Per ogni ml di TRIzol si aggiungono 0.2 ml di cloroformio (in questo caso 0.1 ml). Si agita vigorosamente la miscela, quindi si procede con un'incubazione a temperatura ambiente per 2-3 minuti. Si centrifuga il campione a 12000 g per 15 minuti a 4ºC. A questo punto la miscela risulta separata in tre fasi: una fase superiore acquosa contenente lo RNA, un'interfase contenente DNA e una fase inferiore organica contenente le proteine.