Tornato a Rochester dopo la laurea, Charlie iniziò ad assistere il padre ed il fratello nel loro lavoro, ma presto loro si resero conto che il giovane dottore aveva sviluppato eccellenti capacità chirurgiche, che presto avrebbero raggiunto quelle del dr. Mayo e di Will. Si interessò della chirurgia degli occhi, ma sfortunatamente poco dopo aver iniziato le sue attività professionali, contrasse la pertosse, che lo costrinse ad un periodo di inattività. Il dr. Charles Mayo utilizzò questo tempo per recarsi in Europa partendo nel gennaio 1889. Joseph Lister era in quegli stessi anni a Londra, ma Charlie non riuscì ad incontrarlo. Conobbe Louis Pasteur a Parigi. Negli ospedali del continente Charlie fece esperienza della pratica antisettica. Migliorato nella salute, il giovane tornò a casa e mise in pratica ciò che aveva appreso.