L'Ospedale si sosteneva finanziariamente grazie a lasciti e donazioni da parte di esponenti di famiglie notabili, tra cui diversi religiosi, e dalle annesse proprietà immobiliari e terriere conferite per questo scopo: era infatti importante assicurare la gratuità del servizio a chiunque: solo secondariamente, e in misura minore, si faceva riferimento alla fiscalità generale. Tra i maggiori donatori del secolo XVI vi furono il futuro papa Paolo IV e i cardinali Bartolomé de la Cueva y Toledo, che ne fu protettore dal 1562 su nomina di Pio IV, terminando l'ufficio con un lascito ben 80.000 scudi, e Clemente D’Olera con la sua intera eredità.