Quantificare le bande di DNA dell'inserto e del vettore precedentemente digeriti e fatti correre sul gel di agaroso e calcolare l'opportuna concentrazione dei due elementi in modo tale che il loro rapporto molare sia di 1:3.In un volume finale di 20 µl la miscela di reazione, assemblata in ghiaccio, sarà composta da: Il procedimento seguito prevede l'utilizzo di un buffer di reazione e di ATP per fornire energia alla ligasi; la reazione di norma avviene a basse temperature, intorno ai 16°C, poiché in queste condizioni le esonucleasi sono inibite. In alcuni casi, come nel nostro studio, la reazione può essere anche effettuata a temperatura ambiente per un tempo limitato.