A fondamento dell'ordine Ospitaliero è la Regola che consta di ben 105 brevi capitoli, molti dei quali riprendono per lunghi tratti doveri di altri ordini religiosi sorti precedentemente. Della Regola del Santo Spirito esistono due esemplari di epoca posteriore: uno si trova nell'Archivio di Stato in Roma e l'altro nell'archivio dell'ospedale di Digione, ambedue risalenti al XV secolo. Questa Regola ha la grande efficacia di calarci nell'ambiente ospitaliero, pervaso da disciplina e altruismo, e chiarisce in maniera esaustiva com'era scandita la vita quotidiana nell'ospedale. In particolare, è importante sottolineare come la maggior parte dei capitoli siano incentrati a rendere più confortevole e sana la permanenza degli infermi nella Struttura. Così il Cap. 1 afferma che ogni bene è comune e che "Nessuno ardisca dire che una cosa è sua", oppure nel Cap.15 "Norma costante sia lo spirito di carità", o infine nel Cap. 33 dove si trovano norme scrupolose riguardo alla necessità di provvedere agli indumenti ed alla nutrizione degli orfani.