Il successo nell'utilizzo di farmaci a bersaglio molecolare in diversi tumori (si veda "Nuove terapie", pag. 35) e lo sviluppo di nuove mutazioni che rendono la cellula insensibile al trattamento intrapreso oppure dipendente da un nuovo oncogene ha fatto sì che si pensasse di utilizzare più farmaci contemporaneamente. Si potrebbero quindi associare molecole che agiscono con diverso meccanismo sullo stesso bersaglio, oppure colpire più proteine coinvolte nella stessa via di segnalazione o ancora proteine coinvolte in vie di segnalazione o processi cellulari diversi. Chiaramente, è anche plausibile associare un farmaco a bersaglio molecolare con un agente citotossico (si veda "Terapie combinate", pag. 37).Studi preclinici hanno evidenziato un effetto sinergico dell'inibizione contemporanea di VEGF, con un anticorpo anti-VEGF murino, e EGFR, con cetuximab, in modelli murini di cancro del colon-retto (Tonra et al., 2006), carcinomatosi peritoneale da cancro del colon (Shaheen et al., 2001), adenocarcinoma gastrico  e adenocarcinoma pancreatico (Tonra et al., 2006).Quindi sembrerebbe si possa ottenere un vantaggio clinico dal trattamento contemporaneo con inibitori di EGFR e di VEGF. Sebbene dai primi studi clinici sia emerso che l'associazione di inibitori di EGFR, bevacizumab e chemioterapici sia sicura ed efficace sia nel NSCLC (Herbst et al., 2005) sia nel carcinoma del colon metastatico (Saltz et al., 2007), studi più recenti e con una maggior numerosità campionaria asseriscono invece il contrario.Lo studio CAIRO2 condotto su 755 pazienti con carcinoma del colon ha evidenziato che l'associazione tra bevacizumab e cetuximab non solo non aumenta la sopravvivenza, ma riduce l'intervallo libero da progressione e la qualità di vita (Tol et al., 2009). Gli autori immaginano che l'interazione tra i due anticorpi ne possa ridurre l'efficacia. Questa ipotesi è corroborata dal fatto che nel gruppo trattato con chemioterapici citotossici (capecitabina + oxaliplatino), bevacizumab e cetuximab si è riscontrato un minor numero di casi di ipertensione rispetto al gruppo trattato con chemioterapici citotossici e bevacizumab. L'ipertensione, come il rash cutaneo nel caso del trattamento con gefitinib, correla con una maggiore sensibilità al trattamento (Scartozzi et al., 2009).Questi dati sono stati confermati dallo studio di fase III PACCE (Hecht et al., 2009), in cui il trattamento con FOLFOX o FOLFIRI e bevacizumab è confrontato con lo stesso trattamento più panitumumab (anticorpo monoclonale anti-EGFR), in 1053 pazienti con carcinoma del colonretto metastatico. Anche in questo caso, si è osservata una riduzione dell'intervallo libero da progressione e un aumento degli effetti collaterali (principalmente rash cutaneo, diarrea, disidratazione, ipomagnesiemia) nel ramo trattato con panitumumab. Gli autori ipotizzano anche in questo caso che la riduzione dell'efficacia sia conseguenza dell'interazione tra gli anticorpi e gli agenti citotossici. Un'ipotesi è che il blocco del ciclo cellulare indotto dal panitumumab possa ridurre l'azione degli agenti citotossici. Questo postulato non convince neanche gli stessi autori, visto che il panitumumab in combinazione con FOLFIRI o FOLFOX migliora la prognosi.Anche l'aumentata tossicità rappresenta un ostacolo e non è confinata all'uso di anticorpi monoclonali. Infatti, uno studio di fase II in cui 35 pazienti con carcinoma del colon-retto metastatico sono stati trattati con FOLFOX, bevacizumab e erlotinib non ha raggiunto l'obiettivo primario (valutare l'intervallo libero da progressione) perchè la severità degli effetti collaterali non ha permesso di concludere lo studio (Meyerhardt et al., 2007).L'associazione tra farmaci a bersaglio molecolare e chemioterapici citotossici deve essere valutata attentamente, dal punto di vista sia della sicurezza sia dell'efficacia del trattamento.Allo stato attuale, l'associazione di un singolo farmaco a bersaglio molecolare con cicli standard di farmaci citotossici sembra essere sicura ed efficace.50 µg di proteine sono stati fatti correre in elettroforesi su gel all'8% o al 10% di SDS-poliacrilamide (acrilamide/bisacrilamide 37:1, 0.39 M tris-HCl pH 8.8, 0.1% SDS, 0.03% APS, 0.04% TEMED) in condizioni riducenti. Il tampone di corsa utilizzato per la separazione elettroforetica è costituito da 62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 20% glicerolo. Le membrane sono state trasferite per Western blot verticale su membrane di nitrocellulosa (Hybond, Amersham).Il filtro di nitrocellulosa è stato sottoposto a saturazione mediante incubazione con una soluzione di BSA 10% in TBS, per 45' a 45°C. Gli anticorpi primari sono stati diluiti in una soluzione di BSA al 5% in TBS (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 140 mM NaCl), 0.1% NaN 3 , 0.1% Tween. I filtri sono stati incubati con l'anticorpo per 12 ore circa a 4°C. Dopo 5 lavaggi da 10' in TBS-Tween 0.1%, i filtri sono stati incubati con l'anticorpo secondario, diluito 1:2000 in TBS-Tween 0.1%, per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo 5 lavaggi da 10', la rivelazione delle proteine è stata effettuata tramite il sistema di chemoluminescenza ECL (Amersham).Gli anticorpi utilizzati sono: anti-Src totale monoclonale in topo (Cell Signaling), anti-vinculina monoclonale in topo Il Matrigel è una preparazione solubilizzata di membrana basale estratta da sarcoma murino contenente laminina, collagene IV, proteoglicani e fattori di crescita (Collaborative Research).Sono state depositate 1x10 5 cellule nella camera superiore del filtro in presenza di DMSO, 0.06µM, 0.125µM, 0.25µM, 0.5µM e 1µM di AZD0530. Dopo un'incubazione di 24 ore a 37°C, 5% CO 2 , le cellule non migrate sono state rimosse dal lato superiore del filtro e quelle passate sul lato inferiore sono state fissate con gluteraldeide all'11%, colorate con cristal violetto 0.1% in 20% metanolo e contate utilizzando un microscopio a contrasto di fase a ingrandimento 25x (DMIL, Leica) e analizzate con il programma MetaMorph 6.3 (Molecular Devices, USA).