Le analisi al citofluorimetro tramite FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson & Co., Franklin Lakes, NJ, USA) hanno consentito di identificare all'interno della popolazione delle PBMC specifiche sottopolazioni cellulari e precisamente:-sono stati valutati i precursori degli OC sui 500 µl di sangue periferico, prima della procedura di estrazione delle PBMC. I campioni di sangue sono stati marcati con i seguenti anticorpi monoclonali: anti VNR coniugato con fluoresceina (FITC),  anti CD14 coniugato con ficoeritrina (PE) anti CD11b coniugato con alloficocianina (APC) o corrispondenti isotipi di controllo.Il CD14 è un marker specifico dei monociti, il CD11b identifica i precursori degli OC, dei macrofagi e dei granulociti, mentre il VNR corrisponde al recettore della vitronectina espresso dagli OC maturi. Le cellule triple-positive (CD14+/CD11b+/VNR+), rappresentano la popolazione di precursori degli OC altamente differenziati mentre la positività per il CD14 ed il CD11b identifica uno stadio più precoce di differenziazione (17; 18). Per rimuovere i globuli rossi è stata utilizzata una soluzione lisante, le cellule sono poi state centrifugate ed il pellet ottenuto è stato sospeso in tampone di fosfati (PBS). Le cellule sono state incubate con gli anticorpi fluorescenti o con i corrispondenti isotipi di controllo per 30 minuti a temperatura ambiente. Per analizzare l'espressione degli antigeni di membrana è stato usato il software Cell Quest (Becton Dickinson eCo) e la visualizzazione dei dati è stata ottenuta mediante dot plot bivariati o istogrammi. Ciascun plot mostra i risultati sulla base di 10000 eventi, che rappresentano le cellule vitali selezionate in base a dimensione e granularità.  -È stata identificata la percentuale dei linfociti T regolatori (CD3+/CD4+/CD25 bright +/FoxP3+) all'interno della popolazione dei linfociti CD4+. Il fattore di trascrizione Foxp3, fortemente espresso dalle T reg, si localizza nel nucleo dove agisce come repressore della trascrizione di geni implicati nella produzione di citochine da parte dei linfociti T (57).  -Per valutare la produzione di TNF da parte dei linfociti T (CD3+) e dei monociti (CD14+) le PBMC sono state marcate con anticorpo fluorescente anti TNF in accordo con la letteratura.Le colture di PBMC sono state stimolate con il mitogeno fitoemoagglutinina (PHA) che stimola la proliferazione dei linfociti T e la produzione di TNF da parte dei T ma non dei monociti (35).Nella colorazione intracitoplasmatica per il TNF sono state utilizzate una soluzione fissante ed una permabilizzante con saponina ed isoniazide; le PBMC sono state incubate per 30 minuti a 4°C con gli anticorpi anti CD3 (Per CP) e anti CD14, o corrispondenti isotipi di controllo, per evidenziare la frazione dei linfociti T e dei monociti. E' stato infine aggiunto l'anticorpo anti TNF e sono state eseguite le analisi al FACSCalibur flow cytometer.