Nel settembre 1938, Fleming venne nominato per tutta la durata della Seconda Guerra Mondiale patologo di settore nel Middlesex, con quartier generale a Herafield. Durante il periodo del conflitto tornò ai suoi studi sulle ferite di guerra e rifletté sul possibile uso della penicillina. Il suo primo esperimento terapeutico avvenne nell'agosto 1942 in circostanze drammatiche, su un paziente suo amico affetto da meningite, che guarì in maniera miracolosa. Questo evento scosse la stampa, tanto che nel 27 agosto il Times pubblicò un editoriale intitolato Penicillium, sottolineando le speranze legate a questa prodigiosa sostanza. L'evento scosse anche la comunità scientifica, le case farmaceutiche e il governo britannico. Il 25 settembre 1942 Sir Cecil Weir convocò a Portland House per un'importante conferenza Fleming, Florey e tutti i rappresentanti delle industrie chimiche e farmaceutiche che potevano essere interessati alla produzione della penicillina, tra cui: May e Baker, Glaxo, Wellcome, British Drug Houses e Boots. Si decise che tutte le informazioni sulla sostanza e sulla sua produzione dovessero essere messe in comune, con l'unico fine di produrre penicillina in fretta e abbondantemente. Venne detto alla fine della conferenza da un suo partecipante, Arthur Mortimer: