La ciclofosfamide può essere assunta per via orale o per via parenterale. È un profarmaco inattivo fino alla conversione da parte di un'ossidasi epatica P450 dipendente in 4-idrossiciclofosfamide (metabolita attivo). Questo composto può essere ulteriormente trasformato in 4-chetociclofosfamide, principale metabolita inattivo. La 4-idrossiciclofosfamide è inoltre in equilibrio con un altro composto, ugualmente attivo, chiamato aldofosfamide, catabolizzata in carbossifosfamide (inattiva) attraverso l'aldeide ossidasi mitocondriale. L'aldofosfamide viene dunque trasportata dal torrente ematico nei tessuti sani e neoplastici dove, per scissione non enzimatica, si trasforma in acroleina e fosforamide mostarda, due agenti citotossici.