Dopo somministrazione per via orale la biodisponibilità di busulfano è ampiamente variabile da individuo a individuo, in media intorno al 80%. Il picco di concentrazione plasmatica viene raggiunto entro 1 ora dalla somministrazione orale. La molecola si lega per il 30% circa con le proteine plasmatiche, e in particolare con l'albumina. Nell'organismo busulfan viene metabolizzato a livello epatico tramite una reazione con glutatione: questa reazione chimica è mediata dalla glutatione-S-transferasi. L'emivita media di eliminazione della molecola è di circa 2,5 ore. Solo una piccola quantità di busulfan (intorno al 1-2%) è escreta immodificata per via urinaria.