Il DNA genomico è stato estratto dai leucociti presenti nel sangue periferico mediante l'utilizzo di un metodo di estrazione microvolumetrico, QIAamp DNA mini kit (Quiagen GmbH, Hilden, Germania), in accordo con le istruzioni della casa produttrice.L'esone 8 del gene p62/SQSTM1 è stato amplificato mediante tecnica PCR, usando una coppia di primer localizzati nell'introne adiacente: 5' -CAGTGTGGCCTGTGAGGA -3'/5'CAGTGAGC CTTGGGTCTCG-3'.Invece l'esone 7 è stato amplificato con la seguente coppia di primer: Sono stati così messi a confronto 503 pazienti pagetici provenienti dai tre centri con 496 controlli sovrapponibili per sesso e età. Entrambi i gruppi sono stati genotipizzati anche per il gene SQSTM1.I pazienti portatori di tale mutazione sono stati 77.Il SNP A192V (allele C) ha una frequenza maggiore nei pazienti pagetici (OR 1,3 con p= 0,006 nei casi vs controlli).In più tale allele C di rischio è stato maggiormente osservato nel sotttogruppo di pazienti con la mutazione di SQSTM1 (OR 1,6 con p=0,0009 nei mutati vs non mutati). E' interessante notare che i pazienti con tale allele C mostrano un'aumentata prevalenza di malattia poliostotica (68%, 53% e 51% nei pazienti rispettivamente con genotipo CC, CT e TT con p=0,01) e un aumento del numero di siti scheletrici colpiti (2.9, 2.5 e 2.0 nei pazienti rispettivamente con genotipo CC, CT e TT con p=0,008).Tali differenze aumentano notevolmente se analizziamo i casi con la mutazione La presenza di mutazioni troncanti che comportano maggiori difetti funzionali della proteina del sequestosoma (come ad esempio la Y383X, descritta quasi esclusivamente in soggetti di origine campana) rispetto alle mutazioni missenso, potrebbe in parte spiegare la maggior gravità della malattia e l'insorgenza precoce (riduzione dell'età alla diagnosi: 50 +/-10 anni vs 57 +/-9 anni; p<0,05).Complessivamente 342/533 (64%) dei pazienti riferiva contatti con animali in zone rurali per almeno 10 anni prima dell'insorgenza di PDB.La prevalenza dei pazienti con tale tipo di contatti è risultata ridotta in coloro con la mutazione del gene SQSTM1 rispetto ai wild type (58% vs 65%).I pazienti campani avevano la più alta prevalenza di contatti con animali (69% vs 62% nelle altre regioni) senza nessuna differenza tra soggetti con mutazione o senza.Se si considerano solo i casi familiari della Campania, i contatti con animali sono risultati pari al 90% delle famiglie senza mutazione. Inoltre c'è una progressiva riduzione età correlata delle prevalenza dei contatti con animali nella maggior parte delle regioni fatta eccezione nel sottogruppo dei pazienti campani.I pazienti che riferivano contatti con animali presentavano un maggior numero di siti affetti dalla malattia (2. In particolare dei 19 pazienti poliostotici e mutati, 3 hanno presentato una forma diffusa che interessa tutte le ossa e 6 hanno avuto quattro siti colpiti da malattia.Infine le ossa più colpite nei soggetti mutati risultano essere: la pelvi (55%), il rachide e le vertebre (52%), il femore (28%), l'omero (24%), il cranio (18%).Anche nei soggetti non mutati la pelvi è la sede più colpita (58%), seguita dal rachide e vertebre (32%), dal femore (28%) e dalla tibia (18%). Il cranio è colpito nel 10% e l'omero solo nell'8%.Infine la terza caratteristica riguarda le complicanze della malattia.Abbiamo analizzato la presenza di dolore osseo: esso è presente nella popolazione dei non mutati circa nel 48%. Nei soggetti mutati il dolore è molto più frequente (48% vs 72% p<0,01).Le altre complicanze analizzate sono: osteoartrosi, disturbi uditivi, fratture ossee, deformità, nefrolitiasi, diabete mellito, ipertensione, malattie della circolazione. Nei pazienti affetti dalla G425R l'età media di diagnosi risulta essere di 52,3 +/-4,04 anni.Nel 66% dei casi la malattia risulta essere poliostotica. Le sedi più frequentemente colpite sono in ordine di frequenza: pelvi (100%), rachide (66%).Le complicanze di malattia sono risultate essere: dolore (66,6%), osteoartrosi (33,3%), disturbi dell'udito (33,3%) e vasculopatie (33,3%). Sarebbe bene consigliare ai familiari di primo grado dei pazienti pagetici l'analisi genetica così da poter effettuare una prevenzione secondaria tramite una diagnosi precoce.L'analisi genetica costituisce una procedura essenziale nell'ambito della diagnostica della malattia; d'altro canto sarebbe utile considerare il rapporto costo/beneficio di tale indagine soprattutto nei pazienti che hanno già ricevuto una diagnosi clinica e che non beneficeranno di una diagnosi precoce.Per quanto riguarda il gene TNFRSF11A la presenza dei SNPs è associata a una maggiore suscettibilità di sviluppare PDB e può interagire con le mutazioni di SQSTM1 nel determinare la gravità della malattia.Infine i fattori ambientali correlati al contatto con animali sono importanti nell'eziopatogenesi della malattia di Paget e possono interagire con le mutazioni del gene SQSTM1 influenzando la gravità clinica della malattia.