È stata valutata tutta una serie di sostanze solubili prodotte dall'endotelio, al fine di identificare i migliori indicatori di disfunzione endoteliale.Un indicatore endoteliale, come qualsiasi altro marker, dovrebbe possedere diversi requisiti, come la sensibilità, la specificità e la stabilità; inoltre, dovrebbe essere dosato con tecniche semplici e riproducibili.Nella ricerca di un efficace indicatore di disfunzione endoteliale occorre, quindi, considerare da un lato la difficoltà di valutazione di tale marcatore e dall'altro la specificità in termini di sintesi endoteliale. Quest'ultima rappresenta la maggiore difficoltà nell'utilizzo di indicatori di danno endoteliale; in effetti la maggior parte delle molecole sintetizzate dalle cellule endoteliali sono prodotte anche da altri tipi cellulari. L'enzima di conversione dell'angiotensina (ACE), ad esempio, sebbene sia facile da dosare e la sua espressione è aumentata nel deficit di NO, non è sempre possibile utilizzarlo come marker specifico di danno endoteliale in quanto viene prodotto anche da cellule della linea monocito/macrofagica (186). Analogamente, la prostaciclina (PGI2) viene prodotta anche da fibrocellule muscolari lisce (187). Altri fattori hanno, invece, una breve emivita e/o sono difficili da dosare nel sangue, tanto che la loro utilità come markers viene posta in dubbio; per esempio il monossido di azoto, che insieme al cGMP è stato proposto come indicatore endoteliale, presenta una breve emivita ed è difficile da dosare.Nel nostro sudio, tra i diversi marcatori di attivazione-disfunzione endoteliale sono stati utilizzati i seguenti: PAI-1, proteina C reattiva, alcune molecole di adesione e citochine.L'inibitore dell'attivatore del plasminogeno (PAI) è lo specifico inibitore dell'attivitore tissutale del plasminogeno. I limitati dati finora disponibili suggeriscono che elevate concentrazioni di PAI inducono ipofibrinolisi, diminuendo la capacità del tPA di interagire con il suo substrato, il plasminogeno. La molecola è prodotta non solo dalle cellule endoteliali, ma anche da piastrine, epatociti, monociti e cellule muscolari lisce (188). Nei pazienti con diabete mellito di tipo 2 si sono riscontrati elevati livelli di PAI-1 (189,190) associati a una diminuita attività della cNOS endoteliale e piastrinica con ridotta concentrazione di glutatione. Questo fa presumere, che l'ossido nitrico, surrogato della funzione endoteliale, moduli i livelli plasmatici di PAI-1 (191,192).La Proteina C reattiva altamente sensibile (hsCRP) rappresenta un importante marker di infiammazione; si tratta di una proteina di fase acuta la cui secrezione è stimolata principalmente dall'interluchina 6, ma anche altre citochine contribuiscono alla sua sintesi, come IL-1 e TNF. L'IL-6 e l'IL-1, attraverso l'attivazione di NF-KB, appaiono essere i più potenti stimolatori della sintesi epatica ed endoteliale di PCR. La PCR esercita effetti proinfiammatori e proaterogeni ben documentati a livello endoteliale, dove causa: riduzione della sintesi di NO (197) e prostaciclina, incrementa la produzione di endotelina-1, aumenta l'espressione di molecole di adesione (194), di MCP-1, di IL-8 e di PAI-1. In monociti-macrofagi la PCR induce la secrezione del fattore tissutale, incrementa il rilascio di specie reattive dell'ossigeno e di citochine proinfiammatorie, promuove l'adesione e la chemiotassi dei monociti, e incrementa l'uptake di LDL ossidate (195,196). In corrispondenza delle cellule muscolari lisce, l'effetto più importante della PCR è quello di incrementare l'espressione del recettore tipo 1 per l'angiotensina, con conseguente aumento della proliferazione cellulare e generazione di ROS. Le concentrazioni nel siero di PCR sono strettamente influenzate dall'indice di massa corporea (BMI), in quanto il tessuto adiposo viscerale mostra la capacità di sintetizzare e rilasciare in circolo IL-6 e TNF Quando rilevata con metodiche altamente sensibili, la PCR, costituisce quindi un utile indicatore di infiammazione subclinica e di disfunzione endoteliale (193), poiché l'endotelio attivato da citochine oppure da radicali liberi dell'ossigeno diviene sito di produzione della proteina di fase acuta.Le molecole di adesione sono un ottimo marker della disfunzione endoteliale.La loro presenza in circolo deriva dalla liberazione cellulare (shedding), che avviene per scissione proteolitica, dei loro domini extracellulari.La prima dimostrazione dell'esistenza di molecole adesive solubili fu ottenuta in vitro dosando tali molecole, con metodiche immunoenzimatiche, nel surnatante raccolto da cellule endoteliali attivate con stimoli massimali (IL1 + TNFα), dove raggiungevano concentrazioni significativamente superiori rispetto al surnatante raccolto da cellule endoteliali non attivate (198). Tale osservazione ha costituito la premessa teorica per il loro uso come possibili marcatori bioumorali di attivazione endoteliale in vivo.Si riconoscono due tipi di molecole di adesione endoteliale: le selectine (tra cui la E-selectina) e le immunoglobuline ICAM1 e VCAM1; queste forme solubili sono biologicamente attive, riconoscendo gli stessi ligandi delle molecole di superficie (199). Il controllo dello shedding non è completamente noto, anche se molti ritengono che la liberazione in circolo di queste molecole sia proporzionale alla loro densità sulla membrana plasmatica (200).Nel diabete mellito di tipo 2 sono stati riscontrati elevati livelli di sE-selectina e di sICAM-1 solubili (201). Alte concentrazioni di sE-selectina sono state inoltre rilevate in parecchie altre patologie che coinvolgono, direttamente o indirettamente, l'endotelio, quali: le neoplasie, l'ipertensione arteriosa, lo shock settico, ecc. È plausibile pensare che la E-selectina in forma solubile possa rappresentare uno dei migliori indicatori di danno endoteliale data la sua elevata specificità in termini di sintesi endoteliale (202).Nell'interpretazione del dosaggio di sICAM, sVCAM e sE-selectina nelle patologie in cui è implicata la disfunzione endoteliale, è tuttavia importante ricordare la possibile fonte di queste molecole solubili, diversa dal distretto vascolare che si vuole indagare; inoltre una parte di queste molecole potrebbe non essere dosabile perché legata a recettori complementari; infine, i risultati vanno corretti in funzione dell'età, del sesso e del gruppo sanguigno.L'iperglicemia cronica causando stress ossidativo (ossidazione del glucosio, generazione di AGEs, aumentata suscettibilità all'ossidazione da parte delle LDL glicate) induce anche attivazione dei monociti-macrofagi. Si verifica attivazione di PKC e MAPK, le quali stimolano AP-1 e NFKB (203) .L'attivazione di questi fattori di trascrizione determina un aumento drammatico dei livelli plasmatici di citochine IL6 e TNF. Altri fattori contribuiscono ad attivare i monociti durante l'iperglicemia, come ad esempio la presenza di elevati livelli di angiotensina II (204) , la cronica disfunzione endoteliale indotta dai radicali liberi, la presenza di LDL ossidate e glicate. Va poi sottolineato che l'endotelio, attivato da citochine e stressato dalle specie reattive dell'ossigeno, diventa a sua volta fonte di interleuchine, contribuendo così a generare uno stato infiammatorio. Pertanto la valutazione dei livelli di citochine permette di rilevare la presenza di uno stato di infiammazione innescato da una causa metabolica rappresentata dal glucosio in eccesso.