La biosintesi della 5-HT endogena segue una via simile a quella della noradrenalina, con la differenza che l'amminoacido precursore è il triptofano, invece della tirosina. Il triptofano viene convertito in 5-idrossitriptofano grazie all'azione della triptofano-idrossilasi. Il 5-idrossitriptofano (5-HTP) così prodotto viene decarbossilato a 5-HT, a opera dell'enzima decarbossilasi. Le piastrine accumulano la 5-HT durante il loro passaggio attraverso la circolazione intestinale, dove la concentrazione locale è relativamente alta. La 5-HT viene spesso immagazzinata nei neuroni e nelle cellule enterocromaffini come co-trasmettitore insieme con vari ormoni di natura peptidica, come la somatostatina, la sostanza P, e il polipeptide vasoattivo intestinale.