Nel 1471 l'ospedale fu preda di un imponente incendio che lo ridusse in uno stato fatiscente. Sisto IV, in visita all'ospedale poco dopo la sua nomina a pontefice (1471-1484), lo descrive: “le mura cadenti, gli edifici angusti, tetri, privi d'aria e di ogni più elementare comodità, offrono l'aspetto di un luogo destinato più alla relegazione che a ricuperare la salute”. Ne decise la ricostruzione immediata, anche in previsione del Giubileo. Grazie a Papa Sisto IV il nosocomio rifiorì, divenendo il maggiore luogo per la ricerca scientifica in ambito medico: basti ricordare che al suo interno si avvicendarono illustri medici come Giovanni Tiracorda (medico di Clemente X) e, più tardi, Giovanni Maria Lancisi, Giorgio Baglivi. Inoltre, proprio all'interno dell’"Antica Spezieria" dell'ospedale fu sperimentato l'utilizzo della corteccia di china nel trattamento della malaria. 