Nella genetica classica, cosidetta forward genetics, il primum movens è l'osservazione di un particolare fenotipo da cui si parte per ipotizzare i meccanismi biopatologici sottostanti , una volta identificati i potenziali protagonisti della patogenesi vengono indagati i geni che codificano per queste strutture. Uno degli approcci più utilizzati è sequenziamento automatico del DNA.Il DNA viene estratto dai linfociti presenti nel sangue periferico prelevato dal paziente grazie a un kit di estrazione e purificazione GENTRA, successivamente vengono amplificati con specifici primers gli esoni del gene di interesse utilizzando la tecnica della PCR. Gli amplificati vengono purificati mediante il GenElute TM PCR Clean-Up Kit della ditta SIGMA e successivamente quantificati su gel di agarosio all'1,5%. I campioni vengono sequenziati direttamente utilizzando il Big Dye Terminator e purificati con Illustra TM AutoSeq G-50 Dye Terminator Removal Kit GE Healthcare. Le sequenze vengono poi effettuate su sequenziatore ABIPrism 3100Avant e analizzate con il software Seqscape 2.1 il quale presenta una elaborazione grafica che evidenza, sotto forma di picchi colorati alternati, l'ordine delle basi nucleotidiche che costituiscono la sequenza di DNA (Sanger et Coulson 1975;Rodaghi et al, 1996;Mohammadi et al., 2005;Wilson et al., 2011).L'esaminatore osservando le differenze nell'ordine di basi presentate tra il paziente e le sequenze considerate normali, immagazzinate in specifiche libraries, identifica le mutazioni. Esistono diversi tipi di mutazioni geniche: alcune non producono nessuna modificazione nella struttura della proteina prodotta o perché la tripletta mutata codifica per lo stesso aminoacido della tripletta wild type, o perché codifica per un diverso aminoacido che tuttavia non altera l'assemblaggio della proteina.Sarà lo studio della proteina trascritta dal gene mutato a confermare o meno che la presenza di mutazioni negli esoni del gene in esame possono essere responsabili della malattia.Ovviamente per utilizzare questo approccio nella ricerca di mutazioni in soggetti affetti da diverse patologie è necessario conoscere i geni in cui andare a compiere l'analisi.Con l'avvento di tecniche sempre più sofisticate per il sequenziamento del genoma la quantità di informazioni riguardanti il DNA è aumentata esponenzialmente e l'interpretazione di questi dati è oggi per i ricercatori la sfida più importante.L'approccio molecolare infatti offre la possibilità di partire da differenze in una determinata sequenza di DNA e di investigare gli effetti fenotipici di tale cambiamento.Nasce così la genetica inversa (reverse genetics).La tecnica del sequenziamento degli esomi si inserisce in questo nuovo scenario e richiede un forte impegno sia dal punto di vista tecnico che interpretativo.Si stima che circa l'85% delle mutazioni che causano una patologia a trasmissione mendeliana coinvolgano le regioni codificanti del DNA, chiamati esoni, o i siti di splicing più importanti. Nell'uomo sono stati identificati 180000 esoni, che costituiscono circa l'1% dell'intero genoma umano.Gli esomi sono l'insieme di tutti gli esoni, ovvero di tutta quella parte di DNA che codifica per le proteine.Il sequenziamento degli esomi, whole exome sequencing, è una nuova e innovativa tecnica di analisi genetica, ancora poco nota in Italia e nel mondo, le cui considerevoli potenzialità si stanno sviluppando in questi ultimi anni.Possiamo così riassumere i diversi passaggi che costituiscono questa complessa tecnica:• preparazione della library• sequenziamento della library• applicazione di filtri  La caratteristica fondamentale del whole exome sequencing è l'attenzione specifica a quelle parti di DNA che codificano per le proteine ovvero gli esomi che sono costituiti dall'insieme di tutti gli esoni. È noto infatti che la maggior parte delle mutazioni responsabili della patologie a trasmissione mendeliana riguardano queste regioni.•L'analisi del gran numero di informazioni derivate dal sequenziamento degli esomi è resa difficoltosa dalla presenza di un elevato numero di falsi positivi e falsi negativi. Per ovviare a questo problema vengono applicati alcuni filtri:• confronto tra le varianti geniche identificate tra il sequenziamento e la genotipizzazione array-based genotyping;• confronto tra i polimorfismi del DNA in studio e i SNPs precedentemente identificati nel 1000 Genomes project e nel dbSNP database;• filtri specifici a seconda del tipo di trasmissione della patologia in esame;• identificazione delle varianti comuni in individui affetti dalla stessa patologia ma non riscontrati in soggetti sani I geni coinvolti nelle patologie a trasmissione recessiva sono in genere di più facile identificazione rispetto a quelli a trasmissione dominante poiché è meno probabile che siano presenti rare varianti non sinonime. Certamente in futuro l'incremento dell'uso del sequenziamento di interi esomi porterà alla scoperta di un numero maggiore di dbSNP, in relazione anche all'importante eterogeneità genetica e all'eterogeneità etnica tra le popolazioni, per cui sarà necessario stabilire soglie specifiche per definire quali varianti comuni sono da attribuire a fenotipi patologici.Le varianti che vengono selezionate dopo l'applicazione dei filtri di lettura sono poi analizzate nel loro contesto genomico. Successivamente vengono studiati anche gli effetti fenotipici determinati dalla presenza delle mutazioni identificate.Il sequenziamento degli esomi è dunque una tecnica di ricerca di mutazioni candidate a essere responsabili di malattia che necessita di un importante lavoro di definizione dei filtri da applicare per decifrare l'enorme quantitativo di informazioni che sono ricavate dal confronto tra gli esomi di soggetti diversi sia sani che malati. nuova tecnica per identificare varianti rare e comuni in più di 300 megabasi di sequenze codificanti; l'anno successivo applicando lo stesso metodo identificarono un gene responsabile della Sindrome di Myller, una rara malattia mendeliana a causa ignota (Ng et al., 2009;Ng et al., 2010).Sempre nel 2009 un altro gruppo di ricercatori constatò l'utilità dell'approccio whole exome sequencing nel momento in cui fecero un'imprevista diagnosi genetica di Congenital Chloride Diarrhea in un paziente con una diagnosi sospetta di Sindrome di Bartter (Choi et al., 2009).Il sequenziamento degli esomi è stato applicato anche in una patologia come la sindrome di Charcot-Marie-Tooth che è caratterizzata dalla coesistenza di un gran numero di forme distinte geneticamente ma relativamente uniformi fenotipicamente (Montenegro et al., 2010).Bonnefond et al., hanno confrontato il protocollo Sanger e il whole exome sequencing per l'identificazione di nuove mutazioni de novo nei pazienti affetti da diabete mellito neonatale monogenico non autoimmune NDM e hanno definito come la nuova tecnica possa essere utile per analizzare quei soggetti che sono affetti dalla patologia senza essere risultati positivi alla ricerca delle mutazioni note (Bonnefond et al., 2010).Negli ultimi due anni il sequenziamento degli esomi è stato impiegato per scoprire nuove mutazioni patogene in molti ambiti della medicina che spaziano dai tumori, ad esempio nel melanoma metastatico (Wei et al., 2011), a malattie neurologiche come la Sindrome di Tourette (Sundaram et al., 2011).Due recentissimi lavori, pubblicati quest'anno, hanno analizzato gli enormi progressi effettuati nell'ambito del sequenziamento degli esomi. L'alta sensibilità e specificità dell'analisi, la riduzione dei costi e la automatizzazione crescente delle tecnologie impiegate depongono a favore dello sviluppo di questa nuova tecnologia che avrà in futuro un ruolo fondamentale nella scoperta di mutazioni responsabili di patologie rare a trasmissione di tipo mendeliano in cui i più comuni approcci di analisi linkage e di positional cloning non sono applicabili (Depristo et al., 2011;Ku et al., 2011).  (Druck et al., 1995).