Nonostante i recenti progressi, la prognosi dei pazienti affetti da osteosarcoma in recidiva è tuttora molto severa. In un trial clinico appena concluso, in cui era stata associata la chirurgia alle alte dosi di chemioterapia con rescue con cellule staminali ematopoietiche autologhe, si sono ottenute delle remissioni complete in una grossa porzione di pazienti (78%); pochi pazienti hanno tuttavia mantenuto la remissione, mentre la sopravvivenza globale e la sopravvivenza libera da malattia a 3 anni sono risultate rispettivamente del 20% e del 12%.Si sono pertanto rivelate necessarie delle nuove terapie per mantenere la remissione di malattia. A questo scopo è stato attivato un protocollo nazionale in cui viene utilizzata l'immunoterapia come strategia per il controllo della malattia minima residua: i pazienti con fratello HLA identico vengono sottoposti a trapianto non mieloablativo di cellule staminali ematopoietiche mentre, i pazienti senza donatore compatibile, vengono sottoposti a 12 cicli di IL-2 a basse dosi.Parallelamente, devono essere esplorate nuove strategie immunoterapiche. L'identificazione di antigeni tumorali ed il loro riconoscimento da parte di linfociti tumore-specifici ha permesso lo sviluppo di strategie di immunoterapia in alcuni tumori, soprattutto nel melanoma; recentemente l'espressione di antigeni della famiglia MAGE, SSX, SART-1 e SART-3 è stata identificata anche in linee cellulari di osteosarcoma e in tessuti di osteosarcoma freschi, offrendo l'opportunità immunoterapeutica anche per questo tumore.Gli studi finora riportati in letteratura mostrano come, nonostante la difficoltà e l'incostanza dei risultati, un'immunoterapia antitumorale specifica sia fattibile. Normalmente le cellule tumorali non sono considerate buone APC perché down-regolano le molecole del sistema MHC e possono essere deficitarie nella processazione degli antigeni; tuttavia alcuni studi le hanno utilizzate con relativo successo, sia irradiate o sia rese corpi apoptotici con differenti sistemi. (94,97,101,104,110) Il metodo più ampiamente utilizzato per l'induzione e l'espansione Per la generazione delle DC secondo il metodo lento abbiamo seguito la metodica classica, descritta nella letteratura più recente come quella ottimale per l'immunoterapia antitumorale. (141) In tutti gli esperimenti abbiamo valutato la maturazione delle cellule dendritiche mediante citofluorimetria, evidenziando sempre una positività marcata per La concentrazione di peptidi pari a 1 µM/ml (corrispondente a circa 1µg/ml) è stata utilizzata negli esperimenti 1; 2; 3 e 5, in quanto indicata in letteratura come la concentrazione ottimale per lo stimolo di CTL tumore specifici (141)  sono sufficienti per mantenere la sopravvivenza del pool di CD8+ e CD4+ di memoria. Questa citochina, inoltre, ha la capacità di aumentare le risposte verso antigeni a bassa affinità, offrendo la possibilità di essere impiegato come adiuvante per i vaccini antitumorali. (143) IL-12 è una citochina prodotta da cellule accessorie, quali macrofagi e DC attivate da microrganismi o da loro prodotti o da cellule T. IL-12promuove la produzione di IFN-γ da parte di macrofagi e DC, spostando l'equilibrio Th1/Th2 verso il Th1. (145) IL-15 è una citochina pleiotropica che gioca un ruolo fondamentale La maturazione delle DC è caratterizzata da un aumento di espressione del CD40, che regola la loro differenziazione, maturazione e attività antitumorale. L'efficacia della presentazione degli antigeni da parte delle DC è aumentato dal legame con il CD40-Ligand, incrementando l'espressione di marker di maturazione quali il CD80, il CD86 e le molecole di adesione. (147) Recentissimi dati hanno, inoltre, evidenziato un miglioramento nella maturazione delle DC e nella secrezione di IL-12p70 in seguito all'utilizzo di TNF-α  , INF-α  e poli I:C. L'utilizzo di un cocktail costituito da queste citochine sembra indurre un profilo citochinico in senso Th1 e determinare la produzione di alti livelli di IL-12p70. (151,152,153) Confrontando gli esperimenti 2, 3 e 4 effettuati con cellule del donatore A.P. e gli esperimenti 5 e 6 effettuati con cellule del donatore D.M. si può evidenziare come l'aumento della concentrazione dei peptidi per la stimolazione e l'utilizzo di maggiori stimoli citochinici migliori la risposta specifica dei CTL e l'espansione cellulare dei CTL.In particolare, nell'esperimento numero 2, in cui i CTL sono stati generati con il metodo classico, non si è ottenuta nessuna risposta specifica verso i peptidi o le linee di osteosarcoma e si è evidenziata una perdita di cellule CD8+. L'associazione di IL-7, IL-12 e IL-15 all'IL-2 ha migliorato la curva di crescita dei CTL che si è mantenuta regolare nelle tre stimolazioni; si è inoltre evidenziata una risposta diretta verso la linea SJSA-1. Un miglioramento della risposta specifica si è riscontrata nell'esperimento numero 4, in cui la concentrazione dei peptidi è stata aumentata a 50 µg/ml: l'analisi mediante Elispot Assay la evidenziato una risposta forte verso il peptide SSX-2 e verso la linea SJSA. L'analisi delle citochine ha evidenziato negli esperimenti 3 e 4 un miglioramento anche nella secrezione di IFN-γ.Un miglioramento della risposta specifica in seguito all'aumento della concentrazione dei peptidi si può riscontrare anche confrontando gli esperimenti 5 e 6. Nell'esperimento numero 5 si è ottenuta una risposta debole verso i peptidi della famiglia MAGE e SART-3 b e verso la linea HOS e risposte più forti verso le linee SJSA-1 ed MG-63. Nell'esperimento numero 6 in cui abbiamo aumentato la concentrazione dei peptidi si è mantenuta una lieve risposta verso il peptide MAGE-A2 e si è ottenuta una risposta forte verso il peptide MAGE-A3 a e verso tutte le linee di osteosarcoma.Analizzando i risultati nel complesso è possibile evidenziare che gli esperimenti effettuati con lo stimolo citochinico più intenso, dato dall'associazione dell'IL- Questi risultati non sono completamente concordanti con quelli di Ho et al, (143) che sono riusciti, incrementando gli stimoli citochinici, ad espandere CTL da quasi tutti i donatori sani testati. La differenza può dipendere dal tipo di peptide utilizzato; ad esempio, WT1, utilizzato da questo gruppo, è espresso a basso livello anche nelle cellule CD34+ normali ed in cellule progenitrici di altri tessuti; precursori di cellule T di memoria sono quindi presenti in circolo anche nel sangue di donatori sani. (149) Al contrario, Ayyoub et al (105) hanno evidenziato che le cellule T ad alta affinità verso i peptidi della famiglia SSX possono essere isolati solo nei pazienti affetti da tumore SSX-positivo, e non dai pazienti con tumore SSX-negativo o dai donatori sani. Lo stesso gruppo ha evidenziato che, di conseguenza, è possibile generare CTL solo dai pazienti con tumore SSX-positivo.Nell'esperimento numero 13, l'unico effettuato utilizzando il lisato cellulare nel caricamento delle DC, abbiamo ottenuto un'ottima risposta specifica verso la linea HOS utilizzata per la stimolazione; è importante sottolineare che questa risposta si dimezza riducendo del 50% la concentrazione dei CTL nell'Elispot Assay. Ulteriori esperimenti dovranno essere effettuati per confermare questi dati e per verificare se anche questo sistema possa giovarsi dell'aumento degli stimoli citochinici e di un eventuale incremento della concentrazione del lisato tumorale.Nell'esperimento numero 14, utilizzando direttamente come APC la linea SJSA-1, HLA-identica al donatore sano, abbiamo ottenuto un'ottima risposta verso la linea stessa, anche bloccata dagli anticorpi anti-classe I ma non da quelli anti-classe II; questo risultato si associa ad una più bassa, ma pur presente, risposta verso le linee HOS, MG-63 e U2-OS. Seppur necessarie ulteriori conferme, questi dati preliminari stanno ad indicare la possibilità di generare delle linee CTL osteosarcoma specifiche dai pazienti, utilizzando la linea tumorale del paziente stesso. Con l'esperimento numero 15 abbiamo cominciato, con successo, ad esplorare questa possibilità.