Il fenomeno della tolleranza ai nitrati evidenziato nel 1905 da Stewart è complesso, presumibilmente multifattoriale (Stewart, 1905), e non ancora completamente chiarito (Wang et al., 2005). Numerose ipotesi sono state proposte ed analizzate, ma sono ancora oggi oggetto di studio (Wenzel et al., 2007b;Jurt et al., 2001).I primi studi sull'influenza dei tioli e della loro deplezione nella bioattivazione e nello sviluppo della tolleranza ai nitrati organici risalgono al 1971. Needleman e colleghi (Needleman et al., 1971) dimostrarono, su organo isolato, che la GTN è metabolizzata a GDN con concomitante consumo di glutatione. Successivamente Ignarro e colleghi (1980)(1981) dimostrarono che gli effetti farmacodinamici dei nitrati organici dipendono dai livelli intracellulari proprio di questo tripeptide presente nelle cellule, in condizioni fisiologiche, in alte concentrazioni (0.5-10 mM). Il glutatione costituisce più del 90% del pool intracellulare di tioli non proteici e si trova quasi tutto in forma ridotta (GSH); solo il 5% circa si trova nella forma ossidata di glutatione disolfuro (GSSG). Il tripeptide non può essere assorbito e viene quindi sintetizzato a livello intracellulare a partire dagli aminoacidi glutammato, glicina e L-cisteina attraverso l'azione sequenziale della γ-glutamilcisteina sintetasi e della glutatione sintetasi. Un trasporto continuo e irreversibile di glutatione fuori dalle cellule mantiene una concentrazione costante a livello extracellulare. Il glutatione protegge le cellule dai danni ossidativi, viene coniugato con composti di natura endogena ed esogena rendendoli inattivi e, a livello extracellulare, viene degradato dalle transpeptidasi aumentando in questo modo la biodisponibilità di cisteina.Come precedentemente ricordato, in seguito ad esperimenti in vitro e sulla base della teoria dei nitrosotioli fu ipotizzato che la tolleranza fosse causata da una ridotta bioconversione dei nitrati organici a NO a causa della deplezione intracellulare di tioli (Needleman et al., 1973). D'altra parte, è stato anche dimostrato che una somministrazione di tioli esogeni, quali la N-acetilcisteina, aumenta la risposta emodinamica ai nitrati e ritarda l'instaurarsi della tolleranza. Per giustificare questa aumentata risposta si è considerato che i tioli possano reagire con i nitrati organici a livello extracellulare e portare alla formazione di S-nitrosotioli, che sono dei potenti vasodilatatori (Fung et al., 1988). Va ricordato inoltre che l'N-acetilcisteina, in vivo, agisce come inibitore dell'enzima di conversione dell'angiotensina (ACE); questa azione può essere all'origine della vasodilatazione (Boesgaard et al., 1993b). Non va quindi escluso che la vasodilatazione in presenza di tioli possa essere, almeno in parte, dovuta ad altri fattori. Si deduce che una co-somministrazione di tioli e nitrati può modificare il normale profilo emodinamico dei nitrati e potenziarne l'azione sui vasi a bassa resistenza. È chiaro che il livello dei tioli nel tessuto vascolare è un fattore critico per l'effetto farmacodinamico dei nitrati organici e che in vivo la deplezione di glutatione è associabile ad una attenuazione della vasodilatazione.Sebbene sia evidente il coinvolgimento dei tioli nella bioattivazione dei nitrati (Haramaki et al., 2001) e l'associazione della tolleranza ai nitrati con la riduzione del livello cellulare di tioli (El-Demerdash, 2006), numerosi studi evidenziano che la teoria della deplezione dei tioli non è in grado di spiegare lo sviluppo della tolleranza ai nitrati in vivo. Infatti, nel 1998, Boesgaard e colleghi hanno dimostrato, con studi in vivo, che la tolleranza si sviluppa anche in assenza di deplezione di tioli (Boesgaard et al., 1998).Un altro fattore proposto fu l'aumentata degradazione a livello vascolare di cGMP.Un inibitore della cGMP-fosfodiesterasi, enzima che catalizza la degradazione del cGMP, sembrava potenziare l'effetto di GTN diminuendo lo svilupparsi di tolleranza (Bohyn et al., 1991). Tuttavia, non esistono dati certi che confermino questa osservazione.L'ipotesi dell'attivazione neuronale nella tolleranza ai nitrati, detta pseudotolleranza, è stata sviluppata a partire dall'evidenza che la trinitroglicerina stimola una controregolazione (Parker, 1996) mediata dal sistema nervoso simpatico, che include il rilascio di catecolamine, e dall'attivazione dell'asse renina-angiotensina-aldosterone.Anche se la vasocostrizione indotta da questo sistema è implicata nell'ischemia "di rimbalzo" (Watanabe et al., 1998) causata dalla cessazione della somministrazione di GTN, un ruolo diretto di questo meccanismo nello sviluppo della tolleranza non è mai stato provato.Nel 1983, Axelsson e Anderson indicarono che, in vivo, la tolleranza ai nitrati può essere correlata a una ridotta formazione di cGMP dovuta a un'alterata funzionalità della sGC (Axelsson et al., 1983). Successivamente fu dimostrato che l'esposizione della sGC alla GTN porta all'inattivazione dell'enzima a causa dell'ossidazione dello ione ferroso del gruppo eme che è essenziale per il legame con NO (Waldman et al., 1986;Gorren et al., 2005). Tuttavia, questa osservazione fu messa in discussione da studi successivi. Kowaluk e colleghi dimostrarono che il trattamento con GTN non causa cross-tolleranza con NO-donatori diretti o vasodilatatori endotelio-dipendenti (Kowaluk et al., 1987;Mülsch et al., 1988Mülsch et al., , 1989. Prolungate esposizioni ai nitrati possano causare alterazione della sGC, ma rimane da dimostrare come una sua alterazione sia all'origine dell'instaurarsi della tolleranza. Infatti, l'inibizione di questo enzima sembra diventare rilevante (Fung et al., 2004) solo dopo prolungate esposizioni ad alte concentrazioni di GTN, molto superiori alle dosi submicromolari usate in terapia (Wei et al., 1981).Un'ulteriore interessante ipotesi fu, nel 1995, quella di Münzel e colleghi che correlarono l'instaurarsi della tolleranza ai nitrati organici con l'aumento della produzione di anione superossido intravascolare (Münzel et al., 1995). La rapida reazione che si verifica tra l'anione superossido e l'NO forma perossinitrito (Figura 18), un potente ossidante cellulare, che potrebbe ulteriormente aumentare lo stress ossidativo e aggravare la disfunzione endoteliale (Schulz et al., 2008). Nel 2002 i gruppi di ricerca di Csont e Hanspal misero in dubbio questa ipotesi mediante due ricerche indipendenti (Csont et al., 2002;Hanspal et al., 2002).NO O 2 -OON O + . _ .Figura 18. La reazione tra l'anione superossido e l'NO.Studi successivi proposero che la tolleranza è evitata o diminuita grazie alla co-somministrazione di antiossidanti; in particolare, fu dimostrato l'effetto protettivo della vitamina C, sia negli animali (Fink et al., 2000) che nell'uomo (Thomas et al., 2007).Anche per altri antiossidanti è stata provata l'attività protettiva nei confronti della tolleranza e virtualmente tutti gli antiossidanti sono in grado di proteggere dalla disfunzione endoteliale causata dai problemi cardiocircolatori (Schulz et al., 2008). Inoltre, l'eccesso delle due specie molto reattive, ossia gli anioni superossido e perossinitrito, sembra compromettere l'attività dei canali ionici coinvolti nella regolazione delle correnti di Ca 2+ e K + , che sono i mediatori finali della vasodilatazione indotta dai nitrati organici (Münzel et al., 2005). Tuttavia, secondo Schulz, il coinvolgimento degli antiossidanti non sembrerebbe da correlare alla diminuita inattivazione dell'NO da parte dell'anione superossido e all'attività riparativa sulle funzioni dell'endotelio (Schulz et al., 2008).Quando, nel 2002, Chen e colleghi iniziarono gli studi sull'aldeide deidrogenasi, la concomitanza tra lo sviluppo di tolleranza in vitro e la bioattivazione da parte dell'enzima portò all'ipotesi di una correlazione tra la tolleranza e la già nota inattivazione dell'enzima ALDH-2 causata dai nitrati organici (Chen et al., 2002). Nel 1994, Mukerjee e Pietruszko avevano evidenziato come le isoforme citosoliche e mitocondriali dell'ALDH fossero inibite reversibilmente dall'isosorbide dinitrato; infatti, l'attività veniva ripristinata con 2-mercaptoetanolo, suggerendo il coinvolgimento dell'ossidazione dei gruppi sulfidrilici delle cisteine (Mukerjee et al., 1994). Tuttavia, nel 2003, Di Fabio e colleghi affermarono che la tolleranza non poteva essere correlata all'inattivazione della ALDH-2, perché l'inibizione ottenuta con l'aggiunta di benomyl ai preparati vascolari era simile in presenza o meno di tolleranza (Di Fabio et al., 2003). L'anno successivo, il gruppo di Sydow riportò che il trattamento prolungato con GTN causa una riduzione dell'attività dell'mtALDH-2 vascolare, alla quale si accompagna una diminuita biotrasformazione di GTN ed una ridotta attività di chinasi cGMP-dipendenti. Nello stesso lavoro fu inoltre evidenziato che gli inibitori dell'ALDH-2 attenuavano l'attività vasodilatante solo in situazioni di nontolleranza (Sidow et al., 2004). Il coinvolgimento dell'enzima ALDH-2 nella ridotta bioattivazione di GTN, ma anche di altri nitrati organici, spiegherebbe perché NO-donatori spontanei come il sodio nitroprussiato siano soggetti ad un grado di tolleranza decisamente minore. La conferma del coinvolgimento dell'enzima è avvenuta nel 2005, quando Chen e colleghi hanno evidenziato che topi ALDH -/non sviluppano tolleranza ai nitrati (Chen et al., 2005).L'ALDH-2 mitocondriale, che costituirebbe la più importante via di bioattivazione di GTN, è sensibile all'ossidazione, a causa della presenza dei gruppi tiolici. In questo modo possono essere spiegati i dati sull'effetto protettivo degli antiossidanti, che vanno riferiti all'azione protettiva sulle attività della cellula e in particolare dell'enzima ALDH-2 (Figura 19). 