte sia perché spesso non praticabili in tutti gli ospedali per ragioni economiche e/o di complessità (in particolare le colture effettuate con tecnica quantitativa) o perché non diffuse su larga scala in quanto non ancora ben approfondite, sia perché nel bambino è spesso problematico ottenere una coltura da sangue periferico che serva da mezzo di confronto.Per tali motivi spesso si dispone solo di un'emocoltura qualitativa da CVC, che permette di fare diagnosi di sepsi, ma non di attribuirne l'eziologia al CVC, ragione per cui spesso ci si trova nella condizione di dover effettuare una diagnosi -Simultanee emocolture quantitative da accesso centrale e periferico con rapporto di CFU ≥ 5.-Conta di CFU ≥ 100 CFU nell'emocoltura quantitativa da CVC.-Positivizzazione di una emocoltura da CVC almeno 2 ore prima rispetto all'emocoltura da sangue periferico.-Emocoltura qualitativa da CVC positiva con emocoltura contemporanea da sangue periferico negativa.-Crescita dello stesso microorganismo dall'emocoltura periferica e dalla coltura della punta del CVC rimosso, del tampone del foro d'uscita, del materiale purulento o della tasca del Port.-Febbre con brivido e tremori entro 30-120 minuti dalla manipolazione del CVC associata ad un'emocoltura positiva (meglio se effettuata durante l'accesso febbrile).