Negli “Opuscola anatomica” l'Eustachio indica le fonti della sua formazione scientifica e della diretta esperienza acquisita nella lunga e diligentissima attività anatomica sugli animali e sui corpi umani e promette con l'aiuto di Piermatteo di pubblicare un volume: “ De dissensionibus ac controversiis anatomicis”. Per cause diverse come la malattia, la tarda età e la “fortunarum mearum imbecillitate” questo volume non fu mai pubblicato. Ora si trova nella biblioteca comunale di Siena, scritto per la massima parte dalla mano dell'Eustachio e la rimanente da Piermatteo. Gli argomenti che vengono trattati in risposta a Vesalio che tenta di demolire Galeno sono: ossa e loro connessi, unghie, laringe, cartilagine, muscoli, pelle, muscoli in particolare, vene, arterie, nervi, addome e suoi organi, apparato genitale dei due sessi, feto e sue membrane, torace e suoi organi, cranio ed encefalo.