L'eparina utilizzata negli esperimenti è stata ottenuta da una preparazione commerciale di eparina di sodio da mucosa di bue (Laboratori derivati organici, Milano); tale composto ha un peso molecolare pari a 13700 kD, con un rapporto gruppi solfato/gruppi carbossilici di 2.14.I derivati di K5 utilizzati nei saggi sono: K5-NS, K5-OS(L), K5-OS(H), K5-N,OS(L) e K5-N,OS(H), la cui struttura disaccaridica è mostrata in figura 14; tali molecole sono state acquisite dalla ditta farmaceutica Glycores s.r.l. 2000 di Milano. La sintesi di tali composti è stata compiuta partendo da un singolo lotto del polisaccaride preparato da una coltura in crescita di Escherichia Coli per 16 ore a 37˚C in un medium contenente 2.0 g/l di farina di soia sgrassata, 9.7 g/l di K2HPO4, 2.0 g/l di KH2PO4, 0.5 g/l di sodio citrato, 0.11 g/l MgCl2, 1.0 g/l di ammonio solfato e 2.0 g/l di glucosio, a pH 7.3. Tale medium è stato raccolto e concentrato attraverso l'utilizzo di una membrana ultrafiltrante.Il polisaccaride è stato recuperato dopo precipitazione con quattro volumi di acetone, e le proteine sono state idrolizzate con un'incubazione di 90 minuti a 37˚C con proteasi II diAspergillus orizae (Sigma) in 0.1 M di NaCl, 0.15 M EDTA, e 0.5% SDS, pH 8.0. K5 è stato infine recuperato per mezzo di ultrafiltrazione e precipitazione.O-Solfatazione del polisaccaride K5: un grammo di K5 è stato risospeso a temperatura ambiente in 10 ml di anidro N,N-dimetil-formamide, e poi 15 ml di N,N-dimetilformamide contenente 2.4 o 0.7 g del complesso piridina-sulfotriossido sono stati addizionati per generare K5-OS(H) e K5-OS(L), rispettivamente. I campioni sono stati incubati per 18 ore a temperatura ambiente e recuperati attraverso precipitazione con 16 ml di acetone saturato con NaCl. I pellet sono stati sciolti in H2O e purificati con sali per ultrafiltrazione.N-Deacetilazione/N-solfatazione del polisaccaride K5: un grammo del polisaccaride K5 è stato disciolto in 100 ml di 2.0 N di NaOH, incubato per 24 ore a 60 gradi e raffreddato a temperatura ambiente; il pH è stato portato a 7.0. La soluzione è stata riscaldata a 40 gradi, addizionata in un singolo step a 1.6 grammi di carbonato di sodio e 1.6 grammi del complesso piridina-sulfotriossido per 4 ore, e incubato per un'altra ora alla stessa temperatura. La soluzione è stata poi portata a temperatura ambiente, e il pH modificato a 7.5-8.0. I K5 Ndeacetilati/N-solfatati sono stati purificati da sali tramite ultrafiltrazione, e il campione è stato lasciato asciugare sotto vuoto.O-solfatazione dei K5 N-deacetilati/N-solfatati: i K5 deacetilati/solfatati sono stati disciolti in 10 ml di acqua, fatti passare attraverso una colonna a scambio cationico (IR-120 H+; Bio-Rad) a 10˚C e neutralizzati con il 15% di idrossido di tetrabutilammonio in acqua.Successivamente il campione è stato disciolto in 40 ml di N,N-dimetilformamide, e 0.7 o 3.5 grammi del complesso piridina-sulfotriossido in forma solida è stato aggiunto per generare K5-N,OS(L) e K5-N,OS(H), rispettivamente. I campioni sono stati incubati a 50˚C per 24 ore e raffreddati a 4˚C; acetone saturato con NaCl è stato addizionato fino a quando la precipitazione è stata completata. Dopo la filtrazione, il precipitato è stato sciolto in 10 ml di acqua con l'aggiunta di NaCl fino a raggiungere una concentrazione di 0.2 M, e il pH è stato tarato a 7.5-8.0 con NaOH 2.0 N. Il prodotto è stato recuperato tramite precipitazione con acetone e ultrafiltrazione per ottenere una soluzione al 10%. Poi i campioni sono stati riscaldati a 40˚C, addizionati in un singolo step a 1.6 g di carbonato di sodio e 1.6 g del complesso piridina-sulfotriossido per 4 ore, e incubati per ulteriori 24 ore alla stessa temperatura. I campioni sono stati infine purificati con sali attraverso ultrafiltrazione. Sono state effettuate analisi di spettrometria di massa, analisi sul rapporto dei gruppi solfati/carbossilici e determinazioni del peso molecolare dei differenti composti [Leali et al.,2001].Figura 14: struttura disaccaridica di K5 e dei principali derivati di K5 Bertani agarizzato (tryptone 10g/l, estratto di lievito 5 g/l, NaCl 6 g/l, agar 15 g/l) contenente l'antibiotico necessario alla concentrazione di 100 µg/ml per l'ampicillina, 25 µg/ml per la zeocina, 100 µg/ml per la blasticidina) e incubati tutta la notte a 37°C. L'utilizzo dell'antibiotico blasticidina richiede l'impiego di un terreno Luria Bertani a bassa concentrazione di sali (NaCl 5g/l, tryptone 10 g/l, estratto di lievito 5 g/l, agar 15 g/l).La purificazione dei plasmidi da batteri richiede innanzitutto l'allestimento di una precrescita batterica. Alcune colonie cresciute sulla piastra, costituite da batteri contenenti il plasmide, vengono prelevate e messe in pre-crescita per 8 ore a 37˚C in agitazione a 250 rpm in terrenoLuria Bertani e addizionato dell'antibiotico selettivo. Successivamente la coltura batterica viene inoculata in 100 ml di terreno Luria Bertani in presenza dell'antibiotico di selezione e incubata per 16 ore in agitatore a 37˚C a 250 rpm. Il DNA plasmidico viene estratto dai batteri con il kit NucleoBond Plasmid Purification (Macherey-Negel) e risospeso in un volume opportuno di tampone di estrazione (TE:10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8); viene quindi determinata la concentrazione tramite lettura allo spettrofotometro ed effettuata una corsa su 66 gel di agarosio per verificare la presenza del DNA plasmidico, la sua purezza e l'assenza di eventuali contaminazioni.Per l'analisi del DNA plasmidico sono stati preparati gel d'agarosio allo 0.8% in tampone TAE (Trisacetato 40 mM, EDTA 1 mM), a cui è stato aggiunto bromuro d'etidio (concentrazione finale: 0,5 µg/ml). Alla soluzione di DNA da analizzare su gel è stato aggiunto tampone di caricamento composto da: glicerolo 6%, blu di bromofenolo 0,02%, SDS 0,02% (concentrazioni finali). L'elettroforesi è stata condotta in tampone TAE, ad un voltaggio costante di 80 mV.