È un farmaco che agisce in vivo. l 5-FU agisce in diversi modi, dopo essere stato ribosilato e fosforilato può essere integrato nell'RNA, alterandolo. Inoltre inibisce la timidilato sintetasi. L'interruzione dell'azione di questo enzima blocca la sintesi della timidina, che è un nucleoside necessario per la replicazione del DNA. La timidilato sintasi trasferisce un metile da un donatore a un accettore, cioè dal N5-N10 metilentetraidrofolico al 5-fluorouracile. L'enzima tende a strappare il fluoro, che essendo un cattivo gruppo uscente, ma rimane nel complesso ternario i cui componenti sono: 5-fluorouracile, timidilato sintetasi e 5-10 metilentetraidrofolico. Il complesso è più stabile quando si associa l'acido folinico, precursore del 5-10 metilentetraidrofolico. .