Nel 1314 l'ordine dei Cavalieri Templari fu sciolto e la gran parte delle sue proprietà venne conferita ai Cavalieri Ospitalieri che, peraltro, mantennero la sovranità a Rodi. Gli Ospitalieri erano organizzati in otto "Lingue" (Alvernia, Aragona, Castiglia, Francia, Germania, Inghilterra, Italia e Provenza). Una volta a Rodi, e ormai noti come i Cavalieri di Rodi, essi furono obbligati a sviluppare soprattutto il lato militare della propria attività, impegnandosi soprattutto contro i corsari berberi. Gli Ospitalieri, nel corso del XV secolo, si opposero vittoriosamente a due tentativi d'invasione: uno del 1440 ad opera del sultano mamelucco d'Egitto, il secondo nel 1480 ad opera del sultano ottomano Maometto II, il quale, dopo la caduta di Costantinopoli, vedeva nei Cavalieri del Sovrano Ordine di San Giovanni di Gerusalemme uno dei suoi nemici principali.