Questo costrutto è costituito da uno scheletro di pBR322, un plasmide a bassa copia, in cui è stata inserita una cassetta di trascrizione contenente la sequenza di riconoscimento della T7 RNA polimerasi e siti per gli enzimi di restrizione adatti per il clonaggio del tratto polimorfico CGG exciso dalla 5'UTR del gene FMR1 umano.La strategia di clonaggio prevede la preparazione della cassetta di trascrizione, la preparazione del pBR322 e dei frammenti FMR1 polimorfici. pBR322-1F1 (5' CACCCAACTGATCTTCAGCA 3'), pBR322-1R1 (5' GGGCGTACTTGGCATATGAT 3'), pEGFP-n1-2F2,pEGFP-n1-2R2, pEGFP-n1-3F3 (5' CCTGAAGTTCATCTGCACCA 3'), pEGFP-n1-3R3 (5' GGGTGTTCTGCTGGTAGTGG 3'),pEGFP-n1-34F4 (5' AGAACGGCATCAAGGTGAAC 3') e pBR322-4R4 (5' GGTGATGTCGGCGATATAGG 3').Il DNA plasmidico estratto dalle colonie che presentavano la sequenza corretta è stato sottoposto a taglio enzimatico con l'endonucleasi NheI e successivamente a bluntizzazione con la T4 DNA polimerasi. Infine è stato taglio con l'enzima XhoI e purificato tramite excisione della banda d'interesse su gel d'agarosio.E' stata quindi, allestita una reazione di ligazione tra questo frammento e quello contenente le CGG del 5'UTR del gene FMR1, preparato in precedenza. Dopo trasformazione i cloni positivi per la presenza del plasmide ricombinante sono stati selezionati tramite reazione di sequenza con DMSO e GC RICH buffer.