Nel 1889, sia Shibasaburo Kitasato a Berlino sia Guido Tizzoni e Giuseppina Cattani a Bologna idearono una procedura che consentì di realizzare colture pure di un batterio con spore. Nel 1890 gli stessi Tizzoni e Cattani, contemporaneamente a Knut Faber in Danimarca, scoprirono la tossina proteica tetanica. Agli inizi degli anni venti del Novecento, Gaston Ramon, all'Istituto Pasteur di Garches, mescolando la tossina con formaldeide, ottenne un derivato non pericoloso ma in grado di attivare il sistema immunitario; questo fu il passo decisivo per l'utilizzo di un vaccino utilizzante il tossoide tetanico.