A livello biochimico il cortisolo si configura come glucocorticoide ed è sintetizzato a partire da progesterone (a sua volta derivato da colesterolo previo passaggio da pregnenolone). Più precisamente, il colesterolo subisce due idrossilazioni mediante catalisi del citocromo P450 trasformandosi in 20,22-diidrossicolesterolo. Dalla riduzione di tale composto si giunge al pregnenolone. Il pregnenolone può essere idrossilato in posizione 17 generando il 17-idrossipregnenolone oppure può ossidarsi in posizione 3 e trasferire il legame pi greco che possiede, sul primo anello a sei atomi di carbonio, diventando progesterone. Il 17 idrossiprogesterone, subendo idrossilazione in posizione 21, prima che in posizione 11, diventa cortisolo.