Lo studio mira a generare un metodo per l'identificazione in fase preclinica dei predittori di risposta a un farmaco a bersaglio molecolare che possa valere in generale, ovvero essere applicato anche ad altre patologie (le metastasi epatiche sono state prese come modello) e ad altri agenti targeted.Per quanto riguarda i farmaci, abbiamo focalizzato l'attenzione di questo studio su due composti che possono essere impiegati nell'ambito delle secondarietà epatiche da tumore del colon retto: il Cetuximab, anticorpo monoclonale antagonista di EGFR, già in uso in clinica come terapia singola o in combinazione Realizziamo il trattamento dopo aver suddiviso la popolazione di animali in quattro gruppi omogenei per quantità, per testare l'efficacia del Cetuximab, dell'inibitore di c-Met, della combinazione di entrambi i farmaci e per avere un gruppo di controllo. Nella pratica i 24 topi della generazione p2 vengono separati a formare 4 gruppi di 6 topi ciascuno. Trattiamo un gruppo con il Cetuximab, un altro con il farmaco anti-Met, un altro ancora con il Cetuximab e l'inibitore di c-Met in associazione e l'ultimo non lo sottoponiamo ad alcuna terapia (FIG. 19).In una prima fase, effettuiamo il trattamento sulla popolazione p2 subito dopo l'impianto, per valutare la massima sensibilità al farmaco. Se il tumore non risponde, scartiamo il topo e consideriamo il caso un fallimento terapeutico, per cui l'animale non riceve più il farmaco. Se la neoplasia risponde, invece, eseguiamo la seconda fase del trattamento, ovvero consideriamo il gruppo dei controlli e iniziamo a trattarli.Ci attendiamo tre tipi di risposta dopo la somministrazione del farmaco: una progressione della crescita tumorale, indice di mancata responsività all'agente targeted, per cui i risultati positivi ottenuti in precedenza nel gruppo trattato non sono da considerare validi, quanto da attribuire a fattori casuali; una stabilizzazione della crescita tumorale (dal trattamento il volume della lesione non diminuisce, né aumenta, ma rimane costante); una riduzione della crescita tumorale (FIG. 20). Consideriamo sia la stabilizzazione che la riduzione della massa neoplastica come risposte al farmaco e come prova del successo della terapia nel gruppo primariamente trattato. Solo in caso di risposta terapeutica, espandiamo i tumori che non sono stati trattati, ottenendo così la generazione p3.Suddividiamo i topi appartenenti a questa popolazione in due gruppi, quello di controllo e quello trattato; sottoponiamo una parte dei topi randomizzati per la terapia a trattamento cronico, per confermare il successo terapeutico dimostrato in precedenza. Trattiamo, invece, gli altri per breve tempo, in acuto, per poter eseguire analisi biochimiche e trascrizionali al fine di ricavare i marker dinamici, ovvero quelli presenti in corso di risposta terapeutica. Il lavoro adotta come modello le metastasi epatiche da neoplasia colorettale, sia per l'elevata frequenza della patologia (interessa infatti la metà o più dei pazienti con tumore del colon retto), che ci permette quindi di avere a disposizione una notevole quantità di materiale e di ridurre i tempi della sperimentazione, sia per l'esiguo numero di pazienti a cui ad oggi è possibile offrire trattamenti curativi, per cui la creazione di nuovi regimi terapeutici in questo ambito sarebbe estremamente rilevante.La selezione dei pazienti ha condotto alla raccolta di un buon numero di casi (48 in meno di un anno), che risultano eterogenei per variabili quali sesso, età, caratteristiche delle metastasi, trattamenti chemioterapici eseguiti; la coorte si può quindi considerare ben rappresentativa della popolazione generale.Per migliorare il tasso di attecchimento delle metastasi negli animali (dalla letteratura valori riportati del 15-30%) ottimizziamo sia la fase di raccolta e trasporto del materiale che la procedura di impianto; mantenimento in ghiaccio, ambiente sterile, impiego di antibiotici e rapidi trasferimenti sono i punti chiave per conservare il pezzo tumorale meno alterato possibile fino all'impianto nei topi. Preferiamo impiegare l'impianto sottocute rispetto a quello ortotopico, per la semplicità della tecnica, le minori complicanze operatorie, la possibilità di monitoraggio della crescita tumorale e l'assenza di manipolazione del tessuto tumorale, necessaria, invece, con l'altra modalità di trapianto. Per favorire ulteriormente l'attecchimento del tumore, prima di essere impiantati, i frammenti sono imbibiti nel Matrigel, una soluzione a base di estratto di matrice basale, ricca di fattori che stimolano l'angiogenesi. Le misure adottate determinano un ottimo tasso di attecchimento, pari al 90%, e ad una mortalità operatoria prossima allo 0%.Per quanto riguarda il trattamento, la coorte è suddivisa in quattro gruppi, dei quali uno costituisce quello di controllo -per cui non viene trattato-e gli altri tre quelli su cui testiamo l'inibitore di c-Met, il Cetuximab e la combinazione dei due farmaci.Dal primo impianto fino alla verifica dell'efficacia del trattamento, archiviamo parte del materiale tumorale, in azoto liquido alcuni frammenti, in RNAlater altri.  