In seguito al trasferimento delle proteine su filtro di nitrocellulosa, si procede con la saturazione dei siti di legame aspecifici incubando il filtro in 4% latte, TBS 1X, sotto agitazione, a temperatura ambiente per 1 ora. Successivamente viene effettuata la reazione con gli anticorpi primari di interesse, diluiti in 5% latte e TBST 1X. La reazione viene lasciata in agitazione 2 ore a temperatura ambiente. Si fanno 3 lavaggi da 5 minuti in latte 4% e TBST 0,3% per togliere l'eccesso di anticorpo poi si procede con l'ibridazione, sotto agitazione, a temperatura ambiente per 1 ora con gli anticorpi secondari coniugati alla HRP e diluiti in latte 4% e TBST 0,3%. La scelta dell'anticorpo secondario dipende dall'animale che è stato mutagenizzato per la formazione dell'anticorpo primario.Anticorpi utilizzati: Terminata l'incubazione con l'anticorpo secondario si lava nuovamente il filtro 3 volte con TBST 0,3%, 3 volte con TBST 0,1% e 3 con TBS 1X quindi si procede alla detection. Per la rilevazione dell'anticorpo viene utilizzato il kit "Super signa West pico Kit" (Pierce). Si copre il filtro con una miscela costituita da "stable peroxide solution" e "Luminol enhancer" in rapporto 1:1 e si lascia avvenire la reazione di perossidazione per 5 minuti al buio. Quindi il filtro viene inserito in una cassetta per lo sviluppo ed esposto su lastra autoradiografica (Amersham) per un tempo variabile a seconda della forza del segnale; si procede, in ultimo, con lo sviluppo: