Nel 1849 ottenne finalmente una cattedra come professore di fisiologia e patologia a Königsberg. Qui Helmholtz strinse amicizia con l'astronomo August Ludwig Bush, che lo sensibilizzò alle tecniche di misura del tempo e alla teoria degli errori, e con i fisici Neumann, con Kirchhoff e svolse importanti ricerche sulla velocità di trasmissione degli impulsi nervosi, iniziando ad interessarsi di acustica e di ottica fisiologica.