Le immagini così ottenute non presentavano valori di luminanza confrontabili nel pre e post trattamento, oltre ad avere una dimensione dello stack difficilmente gestibile. E" risultato quindi necessario, per poter procedere all"allineamento, processarle con il software ImageJ in modo da eliminare le zone circostanti il dente che non fornivano informazioni utili ma aumentavano solo il peso dei volumi (funzione di crop), convertirle in formato TIFF (parziale compressione senza perdita evidente di qualità) e ottimizzare la L.U.T. (Look Up Table) per ottenere valori di luminanza confrontabili (Fig. 11). Nonostante l"applicazione delle suddette ottimizzazioni i volumi da trattare risultavano comunque maggiori di 2GB, dunque non è stato possibile elaborarli con normali PC che montano sistemi a 32 bit e si è reso necessario procedere all"impiego di una nuova workstation e di una nuova versione del software Amira 5.3.3 a 64 bit.  I valori sono espressi in pixel, corrispondenti a 9.2µm per pixel. I valori del passo di ottimizzazione sono stati scelti partendo da un valore massimo pari a 1/5 della dimensione del Bounding-box (corrispondente circa alla matrice del volume) fino a un valore minimo pari a mezzo pixel; sono stati poi in seguito cambiati nel caso che il valore dell'ultimo passo di traslazione per l'allineamento (final step length) eccedesse proprio gli 0.5 pixel.Tuttavia questo sistema non ha prodotto i risultati voluti, poiché si è visto che tramite la registrazione dei volumi veniva applicata una traslazione pixel per pixel dei campioni, ma venivano alterati gli assi cartesiani del volume stesso causando quindi una non corrispondenza dei due sistemi di coordinate. In questo modo le coordinate cartesiane di un volume non sarebbero più corrisposte all"altro, rendendo impossibile la definizione di un medesimo piano di taglio per il campione pre-trattamento e per quello posttrattamento. Si è reso così necessario applicare una seconda funzione di elaborazione per ottenere un perfetto appaiamento dei volumi e dei rispettivi assi cartesiani. Il modulo utilizzato è stato l""Apply Transform". Infatti quando in Amira si applica una qualsiasi trasformazione alle immagini, ne viene modificata solo la visualizzazione e non la corrispettiva rappresentazione in memoria. Ovvero se si ingrandisce, rimpicciolisce o trasla un volume, questo appare modificato, ma le dimensioni e le coordinate dei voxel sono in realtà immutati. Utilizzando invece la funzione "Apply Transform" le modifiche apportate alla visualizzazione del volume vengono registrate andando a modificare i parametri delle immagini. Dopo aver marcato i canali trattati con le due metodiche si è proceduto a individuare un piano di taglio a circa 1 mm dall'emergenza del canale stesso e perpendicolare all'asse di quest'ultimo ed un altro piano di taglio a livello del punto di maggior curvatura del canale sempre perpendicolare all"asse (Fig. 12). Quest'operazione, come da protocollo, è stata eseguita sulla ricostruzione tridimensionale. Allo stesso modo le misure sono state fatte sulla stessa ricostruzione tridimensionale, poiché nella modalità Multiplanar Viewer non è possibile eseguire misurazioni. Il protocollo prevedeva di effettuare il taglio su un primo volume tramite la funzione ObliqueSlice e di ricavare le coordinate di questo piano attraverso il comando TCL "getPlane". Esso restituisce le coordinate x, y e z dell'origine del piano e i valori dei vettori u e v che ne determinano l'inclinazione. Successivamente gli stessi valori sono stati applicati a un secondo piano di taglio sul secondo volume tramite la funzione "setPlane". La misura diretta sull'immagine tridimensionale presentava tuttavia dei problemi dovuti sia a un effetto volume parziale dai bordi del canale sulla ricostruzione 3D sia all'aggancio della misura su un solido virtuale attraverso un sistema di input bidimensionale.Il protocollo di misurazione è stato quindi variato in corso di studio nel modo seguente:1. definizione del piano di taglio sul primo volume mediante la funzione "Oblique Slice" sia per gli apici sia per le curve (Fig. 13); 2. salvataggio dell'immagine così ottenuta tramite la funzione "createImage", impostando i parametri in modo che potessero essere definiti dall'utente e ricreando una matrice pari o superiore a quella delle immagini assiali (1650 x 1650): questo perché un taglio obliquo su un voxel isotropico crea un pixel di lato mediamente maggiore dello spigolo del voxel; 3. determinazione delle coordinate x,y e z e dei valori dei vettori v e u dell"origine del piano tramite il comando TCL "getPlane"; 4. definizione del piano di taglio sul secondo volume applicando le medesime coordinate del primo attraverso il comando TCL "setPlane"; 5. salvataggio dell'immagine così ottenuta tramite la funzione "createImage", utilizzando i medesimi parametri della prima immagine; 6. caricamento delle immagini su ImageJ;  Tabella 3 -Numero di misurazioni per ogni singolo canale.Lo scopo di queste misure plurime era di valutare le possibili differenze intra e interosservatore dei valori ottenuti per i singoli canali secondo modalità di misurazione differenti (manuali e automatiche).Tuttavia una volta importate in ImageJ le immagini presentavano ancora varie problematiche che impedivano di effettuare un confronto corretto. Le sezioni infatti non presentavano tutte il medesimo contrasto, parametro importante per la valutazione in modalità manuale, ma in particolar modo per l"utilizzo del Wand tracing tool automatico, che risultava per questo motivo essere impreciso (Fig. 14).Fig. 14 -Differenza di contrasto tra due immagini e istogramma della scala di grigi.E" stato così necessario applicare una equalizzazione alle immagini, andando ad agire sull"istogramma della scala di grigi e applicando una regolazione automatica. In questa maniera tutte le immagini presentavano la medesima scala di grigi.Nel corso delle misurazioni si è presentato un ulteriore problema costituito dalla presenza all"interno di alcuni canali, soprattutto a livello degli apici, di residui di varia natura (pulpari o dentinali) che rendevano difficile l"identificazione precisa dei limiti del canale stesso, alterando l"interfaccia vuoto/dentina (Fig. 15). In modalità automatica non risultava possibile la netta selezione del canale e in alcuni casi la misura non era del tutto fattibile, come riportato nella Tabella 7 dei risultati. In questi casi la misurazione poteva essere eseguita in modalità manuale interpretando criticamente l"immagine e seguendo nella selezione il probabile profilo del canale.Fig. 15 -Residui all"interno di un canale che ne alterano la selezione automatica (sinistra).Per ottimizzare le procedure di identificazione del profilo del canale è stato necessario aggiungere ad ImageJ un plug-in, chiamato MultiThresholder, in grado di evidenziare il canale differenziandolo dalla struttura solida circostante mediante un processo di sogliatura automatica, permettendo così di selezionare in modo preciso l"area in esame (Fig. 16). In questo modo lo strumento Wand tracing tool era in grado di selezionare perfettamente l"area delimitata, e anche in modalità manuale risultava più facile l"identificazione del canale, ottenendo così una maggiore uniformità nelle misurazioni, sia inter sia intra-osservatore.Di conseguenza risultava migliore anche la misurazione dei diametri. Infatti prima dell"applicazione del plug-in solo con difficoltà era possibile definire con precisione il limite del canale, anche in assenza di detriti. Se si considera che in molti casi la differenza riscontrabile tra le immagini pre e post-trattamento consisteva solo di pochi pixel (equivalente quindi a frazioni di millimetro), la necessità di delimitare in modo uniforme e ripetibile per tutti i campioni il limite del canale appare evidente (Fig. 17). In seguito all"esecuzione di tutte le misurazioni sui campioni i dati sono stati raccolti in tabelle e sono state calcolate le differenze pre e post-trattamento di aree, perimetri e diametri. Queste sono poi state riportate sia in numero di pixel sia in termini d"incremento percentuale.Su questi valori in seguito è stata effettuata un"analisi della varianza (ANOVA). Questa è un insieme di tecniche statistiche facenti parte della statistica inferenziale che permettono di confrontare la variabilità interna a due o più gruppi con la variabilità tra i gruppi. L'ipotesi nulla solitamente prevede che i dati di tutti i gruppi abbiano la stessa origine, ovvero la stessa distribuzione stocastica, e che le differenze osservate tra i gruppi siano dovute solo al caso. L"analisi della varianza è indicata qualora si debba applicare un t-test a più di due gruppi, in questo caso infatti l"applicazione di multipli ttest su due campioni per volta porterebbe ad un maggiore rischio di commettere un errore di tipo I. L"ANOVA test risulta invece più efficace per l"analisi simultanea di due o più campioni. Per poter effettuare un"analisi statistica più approfondita si è tenuto conto di una ulteriore variabile oltre al livello di sezione e al tipo di strumento usato, ovvero l"angolo di curvatura. Per questa ragione in un secondo tempo i canali dentari sono stati ulteriormente suddivisi in canali a curvatura Moderata (angolo minore o uguale a 35°) e canali a curvatura Severa (angolo maggiore o uguale a 40°). La valutazione della significatività statistica dei vari fattori che influenzano la lavorazione è stata condotta considerando come risposte sperimentali:-la variazione del rapporto tra i Diametri (Ratio of Geometric Ratio, RGR) pre e post lavorazione: RGR = GR1/GR0 = (D1/d1)/(D0/d0);la variazione dell"Area (Surface Ratio, SR) pre e post lavorazione:SR = S1/S0.Come possibili fattori d"influenza si sono considerati:-il tipo di strumento usato (Fattore Instrument) a 2 livelli (K-File e Path-file);-il punto di indagine (Fattore Point) a 2 livelli (Apici e Curve);-la curvatura (Fattore Curvature) a 2 livelli (Moderata e Severa).Inoltre per poter ottenere un piano sperimentale bilanciato di 3 fattori a 2 livelli è stato necessario eliminare dall"analisi i seguenti denti:-1 lavorato con P e avente angolo di curvatura pari a 64°;-5 lavorato con K e avente angolo di curvatura pari a 20°;-6 lavorato con P e avente angolo di curvatura pari a 50°; -8 lavorato con K e avente angolo di curvatura pari a 20°.