L'indometacina è un inibitore non selettivo di COX-2 (NSAID) e in seguito alla sua somministrazione alle cellule in coltura ci aspettiamo un'inibizione a carico delle cellule positive per tale enzima. I risultati dei nostri esperimenti mostrano come, effettivamente, tale farmaco sia in grado di determinare una riduzione della proliferazione cellulare della linea JJN3 (COX-2 positiva), mentre, invece, non ha nessun effetto sulla linea COX-2 negativa RPMI 8226. L'effetto dell'indometacina, inoltre, è limitato alla sola crescita cellulare senza esplicare un'induzione significativa dell'apoptosi. I risultati ottenuti supportano l'importanza dell'attivazione di COX-2 per la crescita cellulare e come una sua eventuale inibizione possa essere nociva per le cellule che esprimono l'enzima. In base a tale profilo l'indometacina sembrerebbe essere più adatta per approcci terapeutici di mantenimento piuttosto che per essere utilizzata in combinazione con agenti chemioterapici, in quanto in questo contesto sono più utili i farmaci in grado di indurre o favorire l'apoptosi. L'efficacia dell'indometacina nell'ambito della patologia MM è dimostrata da alcuni studi sperimentali. Costes et al. [103] e Lu et al. [104] hanno messo in evidenza come l'azione inibitoria dell'indometacina su COX-2, in esperimenti condotti con cellule prelevate da pazienti con MM, si traduca in una diminuita produzione di PGE2, con conseguente diminuzione nelle colture di IL-6. In vivo questo fatto determina una rallentamento nella crescita della massa tumorale, per diminuita stimolazione delle cellule neoplastiche da parte della citochina. [103,104] Lo studio condotto da Baz et al. [95] costituisce un'osservazione indiretta in ambito clinico del ruolo che un altro NSAID, l'aspirina, può avere nell'ambito della patologia MM. Questi autori hanno dimostrato che pazienti affetti da MM che, per motivi indipendenti dalla patologia neoplastica, assumono basse dosi di aspirina come profilassi antitrombotica hanno una maggiore risposta clinica alla chemioterapia convenzionale ed anche una maggiore sopravvivenza a lungo termine, rispetto ai pazienti che non assumono questo tipo di farmaco. La sua efficacia d'azione è dovuta probabilmente alla capacità di ridurre i livelli di PGs prodotti dalle cellule stimolate. È, inoltre, importante ricordare che i risultati ottenuti sono indipendenti da eventuali decessi per trombosi. [95] Gli esperimenti condotti utilizzando l'NS 398, un inibitore selettivo per l'enzima COX-2 (COXIB), hanno portato risultati diversi da quelli che ci potevamo aspettare. Tale farmaco, infatti, analogamente all'indometacina, avrebbe dovuto esercitare la sua azione inibitoria esclusivamente sulle cellule positive per l'enzima. I nostri dati mostrano, invece, che esso è in grado di agire anche su linee COX-2 negative. La somministrazione di NS 398 alle cellule in coltura porta ad una riduzione della proliferazione cellulare a carico sia della linea JJN3, sia della linea RPMI 8226.Alcuni studi clinici hanno posto in evidenza come i cosiddetti inibitori specifici di COX-2 svolgano, in realtà, funzioni biologiche complesse e non totalmente chiarite. L'azione dell'NS 398 sulle cellule che non esprimono COX-2 è dovuta, molto probabilmente, alla stimolazione di vie di trasmissione intracellulare del segnale indipendenti da COX-2, non influenzabili dall'indometacina. Dati a sostegno di questa ipotesi sono documentati in numerosi articoli [42-45, 96-99, 105-109].Numerosi esperimenti sono stati condotti ponendo le cellule RPMI 8226 in coltura con diversi inibitori specifici per COX-2: NS 398 (Zhang et al. [99]), SC 58125 (Ding et al. [44]) ed etodolac (Nakamura et al. [109]) ed in tutti questi casi è stata effettivamente dimostrata una risposta da parte delle cellule RPMI 8226, convenzionalmente COX-2 negative. In particolare gli effetti, dose-dipendenti, si sono manifestati con una diminuita produzione di PGE2 da parte delle cellule neoplastiche, una diminuita proliferazione, un'aumentata apoptosi ed una diminuita espressione di molecole di adesione sulla superficie cellulare.Lo studio condotto da Grösch et al. [42] ha ampiamente documentato come gli inibitori di COX possano agire su mediatori del segnale diversi da COX-2, ma ugualmente coinvolti nella trasmissione di segnali anti-proliferativi e pro-apoptotici. L'attivazione di vie indipendenti da COX-2 è dimostrata anche in esperimenti condotti utilizzando dimetil-celecoxib (DMC), un analogo di celecoxib non selettivo per COX-2 [43]. Pur non essendo specifico per l'enzima, DMC è in grado sia di inibire la proliferazione cellulare, sia di indurre l'apoptosi nelle cellule di MM, con un'efficacia d'azione direttamente proporzionale alla concentrazione di farmaco ed al periodo di incubazione. [42,43,44,99,109] L'azione dell'NS 398 sulle cellule RPMI 8226 potrebbe, in parte, essere dovuta anche al fatto che questa linea cellulare, che viene convenzionalmente considerata come COX-2 negativa, in realtà non ha un'espressione nulla dell'enzima, ma esso è presente a livelli talmente bassi da non essere considerati significativi. Malgrado l'espressione basale di COX-2, l'azione dell'enzima è probabilmente necessaria alle cellule per mantenere la loro capacità proliferativa e la sua inibizione potrebbe contribuire alla riduzione della conta cellulare anche per la linea RPMI 8226. La PGE2 è un prodotto biologico di COX-2 in grado di favorire la proliferazione cellulare all'interno del microambiente midollare nel MM. A partire da questa considerazione siamo andati ad indagare, sulle nostre linee cellulari, se tale sostanza sia in grado di revertire l'inibizione indotta dall'indometacina e dall'NS 398. L'effetto di PGE2 è evidente in maniera significativa sulla linea COX-2 positiva JJN3 con entrambi gli inibitori utilizzati. Le cellule inibite dall'indometacina e dall'NS 398, dopo 24 ore di incubazione con PGE2, mostrano una ripresa della capacità proliferativa e lo stimolo indotto da PGE2 porta ad un aumento della cellularità superiore al 100% iniziale.La capacità della PGE2 di revertire l'inibizione è dovuta principalmente al fatto che la sua somministrazione fornisce nuovo substrato alle cellule in cui esso viene a mancare in quanto l'enzima che la produce è inibito.L'osservazione preliminare che la PGE2 reverte l'effetto dei farmaci inibitori anche sulle cellule RPMI 8226 mette in evidenza il possibile ruolo trofico della PGE2 non solo nelle cellule COX-2 positive ma anche in quelle con bassa espressione dell'enzima. La PGE2 sembrerebbe in grado di favorire la proliferazione cellulare anche in cellule che non sono in grado di produrre autonomamente questo mediatore o lo producono solo in minima quantità. Il motivo di tale effetto non è, però, ancora stato chiarito dagli studi effettuati finora. L'effetto reverente della PGE2 è, però, solo transitorio e dopo aver raggiunto in breve tempo (24 ore) il suo effetto massimo tende poi a svenire con il passare delle ore. Dopo 72 ore di incubazione, infatti, l'aggiunta di PGE2 alle cellule JJN3 non porta ad un aumento della cellularità, ma anzi se ne evidenzia un forte calo.Il motivo di questo effetto tardivo attualmente non è chiaro. Una possibile spiegazione potrebbe essere la saturazione dei recettori in seguito ad un'esposizione prolungata al farmaco. La PGE2, infatti, legandosi ai propri recettori presenti sulle cellule precedentemente inibite ne stimola immediatamente la ripresa proliferativa; se però tale legame si prolunga nel tempo, oltre il periodo di inibizione cellulare, probabilmente tutti i recettori vengono ad essere bloccati contemporaneamente e la stessa PGE2 impedisce la proliferazione cellulare. Un'ulteriore spiegazione potrebbe essere la necessità di fornire alle cellule un supporto costante nel tempo, ovvero somministrare la PGE2 non solo all'inizio dell'esperimento, ma per tutta la sua durata. L'aggiunta del farmaco ogni 24 ore potrebbe rinnovarne la potenza d'azione, mentre se somministrato solo inizialmente in singola dose, il suo effetto potrebbe progressivamente diminuire con il passare delle ore. 