La comparsa nelle sedi descritte delle lesioni tipiche dell'herpes simplex è spesso sufficiente a porre diagnosi. In alcuni casi, dove può mancare la tipica eruzione vescicolo-ulcerativa (herpes neonatale o in soggetti immunodepressi) è tuttavia necessario escludere malattie sistemiche quali la rosolia, la toxoplasmosi o l'infezione da Citomegalovirus. In questi casi o nei casi dubbi, l'accertamento definitivo si attua con l'isolamento del virus (effetto citopatico tipico dopo isolamento in colture cellulari) nel materiale prelevato con tampone o biopsia.