Infatti, dopo stimolazione antigenica, le cellule T autoreattive a tali antigeni hanno una frequenza molto bassa nel sangue periferico (spesso meno di 1/10 5 cellule) sul totale della popolazione cellulare. Inoltre la manipolazione "in vitro" può indurre artefatti fuorvianti che possono essere correlati con le procedure di isolamento, con la concentrazione degli antigeni, con la provenienza del siero dalle colture e con molti altri. Inoltre le cellule T non possono essere congelate e scongelate senza ledere le loro capacità funzionali.Infine, la purificazione degli antigeni necessari per lo studio delle cellule T hanno caratteristiche variabili che possono prevenire o indurre la risposta T cellulare.In aggiunta a questo, bisogna avere degli adeguati controlli negativi da comparare con i pazienti diabetici in studio, ma anche qui ci sono delle difficoltà, in quanto i polimorfismi dell'HLA, nella selezione delle cellule T, la tolleranza all'induzione ed alla presentazione degli antigeni e il fatto che gli autoanticorpi sono meno presenti con l'avanzare dell'età, limitano la scelta dei controlli (102).Al momento, le evidenze di un coinvolgimento dei linfociti T reattivi verso antigeni insulari nella distruzione delle β cellule sono quindi solo "circostanziali". É stata descritta la ricorrenza della distruzione selettiva delle cellule β in un segmento pancreatico trapiantato da un gemello non diabetico al gemello diabetico; ciò ha fornito la miglior evidenza di una memoria immunologica delle cellule T insule specifiche (110).Altra cruciale evidenza del ruolo dell'immunità cellulare deriva dal report di trasferimento di diabete tipo 1 dopo trapianto di midollo osseo da donatore diabetico ad un paziente ricevente identico non diabetico e immunocompromesso (65).Studi su modelli animali dimostrano che i linfociti T sono in grado di trasferire la malattia e che ciò richiede sia linfociti T CD8 + che CD4 + (96).La malattia invece non si sviluppa nei topi NOD, che sono geneticamente atimici o T linfopenici o timectomizzati alla nascita.Utilizzando metodi di immunocitochimica i linfociti infiltranti nella insulite, nel diabete di tipo 1, nelle isole di Langerhans , sono stati identificati come linfociti T, la maggior parte dei quali di tipo soppressore/citotossico CD8 + . Mediante la tecnica ELISPOT , recenti studi hanno evidenziato una reattività T cellulare dopo stimolo con antigeni precoci quali GAD e peptici IA2, con produzione di citochine infiammatorie, quali IFNγ (131), utilizzando linfociti ottenuti dal sangue periferico ottenuto da soggetti diabetici all' esordio. Tale reattività non è invece presente nei soggetti sani di controllo.Più recenti studi indicano che alterazioni di frequenza o di funzione dei linfociti T regolatori sono coinvolti nel diabete mellito come in altre patologie autoimmuni. Questa connessione è dovuta al fatto che il diabete è collegato ad una perdita di tolleranza nei confronti di antigeni self e, tra i meccanismi che coinvolgono la tolleranza, è inclusa la sottopolazione linfocitaria CD4 + e CD25 + specializzata nella regolazione della risposta immunitaria e, pertanto, definiti T regolatori (T reg.) (133,135). La tolleranza delle cellule T è stabilita centralmente nel timo (133,136) ed è mantenuta da tutta una serie di meccanismi periferici. La popolazione di cellule T regolatorie è in grado di sopprimere in vitro la proliferazione e la produzione di citochine da parte dei CD4 + e dei CD8 + e di conseguenza la cascata d' attivazione che porta alla risposta immunitaria. È stato suggerito che un deficit della sottopopolazione linfocitaria T reg. sia presente nel diabete di tipo 1.Alcuni studi indicano che non vi siano differenze numeriche per tale sottopopolazione linfocitaria tra soggetti diabetici e normali. Nei diabetici però questi linfociti avrebbero minore capacità di inibire la proliferazione T-cellulare in vitro. Inoltre è stato riportato che nei pazienti diabetici all'esordio ,questi linfociti regolatori, (che esprimono il marker CD25 ad alti livelli) coesprimono alti livelli di CD69 (133) e del marker intracellulare CTLA4 (133,135). Queste cellule inoltre hanno dimostrato una maggiore propensione a produrre IFNγ (134,133). Questo nei diabetici di tipo 1 di recente insorgenza , come già descritto, è probabilmente indice di uno sbilanciamento e di un' inadeguata funzionalità della popolazione soppressoria.