Le cellule sono state ottenute dal midollo osseo di topi GFP adulti (età media al momento del prelievo: 7-9 settimane), sacrificati per dislocazione cervicale. Dopo disinfezione della cute e dissezione di femori e tibie dai muscoli e dal tessuto connettivo circostanti, le cellule del midollo osseo sono state prelevate con un ago da 22 Gauge e centrifugate due volte a 1000 rpm per 5 minuti in una soluzione di 2 mM di Lglutamina, 100 U/ml di penicillina e 100 U/ml di streptomicina in terreno di coltura Eagle's α-MEM (minimum essential medium).Le cellule sono state piastrate alla concentrazione di 7 x 10 5 cellule/cm 2 , su piastre di polistirene da 19,5 cm 2 pretrattate con FBS (siero fetale bovino) e incubate in α-MEM con l'aggiunta del 10% di siero fetale bovino a 37° C in un'atmosfera umidificata (95% aria, 5% CO 2 ).La formazione di un monostrato contenente cellule mesenchimali (dalle proprietà adesive) è stata osservata dopo un tempo medio di tre giorni. Il terreno è stato cambiato 4 giorni dopo l'isolamento, e successivamente ogni due-tre giorni, per rimuovere le cellule non aderenti.A dieci giorni dal prelievo, le cellule aderenti sono state recuperate mediante trattamento con tripsina e immunodeplete dalle cellule della linea granulocitaria tramite magnetic cell sorting: le cellule sono state incubate con MicroBeads coniugate con un anticorpo monoclonale di ratto anti-mouse/human CD11b e caricate in una colonna MACS, che ha trattenuto le cellule CD11b-positive. Le cellule CD11b-negative sono state raccolte, lavate e nuovamente piastrate.Prima che la coltura giungesse a confluenza, il monostrato cellulare è stato lavato con α-MEM e incubato con tripsina a 37° C per 5 minuti. La tripsina è stata neutralizzata aggiungendo nuovo terreno di coltura. Ad ogni passaggio la sospensione cellulare è stata diluita 1:2.Immediatamente prima del trapianto, le cellule sono state incubate con tripsina, staccate dalla piastra, contate tramite colorazione con Trypan Blue in camera di Bürker e sospese in soluzione fisiologica (NaCl 0,09%, pH 7,2) sterile, in modo da ottenere una concentrazione finale di 5 x 10 4 cellule/µl.