Le cellule primarie di osteosarcoma, le cellule delle linee commerciali e le cellule mesenchimali da donatori sani, sono state analizzate per la loro capacità di differenziare in senso osteoblastico ed in senso adipocitico.Le tre tipologie di colture sono state allestite in doppio in piastre da 6 pozzetti:-coltura di controllo in terreno α-MEM (Sigma Aldrich) addizionato del 10% di HPL;-coltura per differenziamento in senso osteoblastico in terreno Differentiation Basal Medium Osteogenic (Lonza, Walkersville, MD);-coltura per differenziamento in senso adipocitico in terreno Adipogenic Induction Medium (Lonza) per i primi 7 giorni e successivamente in Adipogenic Maintenance Medium (Lonza).Le cellule sono state seminate ad una densità di 10.000/cm 2 e coltivate per 3 settimane.Ogni 7 giorni le cellule sono state osservate al microscopio, il terreno è stato aspirato, le cellule sono state lavate con PBS (Gibco) ed è stato ripristinato il terreno adatto.Al termine della terza settimana i pozzetti sono stati fissati con paraformaldeide al 4% e colorati.Un pozzetto di controllo e i due pozzetti trattati con il terreno per il differenziamento in senso osteoblastico sono stati colorati con la metodica Von Kossa per valutare la presenza di cristalli di ossalato di calcio prodotti dagli osteoblasti differenziatesi.Questa colorazione permette di evidenziare in nero i cristalli e prevede i seguenti passaggi:- -incubazione con Nuclear Fast Red 0,1% (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, USA) per 3-5 minuti a temperatura ambiente per ottenere la colorazione di contrasto.Un pozzetto di controllo e i due pozzetti trattati con il terreno per il differenziamento in senso adipocitico sono stati colorati con Oil red O (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, USA)Questa colorazione permette di evidenziare gli eventuali lipidi presenti in vacuoli all'interno delle cellule differenziatesi in adipociti in rosso e prevede i seguenti passaggi:-incubazione con soluzione di Oil red O allo 0,5% per 15 minuti a temperatura ambiente;-lavaggio con acqua corrente per 10 minuti;-incubazione con ematossilina di Mayer (Bio-Optica) per 10 minuti a temperatura ambiente per ottenere la colorazione di contrasto;-lavaggio con acqua corrente per 5 minuti.Dopo le rispettive colorazioni i pozzetti sono stati fatti asciugare a temperatura ambiente ed analizzati al microscopio ottico.