Charles frequentò il Chicago Medical College consigliato dal padre, il quale desiderava che i due figli acquisissero punti di vista diversi frequentando università differenti. Il Chicago Medical College era affiliato alla Northwestern University, ma totalmente indipendente dal punto di vista amministrativo e collegato a diverse cliniche gestite da chirurghi come Christian Fenger, Nicholas Senn, Edmund Andrews. Qui Charles conobbe Harry C Whiting, con cui condivise la stanza per i successivi due anni. I due decisero di non discutere di politica, poiché Charlie era democratico e Harry repubblicano, né di religione. Fecero presto la conoscenza di Edward C Morton e James Morgan. I quattro giovani furono amici inseparabili durante gli anni del college. Charlie non fu uno studente particolarmente brillante, sebbene molto dotato, osservava gli interventi con grande attenzione per poi discuterne con gli amici. Quasi tutti i chirurghi da lui incontrati durante questi anni appoggiavano Lister, per cui Charlie ebbe modo di conoscere e approfondire le novità da lui introdotte ed i vantaggi. Si laureò in medicina il 27 marzo 1888.