Florey rimase a Cambridge fino al 1932, aumentando la sua fama di patologo dotato di ottima intelligenza e di una notevole destrezza manuale in laboratorio. Nel 1931 egli decise di fare richiesta per la cattedra di patologia Joseph Hunter alla Sheffield University Medical School, che poteva vantare due membri della Royal Society: John Beresford Leathes e Edward Mellanby. Florey venne assunto nel marzo 1932 nonostante possedesse poca esperienza della materia rispetto a quella che era richiesta ad un professore di patologia. Ad Oxford Florey rimase per tutta la sua vita organizzando un efficiente dipartimento di patologia sperimentale che ebbe un ruolo essenziale in una delle scoperte più importanti del ventesimo secolo: la penicillina. In questo dipartimento lavorava come biochimico un giovane molto talentuoso, Ernst Boris Chain. Florey fu immediatamente molto interessato alla penicillina; rifiutò infatti molti lavori per dedicarsi al suo studio. La penicillina era già da tempo conosciuta fin da quando comparve sul "British Journal of Experimental Pathology" la famosa pubblicazione di Fleming. Florey, inoltre, era spesso in contatto con Fleming che gli forniva informazioni sul lisozima e sulle sue modalità di azione, ricerca che ad Oxford fu assegnata a Chain. Dello staff di Florey faceva parte Cecil George Paine che aveva studiato al St Mary's Hospital dove aveva avuto la possibilità di seguire i brillanti esperimenti di Fleming con la penicillina.