Così come molti anestetici generali, l'esatto meccanismo d'azione dell'isofurano non è stato ancora chiarito. L'isoflurano riduce la sensibilità al dolore (da analgesia) e rilassa la muscolatura. L'isoflurano si lega probabilmente ai recettori GABA, del glutammato e della glicina, ma ha effetti diversi su ciascun recettore. L'isoflurano agisce come un modulatore allosterico positivo del recettore GABAA. Potenzia l'attività del recettore della glicina, che diminuisce la funzione motoria. Inibisce l'attività dei recettori del glutammato NMDA. L'isoflurano inibisce anche la conduzione nei canali del potassio. Attiva l'ATPasi aumentando la fluidità della membrana. 