In particolare alla biopsia, che rappresenta lo standard di riferimento per la diagnosi, si osserva l'assenza di gangli nervosi nella tonaca muscolare e nella sottomucosa, associata a incremento di fibre nervose positive alla tecnica di colorazione della acetilcolinesterasi (vedi Illustrazione sezione bioptica colorata) . Quasi costantemente si assiste a dilatazione e ipertrofia del tratto di colon normale posizionato a monte di quello affetto. La mucosa può risultare infiammata e può ulcerarsi. La diagnosi di certezza è raggiunta, tuttavia, solo tramite colorazione per l'acetilcolinesterasi dei campioni di sottomucosa.