I test che si avvalgono della reazione a catena della polimerasi (PCR) per la diagnosi della malattia di Lyme possono essere disponibili ai pazienti in alcuni paesi. I test basati sulla PCR cercano di rilevare il materiale genetico (DNA) delle spirochete della malattia di Lyme, mentre i test Western blot ed ELISA cercano la risposta dell'organismo, sotto forma di anticorpi contro il batterio. I test con la PCR sono raramente suscettibili agli errori di falso positivo ma spesso mostrano risultati falsamente negativi. L'affidabilità clinica di massa della PCR è ancora messa in dubbio. Il basso numero di spirochete nei campioni di tessuto nell'organismo e nei fluidi biologici è una delle ragioni per le quali è difficile dimostrare l'infezione attiva da Borrelia burgdorferi tramite la PCR, specialmente nello stadio tardivo della malattia.