L'itraconazolo agisce inibendo la sintesi dell'ergosterolo, costituente essenziale della parete cellulare micotica. Specificamente, agisce sull'enzima lanosterolo 14-α demetilasi, il quale converte il lanosterolo, attraverso diversi passaggi, in ergosterolo. Tale enzima rimuove l'ingombro sterico e inoltre catalizza la riduzione catalitica del ferro, mediata da uno specifico citocromo. L'itraconazolo interviene inibendo tale citocromo. Il lanosterolo è anche il precursore del colesterolo nelle cellule umane, quindi particolare attenzione va posta per gli antimicotici azolici quando vengono somministrati per via sistemica, specificamente gli azolici contenenti nell'eterociclo due atomi di azoto (diazolici). Gli antimicotici triazolici invece, fra cui anche l'itraconazolo, appartengono ad una classe di farmaci selettivi per la cellula micotica e possono essere somministrati tranquillamente anche per via sistemica.