Il DNA genomico modificato è stato amplificato tramite reazione di PCR (Polymerase Chain Reaction), che permette la replicazione di regioni target in vitro. La reazione di PCR inizia con una temperatura iniziale di 95°C per 5 minuti (attivazione enzima), in seguito alla quale vengono ripetuti tre passaggi per 35-45 volte. Questi passaggi sono la denaturazione (92-98°C) che permette di separare le due catene complementari di DNA, l'ibridazione (40-60°C) di oligonucleotidi di innesco (primers) corrispondenti a specifiche sequenze complementari del DNA stampo che fiancheggiano la regione di interesse, e l'estensione (70-72°C), passaggio in cui la DNA polimerasi sintetizza il nuovo filamento di DNA. La quantità delle copie prodotte a partire dal filamento stampo è legato alla quantità di cicli in cui queste fasi si ripetono. Tempi e temperature ottimali sono definiti empiricamente poiché relazionati alla sequenza target e ai primers della reazione di sintesi utilizzati. L'utilizzo attuale di termociclatori capaci di passare dalle diverse temperature ha reso questo processo utilizzabile in diverse realtà laboratoristiche. La quantità di DNA di partenza aggiunta in ogni reazione di PCR è altrettanto importante, dal momento che un'eccessiva quantità potrebbe inibire l'enzima mentre una scarsa quantità renderebbe inefficiente la reazione. Anch'esso è un parametro standardizzato solo empiricamente. Nel presente lavoro l'amplificazione del DNA genomico non solo ha permesso di ottenere materiale sufficiente per le analisi mutazionali, ma anche di rendere valutabile mediante sequenziamento diretto con pirosequenziatore (di seguito) delle timine incorporate nelle posizioni non interessate dal processo di metilazione. Il processo di amplificazione è stato effettuato mediante l'utilizzo di primers generici fiancheggianti le regioni del promotore d'interesse, situate in zona 5'UTR dell'esone 1.La reazione di PCR è stata effettuata utilizzando l'enzima polimerasi ad alta processività "Taq Gold polimerasi" (Takara Ex Taq HS, Diatech Labline) e i reagenti necessari, adeguatamente ottimizzati nella miscela di reazione. L'amplificazione è stata eseguita a partire da 100 ng di DNA genomico in un volume finale di reazione di 50 μl composta da enzima Taq polimerasi (1unità), 0.2 mM di dNTPSs mix (miscela equimolare dei 4 nucleotidi), 1.5 mM di cloruro di magnesio (MgCl2) che determina la specificità e l'efficienza di reazione, tampone di reazione 1X (Tris-HCl 100 mM, pH 8,3; KCl 500 mM) che permette di garantire il pH ottimale per l'attivazione della polimerasi e primers (0,8 μM) specifici per la regione di interesse. Per ogni seduta di reazione sono state utilizzati un controllo negativo e i controlli positivi (MethylatedCtrl DNA -Non-MethylatedCtrl DNA), per garantire la specificità e la corretta esecuzione delle procedure. Gli specifici protocolli e profili termici utilizzati sono riassunti nella Tabella 4 qui in fondo al capitolo sulla analisi molecolare.Tabella 4. Specifiche dei protocolli utilizzati per la quantificazione dello stato di metilazione del promotore del gene MGMT.