L'analisi di espressione genica è stata eseguita mediante Real-Time PCR, tecnica che consente di amplificare specifiche sequenze di cDNA, usando come metodo di rivelazione sonde fluorescenti che emettono segnale proporzionale alla quantità di amplificato.Nello specifico, per la quantificazione si è utilizzato un fluorescence-based real-time detection method (ABI PRISM 7900 Sequence Detection System -TaqMan; Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA).È stato utilizzato come gene normalizzatore la β-actina. Sono stati analizzati i seguenti geni: PDEF, WNT-11, SPINK-1, CgA e AR ed è stata valutata la presenza della traslocazione ERG-TMPRSS2. Per ogni esperimento è stato aggiunto un controllo negativo in cui non è presente alcun cDNA, per escludere eventuali contaminazioni della miscela di reazione.Le sequenze dei primer della β-actina utilizzati in tutti gli esperimenti sono già state pubblicate dal gruppo di ricerca presso il quale si è svolta la presente tesi [253], e sono Per tutti gli altri geni analizzati sono stati utilizzati dei saggi TaqMan (PCR-Assay)concentrati 20X e diluiti con master Mix ad una concentrazione finale di 1x. La lista dei saggi utilizzati è riportata in Tabella 6. Tutti i reagenti sono dell'Applied Biosystems.Ogni ciclo di reazione ha seguito le medesime condizioni: 50°C per 2 minuti, 95°C per 10 minuti, seguiti da 46 cicli a 95°C per 15 secondi e a 60°C per 1 minuto. Ogni campione è stato misurato in duplicato ed è stata utilizzata, per l'analisi successiva, la media dei valori di Ct (threshold cycle) delle due misurazioni.Volendo confrontare i dati delle diverse reazioni, i livelli di espressione di ciascun gene sono stati considerati come differenza tra le medie dei Ct del gene target e del gene di riferimento interno, secondo la seguente formula:∆𝐶𝑡 = [𝐴𝑣𝐶𝑡(𝑡𝑎𝑟𝑔𝑒𝑡) − 𝐴𝑣𝐶𝑡(𝛽 − 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑛𝑎)]I livelli di espressione di ogni gene sono stati convertiti in una scala lineare normalizzando ogni valore di ΔCt rispetto al caso con il valore di ΔCt più alto (ovvero con la più bassa espressione relativa del gene). Il ΔΔCt così ottenuto è stato convertito in ratio, mediante la seguente formula [254]: 2 −∆∆𝐶𝑡