La trasmissione del virus avviene principalmente con la saliva. Questo tipo di trasmissione è ben evidenziato dal nome che si dà comunemente alla mononucleosi: "malattia del bacio". Anche le vie di trasmissione ematica e sessuale sono possibili, ma in via del tutto eccezionale. Nei paesi economicamente sviluppati il primo contatto con il virus avviene nell'adolescenza e dopo i 25 anni di età quasi tutti gli individui, anche coloro che non hanno sviluppato la mononucleosi, presentano positività agli anticorpi anti-EBV. L'età della prima infezione si riduce in modo significativo a seconda del livello socio-economico e delle condizioni di promiscuità e di igiene. In Africa la trasmissione estremamente precoce del virus (sotto i 3 anni di età) è stata messa in relazione a particolari abitudini alimentari: la madre premastica il cibo che viene dato da mangiare al bambino piccolo.