La quarta e ultima reazione è catalizzata dalla β-chetotiolasi (chiamata anche acil-CoA acetiltransferasi), che lisa i primi due atomi di carbonio con l'aggiunta di una CoASH sul carbonio in posizione β, liberando così un Acetil-CoA. l'Acil-CoA ottenuto avrà un numero di carboni minore di due rispetto all'Acil-CoA di partenza.