Uno dei numerosi campi di applicazione delle tecniche di indagine molecolare è rappresentato dall'identificazione delle specie batteriche che permette di evidenziare, a partire da diversi campioni di materiale biologico, anche ceppi che non sono coltivabili.Lo studio delle sequenze nucleotidiche ha reso possibile l'acquisizione di conoscenze sempre più approfondite in ambito microbiologico, aumentando l'accuratezza delle indagini rispetto alle metodiche tradizionali. Alla luce di queste osservazioni, alcuni laboratori europei hanno deciso di collaborare ad un comune progetto il cui scopo è quello di sviluppare, perfezionare e applicare metodi molecolari per facilitare lo studio della complessa composizione della microflora intestinale dell'uomo. Sulla base degli studi effettuati in questo campo, è anche possibile valutare le modificazioni indotte dalla dieta sull'equilibrio del microbiota. E' stato realizzato un ricco database di sequenze di 16S rRNA per l'identificazione dei batteri intestinali, partendo dal sequenziamento di frammenti di 16S rRNA. Per ottenere il 16S rRNA sono stati isolati i batteri contenuti in campioni fecali appartenenti a soggetti di varie età raccolti e conservati a basse temperature, sono stati estratti gli acidi nucleici e le sequenze in studio sono state amplificate mediante reazione polimerasica a catena 364 .Già nel 1994, la PCR è stata utilizzata per quantificare la presenza di cinque specie batteriche che normalmente fanno parte del microbiota intestinale dell'uomo. A questo scopo è stato ottenuto un set di primer complementari al 16S rDNA (geni rRNA) che permettessero di rilevare la presenza di Clostridium clostridiiforme, Clostridium perfrigens, Clostridium leptum, Bacteroides vulgatus, Bacteroides distasonis e Bacteroides thetaiotamicron 365 .Due anni dopo l'amplificazione con reazione polimerasica a catena basata sul 16S rRNA è stata utilizzata per identificare i batteri che risultano essere predominanti nell'intestino dell'uomo, valutando le differenze interindividuali. In questo caso i generi analizzati sono stati Bifidobacteria, Eubacteria, Fusobacteria, Peptostreptococci, Lactobacilli, Escherichia, Shigella, Yersinia, Bacteroides, Clostridia, e Salmonella 366 .In un più recente studio italiano condotto da Matteuzzi et al. una metodica molecolare basata sul Ribotyping automatico associato alla PCR è stata impiegata per identificare a livello intestinale e vaginale particolari ceppi di Lactobacilli in soggetti che avevano assunto una miscela di probiotici contenente L .acidophilus, L. casei, L. plantarum e L. delbrueckii subspecie bulgaricus, B. infantis, B. longum, B. breve e Streptococcus salivarius subspecie salicinius. Sono state innanzitutto studiate le sequenze di rDNA 16S-24S e i profili ribosomiali, in modo da poter realizzare dei sets di primer specie-specifici 367 . Il Ribotyping è generalmente eseguito utilizzando un sistema che produce un pattern di RiboPrint utilizzando rRNA di Escherichia coli digerito con endonucleasi di restrizione 368 .In un altro studio del 2003 sono stati analizzati 116 ceppi di Salmonella enterica di cui 64 Multi-Drug Resistant, utilizzando il Ribotyping automatico seguito dalla separazione dei frammenti di acido nucleico mediante elettroforesi su gel, ottenendo risultati con una sensibilità prossima al 100% 369 .La stessa tecnica, con l'ausilio di endonucleasi di restrizione per la frammentazione degli acidi nucleici (EcoRI e BamHI), è stata utilizzata per analizzare la presenza di ceppi di Enterococcus faecium vancomicina-resistenti a livello intestinale in volontari sani e in soggetti ospedalizzati 370 .In ambito più strettamente pediatrico, tecniche di identificazione molecolare e analisi genetica sono state utilizzate in numerosi studi volti a determinare la composizione della microflora intestinale nell'infanzia in base al tipo di alimentazione (latte materno o formule adattate) o le modifiche conseguenti alla somministrazione di terapie antibiotiche. A questo proposito è stato condotto uno studio basato sull'utilizzo della PCR seguita dalla analisi dei frammenti amplificati mediante elettroforesi su gel: sono stati valutati i cambiamenti che si verificavano a livello del microbiota intestinale in un gruppo di bambini sottoposti a terapia antibiotica con amoxicillina o con cotrimossazolo 371 .Come già stato riportato precedentemente, la microflora intestinale non è stabile nel tempo e, a partire dalla nascita, i diversi ceppi batterici si susseguono nella colonizzazione enterica. Gli studi tradizionali volti ad identificare l'evoluzione del profilo di colonizzazione si sono sempre basati su metodiche colturali, in grado di identificare Un gruppo svedese ha invece concentrato l'attenzione sulla presenza di Escherichia coli a livello intestinale, esaminando campioni di feci raccolti a 1,2,4 e 8 settimane, a 6 e a 12 mesi di età. I vari ceppi sono stati tipizzati utilizzando l'amplificazione di segmenti polimorfi di DNA e la PCR è stata utilizzata per caratterizzare i geni responsabili della virulenza (es. P-fimbrie) 350 .Uno studio simile è stato condotto per determinare il legame tra le caratteristiche filogenetiche e la capacità di alcuni ceppi di Escherichia coli di persistere nell'intestino del bambino nonostante la crescita 378 .Un gruppo svedese ha sfruttato tecniche molecolari per indagare la colonizzazione intestinale da parte di Staphylococcus aureus in un gruppo di bambini di età compresa tra i 3 giorni e le 8 settimane; i ceppi identificati sono stati confrontati con quelli presenti a livello cutaneo e fecale nei genitori. Circa il 60% dei bambini presentava S. aureus a livello intestinale all'età di un mese, mentre per le madri la percentuale era del 24%; anche la quantità di colonie presenti era diversa, essendo maggiore nel primo gruppo (10 6,8 CFU/gr vs 10 3,2 CFU/gr). Il 90% dei ceppi di S. aureus isolati in neonati di 2 settimane di età era identico a quelli isolati nelle madri. La colonizzazione da parte di questi batteri era più frequente nei figli i cui genitori erano a loro volta colonizzati (il 96% dei bambini i cui genitori erano positivi, contro il 37% di quelli per cui S. aureus non era isolabile né dalla madre né dal padre). Questi dati suggeriscono che i batteri presenti a livello della cute dei genitori colonizzano facilmente l'intestino dei figli 379 .Al di là delle applicazioni nello studio della flora di bambini sani, le tecniche molecolari trovano un'applicazione anche nella valutazione del microbiota intestinale in situazioni patologiche. E' stato condotta un'indagine sulla microflora di neonati affetti da enterocolite necrotizzante, allo scopo di isolare vari ceppi di Enterobacteriaceae con amplificazione del loro genoma attraverso PCR e separazione dei frammenti con elettroforesi su gel. Le specie più frequentemente isolate sono state Escherichia coli, Klebsiella spp. e Enterobacter spp.; la colonizzazione da parte di Enterobacteriaceae è risultata elevata in neonati di basso peso rispetto all'età gestazionale, ma non è stata rilevata alcuna associazione significativa tra i singoli ceppi e l'enterocolite necrotizzante 380 .La reazione polimerasica a catena, l'elettroforesi su gel ed il Ribotyping sono stati utilizzati per studiare la colonizzazione da parte di ceppi di Serratia marcescens in neonati ricoverati in terapia intensiva, prelevando campioni di sangue, urine, saliva, feci e liquor 381 .Recentemente è stata condotta un'analisi volta a confrontare la microflora intestinale di bambini con intolleranza al glutine e di controlli sani di pari età. Le specie Lactobacillus curvatus, Leuconostoc mesenteroides e Leuconostoc carnosum sono risultate essere tipiche dei soggetti celiaci, mentre il Lactobacillus casei è stato identificato con maggior frequenza nell'intestino dei bambini sani; differenze sono state rilevate anche nella colonizzazione da parte dei bifidobatteri, con una minor presenza di Bifidobacterium adolescentis negli intolleranti al glutine 382 .Infine, tecniche molecolari sono state utilizzate anche per definire la colonizzazione da parte di ceppi di Staphylococcus aureus meticillino-resistenti in bambini ricoverati in ospedale: più del 40% dei soggetti analizzati è risultato colonizzato 383 .  I soggetti reclutati nello studio sono stati divisi in due gruppi: