Storicamente il processo di campionamento fu fatto in due passi data la relativa semplicità di produrre anticorpi primari e secondari in processi separati. Questo dà ai ricercatori molti vantaggi in termini di flessibilità, e aggiunge una amplificazione nel rilevamento. Dato l'avvento di analisi proteiche ad alta efficienza e limiti più bassi di rilevamento, c'è stato interesse a sviluppare sistemi "one-step" che permettono maggior velocità di esecuzione e meno consumabili. Questo richiede un provino anticorpo che rileva la proteina d'interesse e che contenga un'etichetta rilevabile, provini che spesso sono disponibili per proteina bersaglio. Il provino primario è incubato con la membrana in un modo simile a quello dell'anticorpo primario in un processo two-step, e così è pronto per il rilevamento diretto dopo una serie di lavaggi.