Come spiegato nella sezione metodi, Pore Walker identifica e caratterizza il canale più lungo all'interno della proteina, ricercando preferenzialmente un tunnel transmembrana. È quindi facile presupporre che il programma non sia adatto a ricercare un collegamento interno tra una selezione di residui amminoacidici.Caricando il file del monomero A e avviando il calcolo, come risultato ottengo l'analisi dettagliata di un unico canale che attraversa tutto il monomero coinvolgendo ben ottantotto amminoacidici. In questo modo il programma trova il punto di origine e individua otto canali, ma nessuno di essi è soddisfacente. Anche provando con le coordinate degli altri amminoacidi non si riesce ad individuare un tunnel con la giusta direzione o, nei casi peggiori, non viene identificato il punto d'origine, nonostante corrisponda alle precise coordinate di un atomo della struttura.Questo fatto lascia davvero perplessi, sarebbe necessario approfondire ulteriormente la conoscenza sul funzionamento del programma e in particolare sull'immissione degli input per ottenere una spiegazione a tale problema.Inserendo invece le coordinate utilizzate in precedenza come terzo tentativo, il quarto tunnel individuato corrisponde visivamente al tunnel 10_3_1.197 proposto da CAVER (Fig. 60).Almeno in questo caso, quindi, i risultati corrispondono. A questo punto procedo nella ricerca dei due loop inserendo come input i dati riportati in tabella 12. In entrambi i casi i primi tre loop proposti provengono dal LIMP 1 , sono cioè loop di membrana e, pur avendo un ottimo scoring dovuto alla RMSD 1 , presentano un'identità con le sequenze ricercate dello 0%.Dal momento che la GSK-3β è una proteina citoplasmatica, decido di scegliere per la ricostruzione dei loop i primi candidati estratti dal LIP  A questo punto procedo con ANM web server. Dopo aver caricato la struttura con i loop e aver inoltrato i dati, procedo nell'analisi dei risutati.Scorrendo i venti modi vibrazionali proposti appare evidente un problema: i loop inseriti, in particolar modo il primo, e gli ultimi tre amminoacidi presenti sul C- Per quanto riguarda il C loop, i dati sono pressoché invariati, mentre il picco relativo all'A loop risulta nettamente più marcato per i residui 209-211, che il programma ritiene particolarmente liberi nel movimento. Questo fenomeno si verifica anche per i tratti iniziali e finali della catena e per una serie di punti massimi (50,78,119,149,210,307,347,353,372). Per giustificare il fatto che, nel complesso, ANM reputi la proteina più libera nel movimento, bisogna ricordare che i dati sperimentali con cui quelli di ANM sono stati raffrontati sono relativi alla struttura dimerica dell'enzima, di per sé più rigida. Per quanto concerne le correlazioni, osservando la matrice si evince dalla sua colorazione che esse sono piuttosto deboli (Fig. 66). Effettivamente esiste una anti-correlazione tra G e A loop (valori compresi tra -0.1 e -0.6). Una misura simile (-0.45) si riscontra anche per la coppia Ser 66 (dominio β) e Asp 260 (dominio α), a dimostrazione del fatto che i due domini si muovono in direzioni opposte e quindi, considerando che si tratta di un moto di tipo elastico, tendono ad avvicinarsi tra loro.Le stesse deduzioni si possono effettuare studiando i relativi grafici (Fig. 67).         Per cercare di ottenere dei risultati più precisi, provo a sottoporre al programma la struttura della palinurina, molecola in fase di studio come inibitore non ATPasico (vedere Introduzione), come possibile ligando.La palinurina è un terpene dalla struttura lineare, caratterizzato dalla presenza ad un capo di un anello idrossimetilfuranonico (coda) e all'altro capo di un anello furanico (testa) (Fig. 87).    Per proseguire lo studio sulla palinurina è ancora possibile operare un confronto tra la struttura stessa e i risultati ottenuti in precedenza, allo scopo di ricercare eventuali somiglianze.Controllando una per una le cinquecento strutture che DOCK Blaster aveva proposto come ligandi per il sito di legame costituito dall'insieme tre loop funzionali, ottengo che quattro strutture presentano un anello furanico, due strutture un anello metilfuranico, una struttura un anello tetraidrofuranonico, una struttura un anello diidrossifuranico e una struttura un anello diidrossietilidrossifuranonico (Fig. 91).Queste informazioni lasciano dunque supporre che tali strutture mostrino una sorta di "compatibilità" con la palinurina, che, in base a questi dati, potrebbe interagire sia con la testa (per la presenza del furano) che con la coda (per la presenza del furanone, del metile e del gruppo idrossilico). Per quanto riguarda invece i risultati ottenuti per i singoli loop, si era discusso in precedenza di come non ci siano prove riguardo la capacità di tali molecole di inibire l'attività dell'enzima.Recenti studi hanno dimostrato che la delezione dell'N-terminale non influisce sulla capacità della GSK-3β di fosforilare la proteina τ, mentre l'elisione di alcuni residui del C-terminale blocca l'attività dell'enzima, anche se non nei confronti di altri substrati come la glicogeno sintasi 18 .Per queste ragioni, ritengo possa essere significativo concentrare l'attenzione perlomeno sull'A loop, in quanto appartenente al blocco del C-terminale. In conclusione, questo studio di docking ha permesso di verificare l'accesso di possibili ligandi all'interno del core catalitico dell'enzima. Molecole di questo tipo potrebbero bloccare l'attività dell'enzima grazie all'interazione con gli amminoacidi di C e A loop e all'ostruzione del sito per il substrato. È anche stata valutata la possibilità di un meccanismo di inibizione relativo alla cavità sottostante l'A loop nel dominio C terminale.Inoltre, tutti i risultati ottenuti sono stati confrontati con la struttura della palinurina, molecola in fase di studio come inibitore non ATPasico della GSK-3β. Tale analisi ha mostrato una certa compatibilità con essa da parte di alcune strutture: la presenza sia di anelli furanici che furanonici, e in alcuni casi di gruppi metilici e idrossilici, lascia supporre che la palinurina possa interagire con i siti di legame proposti sia con la testa che con la coda. Lo studio è stato condotto attraverso diverse tappe: a partire dalla struttura cristallografica di partenza sono state analizzate con le opportune applicazioni le cavità, i tunnel ed i moti vibrazionali dell'enzima. Inoltre, sulla base dei risultati ottenuti tramite uno studio di docking sono stati proposti dei modelli a potenziale attività inibitrice con un meccanismo di tipo non ATPasico.Come struttura di riferimento è stata scelta tra le varie opzioni proposte dal Protein Data Bank la 1PYX, in cui l'enzima è cristallizzato in forma dimerica con un inibitore ATPasico (AMP-PNP) e due atomi di magnesio per monomero. Tale struttura è caratterizzata da un buon profilo di risoluzione cristallografica, come dimostrato dall'analisi effettuata con l'applicazione VADAR.Le interazioni intermolecolari tra inibitore ed enzima sono state studiate con le applicazioni Astex Vewer, Ligand Explorer e MOE, che hanno consentito di evidenziare i residui del sito ATPasico coinvolti nell'interazione con il ligando. Infine, nel suo insieme questo lavoro di tesi ha anche raggiunto l'obiettivo di raccogliere e descrivere in pratica l'impiego di una vasta serie di metodi computazionali volti allo studio di vari aspetti strutturali e funzionali delle strutture proteiche.