La gentamicina è un potente inibitore della sintesi proteica, capace di legarsi tenacemente alla subunità 30s dei ribosomi, con successiva frammentazione degli stessi e morte cellulare. Questa proprietà condiziona il meccanismo d'azione di tutti gli aminoglicosidi, poiché il loro funzionamento è direttamente connesso alla permeabilità di membrana propria di ogni batterio.