Il fregio venne realizzato da Santi Buglioni suddiviso in pannelli ed illustra le sette opere di misericordia ("Vestire gli ignudi", "Alloggiare i pellegrini", "Visitare gli infermi", "Visitare i carcerati", "Seppellire i morti", "Dar da mangiare agli affamati", "Dar da bere agli assetati"). Le scene raffiguranti le opere sono intervallate dalle figure di Virtù ("Prudenza", "Fede", "Carità", "Speranza" e "Giustizia"), inquadrate da lesene decorate. Completano l'opera due arpie sugli angoli. Il fregio venne eseguito a partire dal 1525, su commissione dello spedalingo fiorentino Leonardo Buonafede, che compare nelle scene in abito bianco con mantella nera, a presiedere le quotidiane attività dell'ospedale. L'ultimo pannello a destra venne sostituito nel 1586 con uno nuovo, eseguito da Filippo di Lorenzo Paladini, privo di invetriatura. Su di esso viene rappresentato al posto del Buonafede lo spedalingo dell'epoca, Bartolomeo Montichiari.