La ZDV appartiene alla classe degli analoghi nucleosidici inibitori della trascrittasi inversa (NRTI). Esso agisce come inibitore dell'enzima transcrittasi inversa virale, bloccando la funzione di DNA polimerasi, l'enzima che l'HIV utilizza per produrre il DNA e quindi riduce la replicazione del virus. La molecola viene introdotta nella cellula ospite e viene fosforilata in forma trifosfata, da una nucleoside-chinasi. In questa forma, l'AZT ha un'alta affinità per la trascrittasi inversa di HIV e compete con la timidina trifosfata per il legame con l'enzima. L'AZT viene incorporato nella catena del DNA nascente e la interrompe, perché non possiede il gruppo 3'-idrossile per l'attacco del successivo nucleoside trifosfato da incorporare. Così la produzione di genoma virale è impedita. Può inibire anche la DNA-polimerasi-γ coinvolta nella replicazione del DNA mitocondriale dell'uomo, pertanto può dare tossicità mitocondriale, con acidosi lattica e tossicità epatica; può dare danno muscolare con aumento dei livelli di creatinfosfochinasi nel siero e cardiomiopatia, con scompenso cardiaco sinistro. Tuttavia queste manifestazioni sono più rare.