Sembra impedire la formazione del complesso d'inizio, composto dalla subunità 30S e 50S del ribosoma, dal tRNA e dall'mRNA. Il linezolid si lega alla porzione 23S della subunità 50S (il centro dell'attività della peptidil trasferasi), vicino ai siti di legame del cloramfenicolo, della lincomicina e di altri antibiotici. A causa di questo meccanismo d'azione unico, la resistenza incrociata tra il linezolid e gli altri inibitori della sintesi proteica è molto poco frequente o inesistente.