Spesso non è possibile determinare quale sia la corretta conformazione dei loop all'interno di una proteina, nonostante il resto della struttura presenti una buona risoluzione. Questo fatto è dovuto all'elevata flessibilità che caratterizza tali loop, fattore a volte correlato alla loro funzione. Infatti, in molti casi essi sono coinvolti in fenomeni di riconoscimento e anche di legame a modulatori o proteine associate, basti pensare alla famiglia di recettori accoppiati alle proteine G.In alcune situazioni può risultare particolarmente utile ricostruire tali frammenti.Le metodiche ab initio calcolano la possibile conformazione dei loop mancanti a partire da zero appoggiandosi a numerose funzioni energetiche e di minimizzazione. Si tratta di pratiche molto laboriose e complesse che, pertanto, richiedono molto tempo. Per ricerche di tipo interattivo è preferibile invece utilizzare metodiche basate su un approccio di tipo comparativo, in cui i loop vengono ricercati all'interno di apposite banchedati. L'ormai elevatissimo numero di strutture depositate all'interno del Protein Data Bank fa sì che con queste tecniche si possa risalire con una certa accuratezza ai loop 39 . SuperLooper è un metodo di modeling comparativo specializzato nella previsione della struttura terziaria di loop proteici mancanti all'interno di una struttura proteica.Per procedere nella ricerca è necessario caricare il file della proteina in formato .pdb.Una volta sottomessa la struttura si apre una pagina in cui la molecola è visualizzata con Jmol e su cui si può intervenire attraverso il pannello "Display options". A questo punto bisogna inserire gli stem atoms, ovvero indicare la posizione dell'ultimo amminoacido prima della perdita dei dati e del primo amminoacido con cui ricomincia la sequenza. Dopo aver selezionato la catena di interesse, si immette la sequenza desiderata per il loop mancante e si avvia il calcolo.Nel caso in cui il programma non riesca ad individuare nessun possibile loop si può ricorrere alla funzione "enlarge N-term" o "enlarge C-term" per espandere la ricerca.Il programma si appoggia a due database per elaborare gli output. Il primo si chiama LIP (Loop In Proteins) e contiene più di cinquecento milioni di segmenti idrosolubili di proteine la cui lunghezza arriva a trentacinque residui 40   Per facilitare l'utente nella scelta, cliccando sui vari loop proposti è possibile visualizzarli con Jmol all'interno della struttura. Inoltre, nel caso in cui si tratti una proteina di membrana, i piani di membrana sono automaticamente individuati e visualizzati. Pertanto, negli ultimi anni ha preso piede il metodo dell'analisi dei modi normali (NMA), grazie ad un netto risparmio in termini di tempo nello studio di grandi strutture e al successo della metodologia dell'Elastic Network.In questi modelli la macromolecola viene infatti rappresentata come una rete, i cui nodi sono costituiti dagli atomi di carbonio α di ciascun residuo amminoacidico, mentre le maglie rappresentano le interazioni che si stabiliscono tra i residui, purché essi si trovino entro una certa distanza tra loro (cutoff). Non viene fatta nessuna distinzione tra le diverse tipologie di amminoacidi, cosicché a tutti venga applicata una generica forza di tipo armonico (γ) per studiare le potenziali interazioni che avvengono tra coppie di amminoacidi 42 .Studiare questo aspetto delle strutture proteiche può essere molto utile in relazione alla caratterizzazione di un sito attivo: si può infatti andare ad La predizione dei moti anisotropici è effettuata tenendo conto di tutte le interazioni rilevate entro una certa distanza dai nodi, che corrispondono ai carboni α dei residui amminoacidici 43 . Si tratta di un valore che costituisce l'unico parametro predeterminato, ma che può essere modificato dall'utente.Tuttavia, indagini statistiche hanno rivelato che i risultati migliori si ottengono impostando come cutoff una distanza compresa tra i 15Å e i 21Å.Il programma, utilizzando algoritmi alquanto complessi, individua i venti modi vibrazionali più plausibili per la proteina. I modi selezionati da ANM web server sono quelli più "lenti", ovvero quelli le cui interazioni sono più riproducibili e meno caotiche. In genere essi forniscono informazioni relative ai movimenti più ampi che avvengono all'interno della struttura e sono moti correlati a funzioni della proteina rilevanti dal punto di vista biologico. In particolare, diversi studi dimostrano che i modi più significativi in questo senso sono i primi tre proposti da ANM 44 .Il programma accetta come input il codice ID della proteina, ma consente anche di caricare i propri file in formato .pdb (Fig. 22). Scegliendo quest'ultima opzione, bisogna tener conto del fatto che per avere un quadro più preciso sui moti vibrazionali della proteina è preferibile considerarla nel suo insieme ed è quindi meglio evitare di utilizzare un file che si riferisca ad esempio ad una sola catena proteica, ovviamente nel caso in cui la proteina sia costituita da più catene. Inserendo il codice ID della proteina e lasciando inalterati i valori automaticamente settati, in pochi istanti si ottengono i risultati.Un punto di forza di ANM web server rispetto ad altri programmi è proprio la possibilità di visualizzare direttamente i risultati con l'applicazione Jmol. L'utente può in questo modo esplorare in modo interattivo la struttura ruotandola, traslandola e zoomandola a piacere.Con un semplice clic del mouse è possibile passare da un modo vibrazionale all'altro per confrontarli visivamente.La percezione dei moti è resa immediata dall'animazione della struttura e dalla presenza di un set di vettori, la cui forma e dimensione indicano l'intensità e la direzione dei moti.La mobilità dei vari residui, inoltre, è facilmente deducibile grazie alla visualizzazione secondo una precisa scala di colori: si passa gradatamente dal rosso, che corrisponde a una fluttuazione elevata, al blu, che indica una particolare staticità. Il B factor misura quanto l'atomo oscilla o vibra attorno alla posizione specificata per ciascun modello vibrazionale, secondo l'equazione:B x = 8π 2 {u x 2 }eq. 1dove B x corrisponde al fattore di temperatura per l'atomo x, 8π 2 a una costante numerica e u x 2 alla media dei quadrati dello spostamento dell'atomo x dalla sua posizione di riposo. Essendo il fattore direttamente proporzionale allo spostamento, ne risulta che gli atomi sono in grado di muoversi tanto più liberamente quanto più alto è il valore del B factor 45 .Un'opzione molto interessante consente di indagare le correlazioni dei vari amminoacidi nella fluttuazione, ovvero di valutare l'influenza che i residui esercitano tra loro all'interno della struttura per ciascun modo vibrazionale.I dati sono presentati sotto forma di matrici.Ciascuna matrice è costruita secondo un codice colorimetrico che si basa sugli stessi toni visti in precedenza: gli amminoacidi correlati tra loro sono colorati in rosso, quelli anti-correlati in blu, mentre le correlazioni deboli appaiono in gradazioni più tenui. La matrice è composta da celle che misurano 10X10 per lato. Per facilitarne la consultazione, cliccando su di un punto qualsiasi al suo interno appare uno zoom della relativa cella. Spostandosi con il puntatore all'interno di questo box viene visualizzato per ciascuna coppia di amminoacidi il grado di correlazione e la distanza tra i loro carboni α. Il massimo grado di correlazione consentito è pari a 1 (ciò si verifica per un amminoacido con se stesso e in questo caso la distanza è pari a 0). Per controllare la posizione dei residui di interesse è possibile selezionarli con un clic all'interno della cella e visualizzarli in un apposito riquadro in cui la proteina è caricata con Jmol. Essi verranno visualizzati seguendo la stessa scala di colori della matrice.ANM visualizza automaticamente la matrice relativa al primo modo vibrazionale, ma è possibile passare agli altri modi, selezionarne un range all'interno dei primi venti suggerititi oppure considerare tutti i modi possibili nel loro insieme.Infine, ANM permette di studiare gli spostamenti tra residui esplorando un'altra serie di matrici relative alle square-distance fluctuations tra coppie di amminoacidi. In questo caso, le fluttuazioni maggiori appaiono in blu e quelle minori in rosso. È nuovamente possibile zoomare sulle celle e visualizzare i residui sulla struttura, nonché analizzare i primi venti modi vibrazionali, ma in questo caso soltanto individualmente. All'interno della stessa pagina, un grafico dell'energia di deformazione per ciascun residuo mostra l'energia potenziale dei residui tenendo conto di tutte le interazioni cui prendono parte 42 .come file di testo (.txt). Per ottenere i risultati, SiteEngine classifica i vari amminoacidi in base alle loro caratteristiche chimico-fisiche in una serie di gruppi funzionali denominati "pseudocentri". Ogni pseudocentro rappresenta un esempio delle proprietà più importanti nello studio delle interazioni tra proteina e ligando: DON: donatore di legami idrogeno; ACC: accettare di legami idrogeno; DAC: donatore/accettore di legami idrogeno; ALI: responsabile di interazioni idrofobiche alifatiche; PII: responsabile di interazioni aromatiche.Gli amminoacidi costituenti il sito attivo vengono ricercati sulla completa superficie della proteina inserita per prima e, nel caso non ci sia un'esatta corrispondenza, il programma propone un'alternativa plausibile considerando appunto le proprietà chimico-fisiche dei residui.  Lo studio dell'interazione di un ligando con il suo target biologico mediante metodi computazionali è noto come docking.Si tratta di una tecnica di calcolo che si pone come obiettivo quello di prevedere la disposizione spaziale più corretta di un ligando all'interno del sito di legame.Questo tipo di studio risulta essere particolarmente interessante in quanto ipotizza le possibili interazioni che si instaurano nella formazione dei complessi proteina-ligando, che sono quelli ad avere importanza dal punto di vista biologico. Un calcolo di docking è un processo costituito da diversi passaggi, tra cui i principali sono il posing, ovvero il posizionamento da parte di opportuni algoritmi di piccole molecole all'interno del sito attivo, lo scoring e il ranking, che consentono di valutare le interazioni proteina-ligando tramite analisi energetiche ed entropiche 47 .Essendo lo sviluppo di nuovi farmaci un processo molto costoso, sia in termini di tempo che di investimenti economici, il docking deve essere inteso come uno strumento atto a semplificarlo e renderlo più efficiente: esso infatti è in grado di indirizzare precocemente verso una giusta strada il drug discovery, ad esempio consentendo di eliminare in partenza quei ligandi che risultano essere inadatti o particolarmente sfavorevoli.In generale, i metodi di docking si dividono in rigidi e flessibili.Nel primo caso sia i ligandi che le proteine sono trattati come corpi rigidi: in questo modo, pur riducendo i tempi di calcolo, i risultati sono meno precisi in quanto il metodo non tiene conto dei possibili arrangiamenti conformazionali che consentono a macromolecola e ligando di ottimizzare l'interazione reciproca.Nel secondo caso, il ligando, e nei programmi più evoluti anche il sito di legame, sono trattati come strutture flessibili. Questo approccio consente uno studio più accurato e realistico della mutua influenza delle due molecole, anche se a prezzo di un aumento dei tempi di calcolo. In questo caso è necessario inserire come input sia la struttura target che il sito di legame. La proteina va caricata in formato .pdb o in alternativa in formato .mol2, poiché il programma è in grado di convertirlo automaticamente in .pdb.Nella preparazione del file bisogna seguire alcune accortezze. In particolare è necessario: inserire solamente i record ATOM (in alternativa gli HETATM vengono considerati come ATOM, falsando i risultati); ignorare gli identificatori di catena; appurare che i residui amminoacidici siano numerati in ordine crescente; rimuovere le molecole d'acqua.In ogni caso l'utente è facilitato in questo compito in quanto il programma individua comunque gli errori nella struttura degli input, li segnala con un messaggio d'errore e, nella maggior parte dei casi, li corregge automaticamente (ad esempio, se qualche atomo nel file appare come "HOH" viene automaticamente rimosso perché riconosciuto come appartenente a una molecola d'acqua).Per quanto riguarda il sito di legame, esso può essere segnalato utilizzando un docked ligand in formato .mol2 oppure fornendo direttamente gli amminoacidi   Dalla pagina ottenuta si ricavano informazioni generali sulla proteina.Nella sezione "Molecular Description" vi è una breve descrizione della molecola in cui si apprende che la glicogeno sintasi chinasi-3β è classificata come una transferasi ed è costituita da due catene monomeriche. Nel riquadro "Source" invece, è specificata la fonte, che in questo caso corrisponde alla specie Homo sapiens. In seguito, la tabella "Ligand Chemical Component" segnala i ligandi che sono complessati alla proteina: l'AMP-PNP e lo ione magnesio.Interagendo con il riquadro "Biological Assembly" è possibile visualizzare direttamente con alcuni programmi la molecola in 3D. Ad esempio, scegliendo l'applicazione Jmol si ottiene un primo modello tridimensionale della transferasi.Dal campo "Deposition Summary" si risale alla data di deposizione della struttura, ovvero il 9 luglio 2003. Infine, dalla tabella "Experimental Details" si apprende che la struttura è stata ottenuta tramite la tecnica della cristallografia a raggi X con una risoluzione di 2.4Å. Cliccando sul link all'Electron density server (EDS), si apre una pagina con una serie di dettagliati parametri relativi alla risoluzione della proteina. Essendo la proteina un dimero, la prima mossa è quella di appurare se i due monomeri che la costituiscono sono identici.Appare subito evidente che la proteina è costituita da due catene (Chain A e B):il primo monomero è costituito dalla Catena A e il secondo dalla Catena B.Un'analisi più attenta rivela che ogni monomero è diviso in tre frammenti (a, b,(3)(4) (6)(8)(1) Resta da valutare se la presenza di questi "amminoacidi fantasma" possa in qualche modo compromettere la caratterizzazione di siti attivi.In primo luogo con un'analisi comparata tra i residui si può escludere che la perdita abbia compromesso i siti attivi.Con una piccola elaborazione della molecola tramite il programma PyMOL è possibile visualizzare la struttura e constatare anche a livello tridimensionale che effettivamente la perdita dei dati non si ripercuote sui siti di interesse (Fig. 30). Il volume escluso rappresenta il volume occupato dal residuo e di conseguenza non accessibile al solvente: di norma, se la proteina è efficientemente impaccata, il volume frazionale di ogni amminoacido deve rientrare nel range 1.0±0.1Å 3 . Un residuo localizzato in una cavità interna presenterà un fV>1.2Å 3 , mentre uno localizzato in una regione particolarmente compressa avrà un fV<0.8Å 3 30 .Nel caso della nostra struttura, 74 residui su 681 sono segnalati come possibili problemi: tutti i valori sforano per eccesso, come si deduce facilmente dal relativo grafico (Fractional Residue Volume, Fig. 32). Questo sta quindi ad indicare che la proteina presenta al suo interno delle cavità. A questo proposito, per avere un quadro generale della struttura, procedo nell'analizzare il Ramachandran Plot proposto come primo grafico negli output.Effettivamente, posso controllare che i residui amminoacidici presentano conformazioni angolari consentite, con la sola eccezione di tre amminoacidi (Fig. 33).  Sono proprio queste ultime due strutture (coil e turn) ad essere particolarmente rilevanti ai fini di questo studio, in quanto, oltre ad avere la funzione di collegare altri elementi di struttura secondaria, possono partecipare alla formazione di siti di legame e di siti attivi negli enzimi, per cui possono apparire disordinati in assenza dello specifico ligando e ordinati in sua presenza (Fig. 34).  Per avere un'idea complessiva sulla qualità della risoluzione della proteina conviene confrontare alcuni dei risultati ottenuti con i valori di riferimento. In particolare, vengono considerati i sette parametri principali ovvero quelli relativi all'area superficiale accessibile frazionale (fASA),al volume frazionale (fVOL), alle torsioni angolari e ai packing defects (Tab. 5). 