La GTN, a causa della sua importanza dal punto di vista terapeutico, è stata oggetto di approfondita caratterizzazione sotto il profilo farmacocinetico, farmacodinamico e di tossicità. Molto interesse hanno suscitato i problemi della tolleranza e della bioattivazione, che sono stati presi in considerazione da numerosi gruppi di ricerca, pur non essendo stati ancora del tutto chiariti. Fino ad ora, studi sistematici delle relazioni struttura-attività (SAR) dei nitrati organici hanno ricevuto poca attenzione; questo è piuttosto strano, soprattutto alla luce del rinnovato interesse che i nitrati organici stanno suscitando per quel che riguarda la scoperta di ibridi NO-donatori utilizzabili in campo clinico (Gasco et al., 2008). Per questo motivo è interessante comprendere quali siano le caratteristiche strutturali dei composti di questa classe in grado di influenzare la cinetica e l'entità del rilascio di NO.A tale scopo il gruppo di ricerca in cui ho svolto la tesi ha intrapreso un ampio lavoro di progettazione e sintesi di nitrossi derivati variamente modulati (Chegaev et al., 2006). Questo progetto è stato realizzato grazie alla messa a punto di metodiche sintetiche, oggetto di precedenti tesi, accessibili e non pericolose. Queste ultime permettono di introdurre gruppi nitrossilici rispettivamente per sostituzione nucleofila di alogenuri con AgNO 3 o mediante addizione/sostituzione su doppi legami con una miscela I 2 /AgNO 3 in CH 3 CN a ricadere. In particolare, sono state realizzate due serie omologhe di composti, in cui rispettivamente i gruppi fenile e benzile sono stati introdotti sulla molecola della GTN.In un precedente lavoro di tesi i composti appartenenti alla prima serie (Figura 20) sono stati caratterizzati per la loro attività vasodilatante NO-dipendente; da questo studio è emerso un particolare profilo di vasodilatazione probabilmente dovuto alla capacità o meno di interagire con l'enzima ALDH-2. Questo interessante profilo farmacologico ha richiesto studi ulteriori.Nella presente tesi viene riportata la caratterizzazione come vasodilatatori degli omologhi superiori (Figura 21), ottenuti formalmente per inserzione di un gruppo benzilico sul gruppo metilenico terminale della GTN. Come risultato di questa modulazione sono state ottenute due coppie di enantiomeri (1a, 1b, 1c, 1d), precedentemente caratterizzati via NMR e separati con tecniche di cromatografia chirale. Sono stati inoltre studiati gli analoghi ottenuti formalmente per eliminazione di uno (coppia di enantiomeri 2a e 2b) o due gruppi nitrossilici (3). Nella seconda parte di questo lavoro di tesi viene esplorato con un lavoro di molecular modeling il grado di complementarietà sterica ed elettronica degli analoghi della GTN con la cavità dell'aldeide deidrogenasi mitocondriale, che in base ai dati sperimentali risulta essere l'enzima bioattivante per alcune di esse. In particolare, si investiga l'interazione della GTN e dei nitrati organici delle due serie di omologhi (Figura 20 e 21) con la cavità dell'enzima mtALDH-2 mediante una procedura di flexible docking.L'utilizzo di questa tecnica è reso possibile dalla disponibilità delle coordinate tridimensionali, pubblicate e depositate nel Protein Data Bank, sia dell'enzima nativo (oloenzima) che dei complessi con diversi inibitori e substrati.Avvalendosi dei dati farmacologici e computazionali si cercherà di formulare delle ipotesi sulle basi molecolari per spiegare la maggiore o minore bioattivazione da parte dell'ALDH-2 dei composti delle due serie, evidenziando come i determinanti strutturali modulano l'affinità per l'enzima.  Sono stati inoltre condotti ulteriori esperimenti in presenza di benomyl (butil 2-[(metossicarbonil)amino]-1H-benzimidazolo-1-carbossilato)(Figura 23), un inibitore dell'enzima mtALDH-2. Questo inibitore è stato utilizzato per determinare il coinvolgimento o meno di questo enzima nella bioattivazione dei nuovi nitrati organici; esperimenti analoghi sono stati già riportati in letteratura per quel che riguarda la GTN ed altri NO-donatori noti. Dai risultati pubblicati è emerso che il benomyl riduce l'attività vasodilatante della GTN e di altri nitrati e lo spostamento della curva concentrazionerisposta è paragonabile a quello osservato su animali knock-out per l'enzima mtALDH-2.Viceversa, NO-donatori diretti come il sodio nitroprussiato non sono influenzati dall'inibitore, facendo quindi escludere effetti aspecifici del benomyl sulla vasodilatazione.Il metodo usato per lo studio dei nuovi nitrossi derivati è stato convalidato precedentemente sulla GTN; questa molecola è infatti di gran lunga la più studiata tra i nitrati organici e presenta analogie strutturali con i composti studiati. Nelle condizioni sperimentali, uguali a quelle usate in questo lavoro di tesi, la GTN ha dimostrato un'attività vasodilatante concentrazione-dipendente nei confronti del tessuto precontratto con fenilefrina (Figura 24). Nell'attività osservata è coinvolto il pathway NO/sGC/cGMP, in quanto la vasodilatazione è quasi completamente abolita preincubando l'organo isolato con ODQ.La potenza della trinitroglicerina, espressa come EC 50 , è paragonabile a quella determinata in altri lavori di letteratura (0.029 µM). Dall'analisi della curva concentrazione-risposta (Figura 25) si può inoltre osservare un andamento che non corrisponde alla classica curva sigmoide; sono infatti individuabili due fasi distinte, caratteristica già riportata da altri gruppi di ricerca (Malta et al., 1989). 3x10 -9 M 1x10 -8 M 3x10 -8 M 1x10 -7 M 3x10 -7 M 1x10 -6 M 3x10 -6 M 1x10 -5 M 3x10 -5 M 1x10 -4 M 3x10 -9 M 1x10 -8 M 3x10 -8 M 1x10 -7 M 3x10 -7 M 1x10 -6 M 3x10 -6 M 1x10 -5 M 3x10 -5 M 1x10 -4M Figura 24. Un esempio di tracciato della vasodilatazione della GTN costruito per aggiunte successive. È stato ipotizzato che la presenza delle due fasi sia dovuta al coinvolgimento di differenti pathway di bioattivazione, con diversa efficienza ed operanti a differenti concentrazioni. Nelle nostre condizioni la prima fase, detta ad alta affinità e ipoteticamente correlata al coinvolgimento dell'ALDH-2 nella bioattivazione, corrisponde a circa l'80% della curva totale, mentre la seconda fase, che inizia alla concentrazione 1 µM, determina l'attività restante fino ad arrivare al 100% di efficacia.Il benomyl si è rivelato in grado di ridurre l'attività vasodilatante della GTN; lo spostamento verso destra della curva concentrazione-risposta è di un ordine di grandezza circa. Anche questo dato è in accordo con dati riportati in letteratura; tale spostamento sarebbe riconducibile all'azione inibitoria del benomyl nei confronti della bioattivazione della GTN mediata da mtALDH-2. La GTN è comunque ancora in grado di rilassare totalmente il vaso precontratto (efficacia = 100%); è interessante notare come la curva concentrazione-risposta in queste condizioni sperimentali abbia un andamento nettamente monofasico. Per quanto riguarda i composti in studio, i benzil trinitrossi derivati hanno mostrato un profilo di attività comune (Figura 26), con la lieve ma significativa eccezione del derivato 1a rivelatosi più attivo rispetto agli altri tre stereoisomeri. Se confrontato con quello della trinitroglicerina, il comportamento dei trinitroderivati presenta differenze significative; la potenza è circa 6 volte minore e l'andamento della curva concentrazionerisposta è monofasico. Si può quindi affermare che l'inserimento di una sottostruttura