I dati relativi alla Real Time PCR in nostro possesso sono preliminari, in quanto fino ad ora sono stati analizzati solamente cinque pazienti che non avevano ottenuto la remissione molecolare (MR) con il consolidamento VTD: i risultati di tale analisi sono illustrati nella figura 19.La massa tumorale documentata all'inizio dello studio oscillava, a seconda del paziente, tra i 10 4 e i  I nostri dati dimostrano per la prima volta che la remissione molecolare (MR) può essere ottenuta in una piccola ma rilevante proporzione di MM senza sottoporre i pazienti ad uno schema di trapianto allogenico, assai rischioso dal punto di vista degli effetti collaterali. Le MR documentate da questo studio sono state ottenute grazie all'utilizzo dei nuovi agenti non chemioterapici: tali farmaci, in particolare Bortezomib e Talidomide, seppur caratterizzati da un ben noto profilo di tossicità, si sono dimostrati più versatili della chemioterapia convenzionale e soprattutto caratterizzati da un'assenza di resistenza crociata con i trattamenti citotossici standard 141-142-143-144-170-171 . Inoltre, i nostri dati confermano l'importanza dell'impiego della valutazione della malattia minima residua (MMR) mediante PCR qualitativa e offrono un'idea per quanto preliminare delle possibili applicazioni della Real Time PCR al monitoraggio clinico dei pazienti con malattie linfoproliferative.La ricerca in corso rappresenta uno dei primi esempi di studio prospettico che preveda la concomitante valutazione quali/quantitativa della MMR. La metodica utilizzata per tale indagine è basata sull' impiego di amplimeri tumore-specifici, derivati dalla regione variabile riarrangiata dei geni per la catena pesante delle Ig. Questa metodica, che rappresenta a tutt' oggi la tecnica migliore applicabile al MM (malattia in cui non abbiamo a disposizione una traslocazione tumore-specifica utilizzabile proficuamente in PCR), si è dimostrata valida sia per il monitoraggio qualitativo sia per l' analisi quantitativa in Real Time PCR mediante l' impiego di sonde di consenso. La validità tecnica di questa metodica era già stata dimostrata in numerosi studi precedenti 192-193-194-198-199 .Il presente studio sottolinea anche quelli che possono essere alcuni dei limiti operativi di questo approccio. Il limite più evidente risiede nel fatto che non in tutti i casi è possibile ottenere la sequenza VDJ tumorale: questo fa sì che circa il 30-40% dei pazienti non possa essere valutato con questa metodica. In secondo luogo la necessità di abbondante tessuto tumorale alla diagnosi può rappresentare una complicazione, essendo spesso i campioni di sangue midollare di MM relativamente poveri di tessuto neoplastico rispetto a quanto si osserva in altre patologie, come ad esempio la leucemia linfatica cronica (CLL); inoltre la minor qualità dei prelievi di midollo osseo ottenibile in uno studio multicentrico, la mancata osservanza di una corretta procedura di prelievo ed un possibile effetto negativo legato alle procedure di trasporto dei campioni dai centri di prelievo sparsi sul territorio nazionale al nostro laboratorio sicuramente hanno influito sulla possibilità di ottenere la sequenza VDJ tumorale per la valutazione della MMR. Infine, questo tipo di approccio è piuttosto laborioso, per cui frequentemente i risultati molecolari vengono ottenuti con ritardo rispetto alle patologie in cui la MMR viene valutata mediante l' impiego di traslocazioni cromosomiche. Tali difficoltà non devono comunque indurre a sottovalutare l' importanza di questo tipo di analisi o spingere a prendere in considerazione solo approcci alla valutazione della MMR che prescindano dall' impiego di marcatori di clonalità tumore-specifici, come ad esempio l' immunofenotipo analizzato mediante citometria a flusso. A questo proposito è opportuno ricordare come un recente studio comparativo 195 tra metodiche molecolari e citofluorimetriche nell'indagare la MMR abbia conferito alla PCR maggiore sensibilità e specificità (e dunque predittività clinica).In conclusione, pur essendo laboriosa, la PCR è senz'altro la metodica più affidabile per la valutazione della MMR, eventualmente complementata dalla citometria a flusso. Chiarito questo punto, non si deve però sottovalutare l' importanza di migliorare l' efficienza e la fattibilità di tale approccio, mediante un continuo sviluppo delle metodiche molecolari: in questo senso potrebbe rivelarsi interessante l'impiego di marcatori alternativi tra cui le catene leggere [200][201] oppure i riarrangiamenti DJH incompleti 202 . Questi ultimi si verificano ad uno stadio precoce dello sviluppo B-cellulare, si riscontrano frequentemente nel MM e soprattutto presentano un tasso molto ridotto di ipermutazione somatica: quest'ultima caratteristica potrebbe renderli dunque molto utili ed efficaci come target di clonalità nell'indagine della MMR [203][204] .Infine la fattibilità di un tale approccio molecolare alla MMR richiede un costante miglioramento della logistica inerente l' impiego di "endpoint" biologici nell' ambito dei protocolli clinici sperimentali.Analizzati i limiti dell'approccio molecolare, rimangono ancora da considerare alcuni limiti generali dell'intero studio. Innanzitutto la tossicità dimostrata dal protocollo VTD. Se, da una parte, il trattamento è stato tollerato dalla maggioranza dei pazienti, è anche vero che si sono registrati un caso di tossicità fatale e ben 18 episodi di tossicità grave non fatale (G3-G4). Per cinque pazienti inoltre tali episodi hanno determinato l'interruzione del trattamento e la conseguente uscita dal protocollo. Un tale profilo di tossicità dovrà essere tenuto in considerazione nella pianificazione di protocolli terapeutici basati sull'associazione di Bortezomib e Talidomide e a maggior ragione qualora si pensasse di integrare queste "new drugs" in protocolli con farmaci chemioterapici convenzionali.Un altro limite importante del presente studio sta nel fatto che i pazienti in MR non sono numerosi (circa un 20% dei casi fra coloro che hanno completato il programma terapeutico) e provengono inoltre da un gruppo di pazienti selezionato dopo autotrapianto. Infatti sono stati arruolati solo pazienti che hanno ottenuto una risposta clinica ottimale dopo trapianto autologo, proprio nell'intento di valutare la possibilità di indurre MR in questo gruppo a prognosi migliore. Se tale approccio ha permesso di osservare un discreto numero di PCR negatività dopo trattamento, è d'altra parte vero che non è assolutamente pensabile proiettare i risultati ottenuti sulla popolazione generale di pazienti con MM. L'importanza di questa ricerca risiede però nella dimostrazione che i nuovi agenti non chemioterapici siano in grado di indurre la MR che i protocolli di autotrapianto non riescono a raggiungere 192 . Si tratta dunque di una dimostrazione di principio ("proof of principle") piuttosto che di uno studio mirato a valutare l'impatto molecolare sulla popolazione generale dei pazienti con MM: solo ricerche più estensive condotte in futuro potranno contribuire ad esplorare a livello epidemiologico l'importanza di tale trattamento. Questo spiega perché siano da considerare validi i risultati ottenuti su un numero così ristretto di pazienti arruolati e giustifica inoltre i rigidi criteri di selezione clinica che hanno portato all'arruolamento di soli pazienti che presentavano un'ottima risposta dopo trapianto autologo.Potrebbe essere invece interessante studiare in futuro gli effetti molecolari di questi farmaci anche su gruppi di pazienti con MM che non abbiano risposto in maniera ottimale all'autotrapianto. Infatti questo studio ha rilevato un tasso di risposte cliniche al trattamento nettamente superiore al tasso di MR: una larga percentuale di pazienti (circa il 50%) ha migliorato il proprio stadio di risposta clinica (convertendosi da VGPR o nCR a CR); la maggioranza dei casi rimanenti ha inoltre mantenuto nel tempo l'ottimale risposta iniziale, mentre solo un paziente (circa il 4% del totale) è regredito verso uno stadio peggiore. Questo dato dimostra dunque come il protocollo di consolidamento non chemioterapico VTD sia in grado di determinare un ulteriore tasso di risposta dopo autotrapianto. Sulla stessa linea risultati molecolari più consistenti potrebbero essere ottenuti tramite l'indagine quantitativa in Real Time PCR su pazienti persistentemente positivi alla PCR qualitativa; i risultati preliminari ottenuti da questo studio mediante l'approccio quantitativo suggeriscono infatti che l'associazione Bortezomib-Talidomide-Desametasone comunque riduca la carica tumorale residua nei pazienti che non riescono ad ottenere una MR: in questo senso un'analisi di sopravvivenza a medio e lungo termine potrebbe chiarificare il risvolto clinico dell'abbattimento della carica molecolare ottenuto con questo protocollo.D'altra parte, considerate anche le percentuali non ottimali di MR ottenute, non è affatto detto che un protocollo basato solo su agenti non chemioterapici (come appunto il protocollo VTD) sia l'opzione migliore da proporre dopo un autotrapianto. Importanti studi condotti negli ultimi anni hanno infatti dimostrato come il Bortezomib e la Talidomide, integrati in protocolli di trattamento con farmaci citostatici, abbiano permesso di raggiungere tassi di risposta più elevati rispetto agli schemi convenzionali: questi studi hanno indagato la combinazione Bortezomib-Melphalan per os in pazienti alla diagnosi con più di 65 anni 179 , lo schema di induzione PAD (Bortezomib-Doxorubicina-Desametasone) 180 e la combinazione MPT (Melphalan-Talidomide-Desametasone) [155][156] . È auspicabile quindi che in futuro siano condotte altre ricerche volte all'indagine della MMR dopo regimi di trattamento comprendenti le "new drugs" associate a chemioterapici convenzionali, in seguito ad attenta valutazione dei rispettivi profili di tossicità. È lecito attendersi che un'ulteriore citoriduzione indotta da farmaci citostatici possa contribuire ad abbattere la carica molecolare del tumore, così come l'utilizzo delle "new drugs" possa determinare un superamento delle resistenze delle cellule di MM ai farmaci convenzionali 141-142-143-144-170-171 .Infine un problema cruciale riguarda il futuro dei pazienti che hanno ottenuto la PCR negatività. I dati in nostro possesso confermano il mantenimento della MR fino ad un massimo di 21 mesi ad oggi, mentre solo un caso di PCR negatività a tre mesi si è positivizzato alla fine del trattamento per recidivare successivamente. I dati della letteratura sono concordi nell'attribuire alla MR un significato prognostico favorevole 117-119-194 , ma troppo poco tempo è trascorso finora dall'ottenimento di questi risultati per poter sbilanciarsi in una previsione clinica sui pazienti PCR negativi. Tantomeno è possibile ad oggi predire se e quando tali pazienti in MR possano ripositivizzarsi e recidivare piuttosto che mantenere nel tempo la loro negatività molecolare: un simile quadro di lungo-sopravvivenza potrebbe essere spiegato da un eventuale guarigione di malattia o da un più verosimile ritrovato equilibrio fra clone neoplastico ed organismo ospitante.