Linee cellulari e condizioni di crescita Le linee cellulari utilizzate sono la linea di carcinoma del colon-retto HT-29, usata come controllo positivo (gentilmente donata dalla Dott.ssa Perrone), e le linee di mieloma multiplo Nello specifico, in WB 100 μg di lisato proteico vengono fatti migrare su di un gel di trisglicina al 10% (Invitrogen, Carlsbad CA, USA). Successivamente le proteine separate vengono trasferite su una membrana di polivinilidenefluoride (PVDF) (Invitrogen, Carlsbad CA, USA). La membrana viene quindi sottoposta a successive incubazioni: 1) in soluzione di latte in polvere (5%), per un'ora a temperatura ambiente (R.T.) (allo scopo di saturare i siti aspecifici); 2) in anticorpo primario di coniglio diluito 1:2000, specifico per COX-2 umana (Oxford Biomedical Research, Inc. Oxford MI, USA), per tutta la notte a 4°C; 3) in anticorpo secondario coniugato alla perossidasi estratta dalla radice di rafano (HRP) per due ore a R.T.(Amersham Biosciences UK limited, Little Chalfont, Buckinghamshire, England). Dopo ripetuti lavaggi (PBS 1x, 0,1% Tween 20) la membrana viene trattata con un sistema di chemiluminescenza (enhanced chemiluminescence-plus detection system, Amersham Biosciences UK limited, Little Chalfont, Buckinghamshire, England) e il segnale di emissione viene poi visualizzato tramite l'impressione di una lastra fotografica Kodak (Roche Diagnostics SpA, MI, Italia).Per verificare l'avvenuto trasferimento delle proteine sulla membrana e verificare che i campioni siano quantitativamente omogenei, è stata eseguita sulla medesima membrana l'analisi dell'espressione della β-actina (Sigma-Aldrich, Saint Louis MI, USA).Quantificazione dei trascritti di COX-2 mediante Real Time PCR Per valutare quantitativamente le variazioni nell'espressione di COX-2 sono stati studiati i livelli di mRNA dei campioni analizzati mediante la metodica di Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction). Il cDNA è stato ottenuto mediante retrotrascrizione partendo da 5 μg di RNA totale estratto dai campioni. La reazione di real-time PCR è stata eseguita utilizzando il sistema ABI PRISM 7900 (Applied Biosystems, Foster City CA, USA). L'amplificazione ha previsto l'impiego della "COX-2 20x Assays-on-Demand Gene Expression Assay Mix", (Applied Biosystems, Foster City CA, USA). I dati ottenuti sono stati normalizzati rispetto al gene housekeeping di riferimento costitutivo ed ubiquitario B-GUS (beta-glucoronidasi). La quantificazione relativa di COX-2 è stata calcolata con l'approccio ∆∆Ct.