Colombo fece molte importanti scoperte nel campo dell'anatomia, compresa quella della circolazione polmonare, o piccola circolazione, che aprì la strada, qualche anno dopo, alla scoperta della circolazione del sangue da parte di William Harvey, contenuta nel suo capolavoro De Motu Cordis (1628). Secondo la visione tradizionale risalente a Galeno, il sangue passava tra i ventricoli del cuore attraverso i micropori del setto interventricolare e in questo modo il sangue venoso diventava sangue arterioso nel ventricolo sinistro, dove l'aria veniva fornita dalla vena polmonare. Durante la vivisezione di cani e altri animali, Colombo trovò ripetutamente solo sangue nella vena polmonare, e niente aria. Secondo il suo modello, il sangue venoso viaggiava dal cuore ai polmoni dove veniva mescolato con l'aria e poi tornava al cuore. Sebbene la permeabilità del setto fosse già stata smentita da Michele Serveto nel 1553 nella sua Christianismi Restitutio e da Ibn al-Nafis nel XII secolo, Colombo fu il primo a completare la teoria con valutazioni e osservazioni anatomiche originali. In aggiunta alla circolazione polmonare, Colombo scoprì anche che l'azione principale del cuore era la contrazione, piuttosto che la dilatazione, come si era pensato in precedenza. Entrambe queste scoperte furono più tardi confermate da William Harvey.