Come altri chinoloni la balofloxacina agisce inibendo in modo selettivo sia la DNA–girasi (conosciuta anche come topoisomerasi II) che la topoisomerasi IV, enzimi fondamentali per i processi di duplicazione, trascrizione e riparazione dell'acido deossiribonucleico (DNA) della cellula batterica. Il blocco di questi due meccanismi enzimatici porta alla morte del batterio.