È determinata da una serie di alterazioni nella sequenza del gene che codifica il fattore IX della coagulazione, situato sul cromosoma X in una posizione più vicina al centromero rispetto al gene che codifica il fattore VIII (Xq27). Ha una dimensione di 33,5 Kb e la trascrizione dei suoi 8 esoni produce un mRNA di 1,4 Kb. La proteina matura è costituita da 415 aminoacidi divisi in 6 domini. Sono note numerose mutazioni a carico del fattore IX, ma non esiste una mutazione prevalente con caratteristiche e frequenza simili a quelle del fattore VIII per l'emofilia A. Le importanti delezioni del fattore IX sono relativamente rare e interessano solo 1-3% di tutti i casi di emofilia B. Più del 95% delle mutazioni riguardano singoli nucleotidi o piccole delezioni/sostituzioni distribuite lungo tutto il gene, trascritte nel database internazionale per i difetti genetici dell'emofilia B.