La pefloxacina è controindicata nei soggetti con ipersensibilità nota al principio attivo, ad altri fluorchinoloni oppure ad uno qualsiasi degli eccipienti contenuti nella formulazione farmacologica. È inoltre controindicata nei pazienti affetti da insufficienza di glucosio-6-fosfato deidrogenasi oltre che nei soggetti in età pediatrica o adolescenti ancora in fase di crescita per il rischio di insorgenza di severe forme di artropatia, in particolare a carico delle grandi articolazioni. Come altri fluorchinoloni la pefloxacina non deve essere assunta da soggetti epilettici e da coloro che presentano alterazioni del sistema nervoso centrale (ad esempio pregressi traumi cranici o cerebrali, pregresse encefaliti o meningiti, ictus cerebrale), che possono determinare un abbassamento della soglia convulsiva. Nei pazienti affetti da nefropatie il dosaggio deve essere diminuito.