Il pryrosequencing è una tecnica in grado di individuare mutazioni e SNP in tempo reale, mediante l'analisi in sequenza di frammenti di lunghezza inferiore alle 100 bp [53].La metodica del pyrosequencing prevede la ricostruzione del filamento di DNA complementare ad un filamento stampo, aggiungendo un nucleotide alla volta; se è avvenuta l'incorporazione di ciascuno dei nucleotidi immessi sequenzialmente si produce, mediante una cascata enzimatica, un segnale luminoso che permette di ricostruire la sequenza del filamento di DNA in analisi.I campioni di DNA vengono inizialmente amplificati mediante PCR con un primer biotinilato in 5' e uno non marcato. Successivamente l'amplificato viene purificato dai nucleotidi e dai primer contenuti nel mix di PCR e denaturato a singolo filamento. Per separare il filamento biotinilato da quello non biotinilato si sfrutta il legame della biotina a particelle di sefarosio ricoperte di streptavidina; tutto ciò che non si è legato alla streptavidina viene rimosso mediante lavaggi.Al singolo filamento di DNA così ottenuto viene allineato il primer di sequenza, poi incubato con gli enzimi DNA polimerasi, ATP solforilasi, luciferasi, apirasi e i substrati luciferina e adenosina 5' fosfosolfato.Viene poi immesso un dNTP alla volta, che, se è complementare con il filamento stampo, viene incorporato dalla DNA polimerasi nel filamento nuovo. In questo modo si libera un pirofosfato. Se lo stesso nucleotide è incorporato in più posizioni consecutive, si libererà pirofosfato in quantità equimolare al numero di dNTP incorporati. Il pirofosfato così generato viene rilevato attraverso la seguente reazione: l'ATP solforilasi converte il pirofosfato in ATP in presenza di adenosina 5'-fosfosolfato. Questo ATP viene usato per la transizione da luciferina a ossiluciferina, con la produzione di luce, che è di intensità proporzionale alla quantità di ATP presente.La luce viene rilevata da una camera CCD (dispositivo a carica accoppiata) e convertita dal software dello strumento in un picco disegnato in un pirogramma; l'altezza di tale picco è proporzionale al numero di nucleotidi incorporati.Se il nucleotide dispensato non è complementare con la sequenza non viene incorporato nel filamento di DNA e quindi non si genera luce.Un'apirasi degrada continuamente l'ATP e i dNTP non incorporati. In questo modo la luce viene spenta e si rigenera l'ambiente di reazione iniziale.I primer per l'analisi con pyrosequencing sono stati disegnati con il software dedicato "SNP primer design"(Pyrosequencing AB); le sequenze sono riportate in tabella I kit per la purificazione del campione, enzimi e substrati, cartucce e piastre PSQ sono stati forniti dalla ditta Pyrosequencing AB. 