Il dr. Mayo si era sempre mostrato interessato alla chirurgia, ma fino ad ora non aveva fatto nessun intervento degno di nota. La chirurgia a quel tempo si limitava principalmente alle amputazioni e alla parte esterna del corpo. Con l'introduzione di nuovi macchinari la chirurgia si sviluppò molto rapidamente, soprattutto in ambito ginecologico. Molte donne ad esempio erano costrette a letto a causa dello spostamento dell'utero, che il medico cercava di riposizionare spingendo l'organo nella sua posizione originaria e mantenendolo fermo con garze o inserendo un supporto meccanico chiamato Pessario all'interno della cavità vaginale. Tale pratica raramente si dimostrava efficace e risolutiva e il numero delle donne malate aumentava sempre più. Il dr. Mayo capì che avrebbe potuto far molto meglio il suo lavoro se avesse saputo come, per questo si recò a New York nel 1869 per studiare chirurgia generale e ginecologia. Qui vide i fratelli Atlee eseguire un'ovariectomia. La prima rimozione di un tumore ovarico fu eseguita da Ephraim McDowell, ma non fu più praticata a causa dell'alto indice di mortalità. I fratelli Atlee ripresero questa procedura migliorandola portando la mortalità al 30%. Nonostante i loro successi molti medici consideravano ancora tale procedura una follia. Nonostante il dr. Mayo avesse appreso come effettuare un'ovariectomia fu restio ad eseguirla fino al 1871. Nel 1872 fu eletto terzo presidente della State Medical Society e molti gli suggerirono di lasciare Rochester per sviluppare meglio le sue capacità chirurgiche, ma ad eccezione di un breve soggiorno a San Paolo, il dottore non lasciò più la città. Iniziò ad essere sempre più occupato e sebbene inizialmente tutti gli interventi consistevano in amputazioni, col tempo si diffuse il principio di James Syme di Edimburgo secondo cui era meglio un arto non funzionante piuttosto che uno mancante. Il dr Mayo adottò questo principio e cercò col tempo di rimuovere solo la parte malata o morta e non l'intero arto. Tale pratica lo costrinse in dibattiti con i collegi riguardo alla necessità o meno dell'amputazione su un paziente. La sua era una chirurgia casalinga, con tutte le implicazioni che indica tale termine. La sala operatoria, allora definita teatro, era generalmente la casa del paziente, il tavolo operatorio un semplice tavolo da cucina o travi poggiate su due cavalletti o un divano e gli strumenti utilizzati non erano sterili sebbene puliti. Come molti medici il dr. Mayo si aspettava infezioni a seguito di un'operazione e si congratulava con sé stesso quando la ferita guariva quasi completamente senza complicazioni. Ben presto divenne noto per le sue abilità chirurgiche. Sviluppo un interesse particolare per il giovane Henry Wellcome, a cui diede lezioni di chimica. Oggi la Burroughs e Wellcome è una delle più famose industrie farmaceutiche.