La preparazione dei campioni da analizzare con la tecnica QT-PCR Real-Time TaqMan (ABI PRISM 7500) prevede le seguenti fasi:• estrazione dell'RNA totale• lettura allo spettrofotometro• retrotrascrizione (RT) dell'RNA in cDNA• amplificazione del cDNA mediante PCR Real-Time TaqMan (ABI PRISM 7500)• analisi dei dati.Un'aliquota di cellule CD4 + , ottenuta con la separazione tramite biglie magnetiche, viene pellettata in provette RNAsi-free (centrifugazione a 1600 rpm per 5 minuti) e lasciata a secco (tramite l'eliminazione di tutto il surnatante). Il pellet viene sottoposto all'azione di una miscela di fenolo e guanidina isotiocianato (TRIPURE, Sigma), entrambi potenti denaturanti, secondo il metodo modificato di Chomczynski-Sacchi (119). Tale passaggio viene effettuato in ghiaccio affinchè le ribonucleasi non si possano attivare, evitando così la degradazione del campione.La lisi cellulare e la frammentazione del DNA sono conseguite mediante passaggi ripetuti in una siringa da insulina (ago molto sottile). Tale miscela può essere conservata a -80ºC per circa un mese, oppure viene direttamente sottoposta alla metodica di estrazione dell'acido ribonucleico. La miscela viene quindi sottoposta al seguente profilo termico:• 10 minuti a 25°C (annealing)• 1 ora a 48°C (retrotrascrizione ad opera della MuLV) all'inizio del processo di amplificazione, con conseguente degradazione della sonda e sua liberazione nel mezzo di reazione.•Esistono numerose tipologie di reporter, con differenti lunghezze d'onda (λ) di assorbimento e di emissione.Per un corretto funzionamento della PCR Real-Time devono essere soddisfatti tre requisiti fondamentali:• integrità della sonda• efficienza di ibridizzazione• efficienza di taglio da parte della Taq Polimerasi.La sonda utilizzata nella PCR Real-Time TaqMan possiede caratteristiche particolari. La sua lunghezza varia, in genere, da 20 a 30 nucleotidi con una composizione di basi in CG pari al 50% e la sua temperatura di ibridizzazione è più alta di quella dei primers (per aumentare la sua stabilità nella fase di annealing).  Trascorse 18 ore sono stati effettuati i 3 test di valutazione funzionale dell'apoptosi FAS-mediata: Sono state analizzate le patologie che questi soggetti hanno manifestato nel corso del follow-up e che dalla letteratura sono state descritte come correlabili all'immunodeficienza di base. In particolare è stata rilevata la presenza di linfoadenopatia, splenomegalia, malattia granulomatosa, citopenia epatopatia e patologie gastrointestinali. Particolare interesse è stato rivolto verso le principali manifestazioni su base autoimmune: la citopenia e la splenomegalia.Undici pazienti (41%) hanno sviluppato una splenomegalia, otto (30%) una linfoadenopatia, due (7%) una malattia granulomatosa, nove (33%) una citopenia (comprendente l'anemia emolitica autoimmune, la piastrinopenia autoimmune e la neutropenia di probabile origine autoimmune), sei (22%) un'epatopatia, otto (30%) una pneumopatia, quattro hanno manifestato patologie gastrointestinali (15%) e diciannove sono stati interessati da patologie di minore rilievo. Fanno parte di queste ultime la ittiosi, le miocardiopatie, le tiroiditi autoimmuni, i neurinomi, le vasculiti, i carcinomi, il deficit di ACTH, gli ascessi, gli aborti spontanei, le artriti e la psoriasi. Prima di procedere all'analisi statistica, la prevalenza delle singole manifestazioni cliniche è stata stratificata secondo il sesso per poter così valutare, tramite il test esatto di Fisher, la presenza di eventuali differenze dovute a questo fattore di confondimento. Come si può anche notare dal grafico 2, non si sono trovate differenze statisticamente significative tra i sessi .Dopo aver escluso la presenza di fattori di confondimento legati al sesso si è intrapresa l'analisi statistica.