Nel 1901 svolge, per quindici mesi, l'attività di medico condotto in Valtellina, per trasferirsi poi all'Ospedale Psichiatrico di San Lazzaro a Reggio Emilia, inizialmente in qualità di medico praticante, in seguito di assistente. È probabilmente in questo istituto che Besta matura la vocazione di neurologo: le sue prime ricerche si basano sugli studi dell'istologia del tessuto nervoso, della fisiopatologia e della clinica dell'epilessia. Risale a questo periodo una serie di pubblicazioni di carattere sperimentale ed istopatologico apparse sulla Rivista Sperimentale di Freniatria. È membro, nel 1907, della "Società Italiana di Neurologia". Nel gennaio dello stesso anno si trasferisce a Venezia all'Ospedale psichiatrico di San Servolo, con l'incarico di dirigere e organizzare il reparto “Osservazione”. Nel giugno 1907, dopo solo sei mesi di primariato a San Servolo, si trasferisce a Padova presso l'Istituto Psichiatrico e Neuropatologico e ottiene, nel maggio dell'anno successivo, la libera docenza in Clinica delle malattie nervose e mentali presso l'Università di Padova. Qui Besta si dà a studi anatomici e sperimentali che, consegnati alle stampe nel novembre del 1912, vengono pubblicati all'interno dell’"Archiv für Psychiatrie und Nervenkrankheiten" di Berlino l'anno successivo. Le pubblicazioni gli permettono di ottenere una certa notorietà: viene nominato, nel 1913, titolare della Clinica delle malattie nervose e mentali dell'Università di Messina. Sposa a Monza, il 25 gennaio 1915, Maria Meroni, ventisettenne originaria della Valtellina.