Il primer fornisce un 3'-OH libero utilizzabile dalla trascrittasi inversa per generare un filamento di DNA complementare al trascritto. Questa fase viene detta di "allungamento" e il suo andamento è strettamente dipendente dalla natura dell'enzima. Anche per quanto riguarda la scelta dell'enzima si hanno diverse opzioni. Utilizzando l'enzima MMLV (acronimo di Virus della leucemia del topo di Moloney, in inglese Moloney murine leukemia virus) la reazione di allungamento va effettuata a 37 °C, il che risulta problematico nel caso si abbia un RNA ricco in strutture secondarie e/o GC. Una scelta migliore risulta essere l'enzima Superscript III (acronimo SSIII): si tratta di una variante dell'enzima MMLV, ingegnerizzato per resistere a temperature più elevate. In questo caso la reazione viene condotta a 50 °C per 1 ora circa. L'enzima SSIII possiede anche un'attività RNasi H ridotta rispetto a MMLV, il che consente di ottenere un cDNA più lungo e con una resa migliore. 