Il meccanismo d'azione di ganciclovir all'interno delle cellule infettate è il risultato di due processi distinti. La molecola inibisce la sintesi del DNA virale sia inibendo competitivamente l'incorporazione di deossiguanina trifosfato tramite l'enzima DNA-polimerasi, sia venendo incorporata come trifosfato nel DNA del virus, in questo modo bloccando o circoscrivendo l'allungamento del DNA del virus. Nelle cellule infettate da citomegalovirus ganciclovir trifosfato viene eliminato con estrema lentezza.