Nel 1890, all'età di diciassette anni, si trasferì a Vienna per iscriversi alla Facoltà di Medicina. Svolse gli studi universitari sotto la guida di insegnanti come l'anatomico Emil Zuckerkandl, il fisiologo Ernst Wilhelm von Brücke e l'oftmalmologo Ernst Fuchs. La Scuola viennese fu elemento di influenza nella formazione di Castiglioni, il quale intuì che nell'evoluzione intellettuale di molti dei maestri di Vienna un ruolo fondamentale era ricoperto dall' arte e da tutti i tipi di manifestazione artistica. Dopo essersi laureato, nel 1897, ottenne il dottorato e frequentò la clinica del Professor "Schrötter".