La novobiocina agisce sulla subunità B della DNA-girasi, enzima che permette la replicazione del DNA, risolvendone i superavvolgimenti causati dallo srotolamento dei filamenti della doppia elica aperta per la duplicazione. L'azione è simile a quella degli antibiotici chinolonici, che però sono attivi sulla subunità A. L'uso combinato di questi due antibiotici ne potenzia l'effetto e non presenta resistenza crociata. L'antibiotico è attivo su batteri gram- e gram+ soprattutto sugli stafilococchi. La resistenza si sviluppa velocemente sia in vitro sia in vivo.