Si occupò intensamente, per undici anni, dal 1880 al 1891, allo studio della malaria. Con Angelo Celli studiò il nuovo protozoo scoperto da Alphonse Laveran nel 1881, ritrovandolo nel sangue di molti pazienti affetti da febbre malarica, riconoscendone i vari stadi di sviluppo (dalle forme ameboidi apigmentate alla fase di scissione) e la sede endoglobulare. Battezzò il nuovo microorganismo "Plasmodium", agente eziologico della malaria. Nello stesso periodo Camillo Golgi ultimò gli studi sui differenti tipi di malaria, distinguendo tra terzana benigna e quartana, e identificandone i due rispettivi agenti eziologici. In seguito, Celli e Marchiafava confrontarono i loro reperti con le tesi di Golgi e identificarono una terza forma di infezione malarica che chiamarono terzana maligna o febbre estivo-autunnale. Questo ceppo, incidente soprattutto in Roma, presentava una natura più violenta con frequente esito in forma perniciosa comatosa ed una certa tendenza ad accumularsi nei vasi cerebrali. I due medici, dopo ulteriori conferme ed approfondimenti, pubblicarono le loro scoperte nella monografia "Über die Parasiten des rothen Blutkörperchens" nel 1891, "Sulle febbri malariche estivo-autunnali" (1892), e "La infezione malarica" (1902).