Dopo aver scelto la membrana per la capacità di legare la proteina, è necessario prevenire le interazioni tra la membrana e l'anticorpo usato per rilevare la proteina bersaglio. Il bloccaggio di legami non specifici è raggiunto ponendo la membrana in una soluzione diluita di proteina - tipicamente 3-5% Bovine serum albumin (BSA) o latte in polvere in Tris-Buffered Saline (TBS), con una piccola percentuale di detergente come Tween 20 o Triton X-100. La proteina nella soluzione diluita attecchisce alla membrana in tutti i punti dove le proteine bersaglio non hanno attecchito. Questo permette, quando l'anticorpo è aggiunto, che esso non si leghi a siti aspecifici in quanto già occupati dalla proteina precedentemente citata. Questo riduce il "rumore" nel prodotto finale, portando risultati più puliti, e eliminando falsi positivi.