In questo lavoro è stata raccolta un'ampia casistica di ADC a prevalente componente mucinosa di cui sono stati analizzati i più importanti caratteri morfologici, immunofenotipici e molecolari in correlazione con i dati clinico-patologici e la prognosi. L'ADC mucinoso è una variante rara la cui precisa definizione morfologica risulta controversa 2 . Inoltre, dal punto di vista prognostico, a tutt'oggi non sono ben definiti quali siano i parametri morfologici che più influenzano la prognosi e che perciò definiscano il grado di differenziazione. Infatti, nella recente proposta di sistema di grading score effettuata da Sica e collaboratori, i mucinosi sono stati esclusi 37 . Per questo si è voluto analizzare tutti i parametri morfologici (architetturali e citologici) impattanti sulla prognosi con lo scopo di trovare quelli più candidabili ad uno score morfologico. Inoltre, siccome anche dal punto di vista immunofenotipico la situazione è controversa, sono stati valutati in questa casistica alcuni dei marcatori più comunemente usati nella diagnosi o nella terapia target dell'ADC. Infine, anche dal punto di vista molecolare non è mai stata fatta un'ampia mappatura delle principali mutazioni che coinvolgono questa particolare categoria di ADC, perciò una parte dei casi raccolti è stata analizzata con tecniche di sequenziamento di nuova generazione identificando i geni più frequentemente alterati.Tra i parametri morfologici architetturali analizzati hanno mostrato un trend di significativa correlazione con la prognosi innanzitutto la quota di componente lepidica mucinosa: i casi con scarsa crescita lepidica (<50%) mostravano un trend per una prognosi peggiore (p=0,07); anche i casi con componente mucinosa invasiva associata a reazione stromale hanno mostrato un trend di andamento peggiore (p=0,08) rispetto a quelli senza reazione stromale. Né la crescita nodulare rispetto alla crescita diffusa, né la presenza di invasione ghiandolare o gli aspetti particolari associati hanno mostrato significative correlazioni con la prognosi. Ciò può essere dovuto al fatto che, queste ultime caratteristiche sono più difficilmente quantificabili nell'analisi morfologica. L'abbondante quantità di muco ha mostrato invece un forte significato prognostico positivo sia in analisi univariata che in multivariata, in linea con la miglior prognosi tipica degli ADC colloidi, per definizione costituiti interamente da muco extracellulare.Tra i caratteri citologici più significativi per gli ADC mucinosi a peggior prognosi, vi sono: la presenza di un'elevata cellularità lungo i setti, cellule disposte in monostrato e nuclei poco affastellati. Inoltre, tra i casi a componente lepidica, altra caratteristica in cui si è riscontrata una significatività prognostica è stata la presenza di una più ampia area di cellule neoplastiche a gruppi coesi, tipo "ciuffi". Per valutare la cellularità lungo i setti, è stata fatta una media ponderata di tutta la neoplasia per includere nella valutazione sia quei casi a maggior componente invasiva, sia i colloidi dove la cellularità era scarsamente rappresentata: perciò nella categoria 0-75% cadeva un ampio spettro di casi che andavano dal nodo composto da abbondanti ciuffi agli ADC colloidi, mentre nella categoria >75% rientravano sia i casi a crescita lepidica che quelli a crescita prevalentemente invasiva; questi ultimi mostravano anche una prognosi peggiore (p=0,007). Questo parametro però non ha mostrato significatività all'analisi multivariata.Un discorso a parte va fatto per la presenza di cellule ad anello con castone: i casi che le presentavano mostravano un significativo peggiore andamento (p<0,0001). Queste cellule sono caratterizzate da abbondante muco intracellulare e dotate di spiccata capacità invasiva; sono anche descritte come aspetto associato anche nelle varianti di ADC convenzionale e anche in questa categoria influiscono profondamente sulla prognosi (come del resto anche in ADC di altre sedi, ad es. lo stomaco), tant'è che la segnalazione della loro presenza è raccomandata nella nuova classificazione di Travis 2 . Perciò, nonostante queste mostrino caratteristiche mucinose, probabilmente sono da considerarsi un aspetto più convenzionale associato piuttosto che una distintiva caratteristica di ADC mucinoso invasivo. Degno di nota è che gli unici due casi ALK positivi presentavano le cellule ad anello con castone.In caso di marcate atipie nucleari, la prognosi era decisamente peggiore (p=0,02), come atteso, e anche la presenza di una forma cellulare tipo hobnail (forma cuboidale con scarso citoplasma e nucleo arrotondato) ha mostrato un trend di associazione (p=0,06) con la prognosi peggiore.Invece la presenza di una prevalenza di una componente di cellule ossifile (16/83 casi, 19%) era associata ad un significato prognostico più favorevole (anche se non statisticamente significativo), a conferma del fatto che tale tipologia di cellule caratterizza in certe neoplasie (quali gli oncocitomi) forme più indolenti.Per capire quale caratteristica distintive dell'ADC mucinoso e risultate significative alle analisi in univariata (la presenza di area estesa di ciuffi, la cellularità lungo i setti, la stratificazione cellulare, l'affastellamento nucleare e la quantità di muco) potesse avere un significato indipendente sulla prognosi è stata fatta l'analisi multivariata: la presenza di ciuffi e la quantità di muco si sono rivelati fattori prognostici indipendenti. Una sorta di validazione di tali parametri, seppur del tutto limitata e speculativa, può essere fatta analizzando i due nodi metacroni insorti in uno dei pazienti della nostra casistica (e quindi associati ad una malattia in progressione). Il primo ed il secondo nodo (insorto dopo 4 anni di sopravvivenza libera da malattia) mostravano alcuni caratteri morfologici associati alla prognosi peggiore e anche la presenza di una estesa area di ciuffi e la scarsità di quota mucoide. Tali parametri morfologici opportunamente validati, potrebbero venire applicati su materiale bioptico o utilizzati per una sorta di grading morfologico con possibile significato prognostico, come già effettuato da Sica per l'ADC convenzionale 37 .Un fattore probabilmente limitante è stata la presenza di una quota (41%) di casi misti cioè con una componente di ADC convenzionale (con diverse varianti di crescita) associata alla mucinosa, che poteva costituire dal 5% al 50% della massa neoplastica. Tale componente, pur essendo prevista nella definizione di ADC mucinoso proposta da Travis 2 non viene quantificata nella definizione: nei nostri casi costituiva sempre una componente minoritaria (<50%) ma questi casi misti avevano comunque una prognosi peggiore rispetto a quelli di ADC mucinoso puro fino ad un cut-off del 20% di componente non mucinosa associata (p=0,04). Tale caratteristica però non manteneva la significatività all'analisi multivariata.Dal punto di vista immunofenotipico la distribuzione dei principali marcatori diagnostici è risultata estremamente eterogenea. La CK7 si è rivelata il marcatore più sensibile, risultando positivo in tutti i casi, anche se nel 23,5% con una intensità più lieve. TTF1 ha mostrato diversi valori di HS con un valore mediano pari a 10, a dimostrare la generale bassa espressione di tale marcatore in questi tumori. La correlazione con la sopravvivenza, anche se non raggiungeva la significatività (probabilmente per la scarso numero di eventi nella popolazione lungo sopravvivente), mostrava un trend in cui i casi con maggiore HS erano associati ad una prognosi peggiore.I marcatori classicamente associati alla prognosi, quali Ki67 e p53, non hanno mostrato alcuna significativa correlazione con la prognosi. Questo non stupisce, in quanto è noto che questi tumori sono caratterizzati in generale da una bassa spinta proliferativa, a favore probabilmente della spinta differenziativa/produttiva associata ad una maggior capacità di migrazione cellulare.Questo è ulteriormente provato dal significato prognostico dei caratteri citologici piuttosto che di quelli "proliferativi" (ad es la conta mitotica che non ha mostrato significatività). Una buona correlazione è stata riscontrata invece tra l'indice di proliferazione e la conta mitotica (Spearman r=0,46, p=0,006), mentre Ki67 e l'espressione di p53 non hanno mostrato correlazione.Probabilmente il meccanismo di carcinogenesi non è mediato da p53 ma da meccanismi oncogenetici alternativi. A parziale conferma di tale ipotesi, sta il fatto che il gene TP53 è ugualmente alterato sia nella popolazione KRAS wild type che in quella KRAS alterata.Tra i marcatori con possibile significato predittivo di risposta alla terapia, ALK è risultato positivo in due soli casi (confermato successivamente all'analisi FISH) caratterizzati da parametri morfologici suggestivi di una elevata capacità invasiva (elevata quota di componente non mucinosa, presenza di cellule ad anello con castone). Tali caratteristiche si discostano dalla morfologia tipica dell'ADC mucinoso per avvicinarsi maggiormente all'ADC convenzionale.L'espressione della proteina MET invece, ha registrato una elevata frequenza nei nostri casi con una maggior percentuale di score 2 e 3 (19/30, 63%). Quest'ultimo gruppo ha mostrato una peggior prognosi (Log-rank p=0,03). Tali dati sono in linea con un recente studio dell'espressione della proteina MET in casi di NSCLC EGFR wild type 98 , candidando MET come un promettente biomarcatore per la terapia specifica con suoi inibitori. Sono stati sviluppati infatti alcuni farmaci che hanno dimostrato efficacia pre-clinica in tumori MET positivi all'immunoistochimica mentre sono risultati inefficaci nei tumori con negatività di MET.Tale strategia potrebbe essere validata anche in questa particolare popolazione di ADC che non riconosce ancora terapia specifica e che frequentemente risulta negativa per le mutazioni attivanti di EGFR.Un discorso a parte merita il marcatore predittivo TS. Tale marcatore è stato ampiamente descritto associato alla risposta terapeutica in ADC convenzionali del polmone perché esprimenti più bassi livelli di TS rispetto agli altri istotipi, in particolare i livelli di mRNA di TS sono correlati alla risposta alla terapia con l'antifolato Pemetrexed. Nella nostra casistica, i livelli di proteina TS e di mRNA erano in generale molto bassi. Anche se ulteriormente da validare, questi dati potrebbero suggerire un potenziale effetto della terapia con antifolati per i pazienti affetti da questa variante di ADC.Dal punto di vista molecolare, il sequenziamento di nuova generazione ha mostrato una prevalenza di numerose alterazioni geniche a livello di molti dei geni indagati, il cui preciso significato biologico è ancora da validare con ulteriori studi. Innanzitutto, è bene specificare che le alterazioni individuate, opportunamente caratterizzate, potrebbero corrispondere sia a mutazioni vere e proprie (attivanti o troncanti) sia a polimorfismi. In una prospettiva futura di validazione delle alterazioni individuate, si dovrà procedere quindi con la caratterizzazione genica mediante l'utilizzo di strumenti bioinformatici per trovare mutazioni specifiche caratterizzanti l'ADC mucinoso invasivo. Un discorso a parte merita il concetto di frequenza allelica della mutazione corrispondente alla percentuale delle alterazioni riscontrate all'interno della popolazione neoplastica analizzata: tale frequenza è indicativa del numero di cellule che portano tale alterazione. E' perciò speculabile che un'alterazione che si riscontra in una bassissima percentuale di cellule neoplastiche (<10%) sia meno probabilmente associata ad un significato biologico per la neoplasia.Con i dati attualmente disponibili si possono effettuare analisi sulla distribuzione delle alterazioni nella popolazione e sul rapporto tra i geni alterati o wild type. I geni alterati sono così stati raggruppati secondo la prevalenza di alterazioni riscontrate, indipendentemente dalla frequenza prima e selezionando solo quelle ad alta frequenza poi. Degno di nota è che, sia il gene KRAS che l'EGFR, fanno parte del gruppo di geni più alterati, ma l'EGFR ha mostrato solo alterazioni a bassa frequenza. Da ciò si può sospettare che tali alterazioni non siano veri "driver" della cancerogenesi di questa categoria di ADC, al contrario di quelle riscontrate in KRAS, prevalentemente ad alta frequenza.Si è quindi analizzato il profilo clinico-patologico, immunofenotipico e molecolare della popolazione KRAS wild type rispetto alla popolazione con KRAS alterato (Tabella 6). Nel primo gruppo si concentrano una maggior quantità di femmine (test χ 2 , p=0,05), non fumatrici (anche se non raggiunge la significatività statistica) in linea con la descrizione di Travis 2 . Dal punto di vista morfologico, i 10 casi wild type avevano tutti, una scarsa quota di componente non mucinosa associata <20% (10/10), scarsa reazione stromale (9/10), assenza di cellule ad anello con castone (6/10), scarsa presenza di ciuffi (8/10) e minor produzione di muco (9/10). Dal punto di vista immunofenotipico le due popolazioni non hanno mostrato significative differenze, mentre dal punto di vista molecolare, considerando solo i geni che hanno mostrato una significativa differenza (p<0,05) o un trend (0,05<p<0,1) di differenza di alterazioni tra le due popolazioni, la popolazione KRAS wild type ha mostrato uno status molecolare più conservato, con una minor quantità di geni alterati (14/18) e con minore frequenza allelica. Tutto ciò porterebbe a confermare KRAS come driver mutazionale in questa particolare popolazione di ADC (Figura 6).Infine, analizzando le caratteristiche molecolari dei tre pazienti che hanno presentato doppi nodi, globalmente si poteva notare una generale similitudine nell'assetto molecolare dei due nodi dello stesso paziente, sia per quanto riguarda i nodi sincroni (in cui solamente i geni APC, HRAS, SMARCB1 mostravano una significativa differenza tra i due nodi) che i nodi metacroni.