Incubazione per 15' con l'anticorpo primario opportunamente diluito con il prodotto DAKO Antibody Diluent (DAKO Corporation, CA).Step Lavaggio per 1-2' in PBS (tampone Na-fosfato 100 mM pH 7.2 contenenteNaCl 8% e KCl 0.2%)Step Incubazione per 15' con l'anticorpo secondario anti-topo, anti-coniglio, anticapra biotinilato diluito in PBS.Step Lavaggio in PBS per 1-2'.Step Incubazione per 15' con streptavidina coniugata con perossidasi di rafano in PBS.Step Lavaggio in PBS.Step Evidenziazione della perossidasi: 5 mg di 3-amino-9-etil-carbazolo sciolti in 1 ml di N-N dimetilformammide (BDH Chemicals Ltd, Poole, England) + 9 ml di tampone acetato pH 5,2 0,1 M e 100 microlitri di H2O2 al 10%.Incubazione delle sezioni per circa 6' con la soluzione precedente, opportunamente filtrata.Step Lavaggio in PBSStep Contrasto per 10-12'' i nuclei con emallume acido di Mayers (alluminio potassio solfato, iodato di potassio, ematossilina, acido acetico glaciale) e virare in acqua corrente per 2-3'Step10 Montaggio in glicerina gelatinata del Kaiser (Merck kGaA, 64271 Darmstadt, Germany).Per quanto riguarda il sistema di riarrangiamento delle immunoglobuline, il protocollo standard utilizzato presso la Clinica prevede:- -Determinazione della clonalità: ogni campione è stato analizzato utilizzando, prima una reazione di amplificazione diretta con le coppie di primers degenerati Fr2-LJH ed FR3A-LJH , seguita nel caso del Framework Fr2 da una seconda reazione seminested 5'Fr2-VLJH3'. In ciascuna tornata di PCR sono stati inclusi un controllo positivo, un controllo policlonale e acqua distillata come "bianco". L'amplificazione è stata effettuata con termociclatore MyniCycler (MJ Researce). I prodotti di amplificazione sono stati esaminati per mezzo di analisi dei frammenti in gel di acrylamide 8%(Cri teri on Gel , Bi oRAD) dopo denaturazi one a 95°C per 5' e 1 ora a 4°c per consentire il corretto appaiamento degli eteroduplex.