Frequentò l'Università di Londra, una delle poche permesse ai quaccheri in quel tempo. Inizialmente studiò nella facoltà di Lettere, ma all'età di 25 anni si laureò con lode in medicina ed entrò nel "Royal College of Surgeons". Nel 1854 Lister divenne primo assistente ed amico del chirurgo James Syme di Edimburgo, considerato allora il miglior chirurgo di Inghilterra. Ad Edimburgo, al “Royal Infirmary”, dotato di 200 posti letto per malati chirurgici, Lister trovò l'ambiente ideale per mettere a profitto le sue doti di chirurgo e ricercatore. In quegli anni compì una serie di esperimenti sulla infiammazione e sulla coagulazione del sangue. Nel 1857 presentò alla Royal Society un lavoro intitolato “I primi stadi dell'infiammazione” nel quale descriveva le sue osservazioni su ferite sperimentali indotte su ali di pipistrello e zampe di rana. Questi tessuti erano scelti in quanto trasparenti, per cui la coagulazione del sangue e gli altri processi associati con la infiammazione e la guarigione potevano essere visualizzati con il microscopio. Nel 1867 scoprì l'uso dell'acido fenico, che divenne l'antisettico più usato al mondo per chirurgia. Successivamente lasciò i quaccheri, entrò nella Chiesa Episcopale Scozzese e sposò Agnes, figlia di Syme. Durante il loro viaggio di nozze passarono tre mesi a visitare i principali centri medici in Francia e in Germania: Agnes si innamorò della ricerca medica e visse accanto a lui come ricercatrice per il resto della vita.