Nel Cinquecento vi lavorarono chirurghi come Martino Longhi il vecchio e Bartolomeo Eustachi, autore delle Tabulae anatomicae e in onore del quale fu intitolata la Tromba di Eustachio, che lavorò a lungo nell'ospedale della Consolazione in quanto esso "abbonda di cadaveri di giovani con membra fresche ed intere, non sfatte da malattie": infatti vi praticava anche autopsie e dissezioni. Eustachi ricordò l'ospedale nel suo testamento per il lascito del ricavato della vendita di vasi d'argento ed altre suppellettili, da dividere insieme all'ospedale di San Giovanni in Laterano.