Dopo somministrazione in bolo endovena la mitomicina presenta una farmacocinetica dose-dipendente e si distribuisce rapidamente nel compartimento intracellulare. La rapida scomparsa dal plasma dopo somministrazione endovenosa di dosi elevate (superiori a 20 mg/m²) era stata messa in dubbio da alcuni studi. Si pensava che le capacità di metabolismo del farmaco potessero essere saturate. Recentemente è stata dimostrata la sua linearità a dosi fino a 60 mg/m². Nell'animale di laboratorio il farmaco raggiunge elevate concentrazioni nel rene, occhi, muscoli, polmoni, intestino e stomaco. La mitomicina nei tessuti tumorali raggiunge concentrazioni decisamente più elevate che in tessuti sani. L'emivita plasmatica è bifasica con una fase "a" di circa 5 minuti ed una fase "b" di 54 minuti.