Nel 1543 tornò a Padova per succedere ad Andrea Vesalio, che era partito per la Svizzera per sovrintendere alla stampa del suo capolavoro "De humani corporis fabrica". Colombo rimase a Padova per due anni prima di trasferirsi a Pisa alla corte di Cosimo I de Medici. Mentre era a Pisa collaborò intensamente con Michelangelo. Egli intendeva lavorare con quest'ultimo per elaborare un testo di anatomia che rivaleggiasse con il "De Fabrica" di Vesalio, ma questo non si realizzò mai, probabilmente a causa dell'età ormai avanzata di Michelangelo. Nel 1548 Colombo assunse un incarico alla Sapienza di Roma,che mantenne fino alla morte, nel 1559. Poiché non era un attento seguace di Galeno, l'autorità riconosciuta in quel tempo nel campo dell'anatomia, e anche a causa delle sue pubbliche controversie con il venerato Vesalio e Gabriele Falloppio, Colombo non ha goduto di alta considerazione in Italia. 