Nelle mutazioni di classe III, la proteina viene prodotta e assemblata, ma mostra una difettosa attivazione del CFTR, a causa della mancata idrolisi dell'ATP nei domini di legame 1 e 2 in proteine integre, ostacolando così l'attivazione del canale del cloro. Esempi di tale classe sono G178R, G551S, G1349D e G551D. Quest'ultima, relativamente comune, costituisce circa il 3% delle mutazioni FC.