Nato da famiglia benestante, Giustiniano Nicolucci studiò al Collegio Tulliano di Arpino e poi si trasferì a Napoli. Nel primo ateneo partenopeo si laureò in medicina nel 1845. Accantonato l'interesse per la fisiologia, campo nel quale inizialmente impartì lezioni private, decise di tornare nella cittadina natale per esercitare la professione di medico.