Il 9 ottobre 1406, le milizie fiorentine entrarono a Pisa e la . A questo, seguì un periodo di decadenza, che colpì anche l'ospedale. La guida dell'ente fu affidata esclusivamente ai fiorentini e il numero di frati si ridusse notevolmente. Questo costrinse papa Eugenio IV a intervenire autonominandosi rettore e incaricando tre ecclesiastici di dirigere l'ospedale.