La sposò e insieme ebbero cinque figli, solo due dei quali giunsero all'età adulta. Nel 1854 si occupò della fermentazione delle bevande alcoliche e dei metodi per l'annientamento dei batteri talvolta presenti nei vini e nella birra. Qualche anno dopo iniziò invece a dedicarsi agli studi sulla generazione spontanea e sui microrganismi. L'8 dicembre 1862 fu nominato membro dell'Accademia delle scienze e in seguito presentato all'imperatore Napoleone III. Nel 1864 Pasteur vinse il premio dell'Accademia francese delle scienze per la dimostrazione della verità della teoria della biogenesi, a discapito della teoria della generazione spontanea. Qualche tempo dopo fu colto dal primo di una serie di attacchi di ictus che lo portarono poi alla morte.