Il monitoraggio molecolare è fino a 10 3 -10 4 volte più sensibile rispetto all'analisi citogenetica convenzionale, ed è quindi in grado di identificare una cellula leucemica su 100.000; questo approccio usa un adattamento della PCR (Polymerase Chain Reaction) noto come PCR con retrotrascrizione (RT-PCR), introdotto alla fine degli anni '90. Il primo step di questa reazione è appunto retrotrascrivere l'mRNA di BCR/ABL in una copia di DNA; poi, attraverso i successivi rounds di amplificazione della copia di DNA della PCR, il DNA diventa abbastanza abbondante da essere detettabile (118). Data l'importanza sempre maggiore della valutazione molecolare della malattia residua, c'è stato uno sforzo internazionale per allineare i valori ottenuti in laboratori diversi, superando le molte variabilità di tecniche e processazioni usate dai singoli laboratori. A questo scopo, è stata creato l'International Scale (IS), stabilito a un meeting di esperti a Bethesda nel 2005 in base ai risultati ottenuti dallo studio IRIS; ogni laboratorio da allora applica ai propri risultati uno specifico fattore di conversione tale da rendere meglio confrontabili valori ottenuti in laboratori diversi (119).La risposta molecolare deve essere quindi valutata secondo l'Interational Scale, come rapporto fra il trascritto di BCR/ABL1 e quello di ABL1 (o analoghi geni di controllo riconosciuti a livello internazionale), espresso in percentuale su scala logaritmica, dove 10%, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.0032% e 0.001% corrispondono rispettivamente a una riduzione di 1, 2, 3, 4, 4.5 e 5 logaritmi rispetto a un baseline standard definito come 100%. Una espressione di BCR/ABL <0.1% corrisponde a una risposta molecolare maggiore (MMR); un livello di risposta MR 4 è definito come malattia residua detettabile con trascritto <0.01% oppure malattia non detettabile con >10000 copie di trascritto di ABL1; similmente, una MR 4.5 è pari a BCR/ABL1< 0.0032% oppure non detettabile con >32000 copie di ABL1, e MR 5 corrisponde a < 0.001% oppure >100000 copie di ABL1.Secondo queste ultime raccomandazioni, dunque, il termine remissione molecolare completa, inizialmente usato per identificare pazienti con BCR/ABL pari a 0%, andrebbe sostituito da quello di leucemia molecolarmente non detettabile, seguito dalla specifica del numero di copie del gene di controllo (120). Il termine remissione completa, infatti, è ora considerato inappropriato poichè evoca una condizione di libertà da malattia che si è dimostrata non realistica in pazienti analizzati con modalità più sensibile. Tali definizioni comunque dipendono criticamente dall'abilità dei singoli laboratori di misurare il numero assoluto delle copie del gene di controllo, e quindi dalla capacità di raggiungere la sensibilità di PCR maggiore possibile.Secondo uno studio del 2007 che ha seguito un gruppo di 53 pazienti estratti dal trial IRIS, dopo il raggiungimento del target della MMR, per lo più avvenuta entro i 18 mesi, la quota di malattia residua in termini di BCR/ABL alla RT-PCR continua a decrescere stabilmente anche dopo anni di terapia protratta con Imatinib: in particolare, la probabilità di trascritto "undetectable" aumenta considerevolmente da 36 a 81 mesi di trattamento in prima linea (7% versus 52%) (121).Il monitoraggio molecolare, da indicazioni NCCN, è raccomandato ogni 3 mesi fino al raggiungimento della CCR; dopo questo traguardo, è possibile effettuarlo ogni 3 o 6 mesi (12). Una frequenza di monitoraggi molecolari appropriata è potenzialmente in grado di fornire avvisaglie precoci di una recidiva in atto, consentendo tempestivi interventi terapeutici prima che la recidiva si manifesti clinicamente.Rispetto al semplice aumento del trascritto, il calcolo del tempo di raddoppiamento di BCR/ABL è in grado di operare una distinzione fra perdita della risposta derivante da resistenza o da mancata aderenza: Branford et. al hanno documentato tempi di raddoppiamento sensibilmente più brevi in caso di progressione alle fasi blastica o accelerata, recidiva post-discontinuazione della terapia in CMR e interruzione momentanea del trattamento durante un intero intervallo di misurazione. Mentre il tempo di raddoppiamento in tali casi era costantemente breve (in media 9 giorni), l'aumento del trascritto era invece altamente variabile (da 71 a 9.5 volte il precedente), e inoltre quest'ultimo dipendeva strettamente dall'intervallo di tempo fra le misurazioni, al contrario del tempo di raddoppiamento, da esso indipendente. Tempi di raddoppiamento decisamente più lunghi (media di 48 giorni) si sono invece verificati in caso di insorgenza di mutazioni di BCR/ABL in pazienti ancora in fase cronica, consentendo quindi di intervenire in tempo con analisi mutazionale e eventuale cambiamento di terapia. L'adozione del tempo di raddoppiamento viene quindi raccomanda da un lato come marker di potenziale non-aderenza, dall'altro come strumento per valutare la rapidità di espansione delle cellule leucemiche in caso di insorgenza di mutazioni del dominio chinasico (122).Attualmente l'esecuzione di una analisi mutazionale del dominio chinasico di BCR/ABL non è raccomandata routinariamente nel monitoraggio della risposta; le indicazioni principali a tale esame sono infatti, in caso di terapia di prima linea, il fallimento o la risposta subottimale alla terapia e la progressione alle fasi accelerata e blastica; l'aumento del trascritto alla RT-PCR quantitativa implica la necessità di un'analisi mutazionale soltanto qualora si abbia la perdita della risposta molecolare maggiore (MMR). Durante il trattamento di seconda linea con TKI di seconda gerazione le indicazioni rimangono il "failure" e la risposta subottimale alla terapia. (123)