Il sequenziamento è una procedura che ha come scopo quello di determinare l'esatta sequenza di nucleotidi del frammento di acido nucleico in esame.L'utilizzo di questa metodica nel presente studio è stata necessaria per analizzare i campioni che, all'analisi in DHPLC, presentavano picchi aggiuntivi di eluizione o un profilo diverso rispetto al "wild type". Il sequenziamento, determinando l'esatta sequenza di nucleotidi di ogni campione analizzato, consente di verificare la variazione nucleotidica responsabile del profilo di eluizione anomalo ottenuto al DHPLC.Sono state ideate diverse strategie per ottenere la sequenza nucleotidica del DNA. La prima fu un metodo chimico, ideato da Maxam e Gilbert nel 1965, seguito nel 1977 dal metodo di sequenziamento enzimatico di Sanger. Questa metodica viene anche definita "a terminazione di catena" o "metodo deidideossinucleotidi" e richiede la presenza del DNA da sequenziare sotto forma di stampo a singolo filamento. La DNA polimerasi, fornita dalla miscela di reazione, utilizza questo stampo per la sintesi di nuovi filamenti di DNA complementari; la reazione avviene utilizzando uno o più nucleotidi marcati ed un primer complementare a una regione del DNA adiacente al sito da analizzare. Oltre ai normali precursori nucleotidici (dNTPs), la sintesi del DNA avviene anche in presenza di dideossinucleotidi base-specifici (ddNTPs) che mancano di un gruppo ossidrile al carbonio in 2'e 3'. I ddNTPs vengono incorporati facilmente nella catena nascente di DNA ma ne impediscono l'ulteriore allungamento. Essi infatti sono in grado di formare un legame fosfodiesterico tra l'atomo di carbonio in 5' e quello in 3' del nucleotide precedentemente incorporato ma, essendo privi del gruppo ossidrilico in 3', non possono formare il legame fosfodiesterico con il nucleotide successivo e bloccano così la polimerizzazione della catena.Questo metodo richiede la suddivisione del campione, opportunamente denaturato, in quattro aliquote e si portano quindi avanti quattro reazioni diverse base-specifiche. In ognuna delle quattro aliquote c'è ovviamente un ddNTP diverso e di conseguenza in ognuna di esse la sintesi si arresta dopo una specifica base. Ognuna delle quattro miscele di reazione sarà composta, oltre che dal campione da sequenziare, anche dalla DNA polimerasi, primer, buffer e cloruro di magnesio, i quattro dNTPs e una piccola proporzione di uno dei quattro ddNTPs.Si producono così frammenti di DNA di lunghezza diversa poiché il nucleotide che blocca il processo, essendo anche in concentrazione minore rispetto al suo analogo dNTP, può essere internalizzato a qualsiasi livello del genoma.Ciascuna delle quattro reazioni base-specifiche genera una collezione di frammenti di lunghezze diverse, con l'estremità 5'comune, perché definita dal primer di sequenziamento, ed estremità 3' variabili. I frammenti ottenuti, diversi in lunghezza anche per un singolo nucleotide, sono separabili su un gel denaturante di poliacrilammide ad alta risoluzione. I metodi tradizionali di sequenziamento prevedevano l'utilizzo di nucleotidi marcati con radioisotopi ( 35 S o 33 P) e la visualizzazione delle bande tramite analisi autoradiografica (Figura 20).Figura 20: Rappresentazione schematica del metodo di sequenziamento di Sanger.