Peg-Interferon alfa-2beta (IFN-PEG alfa2b) presenta una molecola di glicol polietilene (pegilazione) in aggiunta all'IFN alfa-2beta che porta ad un rallentamento del metabolismo a causa dell'aumento delle dimensioni della molecola; tutto ciò prolunga la concentrazione plasmatica del farmaco e permette la somministrazione di una singola dose settimanale. (Lee B et al, 2012) IFN-PEG alfa2b fu approvato dalla FDA nel 2011 come farmaco aggiuntivo nel trattamento di pazienti con melanoma avanzato (stadio IIB, IIC, III) ad alto rischio di ricorrenza dopo chirurgia. Dopo un primo studio (EORTIC 18952) condotto da Eggermont AM et al. (2005) per decidere la dose più efficace del farmaco (6 mg/kg per settimana per 8 settimane come induzione seguita da 3 mg/kg per settimana per 5 anni) l'approvazione fu data grazie un trial clinico randomizzato di fase III condotto dall'Organizzazione Europea per la Ricerca e il Trattamento del Cancro-EORTC 18991. (Agarwala SS et al, 2011) Lo studio ha coinvolto 1256 pazienti con melanoma avanzato nel periodo postoperatorio. La metà dei pazienti (n=627) è stata randomizzata a ricevere alte dosi di IFN-PEG alfa2b e i rimanenti 629 pazienti hanno ricevuto invece la terapia standard. (Eggermont AM et al, 2011) In 3.8 anni di follow up è stato osservato un aumento significativo di sopravvivenza libera da malattia (P=0.011) (45.6% contro 38.9%), ma non è stato visto un aumento della sopravvivenza globale.In tutti i pazienti, la terapia con IFN-PEG alfa2b ha portato a una riduzione del rischio di ricorrenza del 7% e di morte a 4 anni (13% per i pazienti con malattia nodale microscopica [N1] o evoluzione in altri linfonodi).Per quanto riguarda la tossicità, 355 pazienti nel gruppo di IFN-PEG alfa2b (58%) hanno avuto una riduzione della dose. Gli eventi avversi di ogni grado si sono manifestati nel 30% dei pazienti tra i quali fatigue, epatotossicità, e depressione. (Eggermont AM et al, 2008) Eggermont et al. nel 2008, in un'analisi combinata di questi due studi, hanno dimostrato un effetto statisticamente significativo nei pazienti con melanoma metastatico ai linfonodi. (Eggermont AM et al, 2008) Sebbene questi studi, messi a confronto con il gruppo placebo, hanno portato a un beneficio in sopravvivenza libera da malattia, questo è stato perso alla sospensione del trattamento, suggerendo la necessità di un trattamento prolungato. 6.5.4. Terapia con Ipilimumab L'Ipilimumab è uno dei migliori anticorpi monoclonali con target CTLA-4 ed è stato valutato in diversi trials clinici reclutando in totale più di 2.000 pazienti con diversi tipi di tumori solidi. (Hodi FS et al, 2010;Robert C et al, 2011).Cytotoxic T lymphocyte antigen-4 (CTLA-4) è una glicoproteina della superfamiglia delle immunoglobuline ed è una molecola co-inibitrice espressa sulle cellule T. Essa è espressa nel compartimento intracellulare ma può anche essere trasportata sulla membrana. (Linsley PS et al, 1991;Tivol EA et al, 1995) Questa molecola fu clonata nel 1988 ed è critica sia per il mantenimento dell'omeostasi delle cellule T che per la tolleranza immunitaria. CTLA4 ha una sequenza omologa del 30% con CD28, una molecola co-stimolatrice costitutivamente espressa sulle cellule T. (Figura 5) ( Walunas TL et al, 1994) Questa molecola in membrana lega CD80 (B7-1)/CD86(B7-2) come farebbe CD28, ma a differenza di quest'ultimo, CTLA4 interagisce con una maggiore affinità portando ad una inibizione delle cellule T e a un arresto del ciclo cellulare. (Chen L, 2004;Pentcheva-Hoang T et al, 2004) La traslocazione di CTLA-4 in superficie dipende dagli eventi a valle del segnale del TCR, ma non si sa come la molecola diminuisca il segnale dopo il legame con CD80/CD86. E' risaputo che CTLA-4 è costitutivamente espresso dalle cellule Treg, nelle quali gioca un ruolo importante nella tolleranza periferica attraverso la soppressione delle cellule T citotossiche. (Wing K et al, 2008;Sakaguchi S et al, 2009) Ipilimumab (Yervoy), somministrato alla dose di 3 mg/kg endovena ogni 3 settimane per 4 dosi totali ha ottenuto l'approvazione USA FDA nel 2011 per il trattamento di tutti i melanomi metastatici e dall'EMA per tutti i melanomi metastatici pretrattati (II linea) dopo aver dimostrato una risposta duratura nel 10-15% dei pazienti. (Hodi FS et al, 2010) In Italia è solo da Maggio 2013 che l'AIFA ne ha permesso la commercializzazione in seconda linea  e dal 15 Settembre 2014 il farmaco è rimborsabile anche per i pazienti in prima linea.I pazienti che hanno dei benefici con il farmaco nella fase di induzione (1 dose ogni 3 settimane per un totale di 4 somministrazioni) beneficiano di una terapia di mantenimento con Ipilimumab (Robert C et al, 2011) o di una seconda dose di reinduzione al momento della progressione della malattia. (Hodi FS et al, 2010;Lebbe C et al, 2014) Il motivo per cui con il tempo la malattia progredisca non è stato ancora chiarito.Si pensa che la persistente risposta immune possa cambiare il fenotipo del tumore rendendolo meno immunogenico ("immunoediting"). (Robert C et al, 2013) Le risposte all'Ipilimumab solitamente non appaiono fino a 12-16 settimane di terapia (Saenger YM et al, 2008;Hodi FS et al, 2010;Robert C et al, 2011); questo inizio ritardato della regressione del tumore con Ipilimumab è spesso problematico soprattutto nei pazienti sintomatici o che rischiano di sviluppare sintomi imminenti a causa di tumori localizzati in aree critiche (come nel sistema nervoso centrale).Inoltre, l'infiltrazione peritumorale porta ad un transiente ingrossamento della lesione per infiammazione e favorendo l'insorgenza dei sintomi. Per questo motivo, poiché c'è il rischio di analizzare male l'andamento della neoplasia usando i classici criteri come il Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST) (Eisenhauer EA et al, 2009) o il World Health Organization (WHO) (James K et al, 1999), attualmente si usano dei criteri modificati. (Wolchok JD et al, 2009) L'uso dell'Ipilimumab è stato reso possibile dopo la pubblicazione di due trials clinici randomizzati in fase III condotti su pazienti con melanoma metastico. (Hodi FS et al, 2010;Robert C et al, 2011;Yervoy, 2013) Nel La immunoterapia è stata somministrata alla dose di 3 mg/kg con o senza Gp 100 ogni 3 settimane per 4 dosi (induzione). Alcuni pazienti selezionati avrebbero, in un secondo momento, ricevuto una terapia di reinduzione. I risultati ottenuti sono stati sorprendenti: la sopravvivenza globale media è stata di 10 mesi nei pazienti che hanno ricevuto la terapia combinata contro 6,4 mesi del gruppo trattato con il Gp 100 (HR 0.68, P<0.001).I pazienti sottoposti alla terapia con Ipilimumab hanno mostrato una sopravvivenza globale media simile al primo gruppo ossia 10.1 mesi (HR in paragone a Gp 100 da solo: 0.66, P=0.003). Gli effetti collaterali sono stati osservati nel 10-15% dei pazienti con melanoma in stadio III in terapia con Ipilimumab rispetto al 3% dei pazienti trattati con Gp 100.In conclusione, questo primo trial clinico ha evidenziato come l'Ipilimumab con o senza il peptide vaccino Gp 100 aumentasse la sopravvivenza in questi pazienti metastatici precedentemente trattati. (Hodi FS et al, 2010) Sebbene la migliore frequenza di risposte globali registrata è stata modesta, 10.9% nel gruppo Ipilimumab contro 5.7% nel gruppo combinato, alcuni pazienti in entrambi i gruppi hanno mantenuto una risposta obiettiva per almeno 2 anni. (Hodi FS et al, 2010) In questo trial, la OS a 3 anni fu del 20% per Ipilimumab in monoterapia (Hodi FS et al, 2010) e fu confrontata favorevolmente con un OS a 3 anni di 17% dello storico controllo dei pazienti con la chemioterapia standard.  Nel secondo trials, Robert C. et al. (2011) hanno diviso 502 pazienti con melanoma metastatico non precedentemente trattato, metà di loro sono stati sottoposti alla terapia con Ipilimumab (10 mg/kg) combinato con Dacarbazina (850 mg/m2 di superficie corporea) all'altra metà è stata somministrata Dacarbazina (850 mg/m2 di superficie corporea) con placebo. I trattamenti sono stati somministrati alla 1°, 4°, 7° e 10° settimana seguiti dalla somministrazione di Dacarbazina da sola ogni 3 sett per 22 settimane successive. I pazienti con malattia stabile o con una risposta oggettiva e senza effetti tossici dose limitanti, hanno ricevuto Ipilimumab o placebo come terapia di mantenimento ogni 12 sett. I risultati hanno messo in luce come la sopravvivenza globale è stata significativamente più lunga nel gruppo trattato con Ipilimumab con Dacarbazina rispetto a quello trattato con Ipilimumab con placebo (11.2 mesi contro 9.1 mesi). E' stata inoltre evidenziata una sopravvivenza maggiore nel gruppo Ipilimumab-Dacarbazina a 1 anno (47.3% contro 36.3%), a 2 anni (28.5% contro 17.9%) e a 3 anni (20.8% contro 12.2%) (HR 0.72, P< 0.001). Gli effetti avversi si manifestarono nel 56.3% dei pazienti trattati con la chemioimmunoterapia confrontati con 27.5% in terapia con Dacarbazina più placebo (P< 0.001). (Robert C et al, 2011) In questi due studi la frequenza di risposta oggettiva all'Ipilimumab è stata alquanto bassa, dal 10.9% al 15% ma è sembrata duratura nel tempo soprattutto nella minoranza dei pazienti che hanno raggiunto una risposta completa alla terapia. (Robert C et al, 2011;Voskoboynik M et al, 2014) Queste osservazioni suggeriscono che in un certo numero di pazienti, le terapie immunomediate generano un effetto antitumorale importante anche dopo il termine della terapia. Tutto ciò è stato anche dimostrato da Prieto et al. (2012) quando hanno studiato il follow up di 177 pazienti con melanoma metastatico: 14 dei 15 pazienti suscettibili hanno mostrato una risposta prolungata alla terapia con Ipilimumab per oltre 54 mesi. (Prieto PA et al, 2012) Siccome solo una piccola quantità di pazienti (circa il 20%) beneficia di un trattamento a lungo termine (Schadendorf D et al, 2013) sono stati fatti numerosi studi per cercare dei possibili marcatori che indicassero una buona e prolungata risposta al farmaco.In questo momento, nonostante siano stati investigati numerosi biomarkers preliminari, nessuno di questi è stato validato con studi di conferma. (Hamid O et al, 2011;Sarnaik AA et al, 2011;Meyer C et al, 2014) In un'estesa analisi di 95 pazienti trattati all'Istituto Nazionale del Cancro Italiano, l'LDH e il CRP sono stati evidenziati come markers associati ad una risposta all'Ipilimumab. Questi indicatori devono essere misurati al basale e dopo 12 settimane e una loro riduzione nella seconda rivelazione può far pensare a una risposta duratura al farmaco. (Simeone E et al, 2014) Un altro esame di laboratorio spesso usato nella pratica clinica è l'ALC (absolute lymphocyte count) misurato al basale, dopo 4 e 7 settimane; un valore di ALC> 1000 micronL-1 al basale predice un miglior risultato post terapia con Ipilimumab. (Ku GY et al, 2010) Tra le indicazioni dell'Ipilimumab c'è anche quella di terapia adiuvante dopo resezione completa di melanoma in stadio III in pazienti con alta frequenza di recidiva. (Eggermont AM et al, 2005) L'efficacia dell'Ipilimumab in questi pazienti è stata dimostrata nello studio in doppio cieco di fase 3 condotto da Eggermont AM et al. (2005) nel quale sono stati reclutati 951 pazienti operati per melanoma cutaneo in stadio III con una resezione dei linfonodi e senza una precedente terapia sistemica per la neoplasia. I pazienti sono stati randomizzati (1:1) per ricevere l'infusione intravenosa di Ipilimumab a 10 mg/kg oppure placebo ogni 3 settimane per 4 dosi e dopo ogni 3 mesi per 3 anni. L'end-point primario è stato misurato come media della sopravvivenza libera da recidive che ha mostrato valori di 26.1 mesi nel gruppo trattato con Ipilimumab contro i 17.1 mesi nel gruppo placebo (HR 0.75; P=0.0013); la sopravvivenza libera da malattia a 3 anni invece è stata di 46.5% nel gruppo Ipilimumab contro 34.8% nel placebo.In conclusione, i risultati hanno messo in luce un significativo aumento della sopravvivenza in caso di associazione tra terapia chirurgica e sistemica con Ipilimumab.Gli eventi avversi presentati in questo studio sono stati simili a quelli evidenziati nei precedenti trials con un aumento del numero e di durata dell'endocrinopatie dopo la sospensione del farmaco (31 settimane).Un altro importante aspetto evidenziato da questo studio è la diversa risposta alla terapia in presenza di metastasi microscopiche ai linfonodi (linfonodo sentinella positivo) o macroscopiche/palpabili e la presenza o assenza di ulcerazioni nel melanoma primitivo. Sembrerebbe che i melanomi primitivi con ulcerazione e metastasi linfonodali microscopiche abbiano un miglior beneficio dalla terapia con Ipilimumab seguiti dai pazienti con metastasi palpabili e melanoma ulcerato e infine dai pazienti con metastasi microscopiche e primitivo non ulcerato.Queste osservazioni suggeriscono che il melanoma ulcerato è un'entità biologica separata. (Eggermont AM et al, 2005) Per quanto riguarda le controindicazioni alla terapia con l'Ipilimumab, sono esclusi tutti i pazienti con metastasi cerebrali attive a causa della scarsa prognosi.Negli scorsi anni sono stati disegnati due studi per indagare la possibile efficacia del farmaco in pazienti con metastasi cerebrali. L'Italian Network for Tumor Biotherapy (NIBIT) ha condotto uno studio multicentrico (NIBIT-M1) di fase II per descrivere la sicurezza e l'efficacia della combinazione di Ipilimumab e Fotemustina nei pazienti con melanoma metastatico a livello cerebrale. I risultati dimostrarono una risposta a lungo termine della chemioimmunoterapia nei pazienti con melanoma con o senza metastasi cerebrali (DCR=46.5% dell'intera popolazione vs 50% dei pazienti con metastasi cerebrale) e, nonostante lo studio sia retrospettivo e siano stati reclutati pochi pazienti, non ha dimostrato una significativa associazione tra la mutazione di BRAF e i risultati clinici (melanoma BRAF mutato, OS= 10 mesi, melanoma WT, OS= 17.3 mesi). (Di Giacomo AM et al, 2011;Di Giacomo AM et al, 2012;Di Giacomo AM et al, 2015) Visti i risultati incoraggianti del primo studio, la fondazione NIBIT ne ha disegnato un secondo (NIBIT-M2) (attualmente in esecuzione) con lo scopo di investigare l'efficacia della combinazione di Ipilimumab con Fotemustina come trattamento di prima linea nei pazienti con melanoma con metastasi. Di conseguenza è stata composta una prima coorte di pazienti in trattamento con Fotemustina, e una seconda in terapia combinata con Ipilimumab e Fotemustina.In un secondo momento, grazie alle recenti novità delle combinazioni di anti-CTLA4 e anti-PD1, è stato aggiunto allo studio una terza corte di pazienti sottoposta al trattamento con Ipilimumab insieme a Nivolumab (EUDRACT no.2012-004301-27). (Di Giacomo AM et al, 2015) In tutti gli studi sull'Ipilimumab, è stato evidenziato un aumento degli infiltrati di cellule T nei tessuti peritumorali dopo il blocco del CTLA-4. (Hodi FS et al, 2008;Carthon BC et al, 2010) I pazienti trattati, hanno mostrato un aumento delle cellule T esprimenti costimolatori inducibili (ICOS), ossia molecole di superficie membri della famiglia di CD28/CTLA4 sia negli infiltrati peritumorali e sia a livello ematico. (Liakou CI et al, 2008) Questi dati mettono in luce come le cellule T CD4 ICOS+ possano essere considerati come biomarcatori farmacodinamici del trattamento anti-CTLA4 (Tang M et al, 2013); infatti la perdita dell'efficacia degli anticorpi anti-CTLA4 si accompagna a un'alterazione del pathway di ICOS. Tutto ciò suggerisce che, per aumentare l'efficacia di Ipilimumab, basterebbe fornire uno stimolo agonista per il pathway di ICOS (la terapia combinata ha mostrato un'efficacia di 4-5 volte rispetto al trattamento di controllo). (Fan X et al, 2014) In conclusione, quindi, ICOS è sicuramente uno stimolatore del checkpoint ma anche un nuovo target per combinare strategie immunoterapiche.Insieme agli studi sul microambiente tumorale, presto partiranno altri trial che valuteranno gli elementi delle cellule del cancro. Le analisi genetiche del melanoma hanno evidenziato come un elevato numero di mutazioni chiamate "mutational load" possano creare nuovi antigeni "neoantigenes", che a loro volta, sono riconosciuti dalle cellule T. (Snyder A et al, 2014;Schumacher TN et al, 2015) Questi studi forniscono un forte razionale per integrare analisi genetiche di tumori con profili immunologici del microambiente tumorale per una migliore valutazione dei meccanismi che contribuiscono alla risposta alla terapia con anti-CTLA4.