La fNIRS permette di quantificare concentrazioni di cromofori a seguito di fenomeni di assorbimento e scattering relativi a luce diffusa nello spettro elettromagnetico del vicino infrarosso (lunghezza d'onda compresa fra 700 nm e 1 mm). In questo caso, i cromofori di interesse sono rappresentati dagli apporti di emoglobina ossigenata e deossigenata a livello delle zone più superficiali della corteccia cerebrale. Infatti, il coefficiente di assorbimento dell'acqua (il principale costituente dei tessuti biologici) all'interno di questa banda spettrale risulta trascurabile rispetto a quelli relativi all'emoglobina. Perciò, misurando nel tempo differenze nello spettro di assorbimento risulta possibile attribuire quasi interamente variazioni misurate di intensità luminosa alle rispettive variazioni di concentrazione di emoglobina. Convenzionalmente vengono utilizzate almeno due differenti lunghezze d'onda, una al di sopra e una al di sotto del punto isosbestico fra emoglobina ossigenata e deossigenata all'interno della banda spettrale del vicino infrarosso; è tuttavia possibile, sia in linea teorica che sperimentale, impiegare più lunghezze d'onda al fine di ottenere una migliore discriminazione delle concentrazioni così misurate o, allo stesso modo, indagare l'andamento di ulteriori cromofori.