Fu poi professore di medicina pratica in entrambe le università dove aveva studiato. A Padova, in particolare, tra il 1569 ed il 1587, trascorse un periodo molto fecondo, in cui scrisse ben dodici libri, alcuni dei quali basati sugli appunti presi dagli studenti durante le lezioni. Si recò poi a Pisa, dove divenne primo medico di Ferdinando I de' Medici e poté godere di una certa fama come clinico. Curò anche altre importanti personalità del suo tempo, tra cui l'imperatore Massimiliano II, che lo nominò cavaliere e conte palatino. Merita di essere citato un famoso episodio che vede Girolamo Mercuriale convocato a Venezia dalle autorità il 7 giugno 1576 insieme a molti altri medici illustri, consultati per decifrare una misteriosa epidemia che colpiva la città. Mercuriale escluse fin dall'inizio un caso di peste, in quanto solo una minima percentuale della popolazione si era ammalata, il contagio restava comunque molto limitato (3691 morti da agosto 1575 al febbraio 1576), e i contagiati erano quasi tutti poveri e malnutriti ("quasi tutta gente povera et mal notrita e governata. Io certo mai la chiamerei peste"). Dopo una settimana però la malattia ebbe un decorso impressionante (arrivando a cinquantamila morti entro la fine dell'anno ), tra cui anche alcuni familiari del medico stesso. Tre giorni dopo, il 10 giugno, il Maggior Consiglio - prudentemente riunitosi solo in un terzo dei suoi componenti - per scongiurare un eccessivo allarmismo che avrebbe compromesso l'economia cittadina, attribuì i decessi a semplici "febri maligne” e non alla peste, contrariamente al parere dei Provveditori alla Sanità, i quali propugnavano in alternativa quarantene, lazzaretti ed isolamento delle abitazioni degli appestati. Sorprendentemente però tale evento non ebbe gravi conseguenze sulla carriera di Mercuriale che, anzi, durante lezioni che tenne nel 1577 a proposito della peste, continuò a difendere la sua posizione riguardo allo sfortunato caso veneziano.