La mitomicina ed i suoi metaboliti provocherebbero anche la alchilazione del residuo O-6 della guanina, ed in questo modo determinerebbero singole rotture nel DNA. Questo meccanismo di azione è molto più evidente ed efficace nella tarda fase G1 e all'inizio della fase S del ciclo cellulare. Il farmaco inoltre interferirebbe con l'RNA e la sintesi delle proteine.