La grepafloxacina, similmente ad altri chinoloni agisce tramite l'inibizione di due enzimi fondamentali per la cellula batterica, la DNA-girasi (conosciuta anche come topoisomerasi II) e la topoisomerasi IV. La DNA girasi è un enzima essenziale coinvolto nella replicazione, trascrizione e riparazione del DNA batterico. La topoisomerasi IV è invece un enzima che svolge un ruolo chiave nella partizione di batterico DNA cromosomico durante la divisione cellulare. Il blocco di questi meccanismi enzimatici porta alla morte del batterio.