La sostanza nera si trova in posizione intermedia tra il mesencefalo e il diencefalo: come il nucleo rosso, infatti, essa viene convenzionalmente assegnata al mesencefalo, sebbene la sua estremità rostrale si spinga in profondità nel subtalamo. Nello studio del tronco encefalico essa è particolarmente importante, in quanto segna il limite fra il piede, ventralmente, e la callotta, dorsalmente, del mesencefalo.