L'avvenuta reazione di amplificazione è stata verificata mediante analisi HRM (High Resolution Melt), che consiste in una denaturazione del DNA aumentando la temperatura in maniera controllata, da 50°C a 95˚C. Gli amplimeri analizzati ad una precisa temperatura di Melting, dipendente dalla loro sequenza e composizione in basi, passeranno dalla conformazione a doppia elica (dsDNA) a quella a singola elica (ssDNA).Tale processo è monitorato in tempo reale grazie all'utilizzo di molecole fluorescenti intercalanti (SYBR® Green 1, SYTO®9, EvaGreen™, LC Green®, and LC Green® Plus) che, interagendo con DNA a doppio filamento, emettono fluorescenza se eccitate ad una lunghezza d'onda. Il processo di denaturazione porta all'apertura della doppia elica, e al rilascio della molecole intercalante, con conseguente diminuzione del segnale di fluorescenza, che decade quando tutte le molecole di DNA sono in forma di singola elica (95°C). Tale applicazione è possibile anche grazie alla presenza di strumenti in grado di misurare in tempo reale le variazioni di fluorescenza in rapporto all'aumentare della temperatura. Questo rapporto viene visualizzato sottoforma di un grafico, curva diMelting o profilo di dissociazione, che mostra il livello di fluorescenza vs la temperatura.Nel presente lavoro è stato utilizzato l'intercalante EvaGreen™20X (Biotage, Uppsala, Svezia), aggiunto alla reazione di PCR ad una concentrazione di 1X. Il profilo di denaturazione (da 60°C a 90°C) è stato effettuato subito dopo la reazione di amplificazione, con incremento di 1°C ogni 5 secondi con rispettiva rilevazione del segnale di fluorescenza. Le specifiche temperature di denaturazione dei diversi amplimeri sono riportate in Tabella 4 (sopra).