Fino agli inizi degli anni '70, il trattamento dell'osteosarcoma localizzato alle estremità è stato esclusivamente chirurgico. I risultati erano assolutamente deludenti, con una sopravvivenza inferiore al 20% a due anni dalla diagnosi, nonostante gli interventi demolitivi di amputazione o disarticolazione. Metastasi polmonari insorgevano nel 50% dei pazienti entro il primo anno e nell'80% entro il secondo anno. La prognosi dei pazienti con localizzazioni secondarie a livello polmonare era infausta: decedevano tutti entro cinque anni dalla diagnosi. (15,16) Nel tentativo di migliorare questi risultati, agli inizi degli anni '70, vennero introdotti protocolli di chemioterapia postoperatoria (CT adiuvante). L'ottimo controllo locale della malattia ottenuto con un intervento chirurgico demolitivo ma radicale, in contrasto con la percentuale di metastasi a distanza aveva, infatti, fatto supporre che focolai micrometastatici fossero già presenti al momento della diagnosi ma non rilevabili con le indagini radiologiche disponibili.La sopravvivenza ottenuta con questi protocolli di chemioterapia adiuvante migliorò, raggiungendo percentuali intorno al 40-50% dei casi. (17) L'amputazione veniva comunque eseguita nell'80% dei casi.In alcune casistiche furono sperimentati anche protocolli di chirurgia associati ad immunoterapia o irradiazione profilattica dei campi polmonari con risultati non soddisfacenti.All'inizio degli anni '80 vennero proposti protocolli che prevedevano un fase di chemioterapia preoperatoria (CT neoadiuvante), seguita dall'intervento chirurgico e dalla chemioterapia postoperatoria.L'inserimento della chemioterapia preoperatoria venne proposto sia nell'intento di ridurre le dimensioni della lesione e l'interessamento delle parti molli circostanti (con conseguente minor necessità di interventi demolitivi, sostituiti da resezioni ampie e dall'uso di protesi e di innesti ossei), sia per colpire precocemente i microfoci metastatici eventualmente già presenti. (18)(19)(20)(21) La percentuale di interventi demolitivi è passata dall'80% dei precedenti protocolli adiuvanti, al 5-15%, restando comunque il tasso di recidive locali al di sotto del 5%. (22,23) Questo approccio ha permesso la valutazione dell'efficacia degli agenti chemioterapici sul tessuto neoplastico: il grado di necrosi tumorale indotto dalla chemioterapia, valutato sul pezzo operatorio, si è dimostrato essere un importante fattore prognostico. (24,25) In Italia il primo protocollo di chemioterapia neoadiuvante è stato attivato nel 1983 nell'ambito del programma di ricerca del Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR); dal 1983 al 1997 si sono susseguiti sei studi, (23,26,27) avvalendosi anche della collaborazione dello "Scandinavian Sarcoma Group". (28) Questi protocolli hanno permesso di raggiungere, attualmente, una sopravvivenza globale del 70% a cinque anni, aumentando gli interventi conservativi e limitando la tossicità farmacologica. Questo miglioramento è da attribuire al perfezionamento delle tecniche chirurgiche ed alla collaborazione interdisciplinare all'effetto della chemioterapia preoperatoria (28)(29)(30) all'introduzione di una chemioterapia aggressiva, con combinazioni differenti di alte dosi di Methotrexate, Doxorubicina, Cisplatino ed Ifosfamide (20,(31)(32)(33)(34) all'identificazione di una correlazione dose-risposta con Methotrexate, Doxorubicina e Cisplatino (35,36) all'identificazione della risposta istologica alla chemioterapia preoperatoria quale principale fattore prognostico che permette di variare la chemioterapia postoperatoria (25,37) . La prognosi dei pazienti con osteosarcoma in recidiva resta ancora molto severa ed è strettamente correlata con diversi fattori prognostici, quali il trattamento iniziale, l'intervallo tra la diagnosi e l'insorgenza delle metastasi, la sede, il numero e le dimensioni delle lesioni e la presenza di metastasi viscerali o ossee. (38,39) Quando il polmone è l'unica sede di recidiva può essere considerato con intento curativo un approccio chirurgico di metastectomia con una sopravvivenza globale del 20-50% (40) . I pazienti che recidivano con uno o due noduli polmonari dopo un lungo intervallo libero da malattia (superiore a 24 mesi) hanno una buona prognosi (circa 40-50%).La prognosi rimane molto severa per i pazienti che recidivano con lesioni polmonari multiple o lesioni ossee dopo un breve intervallo libero da malattia (inferiore al 10%). (38) Lo sviluppo di metastasi ossee comporta una sopravvivenza dello 0% a quattro anni (41) . Il ruolo della chemioterapia nell'osteosarcoma in recidiva non è ancora ben chiaro, soprattutto nei pazienti pesantemente protrattati. (42)(43)(44) Poiché la rarità della malattia e l'eterogeneità della diffusione metastatica rendono uno studio randomizzato difficilmente realizzabile, sono presenti in letteratura solo studi clinici non controllati; numerosissime problematiche restano pertanto aperte. Un certo numero di regimi di chemioterapia, con diverse combinazioni di farmaci, sono stati usati in questi pazienti, con risultati difficili da analizzare (Tab. 1).La ricerca di nuove strategie per i pazienti con metastasi è pertanto un importante punto di ricerca clinica; la strategia più esplorata è stata quella dell'intensificazione delle dosi di chemioterapia con supporto di cellule staminali autologhe (Tab. 2), che ha permesso di ridurre il tempo di engraftment e la tossicità del ciclo terapeutico, permettendo così di incrementare le dosi dei farmaci. Nell'esperienza del European Bone Marrow Transplantation registry (EBMT), 149 pazienti pediatrici sono stati sottoposti a megaterapia: la sopravvivenza a 5 anni è stata del 33% per i pazienti trattati con alte dosi durante il primo trattamento contro il 14% per quelli trattati dopo la recidiva (p = 0.197, non significativa); con un singolo ciclo è stata del 26% contro il 18% con più cicli ripetuti (p = 0.842, non significativa).Nel tentativo di migliorare la sopravvivenza dei pazienti in recidiva l'Italian e lo Scandinavian Sarcoma Group (ISG-SSG) hanno, pertanto, delineato un protocollo di fase II (ISG-SSG-I) con alte dosi di chemioterapia (HDCT) e reinfusione di cellule staminali periferiche (PBSC) autologhe, che è stato recentemente concluso (54) . Per le HDCT sono stati scelti Carboplatino (CBDCA) ed Etoposide (VP16) per la loro scarsa tossicità, per le evidenze di una attività dell'Etoposide nei sarcomi dell'osso e dei tessuti molli (per la sua attività fase specifica quando somministrato in infusione continua) (55,56) e per la dimostrata attività del Carboplatino nell'osteosarcoma. (57)(58)(59)(60)(61) Con questo schema terapeutico, associato a chirurgia, 25 pazienti su 32 hanno ottenuto una remissione completa associata, però, ad una elevata percentuale di recidiva-progressione (84,4% ad una mediana di 8 mesi dall'ingresso in studio). La sopravvivenza globale e la sopravvivenza libera da malattia a 3 anni erano del 20% e del 12%, rispettivamente. (54) Questo protocollo ha pertanto mostrato la fattibilità delle alte dosi di chemioterapia nei pazienti con osteosarcoma metastatico e la possibilità di ottenere remissioni in un significativo, anche se piccolo, numero di pazienti con una prognosi molto severa, ma ha anche evidenziato l'esigenza di trovare nuove strategie per mantenere lo stato di remissione. Per questa ragione l'Italian Sarcoma Group ha recentemente delineato un nuovo protocollo terapeutico per i pazienti in recidiva di osteosarcoma ad altissimo rischio comprendente:1. due cicli di chemioterapia con Ciclofosfamide (CTX) e VP16 (62) per mobilizzare le cellule staminali ed indurre la remissione di malattia 2. un ciclo di alte dosi di CBDCA e VP16 con reinfusione di cellule staminali periferiche autologhe, 3. trattamento con Samarium associato a reinfusione di cellule staminali autologhe per i pazienti con lesioni captanti 4. una fase di immunoterapia con trapianto non mieloablativo di cellule staminali da fratello HLA-identico o utilizzo dell'IL-2 nei pazienti senza donatore per mantenere la remissione della malattia.Il Samarium-153 ethylene diamine tetramethylene phosphonate ( 153 -Sm-EDTMP) è un radiofarmaco in grado di legarsi all'osso fornendo irradiazione terapeutica alle metastasi ossee. I primi report sulle alte dosi di Samarium nel trattamento dei pazienti con metastasi ossee di osteosarcoma suggeriscono una sua efficacia ed un possibile incremento d'azione da parte di farmaci radiosensibilizzanti. (63) Il razionale dell'uso del trapianto non mieloablativo di cellule staminali nei pazienti affetti da tumori solidi si basa sulla generazione di una risposta immune T-mediata verso le cellule tumorali (64) , definita effetto "trapianto contro tumore" (GVT), simile all'effetto "graft versus leucemia". (65,66) Pertanto dal 1997 Childs e colleghi hanno iniziato a studiare i trapianti allogenici non mieloablativi nei tumori renali metastatici e nel melanoma metastatico, con evidenza di attecchimento del trapianto e di successiva regressione delle metastasi. (67,68) Ci sono numerosi studi che evidenziano il ruolo dell'effetto GVT nella riduzione delle metastasi di osteosarcoma.La procedura trapiantologica è utilizzata come base per l'induzione di uno stato di tolleranza tra donatore e ricevente. tumorali può indurre una citolisi sei volte più massiva. (76) In continuità con tali risultati ci sono diversi studi, tra cui quelli condotti presso l'Istituto Nazionale Tumori di Milano effettuati su pazienti affetti da tumori solidi e in particolare sull'osteosarcoma, che hanno mostrato l'efficacia dell'IL-2, un mediatore dalla risposta immune cellulo-mediata la cui azione si esplica attraverso l'attivazione dei linfociti T e delle cellule NK. (77) La chemioterapia intensiva associata non inibisce la possibilità di amplificare una risposta immunologica IL-2-indotta anche in tempi molto ravvicinati rispetto alla somministrazione degli antiblastici.La terapia cellulare T ha suscitato negli ultimi anni numerosi interessi, soprattutto per quanto riguarda il trattamento delle infezioni virali, (78) dei tumori EBV-associati (79) e delle recidive delle malattie ematologiche. (82) L'identificazione di antigeni tumorali e la dimostrazione del loro riconoscimento da parte di linfociti T citotossici (CTL) tumore-specifici ha permesso anche per tumori come il melanoma, lo sviluppo di strategie immunoterapeutiche. (83,84) E' stata inoltre dimostrata la persistenza nell'organismo delle cellule T trasferite e la ricostituzione di un'immunità virus-specifica in assenza di effetti collaterali importanti. Il target più popolare per l'immunoterapia cellulare T è il melanoma, perché sono stati identificati un elevato numero di antigeni tumore associati ed è molto più facile espandere cellule T reattive da pazienti affetti da melanoma che da ogni altro tipo di tumore umano.Esperimenti in vitro  (Tab.3) e nel modello murino, (115)(116)(117) anche se con risultati talvolta discordanti tra loro, hanno supportato la nozione che le cellule T tumore-specifiche possono essere attivate ed espanse in vitro e che sono in grado di inibire la crescita tumorale.Anche alcuni studi clinici hanno dimostrato l'attività di questo trattamento. Yee et al (118) hanno infuso dei CTL peptide-specifici (in associazione con IL-2 a basse dosi) in 10 pazienti con melanoma in recidiva ottenendo una stabilità di malattia in 5 pazienti e una risposta mista o parziale in altri 3 pazienti per un periodo di 21 mesi. È stato dimostrato che le cellule T infuse persistono in vivo in risposta all'IL-2, si localizzano a livello del tumore e mediano una risposta immune antigene-specifica. Mitchell et al (119) hanno ottenuto una remissione clinica parziale per 24 mesi ed una risposta mista su 10 pazienti affetti da melanoma infusi con 5 dosi da 1 x 10 8 di CTL espansi mediante stimolazione con linea cellulare Drosophila pulsata con 1 peptide della tirosinasi. In uno dei pazienti che hanno risposto al trattamento è stato possibile identificare con la scintigrafia i CTL marcati con Indium-111 migrati a livello di due nodi sottocutanei a 4 e 24 ore dall'infusione;negli altri casi non è stato possibile identificare i CTL nelle sedi tumorali. Meidenbauer et al (120) hanno infuso in 8 pazienti affetti da melanoma, a due settimane di distanza tra loro, 3 dosi di 0,25-11 x 10 8CTL generati mediante stimolazione con DC pulsate con un peptide di Melan-A ed hanno concluso che i CTL possono incrementare il numero delle cellule tetrametro positive del 2%, sopravvivere e/o proliferare per diverse settimane e localizzarsi nel sito del tumore già 48 ore dopo l'infusione. Kawai et al (121) hanno espanso dei CTL utilizzando la linea cellulare ottenuta dalla biopsia del tumore di un paziente affetto da carcinoma renale; dopo l'infusione di 10 x 10 9CTL, le metastasi linfonodali retroperitoneali sono progressivamente diminuite di dimensioni e il paziente è rimasto libero da malattia per 20 mesi dalla prima infusione dei CTL, dopodiché è recidivato.Sempre nel tentativo di esplorare un'immunoterapia antitumorale, in altri studi sono stati infusi linfociti infiltranti il tumore (TIL) (122) o i pazienti sono stati vaccinati con cellule dendritiche pulsate con lisati tumorali o peptidi (123,124) , o sono stati vaccinati con peptidi tumorali da soli. (125) A causa della difficoltà di generare linee cellulari di osteosarcoma, di espandere linfociti T citotossici specifici e di identificare antigeni specifici per l'osteosarcoma, un'immunoterapia specifica per questo tumore non è stata valutata fino agli anni più recenti, quando Nabeta et al (126) sono riusciti ad ottenere una linea cellulare da un paziente affetto da osteosarcoma (su 32 pazienti arruolati nello studio); con ripetute stimolazioni in vitro delle cellule T periferiche del paziente con la linea cellulare autologa hanno indotto una attività citotossica contro le cellule di osteosarcoma autologhe, ma non contro le cellule non tumorali.Recentemente l'espressione di antigeni delle famiglie MAGE, SSX e SART è stata identificata anche nell'osteosarcoma, permettendo lo sviluppo di strategie immunoterapeutiche anche per questo tumore, finora considerato poco immunogenico.La famiglia di antigeni MAGE (specialmente MAGE 1,2,3,4,6 e 12) è espressa a livello del mRNA in molti tumori di differente tipo istologico ma non è presente in tumori benigni o nei tessuti sani, eccetto per il testicolo (sito immuno-privilegiato) e la placenta. Sono degli importanti geni sotto il controllo della metilazione; la perdita di questo controllo porta alla loro espressione nelle cellule tumorali. Gli antigeni MAGE 1-3 sono chiamati "tumor-rejection antigen" perché i tumori che esprimono questi antigeni sono rigettati dai CTL dell'ospite. (127)(128)(129)(130) Sudo et al (131) hanno studiato l'espressione degli antigeni MAGE- I geni SSX sono membri della famiglia "cancer/testis antigen". Gli antigeni SSX 1,2,4,5 sono espressi in molti tumori anche se non sono espressi nei tessuti sani, eccetto per il testicolo e la tiroide (ad un livello molto basso). (132) Naka et al (133) hanno testato 17 campioni di tumore freschi per SSX-1 e 2, ottenendo una positività del 76% a livello dell'm-RNA. Anche Ayyoub et al (134) hanno testato 2 linee ed 1 tessuto fresco di osteosarcoma, ottenendo positività per SSX-1, 2 e 4 su una delle due linee cellulari ed positività per SSX-1 e 5 sul tessuto fresco a livello genico (Tab. 5 A e B).I geni della famiglia SART-3 giocano un importante ruolo nella proliferazione cellulare e non sono espressi nei tessuti sani, ad eccezione del testicolo e del fegato fetale. (135) Tsuda et al (135) hanno testato 20 linee di osteosarcoma e 9 campioni tumorali freschi per SART-3 a livello proteico, rilevando una positività rispettivamente del 100% e 67% (Tab.6).Un altro "tumor-rejection antigen", SART-1, è stato identificato da Ishida et al (137) a livello del citoplasma del 62% delle linee e del 38% dei tessuti freschi di osteosarcoma analizzati (Tab.  Blasti PHA 5 x10 6 PBMC del donatore sono stati risospesi in 10 ml di RPMI con 5µg/ml di Fitoemoagglutinina (PHA) e piastrati in 5 pozzetti della piastra da 24 pozzetti. Il giorno 2, e a giorni alterni, da ogni pozzetto è stato aspirato e scartato 1 ml di terreno, ed è stato aggiunto 1 ml di RPMI con 200 U di IL-2 (concentrazione finale 100 U/ml).