Il vaccino del vaiolo contiene il virus vaccinia che dal punto di vista antigenico è simile al virus Variola, quest'ultimo un Orthopoxvirus della famiglia dei Poxviridae, agente responsabile del vaiolo. La somministrazione del vaccino evoca la replicazione locale del virus vaccinia, che si può verificare anche a livello dei linfonodi periferici. La protezione conferita deriva probabilmente dal coinvolgimento delle cellule T e B del sistema immunitario con produzione di specifici anticorpi. In seguito all'immunizzazione primaria con il vaccino, gli anticorpi compaiono nel siero nel giro di 4-5 giorni. Nelle successive 4 settimane sono raggiunti dei picchi di concentrazione che persistono per qualche anno. A seguito della vaccinazione di richiamo l'immunità è più lunga e persistente. Quando nel siero compaiono gli anticorpi in genere si verifica anche una risposta a livello cutaneo. Infatti, dopo immunizzazione primaria, raramente si verifica la comparsa di anticorpi nel siero senza una risposta cutanea e comunque l'assenza di risposta cutanea indica una inadeguata immunizzazione. La risposta cutanea all'immunizzazione compare entro 3-5 giorni, diviene decisamente evidente entro le 4 settimane successive e può ancora modificarsi perfino 20 anni dopo l'avvenuta immunizzazione. L'immunità conferita dal vaccino presenta un elevato grado di protezione nei confronti della malattia: infatti circa il 100% degli individui che ricevono una singola dose di vaccino risultano protetti per almeno 5 anni.