La costimolazione o secondo segnale (come conseguenza al primo che risulta essere l'antigene) è un meccanismo che causa un aumento della risposta dei linfociti T dopo l'attivazione. L'attivazione senza costimolazione, da esperimenti in laboratorio, sembra comunque procedere ma con regimi molto bassi tanto da renderla necessaria per una risposta efficiente. Lo stato di non responsività in seguito a un'attivazione mancante del secondo segnale prende il nome di anergia. Le principali molecole costimolatorie per l'uomo risultano essere le proteine B7-1 e B7-2. Sono entrambe glicoproteine di membrana presentanti un dominio Ig nella porzione extracellulare e presenti sulle APC. B7-2 è espressa costitutivamente a bassi livelli e viene amplificata in seguito ad attivazione, B7-1 non è espressa, ma viene indotta dopo ore o giorni dall'attivazione. Entrambe legano il recettore CD28 espresso sui linfociti T. Sembra che le cellule dendritiche immature (non aventi ancora incontrato un antigene) presentino bassi livelli di molecole costimolatorie. L'incontro dell'antigene causa l'espressione delle B7 che viene poi mantenuta e supportata dal legame tra CD40:CD40L con i linfociti (che svolge un ruolo di "licensing" cioè stimola le APC a esprimere più costimolatori e a essere più capaci di attivare altri linfociti). Sembra che sulle APC siano comunque presenti bassi livelli di costimolatori per mantenere i linfociti T regolatori o per selezionare ancora una volta i linfociti autoreattivi (legando fortemente all'antigene ma con bassi livelli di costimolazione diventano anergici). I linfociti T effettori e della memoria sono meno dipendenti dalla costimolazione.