Per l'analisi quantitativa su materiale paraffinato sono state raccolte sezioni seriali di 10 µm in condizioni "RNAse-free". Prima dell'estrazione, tutti i campioni sono stati sottoposti a passaggio in stufa a 37°C per 30 minuti e a sparaffinatura in diafanizzante.Per quanto riguarda i prelievi bioptici, i campioni sono stati distinti in base alla percentuale occupato da tumore in ogni sezione, usando come cut-off 50%. Nei casi in cui le aree di tumore fossero inferiori al 50%, queste sono state selezionate su vetrino in ematossilina ed eosina e sottoposte a microdissezione manuale; nei casi con percentuale tumorale superiore al 50% il campione è stato estratto in toto senza sottoporlo a microdissezione. Questa operazione è stata condotta al microscopio stereoscopico invertito a media intensità di illuminazione e a un ingrandimento dell'obiettivo tra 5X e 10X. Le aree tumorali sono state prelevate dissettando il tessuto con un bisturi e i frammenti così ottenuti sono stati posti, grazie all'ausilio di un puntale, in tubi Eppendorf RNAse-free da 2 ml. L'estrazione di RNA totale è stata effettuata utilizzando un kit specifico per materiale esiguo (come può essere un campione bioptico) incluso in paraffina, seguendo le indicazioni fornite dalla ditta produttrice (RNeasy FFPE kit, Quiagen).I pezzi operatori sono stati analizzati dal patologo e sono state selezionate su vetrino in ematossilina ed eosina le aree più rappresentative della lesione tumorale. Le aree sono state quindi sottoposte a microdissezione come sopra illustrato. In 6 casi selezionati, tutti del gruppo di pazienti non sottoposti a terapia androgeno-ablativa, è stata operata nel campione di prostatectomia la microdissezione di due (tre in un caso) focolai neoplastici separati e distanti per una definizione della presenza di eterogeneità tumorale (vedi di seguito).Dopo sparaffinatura, l'RNA totale è stato ottenuto utilizzando un kit di estrazione specifico per materiale paraffinato, seguendo le indicazioni fornite dalla ditta produttrice (High Pure RNA paraffine kit, Roche Applied Science).L'RNA totale da cellule è stato invece estratto usando QIAzol lysis Reagent (Quiagen, Tokyo, Japan), seguendo le indicazioni fornite dalla ditta produttrice.La quantificazione degli RNA così ottenuti è stata effettuata mediante l'utilizzo del Bioanalyser on-chip electrophoresis Agilent 2100 (Agilent Technologies).