La molecola è caratterizzata da un ampio spettro di azione, simile a quello di altri chinoloni e comprendente un'ampia gamma di batteri Gram–positivi e Gram-negativi. La rufloxacina agisce inibendo in modo selettivo sia la DNA–girasi (conosciuta anche come topoisomerasi II) sia la topoisomerasi IV. Questi due enzimi sono fondamentali per la cellula batterica