 Disporre sul lato nero della piastra per trasferimento una spugnetta imbevuta di soluzione di trasferimento fredda. Sovrapporre due foglietti di carta imbevuti di soluzione di trasferimento e togliere le eventuali bolle d'aria. Porre delicatamente il gel di proteine sui 2 foglietti di carta evitando la formazione di bolle. Sovrapporre ordinatamente sul gel il filtro di nitrocellulosa ritagliato (effettuare un taglio su un angolo del filtro per evidenziare il verso del trasferimento) e imbevuto in soluzione di trasferimento. Disporre due foglietti di carta imbevuti di soluzione di trasferimento e togliere le eventuali bolle d'aria. Sovrapporre una nuova spugnetta imbevuta di soluzione di trasferimento. Chiedere la struttura a sandwich e disporla all'interno della struttura di trasferimento. Inserire tale struttura all'interno della vaschetta (nero verso nero e trasparente verso rosso) contenente la soluzione di trasferimento tenuta a freddo con il panetto di ghiaccio e collegarla ad un alimentatore di corrente ad un voltaggio di 100 V per 60'. Ricordarsi di mettere un magnete e porre tutta la struttura sullo stirrer.o Colorare il filtro di nitrocellulosa con Rosso Ponceau per circa 5' su basculante (da questo momento il filtro non deve mai rimanere a secco).o Decolorare il filtro con H 2 O deionizzata fino a quando il fondo appare bianco e si vedono bene le bande delle proteine.o Segnare con una matita il marker e disporre il filtro tra due fogli lucidi per poter fare una fotocopia.o Decolorare del tutto il filtro con TBS 1x 5% BSA con azide mettendolo su basculante per 60' a 42°C.o Effettuare un lavaggio veloce con TBS 1x 0.3% Tween.o Incubare il filtro con l'anticorpo primario (siero immune o anticorpo commerciale) diluito a seconda dell'anticorpo in TBS 1x BSA con azide a 4°C over night.o Il giorno seguente eseguire 3 lavaggi da 10 minuti ciascuno con TBS 1x 0.3% Tween a temperatura ambiente su basculante.o Incubare il filtro con l'anticorpo secondario diluito in TBS 1x 0.3% Tween per 60' al buio a temperatura ambiente su basculante (da questo momento il filtro non deve essere mai esposto alla luce per tempi prolungati). L'anticorpo secondario marcato con l'enzima perossidasi può essere anti-mouse o antirabbit a seconda del tipo di primario utilizzato.o Eseguire 5 lavaggi da 10 minuti ciascuno con TBS 1x 0.3% Tween a temperatura ambiente.