fine di prevenire interazioni tra specie proteiche diverse e formazione di aggregati.Proteine quindi con queste funzioni sono la prima linea di difesa contro il misfolding proteico o contro la tendenza all'aggregazione di molte specie proteiche (Arrigo et al., 2007), ed infatti in molte malattie in cui si osserva un errato folding proteico l'Hsp27 e l'B-cristallina sono spesso over-espresse e si accumulano in inclusioni; le analisi in WB condotte sugli esperimenti di RNA-pull down mostrano una maggiore affinità dell'B-cristallina per la sonda r(CGG) 76 rispetto alla r(CGG) 28 .È noto che l'Hsp27, la cui espressione è prevalentemente citoplasmatica, cambi localizzazione (da citosol a nucleo) in risposta ad uno shock termico (Lavoie J. N. et al, 1993). Abbiamo quindi deciso di analizzare il comportamento di questa proteina in un modello ovarico (cellule COV434) in risposta ad una over-espressione di alleli FMR1 wt o PM. Nell'ambito dello studio della neuropatia indotta da espressione di rCGG in cellule di derivazione umana (neuronale e linfoblastoide) sono stati condotti esperimenti di over-espressione di alleli FMR1 PM, ma non sono mai stati allestiti esperimenti comparativi con alleli FMR1 wt (Arocena et al., 2005). Il tipo di approccio adottato in questo lavoro è invece volto a valutare le differenze esistenti tra contesti wt e PM in cellule umane di derivazione ovarica. di stress cellulare la presenza di queste due sHsp aumenta in modo marcato a livello degli splicing speckles (Adhikari et al., 2004). È plausibile quindi che anche nel citosol questa proteina sia in grado di co-localizzare con zone ricche in RNA grazie alla sua capacità di interagire con proteine che legano l'RNA stesso. In particolare nelle COV434 transfettate con CMV-FMR1(CGG) 76 -EGFP è possibile che uno stallo traduzionale dell'mRNA r(CGG) 76 , ipotizzabile dalla ridotta sintesi della proteina reporter EGFP, osservata in queste cellule già a due giorni dalla transfezione, richiami questa piccola proteina dello stress. A 8 giorni dalla transfezione si assiste ad un netto arricchimento dell'Hsp27 nel nucleo delle cellule EGFP positive, comportamento che è noto dalla letteratura verificarsi in cellule sottoposte a stress termico (Lavoie J. N. et al, 1993;Adhikari et al., 2004). In cellule transfettate con il costrutto contenente 28 ripetizioni CGG (wt) non si osserva nessun cambiamento nella localizzazione cellulare dell'Hsp27, supportando l'ipotesi che la tossicità cellulare, in cellule di derivazione ovarica esprimenti stretch di sequenze CGG, sia lunghezza dipendente e non dose dipendente. In esperimenti di transfezione analoghi condotti su cellule di derivazione neuronale con il costrutto contenente 88 ripetizioni CGG (Arocena et al., 2005), a 8 giorni dalla transfezione si assiste alla comparsa di inclusioni nucleari positive per Bcristallina nel 5% delle cellule EGFP positive. Nel nostro modello cellulare epiteliale di derivazione ovarica non si assiste alla comparsa di inclusioni ad 8 giorni dalla transfezione, ma in tutte le cellule EGFP positive si osserva una riorganizzazione nella localizzazione della proteina Hsp27. È probabile che tessuti differenti reagiscano in modo diverso all'espressione del tratto rCGG espanso; ed infatti la transfezione dello stesso costrutto (contenente 88 ripetizioni CGG) in cellule linfoblastoidi, non ha determinato la formazione di inclusioni, anche se si è osservato una diminuzione della vitalità cellulare (Arocena et al., 2005). Inoltre, in un modello condizionale di neuropatia rCGG indotta in Drosophila si osserva che l'over-espressione del costrutto (CGG) 90 -EGFP, è in grado di causare una severa distruzione della morfologia degli occhi quando espresso nella retina e letalità quando espresso nelle cellule del sistema nervoso centrale e periferico in via di sviluppo, ma non è capace di causare alcun fenotipo patologico quando espresso in cellule epiteliali (Jin et al., 2003). B-cristallina infatti, sono contenute nelle inclusioni associate a distrofia miotonica (Suzuki A. et al., 1998;Forner et al., 2010); questa ipotesi non è ad oggi stata confermata, in quanto non sono stati rilevati difetti nello splicing né in pazienti FXTAS, né nei modelli animali di Drosophila e topo (Brouwer et al., 2008).Considerando però il risultato ottenuto dagli esperimenti di transfezione delle cellule della granulosa ovarica, ossia una netta riorganizzazione della proteina di shock cellulare Hsp27 in cellule esprimenti l'allele PM, e un aumento del trascritto di questa proteina e della B-cristallina e tenendo conto che queste proteine sono correlate ai processi di modificazione dell'RNA come lo splicing, è possibile che nel tessuto ovarico, e in particolare nei follicoli in via di maturazione, possano avvenire alterazioni dello splicing.In particolare nelle donne carrier di premutazione del gene FMR1, i follicoli ovarici in via di maturazione, in cui si osserva un'elevata espressione del gene FMR1 a livello delle cellule della granulosa, potrebbero quindi rappresentare un organo bersaglio in cui l'alterazione dello splicing degli RNA indotta dalla presenza di un mRNA di FMR1 premutato potrebbe indurre un aumento di atresia, della velocità di apoptosi o una disfunzione dei follicoli stessi che potrebbero manifestarsi, come evento finale, in menopausa precoce (Figura 4.1). BIBLIOGRAFIA