Per valutare la tossicità dei vari composti è stato misurato il rilascio dell'enzima lattato deidrogenasi (LDH) da parte delle cellule (36). La LDH è un enzima normalmente presente nel citoplasma, dove catalizza la conversione reversibile dell'acido piruvico in acido lattico, con conseguente ossidazione del NADH + H + a NAD + .Quando le cellule sono danneggiate, si formano dei pori nella membrana plasmatica dai quali fuoriesce materiale intracellulare, tra cui LDH. L'attività dell'enzima è stata valutata attraverso una cinetica enzimatica, sia nel terreno di coltura che nel lisato cellulare. Dopo l'incubazione, è stato prelevato 1 ml di surnatante cellulare, il quale è stato centrifugato per 5 minuti, a 4°C, a 13000 rpm.Le cellule, invece, dopo essere state lavate due volte con 800 µl PBS, sono state staccate meccanicamente con l'aiuto di scrapers, risospese in trietanolammina (TRAP) 82.3 mM a pH 7.6, e sonicate per dieci secondi, per permettere la rottura delle membrane cellulari e la successiva determinazione dell'attività dell'enzima nell'ambiente intracellulare.È stato preparato un mix di reazione contenente NADH ad una concentrazione finale 0.25 mM, e piruvato di sodio ad una concentrazione finale 0.5 mM, entrambi sciolti in TRAP.In una piastra da 96 pozzetti, sono stati poi caricati in doppio:• 5 µl di lisato e 45 µl di TRAP, per la determinazione dell'attività dell'enzima intracellulare;• 50 µl di surnatante, per la stessa valutazione nell'ambiente extracellulare.A queste quantità sono stati aggiunti 250 µl del mix precedentemente preparato. L'attività enzimatica è stata valutata misurando la diminuzione di assorbanza a 340 nm, con uno spettrofotometro Synergy HT (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT). L'attività enzimatica sia intra-che extracellulare viene indicata come micromoli NADH ossidato/min/pozzetto. L'attività dell'LDH extracellulare è stata calcolata come percentuale rispetto all'attività totale (extracellulare + intracellulare) nel pozzetto.