Il meccanismo di azione di cloxacillina è simile a quello delle altre penicilline. Il farmaco agisce interferendo con la formazione della parete cellulare batterica delle cellule batteriche in fase di crescita, andando ad inibire alcuni enzimi (in particolare la transpeptidasi e la carbossipeptidasi), impedendo così la reticolazione del peptidoglicano (mureina o mucopeptide batterico) essenziale per i germi, i quali, privi di tale protezione, risultano più esposti agli stress osmotici e vanno incontro a lisi cellulare.