attivazione di neutrofili, monociti e linfociti sono elevate sia nei fluidi derivanti dal BAL sia a livello dei campioni bioptici dei pazienti con IPF. Queste citochine comprendono la Proteina Infiammatoria Macrofagica-1α (MIP-1α/CCL3) [103] , la Proteina Chemotattica per i Monociti (MCP-1/CCL2) e l'Interleuchina IL-8 [113] .In particolare, le citochine correlate ai linfociti Th2 come IL-4, IL-5 e IL-13 sono significativamente incrementate nelle culture cellulari dei pazienti con IPF rispetto a quelle di volontari sani [114] . I linfociti T dei pazienti con IPF, inoltre, si comportano spesso in modo differente rispetto ai casi di controllo: un esempio è l'azione dell'interleuchina IL-10, la quale provoca una riduzione della proliferazione dei linfociti T nel gruppo controllo (fumatori e non fumatori), mentre non ha la stessa funzione nei pazienti con IPF. Oltre alla differenza qualitativa e quantitativa di queste citochine, nei pazienti con IPF è stata riscontrata anche una differenza di espressione dei recettori per le stesse: per esempio, i recettori per IL-13 sono maggiormente elevati nei campioni bioptici dei pazienti con UIP rispetto ai controlli dei pazienti con NSIP [115] . Inoltre, vi è anche una differente disposizione dei recettori stessi: a livello dei foci fibroblastici è stata dimostrata la presenza di elevati livelli dei recettori IL-4Rα (riscontrato anche nelle biopsie dei pazienti con NSIP ma non in altre categorie) e IL-13Rα2 [115] .Interleuchina-13: si tratta di una citochina prodotta dai linfociti Th2, i quali sono caratteristicamente predominanti nella IPF rispetto ai Th1 [56,116] . L'IL-13 è una citochina fortemente pro-fibrotica: è stato dimostrato che i topi privati dell'IL-13 sono protetti dalla formazione di fibrosi indotta chimicamente [56,116] attraverso una via indipendente dal TGF-, mentre la sua overespressione è in grado da sola di indurre lo sviluppo di una fibrosi sub epiteliale [117] . Gli studi di Fichtner-Feigl et al. [118] hanno dimostrato che questa citochina è in grado di indurre la produzione di collagene da parte dei fibroblasti attraverso il legame con il suo recettore di membrana e la conseguente produzione di TGF-. Gli studi in vitro hanno permesso di dimostrare che IL-13 è coinvolta nella proliferazione dei fibroblasti, nella sintesi di matrice extracellulare e nella differenziazioni dei fibroblasti in miofibroblasti, per via TGF- dipendente e indipendente [116,119,120] . Inoltre, IL-13 sembra indurre l'apoptosi nelle cellule epiteliali [121] .Questi dati hanno suggerito che una target therapy diretta verso l'IL13 o il suo recettore potrebbe essere efficace nel ridurre il processo fibrotico: uno studio sui topi ha dimostrato che la formazione di una proteina di funzione tra l'interluchina-13 e l'esotossina dello Pseudomonas sembra essere efficace nei modelli di fibrosi polmonare bleomicina-indotti [56,116,122] . Questo aspetto è particolarmente importante perché diverse case farmaceutiche hanno prodotto anticorpi monoclonali diretti contro l'IL-13 che sono studiati proprio per la terapia della IPF [116] . I fattori della coagulazione: una delle principali vie che viene attivata in questo processo patologico è quella della cascata coagulativa: in un processo di riparazione tissutale, questa attivazione provoca la deposizione di fibrina necessaria per il mantenimento dell'emostasi e provvede alla deposizione di matrice extracellulare provvisoria, in modo da mantenere la struttura e l'integrità tissutale durante la riparazione del danno, in modo che le cellule infiammatorie e i fibroblasti possano migrare [116,123] .La cascata coagulativa prevede una complessa interazione tra le diverse molecole coinvolte in modo da mantenere un equilibrio tra la deposizione e il rimaneggiamento del coagulo. Nella IPF vi è un'attivazione della cascata coagulativa con deposizione di fibrina a livello degli spazi alveolari e l'attivazione del fattore tissutale (TF) localizzato a livello dell'epitelio alveolare [124] . A dimostrazione di ciò, sono stati riscontrati elevati livelli di trombina e fattore Xa a livello del BAL dei pazienti con IPF [125] : recentemente è stato dimostrato che proprio il fattore Xa può essere localmente prodotto dall'epitelio alveolare ed è in grado di indurre la differenziazione da fibroblasti a miofibroblasti attraverso l'interazione con il recettore della proteinasi attivata (PAR1) e attraverso un azione mediata dal TGF- [126] .Oltre al fattore Xa, grazie a diversi modelli animali, è stato possibile dimostrare che sono molti i fattori della coagulazione che possono indurre la fibrosi, in seguito alla loro over-espressione o inibizione, in particolare gli attivatori del plasminogeno e l'inibitore dell'attivatore del plasminogeno (PAI-1) [116] .La famiglia dei recettori PAR comprende 4 recettori trans membrana associati a proteina G, ognuno dei quali può essere attivato da differenti membri della cascata coagulativa. Il PAR-1, oltre ad essere attivato dal fattore Xa, può attivarsi anche in seguito al legame con la trombina, inducendo, oltre alla già citata differenziazione dei miofibroblasti, la produzione di citochine pro-infiammatorie (IL-1b, IL-6, MCP-1, and TNF-), l'attivazione del TGF-, la produzione di matrice extracellulare e l'apoptosi delle cellule epiteliali alveolari [127,128] . A supportare il ruolo del PAR-1 nella deposizione di fibrosi, vi è l'evidenza sperimentale che i topi knockout per il PAR-1 sono protetti dalla fibrosi indotta da bleomicina [129] .Allo stesso modo, Wygrecka et al. [130] hanno dimostrato che anche PAR-2, attivato dal fattore VII, è in grado di stimolare la produzione di ECM da parte dei fibroblasti, con un effetto a sua volta potenziato dalla presenza del TF.Il ruolo fondamentale della coagulazione nella IPF è stato inoltre confermato da uno studio giapponese [131] , il quale ha dimostrato che la somministrazione di anticoagulanti (Warfarin o Eparina a basso peso molecolare) nei pazienti ospedalizzati a causa dell'IPF conferiva un beneficio in termini di sopravvivenza rispetto alle terapie standard per l'IPF: la bassa numerosità campionaria dello studio e i criteri di arruolamento in questo programma non sono stati tali da consentire un applicabilità di questa terapia a tutti i pazienti con IPF [8] . In ogni caso, da questo studio è nato un certo interesse nei confronti di una possibile terapia dell'IPF basata anche sul blocco della cascata coagulativa, tanto che successivamente sono partiti diversi studi in merito: in particolare, oggi si cerca soprattutto di agire su fattori specifici, quali inibitori del fattore Xa della coagulazione, o inibitori competitivi del PARs.Fattori di proliferazione tissutale: nel corso degli anni sono stati studiati diversi mediatori in grado di promuovere la proliferazione tissutale e la deposizione di collagene nella fibrosi polmonare idiopatica in risposta ad un insulto patologico: i diversi lavori che si sono susseguiti negli anni hanno avuto come obiettivo in primis quello di tentare di delineare la patogenesi di questa malattia, che sotto molti aspetti ancora rimane indefinita, dall'altro lato vi è la speranza di trovare un mediatore sul quale sia possibile agire efficacemente attraverso una target therapy. La maggior parte degli studi sono stati condotti su modelli murini, valutando le molecole e le cellule implicate nella formazione di fibrosi in seguito all'esposizione ad agenti tossici lesivi del parenchima (bleomicina, silice, asbesto). Tra le molecole che sono state maggiormente oggetto di studio per molti Autori ritroviamo il Platelet-Derived Growth Factor (PGDF), il Macrophage Colony-Stimulating Factor (M-CSF), l'Endotelina, il Transforming Growth Factor (TGF-), il Connettive Tissue Growth Factor (CTGF), Tumor Necrosis Factors (TNF-),e diverse interleuchine, tra cui IL1, IL6, IL10, IL13, citate precedentemente [116] . PDGF: il fattore di crescita delle piastrine è un potente mitogeno e chemotattico per le cellule mesenchimali, inclusi miofibroblasti [132] , ed è in grado di stimolare la produzione dei componenti della ECM come fibronectina e collagene I. Nel polmone, la sua espressione è fortemente aumentata a livello dei macrofagi alveolari [133] e dei fibroblasti, che sono in grado di produrlo e rilasciarlo, creando un feedback autocrino con proliferazione e deposizione di matrice. Il PDGF esplica le sue funzioni legandosi ad un recettore di membrana accoppiato a tirosin-chinasi, il quale può essere inibito da farmaci antagonisti recettoriali quali l'Imatinib (anticorpo monoclonale anti tirosin/chinasi), con conseguente azione anti-fibrotica. Inoltre, è stato dimostrato che l'Imatinib è in grado di inibire la via indotta dal TGF- (indipendentemente dall'attivazione del recettore del PDGF), con conseguente blocco di tutte le sue funzioni (induzione dell'espressione genica, proliferazione cellulare e differenziazione) [134] . Nei modelli sperimentali, l'Imatinib è in grado di ridurre la deposizione di collagene indotta da bleomicina [134,135] e di ridurre la proliferazione cellulare [135] . Per questi motivi, si presuppone che l'Imatinib possa rappresentare un approccio terapeutico efficace bloccando gli eventi profibrotici indotti sia dal PDGF che dal TGF- [56] .M-CSF: si tratta del fattore di crescita della popolazione macrofagica. Il M-CSF a livello della matrice è in grado di indurre il reclutamento e l'attivazione dei monociti [136] , con conseguente produzione da parte dei macrofagi di citochine pro-infiammatorie citate precedentemente, e di mediatori della fibrosi quali CCL2 (in grado di reclutare fibrociti nell'uomo) e CCL12 (in grado di indurre l'attivazione dei fibroblasti nel topo) [100] .L'importanza di questo fattore nella IPF è data dal fatto che diversi studi hanno dimostrato che questo fattore di crescita, in condizioni patologiche quali la IPF, è in grado non solo di legarsi ai monociti-macrofagi, bensì anche ad altre linee cellulari, in particolare alle cellule muscolari lisce, inducendone la proliferazione, ed ai neutrofili, inducendone la chemiotassi e l'attivazione [100] . Questa osservazione ha suggerito la possibilità che i monociti siano in grado di differenziare con un fenomeno di plasticità verso altre linee cellulari implicate, nel caso specifico, nella riparazione tissutale. Questo processo potrebbe inoltre essere esteso ad altre cellule mesenchimali, in quanto è stata riscontrata la presenza di recettori tipici dei macrofagi (CD14, M-CSF-R, CCR2) sulla superficie di altre cellule. L'attività di M-CSF è mediata dal legame con il suo recettore espresso sulla superficie cellulare, che provoca l'attivazione intracellulare di una via di segnale che prevede la produzione di radicali liberi dell'ossigeno (ROS) e di altri radicali liberi [137] : la somministrazione di sostanze antiossidanti in particolare il NAC riduce l'attività dell'M-CSF, suggerendo la possibilità che una terapia antiossidante possa inibire queste cellule.Per contro, è stato osservato che l'espressione e l'attivazione dei recettori di fattori di crescita quali PDGF, IGF1, M-CSF aumenta in modo importante in presenza di desametasone in colture cellulari [100,138] suggerendo che parte delle cellule attivate da questi stessi fattori possano essere resistenti alla terapia corticosteroidea.Endotelina-1: si tratta di un peptide vasocostrittore implicato nei processi di fibrosi e del parenchima [139,140] ; l'aumento della produzione di Endotelina-1 (ET-1) da parte dei fibroblasti è strettamente correlata ai processi fibrotici, non solo tipici della patogenesi della IPF ma anche di altre patologie quali la sclerosi sistemica progressiva [141,142] . È stato recentemente dimostrato che l'ET-1 agisce come un mediatore del TGF-, in grado di stimolarne la produzione in fibroblasti polmonari sia di pazienti sani che nei pazienti affetti da SSC, attraverso una via indipendente da Smad. L'ET-1 è a sua volta in grado di legarsi a due recettori espressi sulla membrana cellulare ET A e ET B [143] e promuove la produzione di ECM [144] .TGF-: Il TGF- è una citochina multifunzionale che è strettamente correlata, nell'uomo e negli animali, alla deposizione di collagene e tessuto fibrotico, e, nello specifico, è implicato nella genesi della fibrosi polmonare [100] . Esistono 3 isoforme del TGF-: TGF-β 1 , TGF-β 2 , e TGF-β 3 : il TGF-β 1 appare particolarmente elevato nella IPF ed esercita una serie di effetti profibrotici che coinvolgono moltissime cellule: stimola la chemiotassi dei monociti, la proliferazione e differenziazione dei fibroblasti in miofibroblasti, nonché la protezione di questi ultimi dall'apoptosi, promuove la produzione di matrice extracellulare, stimola la produzione di citochine (IL-1, TNF-, PDGF, and TGF-) riduce l'attività delle metalloproteinasi ed aumenta l'attività dell'inibitore tissutale delle metallo proteinasi (TIMP), stimola la produzione macrofagica di altre citochine, inibisce l'attivazione dell'inibitore del plasminogeno [100,116] . La modalità con cui il TGF- è implicato in queste diverse attività dipende dal meccanismo post recettoriale che si attiva, in quanto il legame del TGF- con il suo recettore provoca l'attivazione di diversi segnali intracellulari [145,146] .Il TGF- è prodotto in forma inattiva, legato al latency-associated peptide (LAP), una regione idrofobica N-terminale che deve essere clivata affinché la molecola sia attiva [116,147] . L'attivazione della molecola può avvenire per via diretta attraverso l'interazione del LAP con i macrofagi [100] o con la trombospondina-1 [116,147,148] oppure per via indiretta, tramite la produzione di ossidanti o proteasi che allo stesso modo provocano l'attivazione della molecola. Un meccanismo in particolare che provoca l'attivazione del TGF- è l'interazione dello stesso con l'integrina ανβ6 espressa dalle cellule epiteliali, la quale sembra essere iperespressa nella fibrosi polmonare [149] . Una volta attivato, il TGF-β si lega ai suoi recettori situati sulla parete cellulare: sono riconosciuti 2 diversi recettori del TGF-β, il tipo I (TbRI), e il tipo II (TbRII). Entrambi sono presenti a livello della parete cellulare e sono recettori serina/treonina chinasi, ma differiscono per un dominio Gly/Ser conservano nel TbRI. In assenza di legame, TbRI e TbRII sono presenti come omodimeri a livello della parete cellulare: il legame con il TGF-β induce l'assemblaggio di questi due recettori, rendendo possibile la fosforilazione e l'attivazione del TbRI da parte del TbRII e quindi la cascata del segnale intracellulare [147] .In seguito all'attivazione del TbRI il segnale arriva fino al nucleo attraverso le molecole della Smad family (R-Smad, Smad1, 2, 3, 5 e 8) in grado di traslocare nel nucleo e provocare la trascrizione genica. Infine, alcune molecole inibitorie della stessa famiglia Smad 6 e Smad 7, vanno ad inibire R-Smad concludendo il segnale con feedback negativo [147] .Inoltre il legame del TGF-β con il suo recettore può provocare l'attivazione di altre vie intracellulari, incluse MAPK e Pi3k, che trasmettono il segnale intracellulare indotto dal TGF-β [116,146] .Figura 7: vie di trasmissione intracellulari del TGF-β [133] Signaling Schemes for TGF-β Roberts A.B. and Derynck R. [133]  Nella patogenesi della fibrosi polmonare idiopatica è stato a lungo studiato il ruolo del TGF-β sia su modelli animali, sia su colture cellulari. Diversi studi hanno dimostrato che il TGF-β gioca un ruolo fondamentale nella patogenesi e nel mantenimento della IPF: nei roditori, l'eccessiva espressione della forma attiva del TGF-β provoca una fibrosi severa con modesta infiltrazione infiammatoria [116,150] , che si caratterizza per la presenza di aumentata matrice extracellulare e miofibroblasti. Inoltre, è stato dimostrato che nel criceto la somministrazione di recettori solubili del TGF-β attenua la comparsa della fibrosi indotta da bleomicina [116,151] , mentre colture cellulari di cellule dell'epitelio respiratorio di topo con induzione di iperespressione del TGF-β presentano, dopo 14 giorni, lo sviluppo di lesioni molto simili a foci fibroblastici [116,152] . Questo importante ruolo nella fibrosi polmonare idiopatica è stata dimostrata anche nell'uomo, dove diversi studi hanno dimostrato un aumento dell'espressione del TGF-β nelle cellule epiteliali e nei fibroblasti dei pazienti con IPF, e, inoltre, è stata riscontrata una maggiore espressione del TGF-β nei macrofagi presenti nel lavaggio bronco-alveolare dei pazienti affetti dalla malattia [116] .D'altro canto però, è stato evidenziato che il TGF-β non agisce da solo, ma in cooperativa con un altro fattore, il CTGF: è stato infatti dimostrato che pur in presenza di alti livelli di TGF-β, la somministrazione di anticorpi anti-CTGF riduce la produzione e la deposizione di collagene, dimostrando che il CTGF agisce come mediatore degli effetti biologici del TGF-β [153,154] .CTGF: il CTGF (Connettive Tissue Grown Factor) è una proteina di 38 kDa, ricca in cisteina, appartenente alla famiglia delle CCN (acronimo di CYR61/CCN1, CTGF/ CCN2, Nov/CCN3). I membri della famiglia CCN sono proteine della matrice extracellulare. Il gene del CTGF consiste di 5 esoni, il primo codifica per un peptide segnale, gli altri quattro sono: il dominio per il legame con l'Insulin-like Growth Factor (IGF), il dominio per il fattore di von Willebrand tipo C (vWC), il dominio per la Trombospondina-1 (TSP-1) e il dominio C-terminale [155,156] .Figura 8: struttura del gene del CTGF [142] Il CTGF è implicato in diverse funzioni cellulari tra cui proliferazione, migrazione, adesione, ma anche sopravvivenza e differenziazione: in particolare, il CTGF è un potente induttore della proliferazione e della differenziazione dei fibroblasti, della chemiotassi e della deposizione della matrice extracellulare [116,155,157] . Inoltre è implicato diversi processi biologici tessutali quali angiogenesi, condrogenesi, osteogenesi, fibrosi e carcinogenesi [155] .Il CTGF è prodotto dalle cellule epiteliali, endoteliali, mesenchimali e dai fibroblasti, in particolare sotto lo stimolo del TGF- che ne è il più potente induttore [116,158] . Il meccanismo con cui il TGF- va a stimolare la produzione del CTGF coinvolge la via funzionale che passa per Smad3, interagendo con il CTGF promoter nel DNA [147] : questo meccanismo è stato dimostrato in topi knockout per Smad3, i quali diventavano resistenti alla deposizione di fibrosi indotta da TGF-, correlata alla mancanza di espressione del CTGF [116,159] . Inoltre, sempre in modelli murini, l'aumento dell'espressione del CTGF indotta da adenovirus induce a 14 giorni un aumento della deposizione di fibrosi e della differenziazione dei fibroblasti in miofibroblasti [116,160,161] , che però dopo 28 giorni si risolve, suggerendo che il CTGF è in grado da solo di indurre ma non di mantenere la produzione di fibrosi nel polmone. Similarmente, sempre nei topi, è stato dimostrato che la somministrazione contemporanea di TGF- e CTGF accentua la fibrosi indotta da bleomicina rispetto alla somministrazione di uno solo dei due fattori, dimostrando cosi la sinergia tra i due fattori [116] . Sempre la somministrazione di anti-CTGF inibisce nel topo la fibrosi polmonare indotta da bleomicina [116,162] .La correlazione tra questi due fattori è stata studiata anche nell'uomo, originariamente a livello dei fibroblasti della cute, dove è stata dimostrata la diretta stimolazione del CTGF da parte del TGF-, ed in vivo durante i processi di riparazione tissutale, sottolineando la presenza di un processo coordinato tra l'up-regolazione del TGF- e l'espressione del CTGF [116] .La regolazione dell'espressione del gene del CTGF è diversa da altri geni regolati direttamente da fattori di crescita, essenzialmente per due motivi: in primo luogo il gene del CTGF è fortemente indotto dal TGF- più che da qualunque altro fattore di crescita, compresi EGF, FGF, PDGF ed insulina, questo sostanzialmente per la diversa via di traduzione del segnale sottostante, associato a serina/treonina chinasi nel caso del TGF-, mentre associata a tirosin chinasi negli altri casi. In secondo luogo la cinetica del CTGF è unica se comparata ad altri fattori di crescita: questo perché altri fattori di crescita quali cmyc o Cyr61 sono transitoriamente espressi dopo stimolazione per un periodo di circa 0.5-6 ore, mentre il CTGF dopo la stimolazione da parte del TGF- può rimanere espresso per 24-36 ore, e la sua induzione non è bloccata da molecole inibitrici [158] .La relazione tra CTGF e TGF- esiste anche in senso opposto: è infatti stato dimostrato che il CTGF è in grado di legarsi al TGF-1 ed aumentare il segnale recettoriale da esso indotto [116] .Come già accennato, il CTGF funziona come una proteina della matrice extracellulare, che può servire sia come substrato di adesione per le cellule, sia come un legame molecolare tra altre proteine dell'ECM. Ad oggi, però, non è stato dimostrata la presenza di un recettore specifico per il CTGF, mentre diversi studi hanno dimostrato che l'interazione dello stesso con alcune integrine è in grado di dare origine ad una via funzionale di segnale: alcune attività biologiche del CTGF, infatti, risiedono proprio nel legame con integrine specifiche espresse sulla superficie di cellule target; questa interazione provoca l'attivazione di un segnale intracellulare che in ultimo regola la trascrizione dei geni e alcune funzioni cellulari. Considerando la particolare struttura del gene del CTGF, diversi studi hanno dimostrato che differenti integrine sulla superficie di una stessa cellula possono legare zone diverse del CTGF attivando così vie intracellulari differenti e indipendenti tra di loro: ad esempio, alcuni studi hanno dimostrato che il CTGF è in grado di interagire contemporaneamente con l'integrina αvβ3 sulle cellule endoteliali e con l'integrina α6β1 sui fibroblasti [155] .Un altro elemento che sembra funzionare da recettore per il CTGF è la Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein (LRP), identificata come tale nelle cellule del midollo osseo, nelle cellule intercalari epatiche e nei fibroblasti, sebbene non sia ad oggi riconosciuta una risposta cellulare indotta dal legame tra CTGF e LRP. Studi su questa via del segnale sono stati eseguiti su linee cellulari di fibroblasti renali, dove è stato evidenziato che il CTGF induce fosforilazione del dominio intracellulare del LRP, ma non è in grado, se non in presenza di TGF-, di indurre differenziazione in miofibroblasti. È stato quindi ipotizzato che questo meccanismo potesse semplicemente essere la via di internalizzazione e degradazione del CTGF [155] .Il ruolo del CTGF nelle fibrosi polmonari e in particolare nell'IPF è stato valutato estensivamente: diversi studi hanno mostrato un aumento dell'espressione di questo fattore di crescita a livello degli pneumociti di tipo II attivati e a livello dei fibroblasti interstiziali, sia con tecniche di immunoistochimica (IHC) sia con studi di proteomica [163][164][165][166] . Inoltre, sono state riscontrate alte concentrazioni di CTGF sia a livello del BAL sia nel siero dei pazienti affetti da IPF [116,164] .Buona parte degli studi sottolinea l'interesse nei confronti del CTGF per la possibilità di creare una target therapy proprio nei confronti di questo fattore di crescita: il CTGF funziona come un mediatore secondario del TGF- per quanto riguarda la stimolazione della proliferazione cellulare e la deposizione di matrice extracellulare, ma, in confronto ad esso, non agisce su altri processi cellulari quali modulazione della risposta infiammatoria e immune. Queste caratteristiche rendono maggiormente interessante il CTGF come possibile target terapeutico per bloccare i processi fibrotici in cui il TGF- agisce come iniziatore, in quanto si andrebbe a colpire un target più specifico, cioè più a valle della via di segnale, creando presumibilmente meno effetti collaterali [158,163] . In letteratura si riscontrano lavori sperimentali sull'utilizzo di anticorpi anti-CTGF: in particolare, si è da poco concluso un studio di fase I (NCT00074698) sull'anticorpo monoclonale anti-CTGF (FG-3019 FibroGen, San Francisco, CA, USA) ed è in fase di inizio uno studio di fase IIa negli Stati Uniti (NCT01262001) [116,163] .