Per la cura delle malattie onco-ematologiche viene già utilizzata da molti anni nella pratica clinica l'immunoterapia attiva grazie al trapianto allogenico: le cellule del sistema immunitario del donatore sono in grado di riconoscere ed eliminare la neoplasia in una discreta percentuale di casi.Questa reazione immunitaria non è diretta però unicamente verso le cellule malate ma colpisce anche i tessuti sani determinando vari danni d'organo (graft-versus-host disease); ciò è difficilmente prevedibile e controllabile una volta che si è instaurata anche ricorrendo a farmaci immunosoppressori. Per sfruttare ulteriormente l'attività antitumorale del sistema immunitario già dagli inizi degli anni '90 si è iniziata l'infusione di linfociti del donatore come trattamento della ricaduta dopo trapianto allogenico, anche se, a fronte di un possibile beneficio di questa procedura, si è aumentata ulteriormente la possibilità di sviluppare gravi danni d'organo (graft-versus-host disease) 60 .La vaccinazione con un antigene tumore-specifico ha lo scopo di stimolare selettivamente sistema immunitario del paziente verso le cellule neoplastiche riducendo drasticamente la tossicità verso i tessuti sani: questo approccio permetterebbe quindi di effettuare una immunoterapia attiva diretta unicamente verso un antigene presente solo nelle cellule tumorali.La proteina WT1 sembrerebbe essere l'antigene ideale verso cui stimolare una risposta immunitaria poiché essa è iperespressa selettivamente nelle cellule di molte neoplasie ematologiche e tumori solidi [25][26][27][28][29][30][31][32][33][34][35][36][37][38][39] , mentre nei tessuti sani è presente a livelli estremamente bassi e limitatamente alle cellule delle gonadi, dei reni, della milza, dei mesoteli e dei progenitori ematopoietici [22][23][24][25] . Inoltre nelle sindromi mielodisplastiche si osserva una correlazione fra la progressione della malattia e la sua evoluzione in leucemia mieloide acuta e il livello di espressione di WT1; ciò indica un'alta associazione con il fenotipo displastico o neoplastico 25 . La risposta immunitaria diretta contro WT1 potrebbe colpire solo le cellule tumorali che contengono elevati livelli di questa proteina e risparmiare i tessuti sani non determinando quindi tossicità d'organo come nel caso della graft versus host disease. L'assenza di danni alle cellule sane sembrerebbe essere confermata da studi pre-clinici in cui la vaccinazione basata su peptidi di WT1 non determina alcun fenomeno di tossicità, anche a livello dei tessuti che esprimono fisiologicamente WT1 a bassi livelli [42][43] . Inoltre anche i primi studi di fase I condotti sull'uomo, basati sulla somministrazione di peptidi di WT1, mostrano l'assenza di qualsiasi fenomeno tossico e l'assoluta sicurezza di questo approccio immunoterapico. Ciò può essere spiegato dall'elevata differenza di espressione di WT1 fra le cellule neoplastiche e le cellule dei tessuti sani che rende sicuramente WT1 un promettente antigene tumore-specifico.Un'altra caratteristica fondamentale che deve possedere la proteina WT1 per essere considerata un ottimo antigene è la sua capacità di generare una risposta immunitaria, cioè il suo grado di immunogenicità. Nell'uomo è stata osservata la formazione spontanea di linfociti T CD8+ verso l'antigene WT1 in pazienti affetti da leucemia mieloide acuta e sindrome mielodisplastica, ma anche in pazienti con tumore del polmone e della mammella [44][45] .In questo studio si è voluto valutare se pazienti affetti da leucemia mieloide acuta, leucemia linfoblastica acuta, leucemia mieloide cronica, mielofibrosi, leucemia mielomonocitica cronica e sindrome mielodisplastica sviluppassero spontaneamente una risposta umorale contro questo antigene tumore-specifico; si è quindi osservato che le IgG anti WT1 sono presenti nel 63% dei pazienti affetti da neoplasie ematologiche, mentre sono presenti solo nel 17,6% dei volontari sani; i differenti livelli di anticorpi anti WT1 sono statisticamente significativi fra le due popolazioni (p=0,006). Questi risultati permettono di dedurre che la proteina WT1 è già in grado di evocare una minima risposta immunitaria in pazienti affetti da queste neoplasie e che il suo potenziale immunogenico è estremamente elevato. Essa sembrerebbe anche in grado di stimolare già fisiologicamente in vivo una risposta sia citotossica T CD8+ sia umorale; quindi si può ipotizzare che un approccio di vaccinazione possa amplificare questa reazione immunitaria in modo tale da renderla efficace nel distruggere le cellule tumorali.In conclusione si può osservare come la proteina WT1 possieda due fondamentali caratteristiche che la rendono un antigene ideale per un approccio di immunoterapia oncoematologica attiva: alto potenziale immunogenico ed elevato grado di associazione tumorespecifico. E' stata valutata anche la presenza di anticorpi anti WT1 nei pazienti affetti da mieloma multiplo, poiché vi sono dati secondo i quali la vaccinazione peptidica con WT1 risulta attiva nei confronti di queste cellule neoplastiche, anche se non è dimostrata una iperespressione di questa proteina 57 . Si può osservare che i pazienti valutati in questo studio mostrano la presenza statisticamente significativa di specifici anticorpi anti WT1 nel 50% dei casi rispetto al 17,6% dei volontari sani. Questa osservazione suffragherebbe ulteriormente l'utilizzo di un approccio vaccino-terapico diretto verso l'antigene WT1 anche nei pazienti affetti da mieloma multiplo e potrebbe indirettamente suggerire che WT1 venga espresso a livelli sufficienti per determinare una risposta immunitaria anche nelle plasmacellule tumorali.In vari studi preclinici effettuati sui topi la vaccinazione peptidica si è dimostrata attiva nei confronti di linee cellulari tumorali e i dati preliminari di studi di fase II condotti sull'uomo sembrerebbero confermare questo risultato anche in pazienti affetti da neoplasie oncoematologiche e da tumori solidi 42,[52][53][54][55]58,59 . E' inoltre importante sottolineare che i pazienti selezionati in questi studi di fase II sono molto spesso già pluritrattati con vari cicli chemioterapici e in fasi molto avanzate di malattia, con un sistema immunitario molto depresso e quindi poco responsivo ad un approccio di vaccinazione. Ciò indica che questi risultati preliminari, in cui si osserva un'attività della vaccinazione peptidica anche in tali pazienti, sono sicuramente molto positivi. Inoltre, poichè la vaccinazione verso l'antigene WT1 si è dimostrata fino ad ora molto sicura e priva di effetti tossici, in futuro si potranno selezionare pazienti in uno stadio di malattia meno avanzato e quindi con un sistema immunitario più efficiente, nei quali si potrà valutare la reale attività ed efficacia di questo approccio immunoterapico.In questo progetto si è scelto di intraprendere un approccio immunoterapico somministrando un vaccino contenente l'intera proteina WT1, poiché i vaccini peptidici hanno il limite di poter essere somministrati solo in pazienti con specifici MHC I ed evocano principalmente una risposta immunitaria di tipo citotossico T CD8+ mediata. Il vaccino basato sull'intera proteina è HLA-indipendente e permette di sfruttare l'intero potenziale di reattività del sistema immunitario, sia citotossico, sia umorale, verso un antigene specifico. Classicamente la risposta T CD8+ è quella maggiormente implicata nel sopprimere la crescita di cellule neoplastiche, ma vi sono alcune ipotesi che sia quella umorale a mantenere nel tempo la risposta immunitaria contro le cellule tumorali 43 .Questo studio preclinico dimostra l'assenza di tossicità del vaccino proteico anche in quei tessuti sani che esprimono fisiologicamente WT1 a bassi livelli: gli emocromi e gli strisci di sangue midollare non risultano alterati nel gruppo di topi vaccinati indicando che i progenitori ematopoietici non vengono danneggiati; l'istologia di rene, milza, gonadi e linfonodi non dimostra alcuna alterazione patologica di infiammazione e danno d'organo, così come infiltrazione linfocitaria, necrosi, fibrosi e iperplasia. Alcuni topi non sono stati sacrificati e vengono tuttora seguiti non mostrando alcun segno di tossicità a 14 settimane dal primo inoculo: ciò indica l'assoluta assenza di effetti tossici di questo vaccino proteico. Si è quindi valutata l'attività del vaccino proteico: la citotossicità T CD8+ è stata mediamente del 6,5% nei topi vaccinati rispetto allo 0% dei controlli, mentre la risposta umorale è stata osservata nel 100% dei topi vaccinati rispetto allo 0% dei controlli.Sembrerebbe quindi che questo tipo di vaccinazione sia in grado di evocare soprattutto una risposta umorale, mentre la risposta citotossica risulta discreta. Importante è però tenere in considerazione che il test di rilascio del cromo è stato effettuato solo con una linea di adenocarcinoma prostatico murino (TRAMP-C2) e sarà necessario testare altre linee cellulari tumorali per potere valutare meglio la reale citotossicità T CD8+.Il vaccino in vivo sembrerebbe mostrare una discreta attività nel ridurre la crescita tumorale, infatti i topi vaccinati non hanno sviluppato, a 8 settimane dall'inoculo delle TRAMP-C2, alcuna massa a differenza di alcuni topi di controllo; essendo però questa linea tumorale a crescita lenta si sta ancora seguendo lo sviluppo della situazione. Anche in questo caso si ritiene comunque opportuno testare ancora altre linee cellulari tumorali iperesprimenti WT1 per poter valutare meglio l'attività in vivo della vaccinazione proteica verso l'antigene WT1.In futuro, se venisse confermato che la vaccinazione con l'intera proteina evoca principalmente una risposta immunitaria di tipo umorale, si potrebbe anche prendere in considerazione di testare la combinazione di questo vaccino con quello peptidico in grado di stimolare la risposta citotossica T CD8+ e valutare se l'associazione risulti più attiva dei singoli vaccini.