La molecola è dotata di un ampio spettro di azione, per molti versi simile a quello di altri composti della stessa classe (ad esempio la ciprofloxacina). In vitro risulta tuttavia particolarmente potente nei confronti degli Stafilococchi, Streptococchi ed Enterococchi. Inoltre la sitafloxacina ha dimostrato una particolare attività ed efficacia verso molti germi appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae e Bacteroides fragilis. Tutti questi batteri sono riconosciuti patogeni di rilevante significato clinico.