DHFR catalizza la trasformazione del diidrofolato nel coenzima attivo tetraidrofolato. L'inibizione di questo coenzima interferisce con la biosintesi del timidilato e della formiltransferasi folato-dipendente. Ne consegue una diminuita biosintesi delle purine ed un'alterata sintesi di DNA, RNA e proteine, cui fa seguito la morte cellulare.