Il meccanismo molecolare dell'azione dell'ossido d'azoto risiede nella sua capacità di legarsi covalentemente alle porzioni eme delle emoproteine. In particolare, Il monossido nitrico ha come bersaglio primario l'enzima guanilato ciclasi, che dal guanosin-trifosfato (GTP) genera il GMP ciclico. Questo secondo messaggero attiva a valle la protein-chinasi GMPc-dipendente (PKG), la quale fosforila proteine contrattili e strutturali della cellula come la calponina, il fosfolambano e la tropomiosina. La fosforilazione di questi substrati riorganizza le strutture citoscheletriche e la sensibilità di queste alle azioni degli ioni calcio, necessari alla contrazione. Inoltre, la PKG fosforila gli InsP3-R, ossia i recettori dell'IP3 (Inositolo trifosfato) situati sulla superficie dell'SR (reticolo sarcoplasmatico) delle cellule muscolari lisce e sul reticolo endoplasmatico delle cellule endoteliali, impedendone il legame con l'IP3, appunto; ciò impedisce il rilascio del calcio dall'SR o dall'ER, inibendo la contrazione della muscolatura liscia e inducendone quindi il rilassamento.