Come già ricordato, il ritmo circadiano della secrezione di cortisolo viene conservato, con un nadir alle ore 23.00, sia nei soggetti normali che nei pazienti con pseudo-Cushing, a differenza di quanto avviene, invece, nei pazienti affetti da sindrome di Cushing. Il dosaggio del cortisolo sierico, effettuato su un prelievo delle ore 24.00, è in grado di differenziare le due diverse condizioni con un'accuratezza diagnostica del 95%. Nello studio citato, onde evitare risultati falsamente elevati dovuti all'interferenza dello stress sulla secrezione del cortisolo, i pazienti venivano ospedalizzati, veniva utilizzato un catetere venoso, inserito almeno un'ora prima del prelievo, e veniva sospesa ogni attività fisica per almeno tre ore. Come appare evidente, questo test risulta poco praticabile e assai costoso e deve essere considerato come test di secondo livello, da utilizzarsi in situazioni dubbie. Tutto ciò ha spinto il mondo scientifico a trovare un test più semplice, conveniente, accurato e con un buon rapporto costo/efficacia, da utilizzarsi per lo screening della sindrome di Cushing. I vantaggi preanalitici esposti in precedenza spiegano il razionale dell'impiego del cortisolo salivare notturno. Inoltre, anche se in letteratura ci sono pochi dati circa la variabilità biologica e l'influenza di fattori estrinseci sulle concentrazioni del cortisolo salivare notturno nei pazienti ambulatoriali, uno studio recente ha dimostrato un'eccellente riproducibilità e una bassa variabilità intraindividuale (solo il 22% della variabilità totale) del cortisolo salivare notturno in soggetti volontari sani; al contrario, il dosaggio del cortisolo salivare al mattino mostrava una variabilità intraindividuale più alta (53,4% della variabilità totale). La differente accuratezza diagnostica del test, riscontrata in molti studi, è da imputare in primo luogo ai differenti valorisoglia utilizzati per interpretare i risultati, e, solo secondariamente, ai differenti metodi analitici e di raccolta del campione. Alcuni autori, utilizzando un valore-soglia di 550 ng/dl (il valore più elevato di cortisolo salivare notturno trovato in un paziente non affetto da sindrome di Cushing) hanno riscontrato, con una specificità del 100%, una sensibilità clinica del 93%. In tale studio era stato utilizzato un metodo RIA (Covance Laboratories Inc, Vienna, A), la cui sensibilità analitica risultava pari a 80 ng/dl, e una modalità di raccolta diretta del campione di saliva. Altri autori, utilizzando lo stesso metodo analitico e le stesse modalità di raccolta del campione, ma avvalendosi di un valore di 168 ng/dl come valore-soglia per il cortisolo salivare alle ore 23.00 (corrispondente al 90° percentile di una popolazione di soggetti normali), hanno ottenuto, con una sensibilità del 100%, una specificità dell'88%. Infine, un'elevata sensibilità diagnostica del cortisolo salivare notturno, pari al 92%, è stata dimostrata da un altro studio, che ha utilizzato un valore-soglia leggermente inferiore (130 ng/dl), calcolato con le stesse modalità del precedente, e che ha impiegato, come metodo di raccolta, il dispositivo Salivette® e, come metodo di analisi, un differente metodo RIA (Coat-a-Count, DPC -USA, distributore italiano Medical Systems -Genova), caratterizzato da una maggiore sensibilità analitica (14 ng/dl).