L'amitriptilina agisce principalmente come un inibitore del reuptake della serotonina e della norepinefrina, con forti effetti sul trasportatore della serotonina, ed effetti moderati sul trasportatore della norepinefrina. Ha un effetto trascurabile sul trasportatore della dopamina e dunque non agisce sul "reuptake" della dopamina, dal momento che è circa 1.000 volte più debole sul reuptake della dopamina rispetto a quello della serotonina.