Il test è basato sul fatto che, se l’enzima lattasi funziona normalmente, il lattosio è scisso in glucosio e galattosio ed è assorbito rapidamente a livello gastrointestinale senza che vi sia una significativa produzione di gas, in particolare idrogeno; al contrario, se il lattosio non viene metabolizzato perché la lattasi è assente, o non funzionante, la produzione di idrogeno risulterà elevata perché i batteri presenti nel colon (intestino crasso) ne produrranno più del normale avendo a disposizione più lattosio (reazione di fermentazione). L’idrogeno prodotto sarà successivamente assorbito nel sangue e una parte di esso sarà eliminata dai polmoni attraverso la respirazione.