Per l'analisi dell'attivazione di Akt, ERK 1/2 e eNOS, sono stati usati i campioni di polmone congelato, utilizzando la tecnica del Western Blotting.Uno dei due polmoni è stato pestellato in azoto liquido mediante un mortaio. Le proteine sono state estratte con un tampone di lisi (1% Triton, 150 mM NaCl, TRIS-Cl pH=7,5, 5 mM EDTA, 10 mM NaF, 10 mM Na4P2O7, 1mM Na3VO4) in presenza degli inibitori delle proteasi (protease inhibitor cocktail set III, Calbiochem). I detriti sono stati eliminati mediante centrifugazione a 4°C per 30 minuti. La concentrazione degli estratti proteici così ottenuti è stata determinata mediante misura colorimetrica con il metodo di Bradford.Sono state caricate quantità uguali di proteine che, sottoposte ad un campo elettroforetico, in condizioni riducenti, hanno corso in un gel di poliacrilammide.Le proteine, distribuite sul gel in base al relativo peso molecolare, sono state poi trasferite su di una membrana di nitrocellulosa (mini TRANS BLOT Cell, BIORAD).Successivamente, le membrane sono state saturate per 1 ora a temperatura ambiente in una soluzione di BSA al 5% in TBS-Tween 0,1%.I filtri sono stati quindi incubati con l'anticorpo primario per tutta la notte a 4°C. Dopo 3 lavaggi, da 10 minuti ciascuno in TBS-Tween 0,3%, i filtri sono stati incubati con l'anticorpo secondario, coniugato ad una perossidasi, e rivelati mediante un sistema di chemioluminescenza ECL (Amersham, UK).La reazione chemioluminescente (effettuata in una camera oscura) è in grado di impressionare apposite lastre fotografiche di sviluppo; ciò determina il formarsi di bande.L'analisi densitometrica di tali bande è proporzionale al grado di espressione della proteina corrispondente.