L’accertamento (diagnosi) della malattia richiede l’esecuzione della biopsia, esame che consiste nel prelevare un frammento di linfonodo, o il linfonodo intero, per poi esaminarlo al microscopio. Generalmente, la biopsia è effettuata in anestesia locale, pertanto non richiede il ricovero. Tuttavia, se i linfonodi da analizzare dovessero essere profondi, potrebbe essere eseguita in anestesia generale. La biopsia, qualora la malattia fosse presente, rivela la presenza di cellule di Reed-Sternberg (grosse cellule binucleate) in un infiltrato cellulare eterogeneo, costituito da istiociti (cellule presenti nel tessuto connettivo che esplicano una funzione fagocitaria nei confronti di diversi antigeni), linfociti, monociti, plasmacellule ed eosinofili. Inoltre, per valutare l’estensione della malattia, potrebbe essere necessario eseguire altri tipi di esami.