Nel corso del nostro studio abbiamo valutato il fold increase delle nostre colture sia nel corso della generazione mediante le due stimolazioni antigene dipendenti, sia nel corso della successiva espansione antigene indipendente.Durante le due stimolazioni antigene dipendenti il numero delle cellule non aumenta, anzi tende a diminuire come atteso considerando che solo alcuni cloni di linfociti CD8+ e CD4+ vengono stimolati dagli antigeni presentati dalle DC.In questa fase non si sono evidenziate differenze significative tra i CTL generati dai pazienti affetti da osteosarcoma verso le cellule primarie autologhe, i CTL generati dal paziente con sarcoma di Ewing verso le sue cellule primarie autologhe ed i CTL generati da PBMC di donatori sani verso le cellule SJSA (CTL Ctrl), come mostrato nella figura 4.14.  Nel corso di questo studio è stato raggiunto anche l'obiettivo di generare ed espandere CTL specifici a partire da PBMC di pazienti affetti da osteosarcoma e sarcoma di Ewing.I CTL ottenuti sono caratterizzati da un buon potere citotossico (circa 40% verso il bersaglio autologo) che è risultato anche specifico, infatti i CTL riconoscono maggiormente i bersagli specifici quali quelli autologi e le cellule delle linee commerciali rispetto ai PBMC allogenici come mostrato sia dai dati del test di citotossicità sia da quelli del rilascio della citochina infiammatoria INF-γ (Fig. 4.14 e 4.15).Per l'ottenimento di CTL specifici ad alto potenziale citotossico utilizzando come fonte di antigene la cellula primaria autologa è fondamentale disporre di DC in grado di stimolare in maniera efficace i linfociti CD3+/CD8+ naive 93 .La metodica da noi testata in questo studio ci permette di ottenere una buona maturazione delle DC in 7 giorni e di utilizzare queste cellule presentanti l'antigene sfruttando al massimo i loro due stadi maturativi. Allo stadio di iDC queste cellule sono caratterizzate da un alto potenziale fagocitico, per questo abbiamo scelto di coltivarle per 5 giorni in terreno addizionato di GM-CSF (citochina che funge da fattore di crescita delle cellule CD14+) e IL-4 (citochina che permette di maturare i CD14+ in senso dendritico). Al termine di questo periodo le iDC sono co-coltivate con la fonte di antigene.Sempre per sfruttare a pieno le caratteristiche fisiologiche delle DC, la fonte di antigene, le cellule primarie autologhe vengono irradiate prima della co-coltura. Questo processo conduce a due benefici sperimentali: in primis non permette la crescita in coltura delle cellule tumorali, non desiderabile soprattutto in previsione di un utilizzo clinico dei CTL generati, ed in secondo luogo rende maggiormente antigeniche le cellule primarie aumentando l'efficienza di fagocitosi da parte delle DC.La successiva maturazione delle iDC, che hanno inglobato la fonte antigenica, fino allo stadio di mDC, caratterizzato da un'elevata capacità di presentare gli antigeni inglobati in superficie attraverso le molecole MHC di classe I e di classe II, consente di ottenere in vitro un'efficace stimolazione dei linfociti naive.Obiettivo secondario di questo studio è stato quello di mettere a punto la metodica di espansione dei CTL generati in vitro. Il numero di CTL ottenuti è fondamentale in funzione dell'impiego futuro in protocolli di immunoterapia.Le condizioni di espansione utilizzate in questo studio si sono rivelate efficaci per l'ottenimento di un buon fold increase (Fig. 4.16 e 4.17).Un altro vantaggio dell'espandere i CTL in maniera antigene-indipendente utilizzando l'anti-CD3 e l'IL-2 è costituito dall'ottenimento della stimolazione a proliferare dei linfociti attivati in vitro dalle due precedenti stimolazioni antigene-dipendenti. Asaftei per l'entusiasmo con cui ha condiviso con me la sua esperienza, per gli insegnamenti che mi ha trasmesso e il tempo che mi ha dedicato nel corso di questi mesi.