In questo studio sono stati analizzati tutti i pazienti con leucemia mieloide cronica in fase cronica trattati presso i centri di Medicina Interna II ad indirizzo Ematologico dell'Ospedale San Luigi Gonzaga di Orbassano (102 soggetti) e dell'Ematologia I e II dell'Ospedale San Giovanni Battista di Torino (170 casi).La diagnosi di LMC era stata confermata in tutti i pazienti dall'esame citogenetico e/o dalla FISH e dalla ricerca in PCR del trascritto BCR-ABL. I pazienti erano stati monitorati con un emocromo ogni 10-15 giorni nei primi mesi dopo la diagnosi e in seguito circa ogni 3 mesi. L'esame citogenetico è stato eseguito con tecnica di bandeggio standard in tutti i pazienti a 6 e a 12 mesi dall'inizio della terapia e in quelli con diagnosi più recente anche a 3 mesi. L'esame molecolare del trascritto BCR-ABL con PCR quantitativa "real time" (q-RT-PCR) e con PCR qualitativa "nested" è stato effettuato ogni 1,5-3 mesi circa fino all'ottenimento della remissione molecolare maggiore e in seguito ogni 3 o 6 mesi, in accordo con le più recenti linee guida; nei pazienti con diagnosi meno recente è stata utilizzata invece solo la "nested" PCR (qualitativa) fino al 1996.È stata analizzata retrospettivamente la casistica di pazienti che hanno effettuato almeno un tentativo di discontinuazione del trattamento con Imatinib, sia provenienti dal centro dell'Ematologia di Torino, cui affluiscono 170 soggetti con diagnosi di LMC effettuata precedentemente al mese di Maggio 2011, sia provenienti dal centro di Orbassano, con 102 pazienti in trattamento dal 2000 in avanti. I pazienti che risultavano off-therapy al momento della chiusura del periodo di osservazione erano in totale 28, di cui 4 afferenti al centro di Orbassano e 24 a quello di Torino.Tali pazienti sono stati monitorati con RQ-PCR dopo la discontinuazione ogni 1,5-2 mesi durante il primo anno e ogni 3 mesi a partire dal secondo anno off-therapy. In caso di riscontro di perdita della remissione molecolare maggiore (MMR) in un singolo test o della perdita della MR 4 in due test consecutivi la terapia con Imatinib è stata ripresa immediatamente.Per quanto riguarda i pazienti seguiti presso il centro di Orbassano, sono stati poi selezionati fra i pazienti con diagnosi di LMC effettuata fra l'anno 1995 e l'anno 2011 quelli attualmente in terapia con TKI ma potenzialmente suscettibili di discontinuazione del trattamento, ponendo come criteri una malattia residua non detettabile con una sensibilità di almeno 4 logaritmi (MR 4 ), oppure un trascritto detettabile inferiore allo 0.0032% (MR 4.5 ), per almeno due anni (definiti come pazienti in CMR in questo studio).L'osservazione è stata chiusa nel Maggio 2014, con un periodo di osservazione minimo di due anni.La malattia minima residua è stata anche confermata su 20 campioni ottenuti da 14 diversi pazienti appartenenti a tale sottogruppo di soggetti potenzialmente "discontinuabili" utilizzando la nuova tecnica di Replicate PCR (rQ-PCR) messa a punto presso il Laboratorio dell'Ospedale San Luigi.La rQ-PCR è in grado di analizzare 8200 ng di RNA per ogni prelievo, suddivisi in 82 replicati per BCR-ABL e 2 replicati di controllo per ABL, impiegando 100 ng di templato per ogni reazione, dove ogni reazione corrisponde ad un pozzetto. Il quantitativo di materiale analizzato con questa metodica è dunque decisamente superiore a quello dell'analisi molecolare standard, e consente perciò un aumento della sensibilità, pari ad una remissione molecolare di livello MR 5.5 -MR 6 , di approssimativamente 2 logaritmi maggiore rispetto alla RT-PCR convenzionale.L'RNA dei 14 pazienti (6 maschi e 8 femmine) è stato estratto dal sangue periferico e analizzato con tecniche classiche di biologia molecolare, di RT-Q-PCR e con il sistema della metodica quantitativa modificata della rQ-PCR. I campioni di sangue periferico proveniente dai pazienti sono stati prelevati in anticoagulante EDTA in una quantità di circa 40 ml totali, per la necessità di disporre di più materiale dovendo effettuare più repliche della reazione.Seguendo le procedure e i protocolli d'estrazione standardizzati, è stato ottenuto l'RNA di ogni campione; sono poi stati retrotrascritti, seguendo il protocollo standardizzato a livello europeo, almeno 9µg di RNA totale per ottenere una quantità sufficiente di cDNA per l'indagine quantitativa "modificata" rispetto alle procedure standardizzate utilizzate in diagnostica routinaria e precedentemente descritte.La RealTime PCR dei cDNA è stata condotta utilizzando delle "TAMRA probe oligos, in custom plates", piastre da 96 pozzetti preparate su ordinazione e fornite dall'Applied Biosystem -(Life Technologies).Le "custom plates" sono state disegnate in modo da avere (figura 21):  82 pozzetti per l'analisi di BCR-ABL del campione in esame  2 pozzetti per l'analisi di ABL del campione in esame  2 pozzetti per il NTC "No Template Control" BCR-ABL  2 pozzetti per il NTC "No Template Control" ABL  4 pozzetti per l'analisi BCR-ABL del plasmide unico (Elitech Group)  4 pozzetti per l'analisi ABL del plasmide unico (Elitech Group)