Per valutare se l'effetto osservato sui PBMC fosse specifico verso la popolazione che differenzia in osteoclasti in coltura (effetto antiosteoclastogenico) abbiamo valutato il numero di precursori di osteoclasti in circolo nel sangue periferico prima e dopo terapia.I precursori osteoclastici circolanti a livello periferico sono stati individuati con tecnica citofluorimetrica eseguendo una citofluorimetria, su sangue intero, a tre colori con i seguenti anticorpi coniugati: VNR-FITC, CD14-PE (ficoeritrina), CD11b-APC ed i corrispondenti controlli isotipici. Il CD14 è un marker specifico che identifica i monociti, il CD11b identifica, oltre ai precursori degli osteoclasti, anche i granulociti e i precursori dei macrofagi, mentre il VNR corrisponde al recettore della vitronectina.Per questo tipo di analisi occorre circa 1 ml di sangue periferico.L'espressione degli antigeni di membrana è stata analizzata mediante il software CellQuest (Becton Dickinson & Co., Franklin Lakes, NJ, USA) e rappresentata in dot plots a due variabili o istogrammi. Ogni plot mostra il risultato ottenuto da 10.000 eventi tra le cellule selezionate per grandezza e granulosità (Fig. 16). La doppia positività per il CD14 ed il CD11b identifica il precursore osteoclastico ad uno stadio precoce di differenziazione mentre la positività per tutti e tre gli anticorpi (cellule triple positive) identifica il precursore osteoclastico altamente differenziato (13). I dati sono stati espressi come percentuale ed anche come intensità di fluorescenza.   