La differenziazione neuroendocrina nell'adenocarcinoma prostatico è un fenomeno ad oggi molto esplorato ma che presenta alcuni aspetti oscuri sia per quanto riguarda la sua insorgenza sia per quanto riguarda le implicazioni cliniche che presenta.In estrema sintesi gli aspetti principali che la riguardano sono:-cellule neuroendocrine sono presenti nelle ghiandole prostatiche normali e sono attive nel regolare la proliferazione delle cellule epiteliali e le funzioni fisiologiche dell'organo;-la presenza di fenotipo neuroendocrino nel carcinoma prostatico si manifesta in una eterogenea gamma di aspetti, in uno spettro che varia dalla focale espressione di marcatori neuroendocrini in un adenocarcinoma altrimenti di tipo convenzionale sino alla presenza di neoplasie neuroendocrine pure, sia ben differenziate sia di alto grado;-la presenza di tale fenotipo può essere riscontrata al momento della diagnosi in un paziente che non ha subito nessuna forma di trattamento precedente, ma è maggiormente frequente in soggetti sottoposti a terapia ormonale sia neoadiuvante sia adiuvante;-la presenza di fenotipo neuroendocrino è associata all'insorgenza di carcinoma prostatico resistente alla terapia antiandrogenica.Da questi punti nasce l'interesse sia patogenetico sia clinico su questo fenomeno che è nella sua totalità molto frequente in questo ambito di patologia.Ragionando in termini patogenetici le evidenze ad oggi disponibili dimostrano che alcune alterazioni molecolari si associano, se non direttamente causano, questo fenomeno. Da un punto di vista puramente genetico infatti, come ampiamente discusso nella introduzione del presente lavoro, la presenza di mutazioni di TP53 e RB1 e l'amplificazione di MYCN sono associate allo sviluppo di fenotipo neuroendocrino e resistenza alla terapia ormonale in pazienti in trattamento antiandrogenico. Tuttavia queste alterazioni possono essere presenti anche in adenocarcinomi prostatici che non sviluppano questo fenotipo e non giustificano la totalità dei casi in cui il fenomeno si manifesta.Per questo motivo sono ipotizzati, ma ad oggi poco esplorati, meccanismi epigenetici, ad esempio la regolazione istonica o l'espressione di microRNA. Questi ultimi sono quindi stati il primo obiettivo del presente studio, focalizzando la nostra attenzione non su aspetti patogenetici generali ma specificamente sul ruolo eventuale di microRNA nell'induzione del fenotipo neuroendocrino in corso di deprivazione androgenica.A tal fine abbiamo percorso uno studio di "profiling" di microRNA sfruttando le informazioni ottenute in parallelo da modelli "in vitro" ed "in vivo".Il modello "in vitro" è rappresentato dalla unica linea di adenocarcinoma prostatico androgeno sensibile disponibile commercialmente, la linea LNCaP, che anche sulla base di dati del gruppo della Anatomia Patologica del AOU San Luigi (Rapa I et al. 2013) si sa evolvere sotto terapia di deprivazione androgenica in un processo di transdifferenziazione in senso neuroendocrino.Il percorso sperimentale è stato quindi indurre l'insorgenza di tale fenotipo nelle cellule LNCaP in androgeno deprivazione e valutare l'espressione differenziale di 1066 microRNA nelle cellule non trattate rispetto a quelle trattate. L'analisi complessiva ha mostrato oltre 200 microRNA differenzialmente espressi, soprattutto in senso di ridotta espressione nelle cellule trattate con fenotipo neuroendocrino rispetto alle non trattate.Il limite di questa analisi, che di per se fornirebbe già informazioni rilevanti, consiste nel fatto che il modello "in vitro" è rappresentativo di una unica linea cellulare e comunque non necessariamente assimilabile a quanto può accadere a livello tessutale, dove l'eterogeneità della popolazione tumore associata è più complessa. Per questo motivo si è voluto associare all'analisi "in vitro" un'analisi analoga ma condotta su campioni di tessuto tumorale derivato da pazienti, quindi concepibile come un test "in vivo".A tal fine sono stati raccolti campioni di adenocarcinoma prostatico di cui era disponibile materiale associato sia pre-sia post-terapia. Sulla base della espressione genica di marcatori neuroendocrini quali la cromogranina A e il fattore di trascrizione hASH-1, di cui riprenderemo le funzioni nell'obiettivo 2 del presente studio, i pazienti selezionati sono stati raggruppati in due gruppi distinti, ovvero quelli in cui si è sviluppato fenotipo neuroendocrino in corso di terapia e quelli in cui il fenomeno non si verificato. L'analisi di microRNA nel gruppo di pazienti trattati (3 casi selezionati esaminati come unico gruppo a fini di analisi differenziale statistica) ha mostrato circa 160 microRNA differenzialmente regolati nel campione post-terapia rispetto a quello non trattato, anche in questo caso con una prevalenza di microRNA regolati negativamente.I dati ottenuti sarebbero di per se molto significativi ma hanno intrinsecamente il limite di essere rappresentativi di una popolazione tumorale mista con una quota stromale associata, ed essere anche in parte rappresentativi della eterogeneità tra pazienti differenti. Per questo motivo l'analisi finale ha voluto mettere insieme i due modelli selezionando unicamente i microRNA comuni ad entrambi, sia al modello "in vitro" sia al modello "in vivo", quali potenziali mediatori effettivi del fenomeno.Un'ultima analisi ha però previsto di mettere a confronto l'elenco di microRNA comuni con quanti differenzialmente espressi tra campioni pre-e post-terapia in quei pazienti in cui il fenotipo neuroendocrino sotto terapia non si è sviluppato, al fine di escludere microRNA coinvolti nella risposta antiandrogenica, ma non direttamente anche con l'insorgenza del fenotipo neuroendocrino. Solo però uno è risultato in comune, a dimostrare l'elevata differenza tra i due modelli.Alla fine dell'analisi complessiva quindi, 21 microRNA sono risultati essere candidati a partecipare ai processi di regolazione della transdifferenziazione neuroendocrina nell'adenocarcinoma prostatico in corso di trattamento di deprivazione androgenica. Alcuni di questi microRNA sono stati descritti nell'adenocarcinoma prostatico, sia come associati allo sviluppo di carcinoma sia come meccanismo di progressione tumorale (Walter BA et al 2013;Moustafa AA et al. 2018). Ad esempio, la down-regolazione del miR-373 è stata dimostrata essere promuovente l'invasività tumorale attraverso l'alterazione della via di TGF-beta (Qiu X et al. 2015). In un altro interessante studio, il miR-124, down-regolato nel nostro modello, è risultato quando presente controllare negativamente la crescita tumorale prostatica regolando negativamente varianti oncogeniche del recettore degli androgeni ed un fattore, EZH2, specificamente coinvolto anche nello sviluppo del fenotipo neuroendocrino (Shi XB et al. 2015).Andando poi a ipotizzare i principali processi biologici coinvolti nell'alterata regolazione dei microRNA identificati, si è valutato quali geni siano principalmente regolati dai microRNA coinvolti attraverso un'analisi bioinformatica. Circa 2000 geni sono stati identificati quali potenziali target di questi microRNA, e sono coinvolti in multipli processi biologici. Il limite di questo tipo di analisi è di essere "aspecifica", in quanto identifica processi generici e poco codificati. Tuttavia questo dipende direttamente dal fatto che i microRNA sono coinvolti fisiologicamente e nella patologia umana in molti processi paralleli simultaneamente, regolando direttamente più geni appartenenti a vie cellulari differenti. Tuttavia quest'analisi bioinformatica è in grado di identificare selettivamente quali geni possano essere potenzialmente implicati nel fenomeno di cui ci siamo occupati nel presente studio, e fornire il razionale per studi di validazione gene-specifici che sono l'oggetto di un piano sperimentale futuro a quanto illustrato in questa tesi.Come anticipato in precedenza, un secondo obiettivo è stato analizzare specificamente uno dei processi conosciuti essere coinvolti nello sviluppo del fenotipo neuroendocrino nell'adenocarcinoma prostatico, sia come fenomeno a sé sia come fenomeno indotto da terapia antiandrogenica (Rapa I et al 2008;Rapa I et al 2013).Tra i mediatori della via del Notch, il fattore di trascrizione hASH-1, codificato dal gene ASCL1, è infatti responsabile della induzione del fenotipo neuroendocrino ed è up-regolato in corso di terapia ormonale. Non solo, ma il fenomeno è reversibile qualora la deprivazione androgenica sia interrotta, almeno in modelli "in vitro". Tuttavia, quali siano le conseguenze dirette della attivazione di hASH-1 responsabili del fenomeno dell'induzione del fenotipo neuroendocrino è un meccanismo ad oggi sconosciuto.Per esplorare questo aspetto del fenomeno oggetto del nostro studio, anche in questo caso, abbiamo disegnato una parte sperimentale sia "in vitro" di screening proteomico sia "in vivo" di validazione immunoistochimica.Il principio è stato esplorare le proteine differenzialmente espresse dal modello cellulare LNCaP transfettato con il gene ASCL1 rispetto alle cellule basali attraverso un'analisi proteomica in gel bidimensionale che ha portato all'identificazione di numerosi spot differenti nei due modelli ipoteticamente riconducibili ad una specifica proteina differenzialmente espressa. Per confermare questa prima fase dello screening, è stata analizzata una trentina di spot mediante tecnica MALDI-ToF che ha portato all'identificazione di altrettante proteine, in parte presenti solo in uno dei due modelli, in parte presenti in entrambi i modelli ma regolate come livello di espressione in modo differente. La scelta di effettuare la fase di screening solo su modello cellulare è dovuta, nei limiti di quanto il modello sia in parte lontano dalla patologia tessutale, alla necessità di avere una popolazione cellulare pura.Anche in questo caso è stata condotta successivamente un'analisi bioinformatica mirata alle proteine identificate e volta a riconoscere i principali processi cellulari in cui sono coinvolte, con gli stessi limiti e pregi espressi in precedenza per l'analisi bioinformatica dei geni target dei microRNA.In seguito si è voluto verificare il ruolo delle proteine identificate in uno specifico processo tra quelli identificati, ovvero quello che implica la risposta allo stress. In questo modo si è visto per questo principale processo il ruolo centrale di due delle trenta proteine identificate, ovvero perossiredossina-2 e calreticulina che sono state quindi scelte per la fase di validazione "in vivo" mediante immunoistochimica.La casistica selezionata per questa fase di validazione ha volutamente presentato caratteristiche differenti da quella scelta per l'analisi di microRNA. In questo caso non si è voluto vedere l'espressione differenziale proteica rispetto al fenotipo neuroendocrino in associazione a terapia antiandrogenica ma esclusivamente l'espressione differenziale in una casistica omogenea il più possibile in cui l'unico discriminante fosse l'espressione di hASH-1, volendo identificare selettivamente i suoi target. Per questo sono stati raccolti campioni tumorali rigorosamente pre-terapia e tutti con Gleason score 8, per eliminare fenomeni di espressione proteica differenziale dovuta al maggior determinante prognostico dell'adenocarcinoma prostatico.L'espressione mediante immunoistochimica delle due proteine selezionate ha confermato un'associazione con i livelli di espressione genica tessutale di ASCL1, in linea con i dati "in vitro", con una significativa riduzione della perossiredossina nei casi over-esprimenti ASCL1 ed una aumentata espressione nello stesso gruppo per calreticulina. Ovviamente anche in questo caso non si può osservare un fenomeno "tutto o nulla" ma l'evidenza "in vivo" di quanto osservato "in vitro" suggerisce fortemente che queste proteine siano coinvolte nel processo di transdifferenziazione neuroendocrina indotta da hASH-1 nel carcinoma prostatico.La calreticulina è stata associata nel carcinoma prostatico ad un diretto effetto sulla regolazione del segnale mediato dal recettore degli androgeni ed a una diminuita aggressività (Zhu N et al. 1999;Alur M et al 2009). In un unico studio su linea cellulare LNCaP, la calreticulina è stata dimostrata essere down-regolata in presenza di fenotipo neuroendocrino (Vanoverberghe K et al. 2004), dato apparentemente in contrasto con quando da noi osservato, sebbene in un modello cellulare diverso e senza la validazione tessutale da noi effettuata.Per quanto concerne invece la perossiredoxina-2, altre isoforme sono state associate al controllo della sopravvivenza cellulare in modelli di adenocarcinoma prostatico (Whitaker HC et al. 2013). Nello specifico di perossiredoxina-2, è stato osservato che una sua diminuzione è associata ad una ridotta proliferazione cellulare ed a un effetto diretto positivo sull'espressione di geni regolati dal recettore degli androgeni, sebbene con modalità differenti a seconda che sia localizzata nel nucleo o nel citoplasma (Shiota M et al. 2011 ). Per questo motivo nell'analisi immunoistochimica abbiamo valutato le due localizzazioni separatamente sebbene in entrambi i casi si sia osservato lo stesso risultato con una ridotta espressione nei campioni hASH-1 positivi.Nell'insieme, i dati da noi ottenuti sia per calreticulina sia per perossiredossina-2 -in confronto con quanto presente in letteratura -sulle funzioni delle due proteine sembrano associare il fenotipo hASH-1 positivo nel carcinoma prostatico ad una ridotta proliferazione cellulare, dato che suggerisce come l'attivazione trascrizionale di hASH-1 operi direttamente su meccanismi differenziativi che rendono le cellule tumorali prostatiche simili alla controparte fisiologica, notoriamente non responsiva allo stimolo androgenico e con caratteristiche di cellula non proliferante in fase pre-apoptotica. Studi su più ampie casistiche confermeranno o meno l'associazione dell'espressione di queste due proteine con caratteristiche specifiche cliniche e patologiche nel carcinoma prostatico, obiettivo che non era pianificato nella nostra analisi di validazione.In conclusione, la presente tesi dimostra in modo originale e innovativo che fattori epigenetici, in particolare un set di microRNA, partecipano all'induzione del fenotipo neuroendocrino in corso di terapia androgeno-deprivativa e identifica alcuni potenziali bersagli di uno dei meccanismi maggiormente rilevanti in questo fenomeno, ovvero la trascrizione indotta dal fattore hASH-1.I dati nel loro complesso aprono a studi di validazione di fattori genici e/o proteici specificamente legati al fenomeno della transdifferenziazione neuroendocrina nel carcinoma prostatico, con il potenziale sviluppo di biomarcatori predittivi della sua insorgenza o di nuove strategie terapeutiche nel carcinoma prostatico resistente alla castrazione, del quale il fenomeno della transdifferenziazione neuroendocrina rappresenta una importante connotazione.     Figura 17-Livelli di espressione dei marcatori neuroendocrini in campioni accoppiati pre e post terapia in 9 pazienti trattai con terapia antiandrogenica.