Saggi di inibizione dell'infezione di pseudovirioni SEAP sulle 293TTAl fine di valutare la capacità dei derivati di K5 di neutralizzare l'infettività di pseudovirioni di HPV-16, di HPV-18, HPV-6 e BPV-1 sono stati effettuati dei saggi di neutralizzazione sulle cellule 293TT.I composti che sono stati utilizzati nei saggi di inibizione sono: eparina, K5, K5-N,OS(H), K5-OS(H), K5-N,OS(L), K5, K5-NS, K5-OS(L). Per ogni saggio sono stati impiegati come controllo positivo cellule infettate non trattate e come controllo negativo cellule non infettate.In una piastra da 96 si pre-piastrano 30000 cellule per pozzetto in 100 µl di Neutralization Assay Medium (DMEM senza FCS, 10% FBS inattivato, 1% di aminoacidi non essenziali, 1% di Hepes, 1% di Glutamax, 1% di antibiotici-antimicotici) e si fa un'incubazione a 37˚C per almeno 2 ore per permettere alle cellule di aderire.I composti vengono diluiti in DMEM senza FCS al fine di ottenere le seguenti dosi finali di composto da saggiare sulle cellule: 100 µg/ml, 33 µg/ml, 11 µg/ml, 3.6 µg/ml, 1.2 µg/ml, 0.4 µg/ml, 0.13 µg/ml, 0.04 µg/ml.Gli pseudovirioni vengono diluiti in Neutralization Buffer Assay utilizzando materiale siliconato; le diluizioni variano a seconda del titolo iniziale. In tabella sono riportate le diluizioni utilizzate nei nostri esperimenti per i differenti pseudovirioni di HPV.PsV HPV-16 PsV HPV-18 PsV HPV-6 PsV BPV-1 1:4000 1:12000 1:1000 1:6000Tabella 6: diluizioni degli pseudovirioni di HPV-16, -18, -6 e BPV-1.In una piastra da 96 sterile a pozzetto concavo si pre-incubano 80 µl di pseudovirioni con 20 µl di K5 derivati alle diverse concentrazioni per 1 ora a 4˚C 