Nasce il 7 luglio 1843 a Corteno (oggi Corteno Golgi in suo onore), in alta Val Camonica, dove il padre Alessandro, appena laureato, si è trasferito come medico condotto. Qui frequenta le scuole primarie e rimane per circa quindici anni. Nello stesso periodo studia anche a Edolo e poi a Lovere (BG). Terminati nel 1865 gli studi a Pavia e laureatosi in Medicina con la tesi "Sull'eziologia delle malattie mentali", discussa con Cesare Lombroso, entra nel laboratorio istologico fondato da Paolo Mantegazza e diretto da Giulio Bizzozero, che sarà suo maestro di ricerca. Per l'urgenza di trovare un lavoro sicuro e pressato dal padre, Golgi decide di partecipare al concorso per un posto di primario chirurgo presso le Pie Case degli Incurabili di Abbiategrasso (fondato nel 1785 nell'ex monastero femminile di Santa Chiara). Golgi vince il concorso e, grazie all'articolo 86 del regolamento interno, gli viene riconosciuto come merito speciale dei sanitari il potersi occupare degli studi anatomo-psicologici.