La sepsi è caratterizzata dalla presenza di infezione sistemica ed infiammazione; la causa principale di morte dei pazienti settici è rappresentata dalla progressione dall'infiammazione sistemica all'insufficienza multiorgano. 6 Questo studio modifica il paradigma riguardante il ruolo di PI3Kγ, individuando in questo enzima una molecola chiave nel passaggio dall'infezione e dalla SIRS al danno d'organo; identifica inoltre questa protein chinasi come un possibile target terapeutico in corso di sepsi addominale e infiammazione d'organo.In particolare, i nostri risultati dimostrano che in caso di infiammazione sistemica, l'assenza di PI3Kγ favorisce il reclutamento dei neutrofili nel sito d'infezione e conferisce una protezione significativa verso la mortalità e l'infiammazione d'organo, causati dalla sepsi indotta da CLP.Due sono gli studi che in precedenza hanno cercato di indagare il ruolo di PI3Kγ nella patogenesi della sepsi, giungendo però a risultati contradditori. Il modello di endotossemia indotto mediante iniezione di LPS appare inadeguato a replicare l'iniziale stato iperdinamico che caratterizza la sepsi nell'uomo; inoltre, la concentrazione di LPS che si riscontra nel circolo del modello murino supera notevolmente quella che si riscontra nell'uomo e la risposta tissutale, come la produzione di citochine è maggiore di quella tipica della realtà clinica della sepsi.CLP surgery mima con maggior precisione il processo patogenetico umano, mediante la generazione di una peritonite che evolve in batteriemia e disfunzione multiorgano. La puntura e legatura del cieco (CLP) riproduce in modo fedele dal punto di vista qualitativo e quantitativo gli eventi che si realizzano a livello vascolare nell'uomo. CLP è infatti associata ad una riduzione significativa della pressione arteriosa media, ad una riduzione del numero dei leucociti, ed in particolare dei neutrofili circolanti, ad un aumento delle concentrazioni di acido lattico nel sangue.In questo modello murino di sepsi addominale è stata poi riscontrata una maggior attività della mieloperossidasi tissutale, indice di accumulo dei neutrofili, in particolare nel polmone e nel piccolo intestino e un aumento significativo delle concentrazioni di E-selectina e P-selectina entro 6 ore dalla contaminazione con il materiale fecale, a livello dell'intestino, della mesenterica e, per quanto riguarda la Pselectina, anche della circolazione polmonare. 71 La presenza di materiale fecale nella cavità addominale promuove il rilascio di citochine e di altri mediatori dell'infiammazione dai mastociti, dai neutrofili e da altri tipi cellulari; l'ipoperfusione della mucosa intestinale contribuisce alla patogenesi della sepsi e all'instaurarsi della disfunzione d'organo.Il modello di sepsi murina indotta mediante legatura e puntura del cieco è stato per la prima volta descritto da Baker nel 1983, che lo aveva utilizzato per valutare il ruolo della terapia steroidea in un modello animale di sepsi. 75 Un'ulteriore limitazione di questi studi precedenti è rappresentata dal fatto che entrambi i gruppi di lavoro abbiano indagato il danno d'organo soltanto a livello polmonare.Yum e Ong non hanno fornito nei loro lavori dati relativi alla sopravvivenza, mentre in uno studio precedente Williams e collaboratori avevano osservato una riduzione della sopravvivenza nei topi, in seguito all'inibizione non selettiva delle PI3Ks. 67 Nel nostro studio è stata valutata la sopravvivenza degli animali in seguito a CLP, servendosi del metodo di Kaplan-Meier per comparare animali WT e KO fino a 7 giorni dall'induzione dello shock settico: l'assenza selettiva dell'isoforma PI3Kγ è risultata correlata ad un aumento significativo della sopravvivenza a 7 giorni da CLP. Questo miglioramento della sopravvivenza ha spinto ad indagare su quali fossero i meccanismi presenti alla base del vantaggio osservato, ritenendo che l'inibizione farmacologica di PI3Kγ potesse costituire un futuro bersaglio terapeutico per i pazienti con shock settico.Una conseguenza precoce della sepsi severa è il fallimento della migrazione dei neutrofili, 35 che risulta dall'eccessiva attivazione dell'immunità innata attraverso la via dei TLRs, con un aumento delle citochine e chemochine sistemiche. La migrazione dei neutrofili svolge una funzione fondamentale nel limitare la colonizzazione e la diffusione batterica, con lo scopo di contenere l'infezione. 76 In uno studio condotto da Hirsch et al., macrofagi e neutrofili di origine peritoneale derivanti da topi PI3Kγ KO hanno mostrato una ridotta motilità e di conseguenza non si sono dimostrati in grado di rispondere alle infezioni in modo paragonabile ai topi WT. 65 Alves-Filho e collaboratori hanno invece dimostrato come in corso di sepsi severa nei neutrofili WT si verifichi una diminuzione dell'espressione di CXCR2 di membrana, che comporta una diminuzione nella risposta a differenti chemochine, responsabili della chemotassi: nel loro lavoro una strategia di prevenzione della diminuzione dell'espressione di CXCR2 in membrana ha dimostrato di ristabilire la corretta migrazione dei neutrofili, il controllo dell'invasione batterica e di migliorare l'outcome. 30,35 Nei risultati ottenuti dal nostro studio si è evidenziato che topi WT sottoposti a CLP mostrano un numero di neutrofili nella cavità peritoneale significativamente maggiore rispetto al gruppo sham, ma ridotto in modo significativo se paragonato a quello dei topi KO, segno di un'alterazione del processo di reclutamento; i topi KO mantengono quindi un'adeguata risposta a CLP, a seguito di un corretto reclutamento cellulare.Nel nostro lavoro, così come in quello pubblicato da Alves-Filho nel 2008, la sepsi indotta da CLP ha comportato un fallimento significativo della migrazione dei neutrofili nella cavità peritoneale, mentre i neutrofili che non esprimono PI3Kγ non hanno mostrato la compromissione della migrazione dei neutrofili e la conseguente perdita del controllo dell'infezione batterica. Questo risultato suggerisce una maggior complessità del ruolo di PI3Kγ nella migrazione leucocitaria, che è stata dimostrata verificarsi in assenza della proteina in studio.Dai risultati ottenuti da diversi autori si può avanzare l'ipotesi che la protezione dei topi KO dalla progressione dell'infezione si realizzi attraverso il miglioramento del reclutamento dei neutrofili, con un controllo dell'infezione, prevenendo la up-regolazione di GRK2 e la diminuzione del recettore di membrana CXCR2.I dati non pubblicati di Martin et al. confermano che l'entità dell'espressione di CXCR2 sulla membrana dei neutrofili, che normalmente appare diminuita in corso di sepsi severa, mentre permane inalterata nei topi KO, potrebbe rappresentare il meccanismo attraverso cui le cellule che non esprimono PI3Kγ vanno incontro ad una più appropriata migrazione verso il sito d'infezione. La corretta espressione di CXCR2 in membrana si mantiene nonostante la presenza di una quantità importante di chemochine, che potrebbero indurre la desensibilizzazione verso il recettore, come è stato dimostrato in vitro. Già in precedenza, infatti, è stato evidenziato come le colture di neutrofili mancanti dell'enzima PI3Kγ e stimolate con MIP-2 presentassero una capacità particolare nel preservare l'espressione di CXCR2 in membrana. In seguito all'interazione con il suo ligando si assiste al passaggio di CXCR2 dalla membrana al compartimento intracellulare, con un sistema GRKdipendente. 77 La correlazione tra il fallimento della migrazione dei neutrofili in corso di sepsi e l'espressione di GRK era già stata descritta in uno studio precedente, così come il fatto che in neutrofili isolati MIP-2 inducesse l'espressione di GRK2 e la desensibilizzazione verso i recettori per le chemochine, in modo PI3Kγ dipendente. Si può quindi concludere che in corso di sepsi il motivo per cui i topi PI3Kγ KO risultano protetti potrebbe essere che la presenza di PI3Kγ comporta un aumento nell'espressione di GRK2 che induce il passaggio di CXCR2 nel compartimento intracellulare dei neutrofili, a cui fa seguito il fallimento della migrazione dei leucociti, la disseminazione batterica ed infine l'insufficienza multiorgano.L'alterato reclutamento dei neutrofili è responsabile della mancata risoluzione dell'infezione: la fagocitosi batterica appare inefficace e viene meno il controllo dell'infezione, con un mancato ristabilimento dell'omeostasi. Si assiste ad un'aumentata proliferazione batterica, cui fa seguito il processo di diffusione dei patogeni nel circolo e negli organi periferici: si realizza così il processo della decompartimentalizzazione batterica.Dai lavori di Alves-Filho si deduce che l'iperstimolazione del sistema immunitario e la conseguente alterata risposta infiammatoria sono responsabili della decompartimetazione batterica e del peggioramento dello stato infiammatorio. 30,35 Nel nostro studio, i topi WT CLP hanno mostrato a livello della cavità peritoneale un numero elevato di colonie batteriche, significativamente superiore rispetto a quello rilevato nei KO CLP, i cui valori tendevano a quelli del gruppo sham.I topi WT CLP si sono inoltre caratterizzati per la presenza di elevati livelli di batteri nel circolo, con valori significativamente maggiori rispetto ai topi sham e rispetto agli animali KO CLP.Nei topi CLP, inoltre, alla colonizzazione della cavità peritoneale e alla diffusione nel circolo dei batteri si associava la disseminazione sistemica dell'infezione, con livelli elevati di patogeni in diversi organi periferici. In particolare, a livello della milza, del fegato, del polmone e del BAL la concentrazione batterica negli animali WT CLP è risultata essere significativamente maggiore rispetto agli animali KO CLP.Dall'analisi dei nostri risultati si può quindi affermare che la mancanza di PI3Kγ svolge un ruolo protettivo, limitando la colonizzazione della cavità peritoneale da parte dei patogeni, proteggendo e limitando la diffusione batterica.In tutti gli organi da noi analizzati i batteri sono presenti in concentrazioni significativamente inferiori tra gli animali KO CLP, rispetto ai topi WT CLP: questo evidenzia il contributo di PI3Kγ nella disseminazione batterica e il ruolo protettivo esplicato dalla mancanza della proteina in esame. La riduzione della batteriemia potrebbe associarsi a una riduzione dell'incidenza dell'insufficienza multiorgano, mediante la riduzione dei livelli di citochine e chemochine circolanti, con una conseguente limitazione del reclutamento dei neutrofili negli organi periferici e del danno d'organo da questi provocato. In seguito alla compromissione del reclutamento dei neutrofili si assiste alla perdita del controllo dell'invasione batterica e all'insorgenza della sepsi, che in alcuni casi evolve in MOF e decesso del paziente. 14,22,35 Per quanto riguarda l'evoluzione verso il danno d'organo, il sistema cardiocircolatorio, respiratorio e della coagulazione, il fegato sono target comuni del danno e della disfunzione indotti dalla sepsi, che contribuiscono al peggioramento dell'outcome dei pazienti. 37 In corso di sepsi, si assiste ad un aumento dei neutrofili negli organi periferici, derivante dalla deregolazione del processo di reclutamento dei neutrofili stessi.Elevate concentrazioni di neutrofili negli organi periferici sono responsabili dello sviluppo del danno d'organo, cui fa seguito l'insufficienza a carico dell'organo stesso. 37 Il polmone e il fegato sono due degli organi che più frequentemente vanno incontro allo sviluppo del danno indotto dalla sepsi, incidendo in modo importante sulla morbilità e mortalità. In corso di sepsi, il polmone è caratterizzato da un'iperattivazione dei macrofagi localizzati a livello degli alveoli e da un aumento dei mediatori dell'infezione, che comportano una rapida infiltrazione leucocitaria. I leucociti rilasciano numerose citochine, chemochine e proteasi, responsabili del danno epiteliale ed endoteliale, cui consegue un aumento della permeabilità del polmone, l'edema alveolare e la disfunzione d'organo. 78 La disfunzione epatica ha una base patogenetica simile ed è anch'essa correlata con un aumento della mortalità dei pazienti affetti da shock settico.Nelle nostre analisi, i topi WT CLP si sono caratterizzati per gli elevati livelli di neutrofili nel fegato, nel BAL e nel polmone, mentre un numero ridotto di neutrofili, paragonabile al gruppo sham è stato riscontrato nei campioni prelevati dai topi KO CLP.I nostri risultati mostrano come la mancanza di PI3Kγ conferisca una protezione significativa verso il danno d'organo e confermano quanto osservato da Yum, identificando la perdita dell'attività di PI3Kγ come la responsabile del ridotto danno polmonare.Diversi sono i meccanismi con cui PI3Kγ potrebbe contribuire allo sviluppo del processo infiammatorio mediato dai neutrofili: la fosforilazione di Atk potrebbe favorire la traslocazione di NF-kB nel nucleo e l'espressione di citochine proinfiammatorie, come IL-1β e TNF-α; potrebbe inoltre favorire il processo di chemotassi, con un aumento dei neutrofili a livello periferico e la diminuzione dell'apoptosi dei neutrofili attivati localizzati negli organi periferici.La mancanza di PI3Kγ contribuisce al mantenimento di un adeguato reclutamento dei neutrofili nel sito d'infezione in corso di sepsi severa, limitando il numero delle cellule neutrofile negli organi periferici, responsabili dell'insorgenza del danno tissutale. Questo fatto suggerisce che la migrazione dei neutrofili può verificarsi anche in assenza di PI3Kγ. La corretta migrazione dei neutrofili negli animali KO risulta in una ridotta decompartimentalizzazione batterica, una minor incidenza dell'infiammazione negli organi periferici e una diminuita mortalità, modificando le convinzioni comuni circa il ruolo di PI3Kγ.Gli animali KO per l'enzima PI3Kγ sono in grado di fornire informazioni essenziali circa il ruolo di PI3Kγ in corso di sepsi addominale, anche se l'applicazione clinica di questi risultati non è immediata, in quanto nel modello sperimentale i topi presentano l'alterazione genetica fin dalla nascita. Per tanto, sarebbe opportuno valutare con analisi future gli effetti dell'inibizione farmacologia di PI3Kγ sullo sviluppo della sepsi e sulla mortalità e la sua efficacia nel trattamento dello shock settico già instauratosi. I dati del nostro studio hanno sottolineato l'importanza nell'impiego di PI3Kγ come nuovo target per una futura terapia molecolare, in quanto tutti i trial clinici condotti di recente per individuare un approccio terapeutico adeguato al trattamento di pazienti con shock settico non hanno dimostrato un complessivo miglioramento dell'outcome. 38,46,79 In conclusione, questo studio identifica il ruolo fondamentale di PI3Kγ in 