Per l'analisi mutazionale è stata utilizzata la piattaforma di sequenziamento di nuova generazione "IonTorrent" (Life Technologies) ad alta risoluzione. Mediante l'utilizzo del pannello commerciale "Ion AmpliSeq Cancer HotSpot Panel v2" (Life Technologies) è stato possibile sequenziare contemporaneamente regioni corrispondenti ad hot-spot mutazionali di geni coinvolti nella cancerogenesi. I geni analizzati corrispondono ai seguenti 50 tra oncogeni e oncosoppressori: ABL1, AKT1, ALK, APC, ATM, BRAF, CDH1, CDKN2A, CSF1R, CTNNB1, EGFR, ERBB2, ERBB4, EZH2, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, GNA11, GNAS, GNAQ, HNF1A, HRAS, IDH1, JAK2, JAK3,IDH2, KDR/VEGFR2, KIT, KRAS, MET, MLH1, MPL, NOTCH1, NPM1, NRAS, PDGFRA,PIK3CA, PTEN, PTPN11, RB1, RET, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TP53, VHL.Le librerie costituite da 207 ampliconi, corrispondenti alle regioni target, sono state ottenute per ciascun campione partendo da 40 nanogrammi di DNA genomico. La libreria di ciascun campione è stata identificata mediante l'aggiunta di barcode per permettere un sequenziamento in parallelo. Previa purificazione post-PCR (Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter) e valutazione qualitativa e quantitativa delle librerie ottenute con l'Agilent 2100 Bioanalyser onchip electrophoresis (Agilent Technologies), è stata effettuata la PCR ad emulsione con l'uso del OneTouch2 Systems (Life Technologies). Tale PCR è stata effettuata su un pool di librerie costituito da 16 campioni marcati con codici a barre differenti e sequenziali, ad una concentrazione finale di 100 µM, per un sequenziamento parallelo. Il sequenziamento è stato eseguito con lo strumento Personal Genome Machine (PGM, Life Technologies), mediante l'utilizzo di CHIP316 (Life Technologies). La profondità di sequenziamento scelta è stata di 1000X per ciascun caso, permettendo una profonda analisi mutazionale somatica. L'analisi dei dati ottenuti e le analisi di blast compreso l'allineamento con il genoma umano di riferimento hg19 è stato eseguito utilizzando il Torrent Suite Software v.4.02 (Life Technologies). La chiamata delle varianti è stata effettuata mediante il plugin VariantCaller fornito dall'azienda produttrice, secondo criteri di filtraggio che permettessero di rilevare alterazioni nelle regioni target con una frequenza allelica minima del 2% e con un copertura di lettura adeguata.