La stimolazione ovarica con gonadotropine è una componente fondamentale del trattamento di procreazione medicalmente assistita, il buon risultato della quale aumenta le probabilità di ottenere un successo in termini riproduttivi. L'utilizzo di iniezioni giornaliere di gonadotropine determina la crescita di molteplici follicoli e il conseguente recupero di più ovociti da utilizzare per l'inseminazione in vitro o eventualmente da congelare e utilizzare successivamente. La raccolta ovocitaria in termini quantitativi varia da donna a donna e dipende da numerosi fattori, tra cui l'età cronologica, il protocollo e i dosaggi della stimolazione, lo stato della riserva ovarica. I dati in letteratura ritengono che, in una donna di età inferiore a 40 anni, un'adeguata risposta ovarica sia caratterizzata dal recupero di 8-10 ovociti (range 5-14) per ciclo di stimolazione 47,48,49 321,34 .Il BMI non si è rivelato un parametro correlato alla risposta ovarica, né all'AMH: riteniamo però che possa avere un ruolo adiuvante nella scelta del dosaggio di gonadotropine, ma che non possa sicuramente essere utilizzato da solo.La AFC rappresenta il marcatore che attualmente nella pratica clinica esprime con maggior accuratezza lo stato della riserva ovarica della paziente. I risultati dimostrano una forte associazione tra l'AMH e la conta dei follicoli antrali (r=0.73, p=0.0001), espressione del fatto che l'ormone anti-Mulleriano viene prodotto dalle cellule della granulosa che costituiscono gli stessi follicoli antrali visibili all'ecografia (cfr. tabella 3).Entrambi i parametri risultano correlati significativamente con la risposta ovarica allo stimolo gonadotropinico, anche se l'AMH presenta una potenza superiore (cfr. tabella 5 e 6). Numerosi studi hanno dimostrato l'esistenza di una relazione tra i livelli di AMH e la AFC e il numero di ovociti recuperati (cfr. paragrafo 5.4). Questo studio evidenzia anche la correlazione di tali marcatori con il parametro che esprime la sensibilità dell'ovaio allo stimolo esogeno: entrambi i marker presentano infatti una buona correlazione negativa con le unità di FSH necessarie al recupero di un ovocita (Gn/oo), (cfr. tabella 5).I due modelli calibrati di regressione lineare hanno dimostrato che sia l'AMH, sia la AFC presentano una relazione statisticamente significativa con la risposta ovarica, senza influenza da parte dell'età. Dal punto di vista clinico entrambi i modelli tendono a sovrastimare le risposte estreme, mentre sottostimano le risposte intermedie, ma emerge la superiorità dell'AMH come marcatore predittivo di risposta ovarica rispetto all'AFC, in quanto l'errore medio assoluto del modello di regressione calibrato risulta inferiore a quello della AFC (cfr. appendice -pag. VIII-IX ).Entrambi i marcatori presentano vantaggi e svantaggi nell'utilizzo nella pratica clinica. I livelli sierici di AMH non sono influenzati dal giorno del ciclo mestruale 241,243,244,245 , come accade per gli altri marker ormonali, né dall'assunzione di contraccettivi orali 251 o di Analoghi del GnRH 250 , né in corso di gravidanza 249 327,328 . Le variazioni tra un ciclo e l'altro nella determinazione della AFC indubbiamente risultano essere più significative nelle giovani donne che ovulano rispetto a quelle infertili.In questo studio la AFC è stata misurata lo stesso giorno del dosaggio dell'AMH ed è stata valutata da operatori diversi: nonostante si tratti di una misura operatoredipendente 240,241 e soggetta a maggiore variabilità inter-e intra-ciclo mestruale rispetto all'AMH, si è dimostrata nel complesso un buon marker predittivo di risposta ovarica, seppure con potenza inferiore a quella dell'AMH (cfr. appendice-regressione lineare).L'esperienza dell'operatore e il tempo che costui dedica all'indagine ultrasonografica sono fattori determinanti nella definizione della AFC, ma potrebbero essere in futuro superati tramite l'acquisizione dell'immagine 3D, già proposta da alcuni autori 329,330 332,295 , dimostrando l'utilità del suo dosaggio quando i livelli di FSH risultano ancora nei range di normalità 295 . Tutto ciò risulta ben evidente nel presente studio in cui alcune pazienti considerate aventi un'adeguata riserva ovarica (in base all'età e ai valori di FSH inferiori a 10 UI/l) hanno mostrato resistenza alla stimolazione ovarica. Ad esempio una paziente di 35 anni con FSH basale di 8.3 UI/l, una AFC di 9 microfollicoli, candidata al primo trattamento di PMA di II livello per sterilità maschile, è stata impostata come normal responders, ma è stato necessario aumentare il dosaggio di gonadotropine fino a 450 UI/die, in corrispondenza del primo monitoraggio (7° giornata di stimolazione), per un totale di 5100 UI di gonadotropine distribuite in 15 giorni, che ha permesso il recupero di 6 ovociti (Gn/oo= 850 UI per ovocita). I livelli di AMH pre-trattamento della paziente sono risultati essere pari a 0.9 ng/ml, ovvero appartenenti al più basso quartile di livelli di AMH del campione studiato. Si tratta di un esempio clinico tratto dal campione studiato che mostra come la conoscenza dei livelli di AMH pre-trattamento possa svolgere un ruolo coadiuvante nella scelta del dosaggio iniziale di FSH più idoneo (nell'esempio citato 300 UI, anziché 225 UI). E' bene sottolineare l'importanza del dosaggio iniziale di FSH, in quanto gli incrementi successivi di gonadotropine possono solo migliorare la crescita dei follicoli già selezionati, poiché il reclutamento follicolare avviene nei primi giorni mediante i dosaggi iniziali di stimolazione 47 . E' stato inoltre dimostrato che sono proprio le pazienti con livelli basali di FSH normali, come quelle reclutate in questo studio, a trarre beneficio da una dose individualizzata di gonadotropine, al fine di migliorare le performance della risposta ovarica 47 ; mentre le pazienti con AFC inferiore a 5 microfollicoli sembrano non trarre vantaggi dall'aumento della dose di gonadotropine 162 : sono pertanto pazienti candidate a protocolli di stimolazione diversi, come il protocollo con citrato di clomifene, gonadotropine a basso dosaggio e GnRH antagonisti; il protocollo breve flare up con GnRH agonisti; il protocollo su ciclo semispontaneo (cfr. stimolazione ovarica, a fronte di un vantaggioso tasso di gravidanza clinica 313 . Lo studio ha quindi evidenziato come un unico dosaggio di AMH prima delle tecniche di superovulazione ovarica possa offrire importanti vantaggi.Alcuni studi degli ultimi anni hanno ricercato un valore soglia di AMH in grado di individuare la poor response (cfr. paragrafo 5.4). Il test di riserva ovarica ideale dovrebbe permettere di individuare le donne che non hanno chance di gravidanza dopo trattamenti di IVF, in modo da escludere tali pazienti dal trattamento con l'obiettivo di ridurre i costi del sistema sanitario, evitare trattamenti inutili, rischi chirurgici e lo stress psicologico di coppia per la delusione. Tale tentativo risulta però difficile perché anche l'AMH non sembra presentare un valore predittivo assoluto di poor response, con conseguente presenza di risultati falsi positivi e falsi negativi nella ricerca di donne con minime chance. Emerge il problema del difficile confronto tra gli studi, in quanto manca in letteratura una definizione universale di poor response 158 . La recente review di La Marca e coll. ha stabilito che l'identificazione delle poor responders tramite il dosaggio dell'AMH, comporta una quota del 10-20% di falsi positivi 286 , con conseguenze negative notevoli sulla vita della coppia in quanto tale risultato potrebbe erroneamente vietare a queste donne di tentare un trattamento di fecondazione in vitro. Inoltre è stato ampiamente dimostrato che anche le poor responders, seppur con probabilità inferiori, possono concepire in seguito ai trattamenti di IVF 166,49 , soprattutto le giovani poor responders 333,334 . Non sembra corretto escludere le pazienti dai trattamenti di IVF sulla base dei livelli di AMH, se non in presenza di livelli bassissimi, come compresi tra 0.1 e 0.35 ng/ml 286 , e ripetuti insuccessi. Il presente studio conferma tutto ciò, identificando Il parametro della qualità ovocitaria, definita in questo studio dalla percentuale di ovociti maturi tra gli ovociti recuperati al pick up non mostra alcuna correlazione significativa con i rispettivi marcatori di risposta ovarica. Alcuni autori hanno preso in considerazione solo il numero degli ovociti maturi (MII) come indice di qualità ovocitaria e hanno evidenziato correlazioni significative con i livelli sierici di AMH 290,301,293 o con i livelli nel liquido follicolare 306,307 . Anche il presente studio evidenza una debole ma significativa correlazione tra i livelli sierici di AMH e il numero di ovociti maturi (r=0.35, p=0.006), (cfr. tabella 3), evidenziata anche nella suddivisione della popolazione secondo percentili di livelli di AMH (p=0.06), che mostra come le donne all'aumentare dell'AMH abbiano recuperato un maggior numero di ovociti maturi (cfr. tabella 4).Riteniamo però che il numero di ovociti maturi sia un parametro strettamente correlato al numero di ovociti recuperati e che non esprima correttamente l'aspetto qualitativo, come invece riteniamo possa esprimere la percentuale di ovociti maturi sul totale di quelli recuperati. Esistono ancora perplessità in merito al valore prognostico del dosaggio dell'AMH nello studio della risposta ovarica qualitativa (cfr. paragrafo 5.5). E' importante sottolineare che il declino dei livelli sierici dell'AMH non dipende esclusivamente dalla riduzione della AFC, ma riflette il grado funzionale e l'aumento del danno apoptotico delle cellule della granulosa che costituiscono i follicoli 334,335 . La riduzione dell'AMH con l'età cronologica può essere secondaria alla compromissione dell'attività delle cellule della granulosa, che è indipendente dalla raccolta ovocitaria 337 , ma può spiegare un'associazione tra i livelli dell'AMH e la qualità degli ovociti 301 . Sono necessarie molteplici ricerche per chiarire il ruolo dell'AMH come indicatore qualitativo dell'attività delle cellule della granulosa e del pool follicolare ovarico.La qualità degli embrioni può essere espressa dal numero di embrioni di ottima o buona qualità ottenuti con le tecniche in vitro in un ciclo di trattamento (cfr. paragrafo 4.3). Recentemente alcuni studi hanno individuato correlazioni tra i livelli di AMH pretrattamento delle pazienti e la qualità degli embrioni ottenuti in vitro in seguito alla stimolazione ovarica 292,308 , non confermate da altri 303,297,309  Italia. Tale Sentenza permette ai medici specialisti di scegliere il numero di ovociti da fertilizzare sulla quota di quelli recuperati, che deve essere indubbiamente "quello strettamente necessario", ma non necessariamente inferiore ad un massimo di 3, previsto dalla Legge, senza l'obbligo di "un unico e contemporaneo impianto". Anche le coppie incluse in questo studio hanno beneficiato dell'applicazione della Sentenza del maggio 2009, per tal motivo il numero di ovociti messi a fertilizzare con il seminale del partner in ciascuna coppia è risultato essere determinato da una scelta specialistica assolutamente personalizzata da parte del ginecologo e del biologo che hanno tenuto conto di tutte le variabili che caratterizzano la coppia: l'età della paziente, eventuali precedenti trattamenti, la qualità e il numero degli ovociti a disposizione, la qualità del seminale e ovviamente la volontà della coppia in merito ad un eventuale possibile crioconservazione di embrioni. Pertanto la valutazione della qualità degli embrioni creati in vitro, il cui numero non risulta fisso, né pari a tre come prima della Sentenza della Corte Costituzionale, né equivalente alla fertilizzazione di tutti gli ovociti maturi come avviene nei Centri di PMA all'estero, instaura una serie di confondenti tali per cui si evidenza maggior probabilità di ottenere embrioni di ottima/buona qualità nelle coppie in cui si sono messi a fertilizzare più ovociti. La correlazione tra i livelli di AMH della paziente e la qualità degli embrioni in vitro non è stata pertanto valutata, se non nella statistica descrittiva in cui è stato riportato il numero medio e la percentuale di embrioni di ottima qualità trasferiti nelle pazienti che hanno effettuato l'Embryo Transfer e il numero delle pazienti che hanno trasferito da 2 (gold standard), a 1 o nessun embrione di ottima qualità.Il presente studio non ha individuato correlazioni tra i livelli sierici di AMH e la gravidanza. I dati in letteratura a tal proposito sono molto controversi (cfr. paragrafo 5.5). Indubbiamente non è stato selezionato un campione idoneo per la valutazione di un marcatore predittivo di gravidanza, che in questo studio rappresenta un outcome secondario di valutazione. La causa prevalente di sterilità tra le coppie reclutate è il fattore maschile (57.4%): si può pertanto ipotizzare che l'eventuale fallimento del successo riproduttivo non dipenda esclusivamente dalle caratteristiche della riserva ovarica della donna, in termini quantitativi e qualitativi, ma anche dalla prevalenza del fattore maschile come causa di infertilità, che indubbiamente influisce sulla qualità degli embrioni formati in seguito alla tecnica di microiniezione di uno spermatozoo (ICSI). In 5 coppie sono stati utilizzati spermatozoi crioconservati derivati da precedente TESE e in 2 coppie spermatozoi da agoaspirato testicolare (TESA) effettuato il giorno del pick up. Si sottolinea come la gravità del fattore maschile nel campione studiato, dato ad esempio dall'azoospermia (cioè dall'assenza totale di spermatozoi nell'eiaculato), possa aver influito pesantemente sugli outcome riproduttivi, indipendentemente dalla risposta ovarica e dalla qualità ovocitaria. La sterilità deve essere sempre considerata un problema di coppia che dipende dalla combinazione dei potenziali riproduttivi di entrambi i partner 6 .Il recente studio di Lee e coll. ha concluso che la valutazione dell'AMH prima della stimolazione ovarica fornisce una stima delle chance di avere un figlio (live birth) in seguito alle tecniche in vitro nelle coppie la cui età della partner femminile sia superiore a 35 anni e/o si tratti di un esclusivo fattore femminile come causa di infertilità. Nelle giovani donne invece sembra essere la morfologia degli embrioni ottenuti in vitro il parametro maggiormente associato alla probabilità di gravidanza 314 . L'autore ritiene che i marker di riserva ovarica possano essere utilizzati come marcatori predittivi di gravidanza nella popolazione di donne caratterizzate da iniziale riduzione della riserva ovarica, che tipicamente si verifica a partire dai 35 anni 338 , e nelle coppie la cui causa di infertilità non sia data dal fattore maschile.Nel nostro campione il 29.5% delle pazienti (18/61) ha ottenuto una gravidanza, di queste il 50% supera i 35 anni di età. Né l'età, né l'AMH sono risultati marcatori predittivi di gravidanza, nemmeno attraverso l'analisi di regressione logistica multivariata. I risultati del nostro studio rivelano che l'unico parametro che sembra presentare una correlazione significativa con la gravidanza clinica è il numero di ovociti recuperati al pick up (p=0.05), (cfr. tabella 9), dimostrazione del fatto che gli aspetti qualitativi della risposta ovarica sembrano essere una misura indiretta degli aspetti quantitativi. Relativamente al sottogruppo di coppie, la cui sterilità non è il fattore maschile, è evidente una correlazione maggiormente significativa tra il numero degli ovociti recuperati e l'occorrenza della gravidanza (p=0.03) e una correlazione che si avvicina alla significatività (p=0.09) con la risposta ovarica (Gn/oo). Sembra quindi esistere una relazione tra la risposta ovarica e gli outcome riproduttivi, maggiormente evidenziata laddove la causa di sterilità non sia il fattore maschile. Il recupero di un numero elevato di ovociti pare un reale fattore prognostico positivo di gravidanza.Questa considerazione è valida soprattutto nei Centri specializzati all'estero, dove la possibilità di fertilizzare tutti gli ovociti maturi aumenta indubbiamente le probabilità di gravidanza non solo nel ciclo a fresco, ma anche in quelli successivi da scongelamento embrionario, con aumento della probabilità cumulativa di gravidanza in seguito ad un unico ciclo di stimolazione. Nel nostro studio le pazienti che hanno recuperato più ovociti sembrano avere maggiori probabilità di gravidanza, pertanto siamo portati a ritenere che gli aspetti qualitativi della risposta ovarica siano strettamente legati agli aspetti quantitativi.Uno dei principali problemi che interessa la capacità di predire il successo riproduttivo risiede proprio nel fatto che la maggior parte degli studi si limita ad individuare una correlazione statistica rispetto all'avvenuta gravidanza dopo un solo tentativo di IVF.Forse questo non rappresenta la strategia ideale per correlare il potenziale riproduttivo di una coppia al risultato di un test. Probabilmente occorrerebbe studiare una serie di cicli di trattamento per coppia per giungere a delle conclusioni 339 . Hendriks e coll.hanno analizzato la capacità predittiva di diversi test di riserva ovarica nei confronti dell'ottenimento della gravidanza dopo tre cicli e hanno constatato che l'età e l'AMH sono gli unici marcatori predittivi della gravidanza dopo tre trattamenti. I livelli di AMH non sono però in grado di aggiungere potere predittivo a quello dell'età femminile 340 .Questo implica che la capacità di ottenere una gravidanza continua a dipendere fortemente dall'età della donna e che i test di riserva ovarica che forniscono aspetti quantitativi falliscono nel tentativo di aggiungere informazioni.Alcuni studi hanno evidenziato dei cut-off di AMH, al di sotto dei quali la probabilità di gravidanza risulta nettamente ridotta (1.1 ng/ml secondo Hazout e coll. 290 ; 1.4 ng/ml secondo Freour e coll. 323 ; 2.7 ng/ml secondo Silberstein e coll. 292 ). Il presente studio non ha rilevato differenze nel raggiungimento della gravidanza nei diversi gruppi di suddivisione delle donne secondo percentili relativi ai livelli di AMH. Anche il recente studio di Guerif, che ha incluso 599 donne, non ha osservato differenze nei livelli di AMH tra le pazienti che hanno o non hanno raggiunto la gravidanza; ha invece riscontrato due gravidanze in donne con concentrazioni sieriche di AMH inferiori a 0.5 ng/ml 309 . Tale riscontro era già stato evidenziato da Nakhuda e coll. che avevano individuato due gravidanze in pazienti con livelli di AMH inferiori alla soglia di 0.35 ng/ml 295 . In questo studio la paziente con più bassi livelli sierici di AMH che ha ottenuto la gravidanza, presentava un AMH pre-trattamento pari a 0.5 ng/ml.