Il farmaco è un antibiotico antineoplastico che agisce mediante un metabolita prodotto per alchilazione bioriduttiva. Nel corso di alcuni processi metabolici la mitomicina perde il gruppo metossilico, il gruppo chinonico viene ridotto ed i metaboliti risultanti vengono attivati. La mitomicina agisce favorendo il cross-linking del DNA ed inibendone la sintesi. Un singolo cross-linking per genoma ha dimostrato di essere efficace nell'uccidere i batteri. L'attività di cross-linking è proporzionale al suo contenuto in guanina e in citosina. I due gruppi funzionali alchilanti (la catena laterale carbamato e il C-1 aziridinico) sono altamente reattivi e sensibili all'attacco nucleofilo del DNA.