L'evoluzione della bioinformatica e la miniaturizzazione dei processi di fabbricazione hanno permesso di creare piattaforme in miniatura, i microarray, che permettono di quantificare l'espressione di decine di migliaia di geni contemporaneamente (analisi dell'espressione genica) o di analizzare l'intero genoma di un campione di tessuto rivelandone le anomalie. Questo secondo tipo d'approccio è stato utilizzato per analizzare il caso particolare descritto nella sezione 3.1.4. I microarray (o chip a DNA) sono delle micromatrici di sonde di DNA depositate su un supporto di vetro. A ciascuna macchia (spot) corrisponde una sonda di DNA, costituita da migliaia di copie di sessantameri (cioè tratti di DNA composti da 60 nucleotidi). Le sequenze di DNA all'interno di uno spot sono tutte uguali tra loro, mentre sono diverse tra uno spot e l'altro per poter esaminare tratti diversi del genoma. In totale, su ogni vetrino (microarray) ci sono circa 44.000 spot; circa 3-4.000 spot sono in realtà delle repliche distribuite in modo sparso su tutta la superficie del vetrino, a scopo di controllo della qualità (per es. verificare che tutto il vetrino sia stato ibridato in modo uniforme). La procedura tecnica qui utilizzata, basata sull'analisi comparativa dell'ibridazione del genoma del campione oggetto dello studio (campione sperimentale, DNA femminile) con quella un campione di riferimento commerciale (DNA maschile), prende il nome di Oligonucleotide array-based Comparative Genomic Hybridization (aCGH, Agilent Technologies, Inc. USA). In questo caso particolare non è stato necessario amplificare il DNA genomico (gDNA) estratto dal campione sperimentale, quindi si è utilizzato il metodo diretto, illustrato nella figura 13. La prima parte della procedura prevede gli stessi trattamenti sia per il campione sperimentale che per quello di riferimento, eseguiti in parallelo, per prepararli all'ibridazione. Dal tessuto in esame viene estratto il gDNA e sottoposto a controlli d'idoneità in termini di quantità, purezza (per mezzo di uno spettrofotometro Nano Drop ND-1000) e qualità (tramite elettroforesi su gel di agarosio). Successivamente sia il gDNA del campione sperimentale che quello del riferimento vengono sottoposti a digestione per mezzo di enzimi di restrizione: la maggior parte del gDNA così trattato non supera la lunghezza di 200-500 paia di basi. Il passo successivo è rappresentato dalla marcatura dei campioni con due nucleotidi fluorescenti diversi: la Cy3 (cianina 3-dUTP, rilevata dallo scanner come colore verde) per il riferimento commerciale e la Cy5 (cianina 5-dUTP, rilevata dallo scanner come colore rosso) per il campione sperimentale. Dopo purificazione su filtri, il gDNA viene sottoposto ad un controllo con spettrofotometro per verificare l'avvenuta marcatura. A questo punto, il gDNA del campione sperimentale marcato con un nucleotide fluorescente e il gDNA del riferimento commerciale marcato con l'altro nucleotide vengono co-ibridati sullo stesso vetrino (microarray), incubando per 40 ore a 65°C in rotazione per mezzo di un'apposita apparecchiatura. Ad ibridazione avvenuta, il microarray viene lavato per allontanare il buffer di ibridazione, tutto ciò che non si è legato oppure che si è legato in maniera aspecifica. Il passo successivo è rappresentato dalla scannerizzazione del microarray. I marcatori fluorescenti vengono eccitati da un raggio laser d'appropriata lunghezza d'onda, generando segnali le cui intensità sono proporzionali al numero di oligonucleotidi marcati ibridati con le sonde di DNA di ciascuno spot: tanti più oligonucleotidi sono presenti in uno spot, tanto più intenso sarà il segnale. Questi segnali vengono poi registrati da un sistema ottico a scansione (Agilent scanner) e trasformati in immagini. La successiva estrazione dell'immagine avviene tramite il programma Feature Extraction software v9.1. Questo programma associa a ciascuno spot un valore di fluorescenza, permettendo di paragonare i diversi spot tra di loro (fig. 14). Figura 14. Scansione del microarray: l'area ingrandita mostra le differenti intensità di segnale degli spot.La mediana dell'intensità dei pixel nell'area centrale viene usata per calcolare l'intensità dello spot, sia per il rosso che per il verde, mentre la corona esterna viene utilizzata per calcolare il segnale di fondo (background); la corona intermedia viene esclusa. Dal segnale dello spot viene sottratto il segnale di background (background subtracted signal), allo scopo di ripulire l'informazione. Il segnale viene quindi espresso come logaritmo in base 2 del rapporto tra i segnali misurati per i due marcatori fluorescenti (rosso/verde) per ciascuno spot. Pertanto, uno spot colorato di un rosso molto intenso, per esempio corrispondente a 3, significa che quel tratto di gDNA è amplificato (amplified) 8 volte rispetto al controllo, il valore 0 indica che non vi sono differenze tra i due campioni (colore nero), mentre il colore verde indica che quel tratto di gDNA è mancante (deleted). Dopo aver effettuato una serie di test di controllo della qualità dell'esperimento, si procede all'analisi dei dati vera e propria (vedi capitolo 4.2).