La DL50 nel topo è risultata pari a 94 mg/kg per somministrazione i.p.; essa è risultata invece pari a 180 mg/kg quando somministrata per os. Nel ratto la DL50 è risultata variabile tra 6 e 25 mg/kg per somministrazione i.p. Quando il metotressato viene somministrato a ratti dal 14º al 18º giorno di gravidanza, può indurre perdita di peso della madre, riassorbimento, aborto e ipotrofia del feto. Il farmaco può indurre l'interruzione della gravidanza in diverse specie animali quali: topi, ratti, conigli. Anoressia, diarrea acquosa e perdite ematiche vaginali sono state talvolta osservate in animali che ricevevano il farmaco a dosi ripetute superiori a 0,5 mg/kg, mentre con dosi singole di 1,6 mg/kg non sono stati riscontrati tali effetti. Il metotressato come del resto la maggior parte dei farmaci antitumorali e immunosoppressivi, ha dimostrato proprietà cancerogene negli animali in particolari condizioni sperimentali.