Numerosi studi sono stati condotti per la valutazione della MMR utilizzando i tradizionali approcci di PCR quantitativa e semiquantitativa (end-point, competitive, limiting diluition). Tuttavia tali approcci hanno evidenziato limiti nell'applicabilità, dovuti all'elevata complessità e alla scarsa riproducibilità. L'introduzione della tecnologia TaqMan e lo sviluppo dei termoamplificatori analitici hanno permesso la realizzazione di un approccio più accurato e riproducibile per l'analisi quantitativa della MMR 189 . L'analisi quantitativa condotta con la Real Time PCR utilizza una coppia di amplimeri e una sonda cromogenica complementare alla porzione di DNA contenuta tra gli amplimeri. Durante l'amplificazione la sonda viene clivata dall'attività esonucleasica 5′→3′ della Taq. Dalla sonda viene così liberato un gruppo cromoforo che diventa fotometricamente attivo e pertanto misurabile dal lettore laser del termoamplificatore analitico. L'incremento della fluorescenza, proporzionale all'accumulo di prodotto amplificato, viene misurato diverse volte ogni ciclo; è possibile così ottenere una misurazione in tempo reale del numero di cicli richiesto da ogni singola reazione per entrare nella fase esponenziale (parametro denominato Ct [threshold cycle]: si tratta del ciclo soglia, ovvero del punto sulla curva in cui la quantità di fluorescenza comincia ad aumentare in maniera esponenziale, solitamente alcuni scarti quadratici medi sopra la linea di base).Per effettuare una quantificazione molecolare sui campioni da analizzare, vengono amplificati contemporaneamente alcuni campioni contenenti concentrazioni note di DNA bersaglio. Dai Ct di questi campioni il software del termoamplificatore analitico ricava la curva standard che permette di risalire al numero di copie di DNA bersaglio presenti nel campione in esame. La Real Time PCR è stata utilizzata con successo nella valutazione della MMR utilizzando come marcatori molecolari alcune traslocazioni cromosomiche, quali ad esempio la t (14;18), la t (9;22) e la t (8;21) e il riarrangiamento clonale delle IgH 190 . Questi approcci prevedevano l'uso di sonde derivate dalla regione CDR3, specifiche per ogni singolo paziente. L'elevato costo di sintesi delle sonde cromogeniche ha condotto allo sviluppo di una strategia alternativa basata sull'impiego di sonde di consenso, derivate dalle regioni conservate di "framework" (FR), associate ad amplimeri tumorespecifici derivati dalla CDR2 e dalla CDR3. Questo ha permesso di utilizzare la medesima sonda nei diversi pazienti in esame mantenendo la stessa efficacia ma riducendo notevolmente i costi 191 .