Come altri antifungini della classe dei triazoli o degli imidazoli, il fluconazolo agisce inibendo la 14 α-demetilasi del citocromo P450 fungino. La selettività dell'azione è data dal fatto che la demetilasi dei mammiferi è molto meno sensibile al fluconazolo di quella fungina. Questa inibizione impedisce la conversione del lanosterolo in ergosterolo, un componente essenziale per la membrana citoplasmatica dei funghi, con conseguente accumulo di 14α-metil steroli. Il fluconazolo è principalmente un fungostatico; può essere fungicida nei confronti di alcuni organismi in modo dose-dipendente, in particolare verso i Cryptococchi.