La singola catena polipeptidica della mioglobina contiene come gruppo prostetico l'eme, con al centro un atomo di ferro ferroso, (Fe2+), proprio come l'emoglobina. Il Fe può formare altri 2 legami, uno su ciascuna della 2 facce del piano dell'eme e che formano il V e il VI sito di coordinazione. Nella mioglobina il V sito di coordinazione è occupato da un'istidina (His F8 o His 93) della proteina, chiamata "istidina prossimale". Nella deossimioglobina, il sesto sito di coordinazione è vuoto e perciò è disponibile per il legame con l'ossigeno.