La Reazione a Catena della Polimerasi (PCR) è una metodica di amplificazione che consente di ottenere copie multiple di una sequenza specifica di DNA.Perché ciò possa avvenire è necessario l'utilizzo della DNA polimerasi, in grado di produrre filamenti di DNA complementari alla doppia elica di origine.L'enzima polimerasi ha bisogno di un innesco detto "primer" che è una sequenza oligonucleotidica complementare ad una specifica regione del gene che si intende amplificare. I primers di innesco sono disegnati con una sequenza complementare alle sequenze fiancheggianti la sequenza genica da amplificare.La reazione di sintesi viene ripetuta un numero variabile di volte (30)(31)(32)(33)(34)(35)(36)(37)(38)(39)(40), così da permettere l'accumulo esponenziale di frammenti di DNA amplificato ad ogni ciclo successivo.Per il nostro studio l'analisi quantitativa di espressione per i geni candidati è stata effettuata su cDNA ottenuto da RNA estratto da sangue periferico mediante saggio 5'esonucleasico in una reazione di Real Time PCR. L'amplificazione è stata effettuata utilizzando uno strumento ABI PRISM 7900 (Applied Biosystems).Il ciclo di amplificazione prevede una prima fase di 10 minuti a 95°C per l'attivazione della Taq Polimerasi e poi una successione di 40 cicli costituiti da: 15 secondi di denaturazione a 95°C e da una fase di appaiamento ed estensione di 1 minuto a 60°C. Nei 30 secondi finali della fase di annealing/estensione avviene la misurazione della fluorescenza emessa.La Real Time PCR quantitativa è una reazione a catena della polimerasi modificata in modo da monitorare l'andamento della reazione mentre essa è ancora in svolgimento.Questo permette di misurare in tempo reale l'accumulo dovuto ad amplificazione di una sequenza target di cDNA templato e da questa informazione risalire alla concentrazione iniziale della stessa nel campione biologico.La valutazione in tempo reale dell'accumulo di prodotti di PCR è possibile tramite l'impiego di una sonda di ibridazione marcata con molecole fluorescenti, il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR.In questa ricerca sperimentale è stata utilizzata la sonda TaqMan.Questa è un oligonucleotide disegnato in modo complementare alla sequenza bersaglio che deve essere amplificata.La sonda Taqman presenta una duplice modificazione: al 5' contiene un fluorocromo ad alta energia detto "reporter", ossia un marcatore che emette fluorescenza, mentre al 3' presenta un diverso fluorocromo a bassa energia detto "quencher", in grado di assorbire la fluorescenza emessa dalla molecola "reporter" grazie alla vicinanza con questa e riemetterla ad una differente lunghezza d'onda (Fig. 12). Nella fase di estensione, quando la DNA polimerasi nel corso del suo processo di amplificazione raggiunge la sonda, per mezzo della propria attività 5' esonucleasica la frammenta separando cosi il "quencher" dal "reporter" e l'emissione di quest'ultimo, non essendo più mascherata dalla vicinanza del "quencher", può essere misurata con un apposito lettore.Un aumento della fluorescenza alla lunghezza d'onda di emissione del reporter è quindi indice dell'avvenuta ibridazione della sonda sul DNA stampo.Poiché, quanto descritto, avviene durante un processo di PCR il numero di frammenti disponibili per l'attacco delle sonde cresce in maniera esponenziale seguendo la curva di amplificazione e risultando in un pari e progressivo aumento dell'intensità complessiva di fluorescenza.La misurazione della quantità di fluorescenza emessa avviene quando la sua intensità raggiunge il livello soglia durante la fase esponenziale dell'amplificazione.Tutte le operazioni relative alle misurazioni avvengono sotto il controllo di un apposito software che acquisisce lo spettro di emissione di ogni singolo campione per tutta la durata della PCR, convertendo la variazione di fluorescenza del reporter in una rappresentazione in tempo reale della cinetica di amplificazione. L'algoritmo di analisi calcola l'emissione del reporter e del quencher ogni pochi secondi e contemporaneamente determina il ciclo soglia (Ct).Il ciclo soglia corrisponde all'effettiva emissione di fluorescenza, scorporata dal rumore di fondo. Il numero di cicli necessario perché un campione raggiunga il proprio Ct è inversamente proporzionale al numero di copie target presente inizialmente.Nella nostra ricerca sperimentale i livelli di espressione dei geni del riparo del DNA sono stati valutati secondo metodica Real Time PCR (Fig. 13) con una quantificazione relativa rispetto al livello di espressione del gene G6PD di riferimento endogeno. G6PD è un gene definito "house-keeping" in quanto il suo livello di espressione, in ciascun tessuto del medesimo individuo, si assume essere costante.Questo deriva dal fatto che tale gene appartiene ad un gruppo di geni che codificano proteine coinvolte nei meccanismi basali delle cellule (113). I livelli di espressione dei geni esaminati sono stati calibrati in riferimento a quelli della G6PD, operazione che rende confrontabili le misurazioni effettuate su campioni diversi. I campioni sono stati analizzati in triplicato includendo dei controlli negativi di analisi.  Anche l'analisi di correlazione fra i livelli di espressione dei geni studiati e la sopravvivenza dimostra un andamento analogo, con espressioni più elevate fra i pazienti con migliore sopravvivenza per tutti i geni studiati; tuttavia non abbiamo correlazioni statisticamente significative.La sopravvivenza globale (OS) mediana, è stata calcolata su 38 pazienti valutabili ed è risultata di 10 mesi.Per i geni ERCC1,ERCC2,XRCC3 le curve di sopravvivenza di Kaplan Meier sono interessanti e emergerebbe nel gruppo di pazienti con sopravvivenza migliore una più elevata espressione per ciascuno dei tre geni considerati.In blu è rappresentata la funzione di sopravvivenza per il gruppo di pazienti a basso livello di espressione ossia al di sotto del valore medio per ciascuno dei tre geni.In verde è rappresentata la funzione di sopravvivenza per il gruppo di pazienti con alto livello di espressione ossia al di sopra del valore medio per ciascuno dei tre geni. 