Originariamente per la PCR veniva usata la DNA polimerasi di E. coli , tuttavia questo enzima è sensibile al calore e viene distrutto alle temperature richieste per separare il DNA a doppia elica. Per tale motivo, a ogni ciclo si doveva aggiungere manualmente enzima fresco. Un importante avanzamento tecnico derivò dalla scoperta che i batteri che vivono nelle falde idriche molto calde possiedono una DNA polimerasi attiva anche ad alte temperature. Il batterio Thermos aquaticus vive in acqua alla temperatura di 75°C; la sua DNA polimerasi (Taq polimerasi) è tale da poter essere aggiunta una sola volta all'inizio della reazione, rimanendo attiva per una serie completa di cicli di amplificazione. L'introduzione di questo enzima ha permesso l'automazione della PCR mediante l'impiego di apparecchi termostatici ciclici, costituiti da blocchetti metallici che si riscaldano in modo programmabile al fine di effettuare i cicli alle temperature e per i tempi desiderati. La Taq polimerasi aumenta anche la sensibilità e la specificità della PCR. Alla temperatura più bassa necessaria per la DNA polimerasi di E. coli, i primer possono appaiarsi con il DNA in siti in cui le sequenze possono essere leggermente diverse rispetto alla sequenza bersaglio. Qualora questi appaiamenti sbagliati (mismatch) dei primer si trovino sui filamenti opposti del DNA in posizioni molto vicine, è possibile che si attui un'amplificazione aspecifica e, poiché nel frammento sintetizzato vengono incorporate le sequenze complementari corrette dei primer, il risultato è la produzione di una sequenza diversa da quella voluta, ma le cui estremità corrispondono esattamente ai primer. Tale frammento non corretto sintetizzato nei primi cicli della PCR può essere pertanto amplificato in modo efficiente nei cicli successivi. Al contrario, alle temperature più alte impiegate con la Taq polimerasi, l'appaiamento dei primer oligonucleotidici in siti diversi da quelli desiderati risulta significativamente ridotto e non si verifica alcuna amplificazione di sequenze diverse da quelle bersaglio. La specificità può essere ulteriormente aumentata con il metodo della "partenza a caldo" (hot start), che prevede che tutti i reagenti eccetto uno, generalmente la Taq polimerasi, vengano riscaldati a 72°C prima dell'aggiunta dell'ultimo reagente. In tal modo si eviterà che la sintesi di DNA abbia inizio a temperature inferiori, alle quali potrebbe essersi verificato un appaiamento aspecifico dei primer, che produrrebbe segmenti amplificati non corretti. Questo aumento di specificità semplifica l'analisi dei prodotti della PCR; il frammento bersaglio amplificato può essere individuato facilmente in un gel colorato con bromuro di etidio, dal momento che viene eliminata la colorazione di fondo dovuta a sequenze che non costituiscono il bersaglio.Come tutti gli altri processi biochimici, la duplicazione del DNA non è esente da errori ed occasionalmente la DNA polimerasi incorporerà nella sequenza in allungamento un nucleotide errato. In natura, la quota di errori di incorporazione misurata in una molecola di DNA in duplicazione è circa di 1 su 10 9 nucleotidi. La cellula ha raggiunto un così alto grado di precisione in quanto un enzima rimuove dalla sequenza neosintetizzata i nucleotidi male appaiati. In vitro la Taq polimerasi non possiede questa capacità di "correttore di bozze" e, alle temperature e alle concentrazioni saline tipiche della PCR, l'enzima incorpora un nucleotide sbagliato ogni 2x10 4 nucleotidi. Questo problema può essere ridotto dando inizio alla PCR con un numero di molecole di stampo ampio; in tal caso il numero di cicli di amplificazione richiesto è minore, e minore è anche la sintesi totale di DNA che viene effettuata. Spesso il DNA per la PCR è DNA genomico totale estratto dalle cellule. Tuttavia, la PCR non richiede un DNA altamente purificato ed è possibile impiegare direttamente, senza alcuna purificazione, il DNA liberato dalle cellule in seguito a bollitura. La PCR può essere usata anche per studiare il profilo di espressione genica: l'mRNA viene convertito in cDNA impiegando la trascrittasi inversa e il cDNA può quindi servire da stampo per la PCR. Non è necessario isolare le sequenze di DNA prima dell'amplificazione mediante PCR, dal momento che la specificità di sequenza viene determinata dai primer oligonucleotidici.Come qualunque DNA, anche quello a doppia elica prodotto dalla PCR può essere sequenziato; tuttavia, per la sequenziazione mediante il metodo di Sanger, che impiega didesossinucleotidi come terminatori di catena, lo stampo più idoneo è costituito da DNA a singola elica. E'stata pertanto ideata una tecnica denominata PCR asimmetrica, che permette di produrre DNA monofilamento: questa consiste nell'effettuare una normale PCR, ad eccezione del fatto che le concentrazioni dei due primer differiscono fra loro di un fattore 100. I frammenti di DNA a doppia elica vengono prodotti solo finchè non si esaurisce il primer che è presente in quantità limitante. Il primer rimanente continua ad appaiarsi con il DNA di stampo e ad innescare la nuova sintesi, producendo uno solo dei due filamenti. Benché questo filamento venga prodotto secondo una cinetica lineare anziché esponenziale, viene prodotta una quantità di DNA a singola elica sufficiente per il sequenziamento.La reazione standard della PCR può essere modificata per permettere l'incorporazione di nucleotidi marcati. Solitamente si usano due metodi, di cui il primo è rappresentato dalla "marcatura del DNA mediante PCR standard": la PCR tradizionale viene cambiata per includere i precursori di uno o più nucleotidi marcati, che vengono incorporati nel prodotto della reazione per tutta la sua lunghezza. La seconda tecnica è la marcatura dell'estremità 5' mediante primer: con il procedere dei cicli il primer con la marcatura in 5' viene incorporato nel prodotto della PCR 361,362 .