Per verificare l'eventuale presenza di mutazioni, un frammento (1143 pb) del gene EphA3 a cavallo del dominio tirosin chinasico, è stato amplificato, purificato e sequenziato.In particolare, sono stati amplificati due segmenti parzialmente sovrapposti, utilizzando due coppie di primers: 1F-1R, 2F-2R (Tabella 7.) Sono stati sottoposti a tale reazione 45 campioni che risultavano iperespressi dall'analisi quantitativa; ognuno di essi è stato amplificato in duplicato, triplicato o in quadruplicato, a seconda del livello di espressione presentato.Primer SequenzaLa reazione è stata condotta utilizzando il Thermal Cycler 2400 ed i prodotti di amplificazione così ottenuti di 593 bp (1F-1R) e 592 bp (2F-2R) sono stati visualizzati mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio al 2%, colorato con etidio bromuro.I prodotti di amplificazione ottenuti dalla reazione polimerasica a catena, sono stati sottoposti ad una procedura di purificazione, mediante il QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen), secondo le istruzioni indicate dalla casa produttrice. In caso di presenza di aspecifici, rilevati al momento del controllo degli amplificati, è stata effettuata una purificazione da gel, che prevede una corsa elettroforetica lunga degli amplificati su gel di agarosio all' 1,5%. Le bande ottenute, visibili grazie all'intercalante etidio bromuro, sono state successivamente tagliate al transilluminatore. Una volta calcolato il peso della banda, il DNA è stato estratto dal gel di agarosio e purificato mediante il QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen). La resa della purificazione viene analizzata mediante corsa elettroforetica breve su gel di agarosio al 2%.La successiva reazione di sequenza è stata condotta utilizzando una mix particolare, laTerminator Ready Reaction Mix (RR), premiscela di tutti i componenti necessari, salvo ovviamente il template cDNA ed i primers; per quanto riguarda questi ultimi sono stati utilizzati i medesimi impiegati nella reazione polimerasica a catena. In ogni provetta vengono introdotti 2 µl di RR (ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit), 1 µl di primer forward o reverse corrispondente a 1.6 picomoli e una quantità di cDNA che dipende dalla lunghezza del frammento da sequenziare (nel nostro caso pari a 10 ng), in un volume finale di 10 µl.La reazione di sequenza è stata effettuata utilizzando il Thermal Cycler 2400 Perkin Elmer, con le seguenti condizioni di reazione: 96°C per 10 secondi, 60°C per 4 minuti per 25 cicli.I prodotti sono stati sottoposti ad una reazione di purificazione finale utilizzando le colonnine "AutoSeq G-50" (Amersham Pharmacia) in cui è presente una resina (G-50) che consente, operando una sorta di cromatografia, di eliminare i dideossinucleotidi fluorescinati in eccesso. La purificazione finale è stata condotta secondo le istruzioni della casa produttrice e l'eluato raccolto conservato a -20°C.Il sequenziamento è stato effettuato mediante elettroforesi capillare con lo strumento ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Applied Byosistems), dotato di 16 capillari in silice fusa, che consente di analizzare i frammenti di DNA marcati con la fluorescenza. I prodotti della reazione di sequenza purificati, dispensati in una piastra da 96 pozzetti (MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate), in seguito ad una fase di denaturazione a 96°C per 2 minuti, vengono caricati nei capillari grazie ad un'iniezione elettrocinetica. La fluorescenza emessa dai frammenti di DNA, in seguito all'eccitazione dei fluorocromi da parte di una luce laser, viene captata dai rivelatori. Le varie fluorescenze emesse vengono raccolte simultaneamente, separate da uno spettrografo e successivamente lette ed interpretate dal software collegato allo strumento che, come risultato finale, dà un elettroferogramma.