Il meccanismo con cui l'ALDH-2 catalizza la bioattivazione dei nitrati organici non è ancora stato chiarito. Sulla GTN un meccanismo analogo all'idrolisi degli esteri darebbe Cys302-SNO 2 come intermedio legato al sito attivo, che poi per idrolisi libererebbe nitrato (NO 3 -). Chen e colleghi, nel 2002, non hanno notato la presenza tra i prodotti di nitrato, bensì la formazione stechiometrica di 1,2-dinitroglicerina e nitrito (NO 2 -) (Chen et al., 2002). La formazione di 1,2-GDN è risultata essere proporzionale all'aumento della concentrazione di GTN tra 0.1 e 10 µM, mentre 1,3-GDN non raggiunge concentrazioni rilevabili.Lo step iniziale (Figura 11) è stato ipotizzato essere, come nelle altre reazioni catalizzate dall'ALDH-2 (Chen et al., 2006), l'attacco nucleofilo dell'anione tiolato di Cys302 a carico di uno dei tre azoti nitrossilici, prevalentemente uno terminale. Questo porterebbe alla formazione del tionitrato intermedio e al rilascio dell'alcol corrispondente (1,2-GDN).Figura 11. Lo step iniziale della reazione di ALDH con GTN (Mayer et al., 2008).Due meccanismi alternativi sono stati proposti per giustificare la formazione di anione nitrito (NO 2 -) dall'intermedio.Figura 12. La liberazione dell'anione nitrito dall'intermedio Cys302-SNO 2 (modificata da Chen et al., 2006).Nel primo caso (Figura 12a), l'attacco di un tiolo appartenente a uno dei residui di cisteina adiacenti (Cys301 o Cys303) porterebbe alla formazione di un ponte disolfuro nel sito attivo dell'enzima. Alternativamente (Figura 12b), l'attivazione di una molecola di acqua da parte del residuo Glu268 porterebbe all'idrolisi dell'intermedio a nitrito e all'acido sulfenico della Cys302, che a sua volta subirebbe una S-tiolazione da parte di una delle due cisteine adiacenti (Biswas et al., 2006).Entrambi questi pathway sarebbero compatibili con l'inattivazione ossidativa dell'ALDH-2 da parte della GTN, dimostrata in diversi modelli sperimentali. In passato era già stata evidenziata l'inibizione di diverse isoforme di ALDH da parte dei nitrati organici, ma le implicazioni di queste osservazioni con la farmacologia degli NO-donatori sono state intuite solo recentemente. Visto il ruolo dell'ALDH-2 nella bioattivazione dei nitrati, si è infatti ipotizzato che l'inattivazione dell'ALDH-2 indotta da GTN possa essere coinvolta nello sviluppo di tolleranza (Munzel et al., 2005); la comprensione del meccanismo di questa inibizione a livello molecolare diventa quindi un obiettivo di grande importanza.L'inattivazione ossidativa dell'enzima dopo un singolo turnover implica la presenza di un cofattore riducente per permettere la continua rigenerazione dell'enzima, dal momento che la sintesi ex novo dell'enzima rappresenterebbe un elevato costo metabolico per la cellula.È stato dimostrato che l'attività dell'enzima può essere parzialmente ristabilita da tioli esogeni quali il ditiotreitolo (DTT) e il 2-mercaptoetanolo (Chen et al., 2006) in grado di ridurre il tiolo ossidato del sito attivo. Recentemente è stato proposto anche l'acido diidrolipoico (Wenzel et al., 2007a) come agente riducente naturale ed ipotizzato un ruolo importante nella regolazione dell'enzima svolto dalle specie reattive dell'ossigeno e dell'azoto (rispettivamente: ROS e RNS). Questo concetto ha riportato in auge la teoria dei tioli di Needleman (Needleman et al., 1971), che molti anni fa ipotizzò l'interazione dei nitrati organici coi gruppi tiolici dei mitocondri e l'ipotesi del coinvolgimento della deplezione del pool tiolico nell'instaurarsi della tolleranza (Wang et al., 2005).Un aspetto poco chiaro nella caratterizzazione del meccanismo di bioattivazione della GTN mediata da ALDH-2 riguarda le modalità con cui la formazione di nitrito sia accoppiata all'attivazione della sGC (Gladwin et al., 2006). È noto che l'anione nitrito possa portare ad attività biologiche NO-mediate, ma le modalità con cui è convertito ad NO non sono ancora chiare. Vi sono diverse reazioni in grado di generare NO da nitrito che potrebbero essere biologicamente rilevanti in particolari condizioni di ipossia.La protonazione del nitrito ad acido nitroso potrebbe fornire NO tramite disproporzionamento di N 2 O 3 (Figura 13). Mentre il secondo step di rottura omolitica è veloce, la conversione di HNO 2 a N 2 O 3 è molto lenta anche a concentrazioni di nitrito elevate. Un'altra reazione possibile, catalizzata da alcune molecole quali l'ascorbato, è la riduzione diretta dell'anione nitrito a NO.HNO 2 N 2 O 3 O H 2 N 2 O 3 NO NO 2 + + Eq.1Eq.2Figura 13. Liberazione di NO dall'acido nitroso .È comunque più verosimile che i nitriti vengano attivati ad NO per via enzimatica (Mirvish et al., 1972). Un enzima proposto a questo scopo è la xantina ossidasi, ma, vista la localizzazione mitocondriale dell'ALDH-2, è maggiormente probabile che componenti della catena respiratoria mitocondriale possano esibire attività nitrito-reduttasica. Chen eStamler proposero che il nitrito derivante da GTN ed ALDH possa essere ridotto da aminoacidi dell'enzima stesso o subire disproporzionamento acido nello spazio intermembrana mitocondriale fornendo NO o S-nitrosotioli (Chen et al., 2006).Beretta e colleghi hanno recentemente proposto che l'ALDH-2 possa reagire con la GTN liberando alternativamente NO o NO 2 -, a seconda che la reazione, nel sito attivo, coinvolga 3 o 2 elettroni. Sono necessari ulteriori studi per verificare questa ipotesi e per determinare come le due reazioni siano regolate nelle diverse cellule (Beretta et al., 2008).Per spiegare la formazione di NO non si può escludere che esso venga liberato direttamente dall'intermedio tionitrato (E-S-NO 2 ); come mostrato nello schema (Figura 14), sono state proposte due ipotetiche vie (Beretta et al., 2008). La prima consiste in una rottura omolitica, tramite cui si libera NO e radicale sulfenile, il quale per reazione con un altro radicale sulfenile formerebbe un ponte disolfuro. Il secondo pathway proposto coinvolge l'intervento catalitico di ioni metallici nella reazione tra l'intermedio e una cisteina laterale con formazione del ponte disolfuro e liberazione di NO e OH -.Figura 14. Ipotetico meccanismo della liberazione di NO dall'intermedio Cys302-SNO 2 (modificata da Beretta et al., 2008).Servono ulteriori studi per comprendere meglio come l'interazione tra la GTN e l'ALDH-2 porti all'attivazione della sGC. Occorre migliorare le tecniche di rilevazione dell'ossido d'azoto perché va chiarito se non sia liberato per nulla, o se invece sia prodotto in concentrazioni non rilevabili, in quanto ad oggi i dati raccolti su enzima isolato, su cellule e in vivo danno risultati contrastanti.