La PML dovrebbe essere sospettata in pazienti che presentano deficit neurologici subacuti in corso di una terapia immunosoppressiva o immunomodulatoria, con lesioni focali o multifocali della materia bianca sottocorticale alla RM, che non presentano un effetto massa e non sono conformi ai territori vascolari. L'aspetto tipico della PML, su studi di neuroimaging, è rappresentato da discreti focolai unilaterali o bilaterali di demielinizzazione che non sono conformi ai territori cerebrovascolari e non mostrano né effetto massa né aumento del contrasto (che tuttavia può verificarsi nei casi di PML-IRIS). Le lesioni di solito interessano la materia bianca sottocorticale dei lobi parieto-occipitale o frontale, ma può anche coinvolgere il corpo calloso, il tronco encefalico, i tratti piramidali e il cervelletto 389 , mentre il coinvolgimento della materia grigia profonda, compresi i gangli basali e il talamo, può essere riscontrato fino al 17% dei casi, ma sempre in connessione con le lesioni a livello della materia bianca 389 .Alla RM, le lesioni sono visualizzate come aree di segnale: diminuito su immagini T1-pesate e, al contrario, aumentato su sequenze T2-pesate e FLAIR 389 .Nei pazienti con caratteristiche cliniche e neuroimaging compatibili, la diagnosi di certezza di PML viene stabilita dimostrando la presenza del DNA del virus JC nel liquido cerebrospinale mediante la PCR 391 . Nell'esame dell'LCR devono anche essere analizzate: la conta dei globuli bianchi, la concentrazione di proteine e di glucosio, la colorazione di Gram, l'esame citologico, la citometria a flusso (per escludere il linfoma), la ricerca della carica virale dell'HIV, dell'antigene criptococcico (se sieropositivo per l'HIV) e la PCR per EBV, VZV, CMV, HSV-1 e 2. In caso di PML le analisi possono rivelare alterazioni non specifiche come un moderato aumento delle proteine (<100 mg/dL) e una pleocitosi lieve con <20 cellule/microL (se >20 cellule/microL può essere indice di una PML-IRIS o di una causa infettiva diversa).