Le prove di efficacia del Cetuximab come terapia del carcinoma del colon-retto sono numerose sia in monoterapia sia in aggiunta alla terapia classica. Con la somministrazione di questo farmaco in pazienti refrattari alla terapia classica, da solo o in combinazione con irinotecan, si ottiene un incremento del tasso di risposta, del controllo della malattia, della sopravvivenza libera da malattia e della sopravvivenza totale. Anche quando utilizzato in prima linea ha dimostrato di incrementare gli effetti positivi della chemioterapia classica permettendo inoltre ad un numero maggiore di pazienti con carcinoma del colon-retto metastatico di andare incontro ad una resezione epatica ad intento curativo. Purtroppo però non tutta la popolazione a cui il farmaco viene somministrato beneficia degli effetti positivi del cetuximab, e per questo motivo la ricerca scientifica da alcuni anni sta indagando la possibile esistenza di fattori che possano predire la risposta alla terapia. Si è già giunti alla definizione di alcuni marcatori predittivi e molti sono i possibili candidati, ma ad oggi non esiste un marcatore che possa identificare con adeguata sensibilità e specificità i pazienti che risponderanno adeguatamente alla terapia con cetuximab. L'identificazione di questi marcatori sarebbe estremamente utile per applicare il farmaco in una popolazione selezionata sia in regime di prima linea sia di seconda linea permettendo così di diminuire i costi, evitare ai pazienti non responsivi un inutile trattamento gravato da effetti avversi e permettere loro eventualmente di sottoporsi a terapie più adatte. Ancora più importante sarebbe l'identificazione di fattori predittivi per poter applicare il farmaco in campo adiuvante. Ad oggi non esistono lavori conclusi in cui il cetuximab è stato utilizzato in terapia adiuvante ma ci sono diversi studi ancora in corso i cui risultati preliminari sembrano essere promettenti per quanto riguarda l'efficacia del farmaco. In assenza di marcatori specifici di risposta il cetuximab in terapia adiuvante viene somministrato per un periodo limitato di tempo, solitamente 6 mesi, anche se data la sua azione di tipo citostatico questo farmaco probabilmente sortirebbe una reale azione di inibizione della crescita e della diffusione dei residui di malattia a lungo termine solo se assunto in modo cronico per lunghi periodi di tempo a partire dall'intervento chirurgico. Tuttavia non è possibile sottoporre ad un trattamento così lungo, gravato da effetti avversi e che può peggiorare la qualità di vita del paziente se non si è certi della sua utilità. Per questo motivo in campo adiuvante ancora più che in altri ambiti riteniamo fondamentale l'identificazione di fattori capaci di predire la risposta al cetuximab.In questo ambito si inserisce il nostro studio che ha lo scopo di creare un modello ex-vivo di metastasi epatica da tumore del colon tramite lo xenotrapianto in topi immunocompromessi di un frammento di metastasi prelevato da pazienti operati. Tramite questo strumento abbiamo potuto valutare prospetticamente la risposta al cetuximab ed effettuare in parallelo una serie di analisi sui campioni tumorali per identificare marcatori predittivi di risposta. A questo scopo sono state condotte analisi dello stato mutazionale di fattori già noti come KRAS e BRAF e di PI3K la cui capacità predittiva di risposta è dibattuta in letteratura, inoltre verranno portati avanti studi che permettono di individuare alterazioni in tutto il genoma e il trascritto delle cellule del materiale in nostro possesso oltre che analisi dell'espressione di EGFR e di proteine che dipendono da esso. Con questi dati è possibile sia la rianalisi di fattori già ampiamente studiati in letteratura come KRAS, BRAF ed EGFR allo scopo di ottimizzare la loro capacità predittiva operando una integrazione tra di essi sia l'identificazione di nuovi predittori di risposta alla terapia. In questo modo il lavoro presentato da un lato va ad inserirsi nella ricerca di marcatori predittivi già noti di risposta al cetuximab aggiungendo dati a quelli disponibili in letteratura, dall'altro può portare all'identificazione di nuovi candidati. Tutto ciò avviene nel contesto di un'analisi integrata volta a far emergere potenziali sinergie fra diversi parametri che finora sono sempre stati analizzati in modo indipendente. .La coorte oggetto dello studio è costituita da un totale di 83 pazienti, selezionati da luglio 2008 a settembre 2009. Premettendo che i risultati riportati, per i parametri analizzati, sono riferiti a una coorte più ristretta di circa 52 pazienti perché le informazioni dei restanti pazienti non ci sono ancora pervenute, verranno di seguito descritte le caratteristiche anagrafiche dei pazienti selezionati, gli aspetti relativi al tumore primitivo e infine le peculiarità riguardanti le metastasi epatiche.La coorte è costituita da pazienti di età variabile da 46 a 81 anni, con una media di 63; sul totale di 52, in particolare sono 7 i soggetti di età inferiore ai 50 anni, 12 coloro con un'età compresa tra i 50 e i 60 anni, 20 quelli che hanno tra i 60 e i 70 anni e 13 coloro che superano i 70 anni. Il rapporto M/F è 1.36, con 30 pazienti di sesso maschile e 22 di sesso femminile.Per quanto riguarda le caratteristiche del tumore primitivo, rileviamo una prevalenza di localizzazione della neoplasia a livello colico rispetto al retto. Infatti i pazienti con tumore primitivo del colon sono 37, mentre coloro con neoplasia a livello rettale sono 15.Considerando la stadiazione del tumore, su un totale di 49, i pazienti possono essere suddivisi come segue: 1 caso presenta neoplasia allo stadio Tis, nessuno allo stadio T1 e 4 sono i soggetti con tumore stadiato come T2; 36 hanno invece tumore primitivo T3 e 8 hanno neoplasia stadiata come T4 (Tabella 8.1). Per quanto concerne l'interessamento linfonodale, si rilevano 15 casi di tumore primitivo in cui i linfonodi locoregionali non sono colpiti da metastasi (N0) e 33 casi in cui si sono ritrovati linfonodi positivi per cellule neoplastiche, in particolare 20 neoplasie allo stadio N1 e 14 allo stadio N2 (Tabella 8.2). Nell'ambito delle caratteristiche istopatologiche della neoplasia si descrive il grading tumorale; avendo a disposizione informazioni a riguardo di 36 pazienti, uno solo presenta neoplasia con grading G1, 23 sono quelli aventi tumori con grading G2 e 12 sono coloro con carcinomi descritti come G3. La presenza di metastasi extraepatiche è rilevata in 3 pazienti, di cui uno avente secondarietà polmonari, un altro con un linfonodo metastatico a livello dell'arteria epatica e l'ultimo presentante una neoformazione paracavale destra.Considerando 40 pazienti di cui si hanno a disposizione sufficienti informazioni, possiamo evincere che in 7 casi (17%) le metastasi epatiche costituiscono una recidiva di secondarietà al fegato già resecate in passato; in particolare per 2 pazienti la lesione attualmente operata è la seconda recidiva, mentre negli altri 5 è la prima. Nei rimanenti 30 casi, invece, le secondarietà epatiche rappresentano il primo episodio di metastatizzazione della malattia.Considerando l'intero gruppo di pazienti, 34 (65%) presentano metastasi sincrone al tumore primitivo, mentre 18 (35%) sviluppano metastasi metacrone. Tra questi ultimi, di 15 conosciamo l'intervallo di tempo intercorso tra intervento sulla neoplasia primitiva e la diagnosi di secondarietà epatiche. Con una variazione da un minimo di 1 mese fino a un massimo di 35 mesi, trascorrono in media 13.5 mesi tra la resezione del tumore colorettale e la diagnosi delle metastasi epatiche. Per quanto riguarda i casi che presentano metastasi sincrone, di 33 è possibile indicare il momento della resezione: simultanea all'intervento sul tumore primitivo in 16 casi (49%) e differita rispetto alla resezione intestinale in 17 casi (51%).Sul totale di 51 resezioni, 16 sono simultanee e 31 sono differite.La resezione epatica risulta radicale in 32/46 casi (69%), mentre nei restanti 14 pazienti (31%) la neoplasia giunge al margine di resezione, per cui la resezione non si può considerare radicale.Relativamente all'esecuzione di CT neoadiuvante sulle metastasi epatiche, 20/51 (39%) pazienti non sono stati chemiotrattati, mentre i rimanenti 27 (61%) hanno effettuato cicli di CT prima della resezione epatica. Gli schemi chemioterapici impiegati sono FOLFIRI(2 pazienti), FOLFIRI in associazione a Bevacizumab (10 soggetti), FOLFOX (10 pazienti), FOLFOX combinato a Bevacizumab (3 soggetti) e XELOX (2 pazienti). Il numero medio di cicli di CT è 7,6 con variazioni da 3 fino a 17 cicli. Sul totale di 27 pazienti trattati, di 10 conosciamo la risposta alla CT neoadiuvante. Di questi un caso presenta progressione di malattia e un altro una condizione descritta tra la progressione e la stabilizzazione di malattia; 6 manifestano risposta parziale alla CT, in nessun caso invece si riscontra una risposta completa. Infine in 2 casi registriamo una stabilizzazione di malattia tra prima e dopo il trattamento neoadiuvante.Tra i pazienti con metastasi metacrone (18), 5 sono stati sottoposti a CT neoadiuvante, mentre 13 non sono stati trattati prima della resezione epatica. Nel gruppo di soggetti con metastasi sincrone (34), di uno non è noto se ha eseguito CT neoadiuvante, diversamente dagli altri 33, dei quali siamo a conoscenza che 22 sono stati chemiotrattati e 11 non hanno effettuato la terapia neoadiuvante (Tabella 8.5).Per quanto riguarda, infine, la coorte dei pazienti con metastasi sincrone (34), da cui escludiamo un paziente per carenza di dati, possiamo descrivere quanti di coloro sottoposti a resezione simultanea ( 16) e a resezione differita ( 17 Nel complesso, la coorte risulta eterogenea sia per età e sesso dei pazienti selezionati che per numero e dimensioni delle metastasi; non sono quindi presenti fattori confondenti che possano sbilanciare la coorte e potenzialmente falsare i risultati. Inoltre il gruppo in studio è eterogeneo per quanto riguarda i regimi terapeutici somministrati prima dell'intervento di resezione epatica, ovvero circa metà della coorte ha effettuato CT neoadiuvante mentre l'altra metà non è stata trattata. Da ciò deriva da un lato la possibilità di correlare l'efficacia della targeted therapy con l'efficacia della CT neoadiuvante, valutando se sussistono differenze in termini di risposta al farmaco targeted nel gruppo di chemiotrattati rispetto al gruppo non trattato; dall'altra tale suddivisione dei pazienti ci consente di valutare se il trattamento chemioterapico possa influenzare in qualche modo la risposta alla targeted therapy. Infine, avendo a disposizione dati relativi alla radicalità della resezione epatica, è possibile valutare se resezioni non R0 rispondono al farmaco a bersaglio molecolare, nell'ottica dell'applicazione della targeted therapy come trattamento adiuvante.Il materiale raccolto dai pezzi operatori di metastasi epatiche è stato in parte impiantato nei topi e in parte è stato archiviato con diverse tecniche allo scopo di conservarne il più possibile le caratteristiche biochimiche. Una parte di esso è stato conservato in RNA later, una soluzione che permette la conservazione degli acidi nucleici all'interno della cellula.A partire da questo materiale è stata effettuata l'estrazione completa del DNA genomico, che permette analisi genetiche complete, in 75 su 83 campioni, quindi nel 90% di essi, e l'estrazione del RNA in 61 su 83, quindi nel 73% dei campioni di cui disponiamo (Tabella 8.6). In particolare l'estrazione dell'RNA viene impiegata per lo studio del trascritto cellulare tramite analisi condotte con microarray che verranno descritte meglio in seguito.A partire dal DNA estratto saranno condotti due tipi di analisi che gettano le basi per studi successivi volti a ottimizzare le conoscenze già disponibili e ad identificare nuovi marcatori predittivi.I due tipi di studio già effettuati sul materiale genomico comprendono l'identificazione di eventuali mutazioni sui geni di KRAS, BRAF e PI3CA e la misurazione del numero di copie del gene (Gene Copy Number) di EGFR tramite RT-PCR utilizzando sonde di tipo Taqman.Entrambe queste analisi non solo permettono di capire come le alterazioni di questi geni possano influenzare la risposta alla terapia dei casi in studio e di confrontare i risultati con quelli ottenuti in letteratura ma permettono anche di effettuare un'ottimizzazione del potere predittivo parziale che essi possiedono tramite una integrazione dei dati ottenuti.Per quanto riguarda la misurazione del Gene Copy number di EGFR (Error! Reference source not found.) si considera un numero di copie normale di EGFR quando esso è al di sotto di 3 e nella nostra casistica otteniamo un totale di 22 tumori su 73 analizzati che presentano un numero di copie di EGFR che oltrepassa tale valore. Quindi un aumento di numero di copie di EGFR è presente nel 30% dei tumori in studio in modo simile a ciò che è stato descritto in letteratura (Cappuzzo, et al., 2008) (Cappuzzo, et al., 2007.Possiamo notare che nella nostra casistica non sono presenti tumori con amplificazioni focali ad alta frequenza poiché possiamo osservare che la maggior parte dei campioni amplificati (68%) possiede un numero di copie di EGFR compreso tra 3 e 4, solo 7 possiedono un numero di copie maggiore di 4 e solo 3 sono portatori di più di 6 copie.Anche in altri studi di questo tipo sono stati ottenuti dati simili in cui il numero di copie di EGFR, quando amplificato, si assesta su valori comunque decisamente bassi e raramente si trovano tumori con un numero di copie di EGFR maggiore di 10 (Cappuzzo, et al., 2008) (Sartore-Bianchi, Moroni, Veronese, & al., 2007. In particolare è stato ipotizzato che ciò che causa questo modesto aumento del numero di copie è la trisomia o la polisomia del cromosoma 7 che contiene il gene di EGFR. Questa ipotesi è supportata dalla contemporanea amplificazione di un basso numero di copie di alcuni geni contenuti nel cromosoma 7 nelle cellule con aumentato numero di copie di EGFR. Quindi l'assenza di amplificazioni focali ad alta frequenza è stata attribuita al meccanismo di amplificazione di EGFR che dipende da una polisomia cromosomica e che quindi difficilmente può apportare un alto numero di copie geniche. (Cappuzzo, et al., 2008) (Cappuzzo, et al., 2007) (Cappuzzo, et al., 2008. In definitiva questi risultati sono in linea con quelli ottenuti dalla letteratura e sono concordanti con questa teoria.  