Nel presente lavoro, la procedura utilizzata è stata una metodica di analisi indiretta basata sull'amplificazione di regioni target in seguito a ibridazione con sonde specifiche, conosciuta come saggio Methylation-Specific Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MS-MLPA). Questa procedura è attualmente in uso nella pratica diagnostica per la valutazione di alterazioni del numero di copie (CNV) di loci cromosomici specifici, con una sensibilità superiore all'attuale tecnica di ibridazione in situ (<10Mb). Tale metodica consiste in una analisi semiquantitativa utile per determinare il numero di copie di un massimo di 60 sequenze di DNA in una singola reazione di PCR, identificando delezioni e duplicazioni eventualmente presenti nel campione di DNA. Questa procedura è simultaneamente utilizzata anche per la valutazione dello stato di metilazione delle regioni genetiche di interesse, fornendo informazioni sia sul loro numero di copie sia sullo stato epigenetico coinvolto nella loro regolazione genica.Il principio del saggio si basa sull'amplificazione mediante una reazione di multiplex PCR (Polimerase Chain Reaction), utilizzando un'unica miscela contenente una singola coppia di primer universali a cui si abbinano fino a 60 diverse sonde, ciascuna delle quali rileva una specifica sequenza di DNA (Figura 12). Durante la successiva reazione di PCR, tutte le sonde legate sono amplificate contemporaneamente utilizzando la stessa coppia di primer (primers universali), dove uno di essi essendo marcato con un fluorocromo permetterà di visualizzare i prodotti di amplificazione durante la separazione dei frammenti su matrice capillare. Questa separazione viene eseguita tramite elettroforesi capillare, ottenendo così un elettroferogramma specifico delle regioni di interesse analizzate. Per determinare sia lo stato del numero di copie sia quello di metilazione delle regioni target, tale procedura prevede l'uso di sonde contenenti sequenze consenso per endonucleasi (HhaI), in prossimità delle isole CpG e sensibili alla metilazione.Infatti, a seguito delle fasi di ibridazione delle sonde, la reazione di MS-MLPA si divide in due parti. Una parte viene processata come una normale reazione di MLPA, fornendo così informazioni sullo stato del numero di copie del DNA target. La restante parte viene trattata sia con ligasi sia con l'enzima HhaI, e fornisce informazioni sullo stato di metilazione del DNA in esame. In presenza di sequenza target non metilata, la sonda specifica si legherà e simultaneamente verrà digerita dall'enzima di restrizione (HhaI), mentre la presenza del gruppo metilico nella regione di interesse impedirà la digestione da parte dell'enzima di restrizione. Il saggio MS-MLPA richiede che tale procedura sia eseguita simultaneamente su un gruppo di campioni normali utilizzati come riferimento.Al termine dell'amplificazione dei frammenti ottenuti sia dalla procedura di metilazione che da quella di CNV, si procede con la fase di separazione dei frammenti mediante elettroforesi capillare.Questo permette di visualizzare l'elettroferogramma che corrisponde al profilo casospecifico. Nel dettaglio, per valutare l'eventuale CNV l'altezza relativa di ciascun picco, corrispondente ad ogni sonda, viene rapportata alla relativa altezza del medesimo picco nei vari campioni di riferimento (casi normali). Una delezione di una o più sequenze viene evidenziata da una diminuzione dell'altezza del picco della sonda di interesse, mentre un aumento della sua altezza riflette un'amplificazione.Per l'analisi dello stato di metilazione, si valuta invece l'eventuale presenza o assenza dei picchi corrispondenti alle sonde "sensibili" alla metilazione: la digestione della sequenza target non metilata, da parte dell'enzima di restrizione, non genererà un picco in quanto non amplificata durante la reazione di PCR; al contrario se la tale sequenza è metilata, l'enzima HhaI viene inibito e l'amplificazione genererà un normale picco, la cui altezza sarà proporzionale alla quantità di metilazione presente nel campione (Figura 13). L'analisi dei dati ottenuti è stata effettuata utilizzando il software COFFALYSER.NET (https://www.mlpa.com), fornito dalla casa produttrice del kit. Tale analisi si basa su due passaggi: la normalizzazione intra-campione (cioè la comparazione tra sonda investigata e sonda controllo all'interno dello stesso campione) e inter-campione (cioè la comparazione dei picchi di ciascuna sonda tra i vari campioni in esame e quelli di riferimento). Queste fasi permettono di ottenere una ratio corrispondente ad un valore numerico, il cui significato biologico è attribuito a seconda delle analisi effettuate.Per quanto riguarda l'analisi dei CNV, l'elettroferogramma di un campione privo di aberrazioni genomiche sarà identico a quello dei campioni di riferimento: infatti la ratio finale ottenuta nella normalizzazione inter-campione sarà circa 1.0. Questa ratio finale prende il nome di quoziente di dosaggio (DQ) e viene calcolata dai software di analisi per ciascuna sonda in ciascun campione.Nella Tabella 2 sono riportate le relazioni tra la distribuzione tipica dei DQe il numero di copie geniche nella popolazione sana. In maniera simile alla determinazione dei CNV, la percentuale di metilazione viene calcolata sia sul campione digerito che su quello non digerito. La ratio ottenuta per una singola sonda viene inizialmente comparata tra i campioni digeriti e quelli non digeriti, per poi confortare i campioni, digeriti e non digeriti, in esame e di controllo. Tale valore viene infine espresso in percentuale di metilazione.Nel presente lavoro è stata utilizzato il kit disponibile in commercio SALSA MS-MLPA ME001-C2 Tumor suppressor mix 1 (MRC-Holland, Olanda), costituito una miscela di 41 sonde che identificano lo stato di metilazione delle regioni promotrici di 24 oncosoppressori (26 probes), frequentemente silenziati nei tumori, e sui cambiamenti del numero di copie di 39 geni (41 probes) (Tabella 3). Analisi elettroforetica e bioinformatica dei risultati. Terminata l'esecuzione della metodica, rimane la fase analitica dei risultati ottenuti.In prima battuta per ogni campione è stato generato un elettroferogramma mediante elettroforesi capillare, per separare i frammenti corrispondenti alle sonde e regioni d'interesse. Tale elettroforesi è stata effettuata mediante sequenziatore automatico ABI PRISM 3130XL (ThermoFisherScientific).La mix di elettroforesi è costituita da: prodotto di PCR, marcatore ILS600 ROX, HiDiformamide e acqua fino a volume di 15μl. La corsa è stata eseguita previa fase di riscaldamento per 3 minuti ad 86°C e raffreddamento per 2 minuti a 4°C del campione. I dati ottenuti, come altezze assolute dei picchi, sono stati analizzati come descritto in precedenza e gli elettroferogrammi sono stati prodotti dallo strumento per una visualizzazione del pattern ottenuto.In Figura 14, sono riportati gli elettroferogrammi di un caso normale sia per lo stato di CNV che per quello di metilazione. Le aree di cancro sono state prelevate dissettando il tessuto con un bisturi e i frammenti così ottenuti sono stati posti, grazie all'ausilio di un puntale, in tubi Eppendorf RNAse-free da 2 ml. L'estrazione sia di RNA totale sia di microRNA è stata effettuata utilizzando un kit specifico per materiale esiguo (come può essere un campione citologico) incluso in paraffina, seguendo le indicazioni fornite dalla ditta produttrice (miRNeasy FFPE kit, Quiagen).La quantificazione degli RNA così ottenuti è stata effettuata mediante l'utilizzo del Bioanalyser on-chip electrophoresis Agilent 2100 (Agilent Technologies). In particolare, 32 su 39 geni hanno mostrato la presenza di varianti del numero di copie (CNV). La frequenza di alterazioni per gene è risultata molto variabile, e compresa tra l'1,5% e il 33%. I geni con maggiore frequenza di amplificazione sono risultati GSTP1, TP73, VHL, e CDH13, tutti superiori al 20%. La gran parte dei geni, tranne CDH13, ha mostrato alterazioni coerenti per tipologia qualora presenti, ovvero amplificazioni oppure delezioni.Per quanto riguarda la presenza di metilazione del promotore nei 24 geni analizzati, solo 8 hanno mostrato presenza di almeno un caso metilato. Di questi 8, solo due hanno presentato metilazione in più di un caso, rispettivamente CDH13 in 4 casi e RASSF1A in 5 casi. Rosso e rosa: presenza di amplificazione; blu e azzurro: presenza di delezione; bordato rosso: presenza di metilazione; grigio: assenza di alterazioni.  In entrambi i casi si è osservata una differente distribuzione di espressione nei due gruppi, senza però raggiungere un valore statisticamente significativo, probabilmente anche a causa della disomogenea distribuzione numerica nei due gruppi ed in particolare dell'esiguo numero di casi pN1.Il miR-483-5p ha mostrato una maggiore espressione nei casi con stadio pN0 rispetto ai casi pN1 (p=0,07). Sebbene la differenza di espressione media non sia risultata come detto statisticamente significativa, dal grafico si osserva molto chiaramente come non vi siano casi ad elevata espressione nel gruppo pN1 (Figura 20).Figura 20. Distribuzione di miR-483-5p nei casi con stadio pN0 rispetto ai casi con stadio pN1Per quanto riguarda il gene KLF12 si è osservata la stessa distribuzione (p=0,15). È importante notare che in questo caso il gene sia regolato negativamente da un gruppo di microRNA over-espressi nei casi della casistica pilota con stadio pN1. In questo caso quindi la minore espressione nel gruppo pN1 è concorde con l'osservata maggiore espressione dei microRNA che lo regolano.Figura 21. Distribuzione di KLF12 nei casi con stadio pN0 rispetto ai casi con stadio pN1.