Lo sviluppo del clonaggio del DNA è da attribuirsi soprattutto alla scoperta e all'utilizzo delle nucleasi di restrizione di tipo II, enzimi che normalmente tagliano il DNA in tutti i punti che contengono una piccola e specifica sequenza di riconoscimento, lunga solitamente 4-8 nucleotidi.Le sequenze di riconoscimento per la maggioranza delle nucleasi di restrizione di tipo II sono normalmente palindrome: la sequenza di basi è identica su entrambi i filamenti, quando ciascuno di essi venga letto in direzione 5'→3' (es. GAATTC per EcoRI) (Fig. 34).