La ligazione è una reazione che in vitro permette di legare le estremità, compatibili tra loro, di molecole di DNA ottenute tramite digestione enzimatica. Il legame avviene grazie alla formazione, da parte dell'enzima T4 ligasi, di legami fosfodiesterici tra l'estremità 5' di un frammento e l'estremità 3' del frammento compatibile.Nella ligazione sono stati utilizzati eccessi di inserto (in un rapporto molare di 3:1) e il vettore, per aver in totale nella reazione, 100ng di DNA. Il volume finale della reazione è di 20 l. La ligazione avviene a 15°C over night.