Come altri chinoloni la pazufloxacina agisce inibendo in modo selettivo sia la DNA–girasi (conosciuta anche come topoisomerasi II) che la topoisomerasi IV. Questi due enzimi sono cruciali per la cellula batterica, in particolare per i processi di duplicazione, trascrizione e riparazione dell'acido deossiribonucleico (DNA) nei batteri. La topoisomerasi IV separa le catene di DNA che deve essere replicato (cioè duplicato), prima che abbia inizio la divisione cellulare batterica. Il blocco dell'enzima impedisce al DNA di essere separato, interrompendo il processo di replicazione delle molecole dell'acido deossiribonucleico: il batterio quindi non può più dividersi né replicarsi. La DNA girasi, d'altra parte, è responsabile del superavvolgimento del DNA: quest'ultimo processo è cruciale affinché la molecola possa essere fatta rientrare nelle cellule di nuova formazione. Il blocco di entrambi i meccanismi porta quindi alla morte del batterio.