1µg di RNA ottenuto da pazienti affetti da CML e ALL e da volontari sani è stato retrotrascritto per la produzione di cDNA utilizzando il ThermalCycler 2400 e il kit di retrotrascrizione Perkin Elmer (Shelton, CT).L'analisi quantitativa del cDNA è stata eseguita mediante l'utilizzo dello strumento iCycler (Bio-Rad Life Science, Hercules, CA, USA), utilizzando la TaqMan Universal PCR Master Mix (premiscela di tutti i componenti eccetto la sonda della sequenza bersaglio), (Applera, Milano).I prodotti amplificati sono direttamente proporzionali all'incremento della fluorescenza: infatti, con il susseguirsi dei cicli di PCR, la fluorescenza aumenta e i valori rilevati nel tempo formano una curva che all'inizio avrà un andamento di crescita esponenziale, poi raggiungerà un plateau.Il punto in cui si ha l'inizio dell'incremento esponenziale, ovvero il primo ciclo in cui si sviluppa una fluorescenza significativa in grado di essere captata dallo strumento, viene definito come ciclo soglia (Ct), e sarà quello che, essendo nella parte di linearità della curva, verrà preso in considerazione per tutti i campioni da analizzare e sarà tanto più precoce quanto maggiore sarà la quantità di trascritto espresso.I livelli di espressione del CD25 nei diversi pazienti sono stati determinati mediante un'analisi quantitativa relativa, utilizzando gli assay on demand opportuni (IL2RA Hs00907777_m1, Thermofisher scientific e GUSB • sparaffinatura• smascheramento antigenico in tampone EDTA pH 9• incubazione con anticorpo primario• lavaggi ripetuti• incubazione con anticorpo secondario specie-specifico• amplificazione del segnale (cromogeno diaminobenzidina)• Lavaggi• controcolorazione (ematossilina)• Disidratazione• Montaggio È stato utilizzato come controllo negativo una biopsia midollare di un paziente sano e come controllo interno è stata valutata la positività dell'endotelio dei vasi.Per l'analisi della quantificazione abbiamo usato il software IHC Profiler, plugin del programma ImageJ.