In un contesto anamnestico ed obiettivo compatibile (segno di Nikolsky I e II positivi), l'unico esame in grado di dimostrare il pemfigo è la biopsia: l'esame istologico rivela tipicamente una bolla intraepiteliale acantolitica (per perdita delle giunzioni intercellulari) soprabasale nel pemfigo volgare, con scarso infiltrato infiammatorio. L'immunofluorescenza mostra depositi di IgG e C3 intercellulari a formare un reticolo. Recentemente introdotti nella diagnostica i kit ELISA per il dosaggio degli anticorpi anti-desmogleina 1 e 3.