In particolare la neostigmina agisce a livello del sito attivo dell'AChE dove l'idrolisi del carbammato va a transesterificare un residuo di serina della tasca catalitica. Si ottiene così l'enzima carbammoilato dal quale la rigenerazione della forma attiva è molto più lenta (nell'ordine di grandezza dei minuti) rispetto al ritorno alla forma attiva in seguito ad acetilazione (meccanismo fisiologico che avviene in seguito all'idrolisi del legame estereo dell'acetilcolina), che richiede meno di un millisecondo.