La Riforma protestante, che spaccò l'occidente europeo tra protestanti e cattolici romani interessò anche i cavalieri di Malta. In diversi paesi, tra cui Inghilterra, Scozia e Svezia, l'ordine venne ufficialmente sciolto. In altri, tra cui i Paesi Bassi e la Germania, interi baliaggi o commende (divisioni amministrative dell'ordine) si convertirono al protestantesimo; questi andarono a costituire i cosiddetti "ordini giovanniti" che ancora oggi sopravvivono in Germania, Paesi Bassi, Svezia e altri paesi come gli Stati Uniti o il Sud Africa. Venne comunque stabilito dal gran maestro che l'ordine dovesse mantenersi neutrale nella guerra tra nazioni fondamentalmente cristiane.