Per il dosaggio del cortisolo salivare la saliva è stata raccolta in tamponi di cotone che venivano masticati per 2-3 minuti ed erano quindi inseriti in provette di plastica a doppia camera (Salivette Sarstedt). I campioni sono stati immediatamente centrifugati e quindi stoccati a -20°C fino al dosaggio. Il cortisolo salivare è stato misurato con lo stesso Kit usato per il cortisolo sierico e urinario (RADIM Italia, Roma) aumentando il volume dell'analita da 25 a 100 μL. Il metodo analitico utilizzato per il dosaggio del cortisolo consiste in una competizione che si instaura tra ormone marcato (coniugato radioattivo) ed ormone non marcato (calibratore e campione) a legarsi ad un numero limitato di siti leganti specifici sull'antisiero adeso alle provette. Dopo un periodo di incubazione le provette vengono lavate, il liquido contenuto eliminato e infine contate in un contatore gamma. Si tratta di una metodica RIA con sensibilità funzionale di 0,9 μg/L e coefficiente di variazione intrasaggio tra 4,2-5,4 % e coefficiente di variazione intersaggio tra 7,2-8,5%. I valori di cortisolo salivare a mezzanotte riscontrati nei soggetti affetti da sindrome di Cushing sono risultati mediamente più elevati dei valori dosati per tutti gli altri gruppi di pazienti (Fig. 1). Solo in 3 casi la concentrazione dell'ormone in questo gruppo era inferiore al livello soglia di 4,5 μg/L. Il limite superiore di normalità del cortisolo salivare alle ore 24 è stato posto a 4,5 μg/L, valore che rappresenta il 97° centile di distribuzione delle concentrazioni osservate nel gruppo di pazienti nei quali la diagnosi non è stata confermata e che è stato considerato come gruppo di controllo.*I valori del cortisolo salivare sono espressi come media ± deviazione standard. L'unità di misura è μg/L.  Il confronto tra tutti i gruppi di pazienti ha dimostrato una differenza statisticamente significativa nelle concentrazioni di cortisolo (p<0,0001). In un confronto post hoc tra i diversi gruppi, si è evidenziata una differenza significativa tra i livelli osservati nel gruppo Cushing versus tutti gli altri (p<0,0001) così come la presenza di una differenza significativa tra il gruppo incidentaloma e i controlli (p=0,025).Analizzando tutti i soggetti (n=155) che disponevano sia di un dosaggio del cortisolo salivare, sia di uno del cortisolo sierico si è osservata una correlazione tra i due statisticamente significativa (r = 0,53, p<0,0001). (Fig. 3) Successivamente si è proceduto con l'analisi dei dati sui diversi gruppi di soggetti in studio. Nei pazienti con sindrome di Cushing, che disponevano di entrambi i dosaggi (n=29) la correlazione è risultata statisticamente significativa (r = 0,57 e p< 0,0001) mentre nei soggetti con incidentaloma (n=58), così come nel gruppo di controllo (n=30) la correlazione non è stata confermata (r = 0,16 e -0,17 rispettivamente con p non significativa).(Fig. 4)  F24= cortisolo ore 24Valore predittivo positivo per cortisolo salivare ore 24: 96,8%Valore predittivo negativo per cortisolo salivare ore 24: 93,7%Valore predittivo positivo per cortisolo sierico ore 24: 70%Valore predittivo negativo per cortisolo sierico ore 24: 86,3%All'analisi con il test del χ 2 la specificità del cortisolo salivare risulta essere significativamente maggiore (p<0,0001) mentre non c'è alcuna differenza in termini di sensibilità. E' interessante notare che i 3 pazienti con sindrome di Cushing confermata che sfuggono all'identificazione con cortisolo salivare (falsi negativi) vengono riconosciuti dal dosaggio di cortisolo sierico. complesso, sia ripetendo l'analisi nei vari sottogruppi separatamente. Sono stati considerati pazienti che avessero eseguito due campionamenti nell'intervallo di 1 mese (Fig.9,10,11,12).  Da questi dati è emerso che non ci sono differenze significative tra il primo e il secondo dosaggio di cortisolo, ma analizzando la concordanza in termini di classificazione (positivo/negativo per ipercortisolismo) dei risultati dei due test effettuati nel gruppo di pazienti con sindrome di Cushing è emerso che il 71,5%dei dati accoppiati è concordante (sebbene in 2 casi entrambe le valutazioni risultassero falsamente negative).Nel gruppo di controllo il 92,5% dei dati ripetuti è risultato concordante, nel gruppo di incidentaloma l'87,3%.Una delle peculiari alterazioni biochimiche a cui vanno incontro i pazienti con sindrome di Cushing è la perdita del ritmo circadiano di secrezione di ACTH e cortisolo e, in particolare, del fisiologico calo notturno. Questo fenomeno è stato utilizzato per la diagnosi precoce della sindrome di Cushing attraverso diversi approcci, come, ad esempio, la determinazione del cortisolo sierico a mezzanotte.Questo metodo si è dimostrato molto efficace per la diagnosi della sindrome di Cushing, con una sensibilità elevata e una buona specificità, ma comporta notevoli disagi al paziente e costi piuttosto elevati per la necessità di eseguire il prelievo in regime di ricovero. risultati simili si ottengono sia con il prelievo diretto, sia con il prelievo tramite tampone.Il dosaggio del cortisolo salivare alle ore 24 si è dimostrato un test accurato per la diagnosi della sindrome di Cushing, come già dimostrato in altri studi precedenti (122,123,124) che hanno proposto cut-off diversi con valori che variano da 0,13 a 0,55 μg/ dL, dipendenti soprattutto dalle metodiche di dosaggio utilizzate negli studi (43,70).In particolare dalla nostra casistica risulta che il dosaggi del cortisolo salivare è utile nel differenziare i soggetti affetti da sindrome di Cushing da soggetti sani, ma anche da soggetti che presentano delle alterazioni di minore entità della secrezione dell'ormone, non legate alla presenza di un franco ipercortisolismo, come accade nei pazienti con incidentaloma surrenalico.Il fatto di considerare come gruppo di controllo pazienti valutati per sospetta sindrome di Cushing, non soggetti sani, rappresenta un punto di forza dello studio, perché il valore soglia ottenuto, nella nostra esperienza, di 4,5 μg/L è direttamente applicabile nella pratica clinica.Calcolando la sensibilità e la specificità della metodica con i dati a nostra disposizione è emerso che, con un valore soglia di 4,5 μg/L, si ottiene  Fattori tecnici e la presenza di anomalie del drenaggio venoso possono rendere conto di risultati falsi negativi in pazienti con sindrome di Cushing ipofisaria. E' stato proposto di dosare la prolattina come indice di corretto incanulamento dei seni (121).Risultati falsamente positivi e negativi sono emersi negli ultimi studi in parte dovuti a presenza di forme di ipercortisolismo intermittente, in parte alla presenza di tumori ectopici che secernono sia ACTH che CRH, è utile quindi effettuare prima dell'esame dei dosaggi ormonali per confermare la presenza di ipercortisolismo poiché i risultati del cateterismo non sono affidabili se l'esame viene effettuato in condizioni di ipercortisolismo attivo (94)Il BIPSS rappresenta, al momento, la metodica più accurata per la diagnosi differenziale della sindrome di Cushing ACTH-dipendente, anche se sono in corso di studio altre tecniche di cateterismo, ad esempio della giugulare interna (JVS) (95). Questa tecnica si è dimostrata avere una sensibilità minore (81,3%) rispetto al prelievo dai seni petrosi, utilizzando un gradiente di concentrazione uguale, mentre riducendo i gradienti a 1,6 in condizioni basali 2,5 dopo stimolo la sensibilità è aumentata all'87%.L'impiego del BIPSS per identificare il lato nel quale sia presente l'adenoma è controverso, e non è chiaro quale sia la sua accuratezza diagnostica a tale scopo, da diversi studi infatti emergono risultati contrastanti dall'83% al 65% (44,84,94).Ci sono diversi fattori che possono influire sulla corretta identificazione del sito della lesione tramite questa metodica come la possibile asimmetria di drenaggio venoso. Si possono trovare infatti delle varianti anatomiche responsabili dei risultati ingannevoli, considerando infatti soggetti con un drenaggio venoso simmetrico, i risultati per la corretta identificazione del sito della lesione sono buoni (86%) sia utilizzando il prelievo dai seni petrosi, sia utilizzando quello dai seni cavernosi (93).Molti dei risultati falsi negativi sono dovuti a ipoplasia dei seni petrosi omolaterali alla lesione neoplastica, oppure a drenaggi venosi anomali che creano anastomosi con altri distretti, diluendo in questo modo il sangue proveniente dall'ipofisi con valori di ACTH registrati inferiori all'atteso. I risultati migliori in termini di accuratezza nell'identificazione della lesione neoplastica si ottengono con tumori localizzati nella periferia della ghiandola (90%) mentre per forme localizzate centralmente i risultati sono peggiori (75%).Anche la posizione dell'adenoma rispetto a quella di inserzione del catetere può falsare i risultati, se il microadenoma è posteriore e il prelievo viene effettuato nella porzione anteriore del seno cavernoso il gradiente dell'ACTH può risultare falsamente negativo. Infine ci sono dati discordanti anche per quanto riguarda i vantaggi dell'utilizzo del CRH per aumentare l'accuratezza diagnostica nell'individuazione del sito della lesione, in alcuni studi emerge che con lo stimolo ormonale si hanno migliori risultati, in altri invece sembra che questo non influisca (94).Valutando i risultati ottenuti nella nostra casistica 8 pazienti su 11 presentavano un gradiente di ACTH sia basale, sia dopo picco, maggiore del cut off fissato per fare diagnosi di malattia di Cushing ipofisaria.E' stato visto come correggendo il gradiente centro periferia su picco di ACTH dopo CRH con quello di PRL basale (proposto da Findling) è possibile identificare i pazienti con malattia ipofisaria che risultano essere falsi negativi al BIPPS. E' stato preso come cut off un valore superiore a 0,8, indice di malattia di Cushing ipofisaria, mentre un gradiente inferiore a 0,6 è stato preso come riferimento per la diagnosi di secrezione ectopica.94 Dei tre pazienti classificati come ectopici nella nostra casistica, uno non è stato confermato dal calcolo di questo gradiente presentando un valore di 0,87. Si trattava effettivamente di un paziente con diagnosi non istologicamente confermata.I risultati preliminari della nostra esperienza suggeriscono come il concomitante dosaggio di prolattina insieme all'ACTH possa fornire utili informazioni sull'adeguatezza dell'incannulamento e, quindi, possa aiutare nell'interpretare i risultati.95 CONCLUSIONI Lo scopo del lavoro oggetto della presente tesi è stato quello di valutare la performance diagnostica di alcuni test recentemente introdotti nell'approccio clinico a pazienti con sindrome di Cushing accertata o presunta.In prima battuta, è stata valutata l'accuratezza diagnostica del dosaggio del cortisolo salivare alle ore 24,00, operando un confronto con il dosaggio del cortisolo sierico alle ore 24,00, che rappresenta il metodo più efficace per confermare o escludere il sospetto clinico di ipercortisolismo (80).Dai risultati ottenuti con la nostra casistica possiamo affermare che è importante riuscire a fissare un cut off preciso per il dosaggio del cortisolo salivare alle ore 24, utilizzando una popolazione numerosa e rappresentativa, ma, valutati i risultati ottenuti, la riproducibilità della metodica e la facilità di esecuzione, correlata al minor costo, è verosimile che in futuro il cortisolo salivare sostituisca la determinazione del cortisolo sierico alle ore 24 nella diagnostica della sindrome di Cushing.In seconda istanza, è stato valutato il test combinato desametasone-CRH nel processo di diagnosi dell'ipercortisolismo. Infine è stato analizzato se il concomitante dosaggio di prolattina in corso di BIPSS possa aumentare l'accuratezza della procedura nella diagnosi differenziale delle forme ACTH-dipendenti di sindrome di Cushing.I risultati preliminari della nostra esperienza, seppur tenendo presente l'esiguo numero dei soggetti in studio, suggeriscono come il concomitante dosaggio di prolattina insieme all'ACTH possa fornire utili informazioni sull'adeguatezza dell'incannulamento e, quindi, possa aiutare nell'interpretare i risultati ottenuti attraverso questa procedura diagnostica.