In caso di avvelenamento da organofosfato, questo composto si va a legare ad una sola estremità dell'enzima acetilcolinesterasi (il sito esterasico), bloccando l'attività dell'enzima. La pralidossima è in grado di attaccarsi all'altra metà del sito d'azione (il sito anionico) dell'enzima acetilcolinesterasi, per poi legarsi all'organofosfato. Quest'ultimo viene a cambiare la propria conformazione spaziale, perdendo così la capacità di legarsi all'enzima acetilcolinesterasi. Il complesso organofosfato/antidoto si viene successivamente a staccare dal sito, e l'enzima viene a "rigenerarsi", ovvero torna in grado di funzionare nuovamente.