Una DNA polimerasi DNA-dipendente termostabile, un enzima con attività 5'→3' polimerasica viene aggiunta allo stampo di cDNA e in presenza di una coppia di primer specifici per la sequenza del gene che si desidera amplificare, la reazione di PCR viene avviata. Se non si dispone della sequenza o se interessa l'amplificazione di tutto il DNA, il secondo primer sarà aspecifico in modo tale che si appai con l'estremità del primo filamento di DNA e di tutti i cDNA neosintetizzati.