La numerosità dei pazienti con diagnosi di PH è ancora oggi molto bassa e non può essere imputata solamente alla rarità della malattia. E' noto in molti Paesi che le conoscenze di queste malattie, in particolare nelle nefrologie dell'adulto, sono ancora poco diffuse e la disponibilità d'indagini diagnostiche biochimiche e molecolari è ancora limitata. E' quindi auspicabile una maggior attenzione a questo gruppo di malattie, largamente sotto diagnosticate, al fine di garantire un adeguato trattamento ai pazienti. L'analisi genetica è uno strumento fondamentale per porre diagnosi di PH, soprattutto nei casi con fenotipo non classico. Inoltre, la differenziazione tra le diverse forme di PH oggi note consente di personalizzare il trattamento, in particolare mediante l'assunzione di vitamina B6 in presenza di specifiche mutazioni del gene AGXT responsive, o per una migliore programmazione della strategia di trapianto (in PH2 e PH3 il trapianto di fegato non è indicato). L'estensione dell'analisi molecolare ai geni GRHPR e HOGA1 ha assunto un ruolo rilevante nella diagnostica della PH, soprattutto per pazienti con iperossaluria risultati negativi all'analisi di AGXT. Le mutazioni dei geni responsabili di PH2 e PH3 descritte finora sono per la maggior parte di tipo puntiforme, tuttavia in analogia con la PH1 si ipotizza l'esistenza di delezioni di GRHPR e di HOGA1. Il sequenziamento diretto non riconosce delezioni di interi esoni, poiché il profilo di sequenza è identico a quello di omozigosi per un allele.In questo studio alcuni pazienti sono risultati omozigoti per i geni analizzati, per cui si valuterà la possibilità di proseguire l'analisi mediante MLPA [MRC-Holland®], tecnica in grado di riconoscere la presenza di delezioni di interi esoni. Tale indagine potrà essere eseguita in collaborazione con il gruppo del dr. Bodo Beck (Istituto di Genetica Umana, Università di Colonia, Colonia, Germania). L'individuazione dei geni responsabili di PH2 e PH3 e del corrispettivo enzima ha reso possibile un approfondimento delle conoscenze sul metabolismo dell'ossalato. Tuttavia, molti aspetti di questa della via metabolica non ancora del tutto chiariti e una conoscenza più approfondita di questi processi biochimici e dell'espressione tissutale degli enzimi GR/HPR e HOGA potrebbe essere utile per la definizione di trattamenti specifici per la PH2 e la PH3.Inoltre, un approfondimento delle conoscenze in questo ambito consentirebbe di chiarire meglio la patogenesi dell'iperossaluria in soggetti in cui le indagini molecolari oggi disponibili siano risultate negative. Alcuni di questi pazienti potrebbero essere portatori di alterazioni non riconoscibili con le indagini genetiche di routine e in essi la valutazione dell'attività enzimatica di GR/HPR e HOGA potrebbe essere impiegata a scopo diagnostico. L'ottimizzazione di tecniche di dosaggio enzimatico su tessuti alternativi al fegato potrebbe consentire un maggior utilizzo di questa tecnica, in particolare se il prelievo presentasse minori complicanze rispetto alla biopsia epatica. Infatti, a differenza di AGT, gli enzimi responsabili di PH2 e PH3 sono espressi in diversi tessuti (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/ESTProfileViewer.cgi), e la valutazione enzimatica di GR/HPR potrebbe essere eseguita su linfociti, mentre quella di HOGA su cute. La maggior diffusione del dosaggio enzimatico su tessuti facilmente prelevabili consentirebbe anche una miglior correlazione genotipo-fenotipo, in particolare in presenza di varianti genetiche a significato patogenico non noto.In questo lavoro di tesi è stata identificata una variante del gene HOGA1 a significato patogenico non noto. Poiché non è stato possibile eseguire valutazioni enzimatiche di HOGA su materiale biologico del paziente, per poter definire con maggiore precisione la patogenicità della variante identificata si procederà ad analisi in vitro. A tale scopo sono stati realizzati due minigeni comprendenti l'esone 2, l'introne 2 e l'esone 3 normali e con la variante nota, che verranno inseriti in un vettore (pSPL3) già utilizzato per la caratterizzazione di varianti di HOGA [54] in cui saranno clonati. Si procederà quindi alla retrotrascrizione e al sequenziamento dell'mRNA per valutare l'effettiva presenza dell'inserzione di 79 bp nel trascritto con la variante (r.340_341ins341-79_341-1) in conseguenza all'utilizzo del nuovo sito accettore di splicing (Fig. 3 in RISULTATI).Alcuni studi recenti hanno descritto mutazioni delle regioni che regolano l'espressione dell'enzima AGT, responsabili della riduzione dell'attività dell'enzima [107]. Allo scopo di ampliare l'offerta di diagnostica molecolare di PH, sarà messa a punto in questo laboratorio l'analisi del promotore di AGXT, che potrebbe quindi sostituire la valutazione dell'attività enzimatica su tessuto epatico. Questa indagine potrebbe essere utile soprattutto per i pazienti in cui vi sia forte sospetto clinico di PH, in assenza di mutazioni del gene AGXT.Potrebbe quindi essere indicato proseguire le indagini nei pazienti inclusi in questo studio, risultati negativi per mutazioni dei geni responsabili di PH, con l'analisi del promotore di AGXT.Inoltre è da molti ipotizzata l'esistenza di altri tipi di PH i cui geni responsabili potranno essere identificati in futuro, anche grazie alle nuove tecnologie di analisi del DNA mediante sequenziamento di nuova generazione [6,67,68]. Tra i possibili geni candidati vi è SLC26A6, uno scambiatore ionico coinvolto nel trasporto intestinale dell'ossalato, localizzato nella porzione apicale degli enterociti di duodeno, digiuno, ileo e in percentuale inferiore a livello colico [108,109]. L'ipotesi è nata da alcuni studi condotti in vivo su topi knock-out per il gene SLC26A6, nei quali sono stati osservati iperossaluria, iperossalemia, nefrolitiasi di ossalato e un incremento dell'assorbimento intestinale di ossalato [108].Tuttavia SLC26A6 non sembra avere lo stesso ruolo nell'uomo; infatti recenti studi non hanno identificato mutazioni del gene e le uniche varianti riconosciute non sembrano influenzare l'escrezione dell'ossalato urinario nell'uomo [110]. Altri scambiatori ionici, appartenenti alla classe SLC26, come ad esempio SLC26A1, potrebbero essere coinvolti nel trasporto dell'ossalato ma sono necessari studi più approfonditi per definire con precisione il ruolo di questi geni nel metabolismo dell'ossalato [108,111].Un altro enzima importante per il metabolismo dell'ossalato è la LDH, che nei pazienti affetti da PH è responsabile dell'eccessiva produzione di ossalati. Potrebbe essere utile conoscere meglio i processi biochimici in cui questo enzima è coinvolto (sono note diverse isoforme con diversa localizzazione intracellulare e diversa espressione tissutale) sia per il riconoscimento di mutazioni potenzialmente patogeniche sia per l'identificazione di varianti con diversa capacità metabolica, che potrebbero contribuire alla determinazione della gravità del quadro clinico [112].L'iperossaluria primaria è una malattia genetica rara, a carattere eterogeneo che si può manifestare con una clinica sfumata e di difficile interpretazione, ma ha una prognosi grave e l'analisi genetica ha un importante ruolo diagnostico, soprattutto per poter riconoscere la malattia in tempi precoci e poterla trattare in modo adeguato, evitando il declino della funzionalità renale. A causa della sua rarità non è ancora ben conosciuta e sono necessari ulteriori studi per approfondire l'eziopatogenesi, la correlazione genotipo-fenotipo, e soprattutto la terapia, dato che finora per la PH2 e PH3 non esiste un trattamento specifico.