Confronto tra pazienti per mutazione genetica I pazienti risultati positivi all'analisi genetica per ipercolesterolemia monogenica sono stati confrontati con i pazienti negativi per diversi parametri quali: età, età alla diagnosi, BMI, IMT carotideo, colesterolo totale, colesterolo LDL, colesterolo HDL, trigliceridemia, glicemia, creatininemia, LDL prima del trattamento.I soggetti con ricerca della mutazione non conclusiva (10 pazienti) sono stati esclusi da questo confronto al fine di valutare le differenze tra due gruppi geneticamente ben definiti.Nello specifico sono state riscontrate differenze statisticamente significative per quanto riguarda l'età alla diagnosi, che si è dimostrata inferiore nei soggetti con ipercolesterolemia monogenica rispetto ai soggetti con ipercolesterolemia di altra natura (31±15 anni vs 39±14anni, p=0,05), i valori di trigliceridemia che si sono rivelati significativamente inferiori nei pazienti positivi all'analisi genetica rispetto a quelli negativi (102±45 mg/dL vs 145±74 mg/dL, p=0,001) e il livelli di creatinina che si sono rivelati superiori nei pazienti positivi (1,01±0,36mg/dL vs 0,83±0,20mg/dL, p=0,05).Il confronto tra i livelli di LDL pre-trattamento ha indicato la presenza di una differenza prossima alla significatività statistica tra i due gruppi (290±80mg/dL vs 266±39mg/dL, p=0,065); differenza che si è dimostrata invece significativa al confronto tra i valori stimati di LDL pre-trattamento (295±107mg/dL vs 252±57mg/dL, p=0,014).La differenza tra le concentrazioni di LDL pre-terapia è risultata essere di 24mg/dL per il valore noto e di 43mg/dL per il valore calcolato indicando quindi la presenza di livelli di colesterolo LDL circolanti nei pazienti FH positivi maggiori del 8% secondo il valore noto e del 15% secondo quello calcolato.La differenza per i valori di colesterolo HDL (54±14 vs 60±15, p=0,068) si è rivelata prossimi alla significatività statistica.I restanti valori confrontati tra i due gruppi non hanno presentato differenze statisticamente significative.Da questo primo confronto si evince come la presenza o meno di una mutazione nei geni causativi di ipercolesterolemia monogenica porti a due fenotipi clinici differenti.I soggetti con una forma monogenica sono caratterizzati da livelli di colesterolo LDL pre-trattamento superiori e da un'età alla diagnosi di ipercolesterolemia inferiore, mentre i soggetti negativi per una forma monogenica presentano livelli maggiori di trigliceridemia.Il BMI dei due gruppi è risultato completamente sovrapponibile (25,3±4 nei positivi vs 25,9±4 nei negativi, p=0,504) suggerendo dunque ad una prima analisi l'assenza di una maggior prevalenza di sindrome metabolica nei pazienti FH negativi.I pazienti con una forma monogenica tendono a essere diagnosticati ad età inferiori rispetto agli altri soggetti ed è ipotizzabile che tale fatto avvenga per la presenza di famigliarità per la patologia che porta ad una maggior sorveglianza medica sui componenti della famiglia e soprattutto per gli elevati livelli di colesterolo presenti sin dalla nascita.In relazione a tale osservazione considerando i livelli di ispessimento intimale misurati attraverso l'ecografia dei tronchi sopraortici si è potuto apprezzare che nei pazienti affetti da FH l'ispessimento è risultato essere tendenzialmente inferiore rispetto ai pazienti non FH senza però raggiungere una significatività statistica.Tale risultato ovviamente non permette di giungere a conclusioni ed è probabilmente limitato dalla bassa numerosità del campione di soggetti per cui tale dato è disponibile. Letto però nell'insieme complessivo dei risultati potrebbe essere suggestivo del fatto che nei pazienti affetti da FH la maggior sorveglianza a cui sono sottoposte le famiglie conduce ad una precoce diagnosi seguita da un precoce avvio di terapia medica che si riflette in una riduzione del danno d'organo derivante dalla malattia. Tale riscontro merita di essere approfondito in futuro con ulteriori dati e osservazioni.Inoltre, sul piano metabolico i soggetti con forma monogenica presentano una forma di disturbo circoscritta al colesterolo e con valori fisiologici di trigliceridi che invece si dimostrano aumentati nei soggetti con forme non monogeniche di ipercolesterolemia.Le differenze osservate nei valori di colesterolo HDL e nei valori di creatinina potrebbero essere spiegate in base alla distribuzione asimmetrica dei soggetti di sesso maschile tra i due gruppi. Nella popolazione di soggetti positivi si ha una maggior presenza di individui di sesso maschile (30 uomini positivi vs 24 uomini negativi) -caratterizzati in condizioni fisiologiche da livelli inferiori di colesterolo HDL e da livelli superiori di creatinina -a parità di soggetti femminili (24 donne positive vs 23 donne negative).Le differenze osservate nel nostro studio risultano paragonabili a quelle osservate in altri lavori presenti in letteratura 145,146 .Successivamente i pazienti risultati positivi per ipercolesterolemia monogenica sono stati confrontati con i soggetti negativi in relazione al numero e al tipo di comorbilità, al numero e al tipo di terapie farmacologiche antidislipidemiche e al numero e al tipo di terapie concomitanti assunte per il trattamento delle eventuali comorbidità.I soggetti affetti da ipercolesterolemia monogenica hanno evidenziato una prevalenza significativamente maggiore di infarto acuto del miocardio (p=0,03) e di angioplastica coronarica transluminale percutanea (p=0,05) rispetto ai soggetti negativi.Nei soggetti negativi per mutazione è stata invece riscontrata una prevalenza significativamente maggiore di ipertensione arteriosa (p=0,004), diabete mellito tipo 2 (p=0,05) e arteriopatia occlusiva periferica (p=0,04).I due gruppi sono stati confrontati per numero di comorbidità senza riscontrare differenze significative.La presenza di una minor prevalenza di diabete nel gruppo dei pazienti FH positivi va ad aggiungersi ad un insieme di evidenze presenti in letteratura che indicano una scarsa compresenza delle due malattie e che in alcuni lavori porta a ipotizzare un possibile effetto protettivo delle mutazioni di LDLR sullo sviluppo di diabete mellito tipo 2. 70,147 Nell'ambito delle terapie antidislipidemiche, queste sono state suddivise in base alla combinazione di farmaci assunta da ogni paziente raggruppandoli in categorie come statine a bassa intensità (fluvastatina 20mg, fluvastatina 40mg, pravastatina 10mg, pravastatina 20mg, pravastatina 40mg, simvastatina 10mg), statine a bassa intensità associate a ezetimibe 10mg, statine a media intensità (simvastatina 20mg, simvastatina 40mg, atorvastatina 10mg, rosuvastatina 5mg), statine a media intensità associate a ezetimibe 10mg, statine ad alta intensità (simvastatina 80mg, atorvastatina 20mg, atorvastatina 40mg, atorvastatina 80mg, rosuvastatina 10mg, rosuvastatina 20mg, rosuvastatina 40mg), statine ad alta intensità associate a ezetimibe 10mg, ezetimibe 10mg in monoterapia, anticorpi monoclonali anti-PCSK9 (Alirocumab 150mg, Alirocumab 75mg, Evolocumab 140mg).Le statine sono state classificate, sulla base delle linee guida NICE per le malattie cardiovascolari 99,148 , in statine a bassa, media o alta intensità.Dall'analisi statistica è emerso che i soggetti con forme di ipercolesterolemia non monogenica fossero più frequentemente in terapia con statine ad alta intensità (p=0,05), mentre i soggetti con forme di ipercolesterolemia monogenica fossero più frequentemente in terapia con statine a media intensità associate ad ezetimibe o con statine ad alta intensità associate ad ezetimibe (p=0,01 e p=0,04).La terapia con anticorpi monoclonali anti-PCSK9 è risultata essere leggermente più frequente nei soggetti con mutazione, senza che tale differenza risultasse però statisticamente significativa (6 pazienti vs 2 pazienti, p=0,310).Inoltre, i soggetti con forme di ipercolesterolemia monogenica sono risultati essere più frequentemente trattati in politerapia con più farmaci rispetto ai soggetti che presentavano forme di ipercolesterolemia non monogenica (p=0,003).La correzione percentuale media del colesterolo LDL ottenibile in base ai tipi di terapia antidislipidemica utilizzata nei pazienti con ipercolesterolemia monogenica si è rivelata significativamente maggiore rispetto a quella ottenibile con le terapie prescritte nei soggetti con ipercolesterolemia di altra causa (-52%±12% vs -46%±9%, p=0,02).È ipotizzabile che tale differenza sia ascrivibile ai maggiori livelli di colesterolo basale dei pazienti con ipercolesterolemia monogenica.Un'altra possibile spiegazione è legata al fatto che nella storia clinica di questi pazienti si sono verificati più frequentemente eventi di infarto miocardio acuto e quindi più spesso questi pazienti sono in prevenzione secondaria con conseguenti target più bassi di colesterolo LDL da ottenere.Inoltre, analizzando le terapie per le comorbidità, è emerso come i soggetti positivi per ipercolesterolemia monogenica evidenziassero una prevalenza significativamente minore di terapie ipoglicemizzanti (p=0,015) o antidepressive (p=0,034) rispetto ai soggetti con ipercolesterolemia di altra natura.I due gruppi non presentavano differenze per numero di terapie concomitanti per il trattamento delle comorbidità.Da ultimo è stato valutato se i soggetti affetti da ipercolesterolemia monogenica presentassero una maggiore prevalenza di intolleranza alle statine rispetto ai soggetti con ipercolesterolemia non monogenica sia in base al dato anamnestico sia in base alla valutazione della presenza o meno nel loro genoma di polimorfismi associati ad un'alterata sensibilità alle statine.In entrambi i casi l'analisi statistica ha escluso la presenza di una distribuzione ineguale di eventi di intolleranza o di alterata sensibilità tra i due gruppi (p=0,386 e p=0,142).L'analisi di tolleranza alle statine viene approfondita ulteriormente in una sezione successiva del lavoro.Analisi delle mutazioni genetiche Partendo sempre dai dati presenti in letteratura sarebbe stato verosimile aspettarsi dei livelli superiori di colesterolo LDL circolante nei pazienti caratterizzati dalla compresenza di più mutazioni.Nel gruppo di pazienti studiato tale evenienza non è stata invece osservata ed una possibile causa di tale fenomeno può essere imputata al fatto che nel campione considerato dallo studio la maggior parte delle mutazioni associate ad una mutazione di LDLR erano o delle mutazioni inermi qualora in un allele solo (mutazioni di LDLRAP1) oppure erano al contrario mutazioni lossof-function di PCSK9 che quindi esercitavano un effetto protettivo.Al contrario invece diverse mutazioni osservate nei pazienti con soltanto un allele di LDLR mutato erano caratterizzate da fenotipi di ipercolesterolemia molto importanti e in alcuni paragonabili a fenotipi omozigoti.Successivamente è stato deciso di concentrare l'analisi sul gene LDLR, dato che rappresentava il gene più interessato dalle mutazioni.Inizialmente sono state confrontate le mutazioni collocate in regioni introniche con quelle inserite in regioni esoniche senza che si rivelassero differenze significative (Tabella 7).Non sono state riscontrate significatività nemmeno al confronto tra le diverse tipologie di mutazione: missenso, nonsenso, silente, splicing, variazioni di numero di nucleotidi (delezione, inserzione, duplicazione).Neppure quando il confronto è stato svolto tra le mutazioni missenso, caratterizzate da piccole variazioni nella sequenza codificante, e le mutazioni di altro tipo, caratterizzate da riarrangiamenti più importanti della sequenza genetica, aggregate in un unico insieme. (Tabella 8)A questo punto sono state confrontate le alterazioni proteiche derivanti dalle varie mutazioni genetiche con particolare attenzione al confronto tra i soggetti che presentavano sostituzioni di un singolo amminoacido rispetto a coloro che presentavano i risultati di un frameshift della proteina.Tale raggruppamento da un lato è risultato necessario in quanto le tipologie di alterazione proteica restanti, quali delezione di amminoacidi (presente in un solo paziente) o proteine tronche derivanti da mutazioni nonsenso (presenti in due pazienti) presentavano numerosità campionarie insufficienti ai fini dell'analisi statistica.Soprattutto però tale raggruppamento permetteva di confrontare due categorie molto diverse sul piano molecolare: una caratterizzata da un'alterazione di entità ridotta quale la sostituzione di un amminoacido, l'altra di portata maggiore quale lo sconvolgimento completo della sequenza amminoacidica derivante dallo slittamento della cornice di lettura del DNA.Ciononostante, anche in questo confronto, contrariamente a quanto ci saremmo potuti aspettare, non si sono dimostrate differenza significative tra i due gruppi. (Tabella 11)Quest'ultimo confronto sembrerebbe suggerire che i valori lipidici derivanti da piccole alterazioni della sequenza amminoacidica di una proteina risultino sovrapponibili a quelli che conseguono ad alterazioni ben più importanti derivanti dallo sconvolgimento della sequenza di amminoacidi di un'intera porzione di proteina.Molte delle nostre osservazioni in relazione al legame tra genotipo e fenotipo clinico risultano contrastanti rispetto alle evidenze presenti in letteratura.Diversi studi indicano che la presenza di mutazioni genetiche nonsenso o responsabili di alterazioni di splicing sono legate a livelli di colesterolo ben più elevati rispetto a quelli osservati nei soggetti con mutazioni missenso.Inoltre, i soliti studi indicano che la presenza di mutazioni responsabili di fenomeni di grosse delezioni o di frameshift sono responsabili di livelli di colesterolo maggiori rispetto alle mutazioni responsabili di un semplice scambio di amminoacidi (missenso).È possibile che il motivo per cui le nostre osservazioni si distaccano dalle evidenze presenti in letteratura sia da un lato legato alla particolare combinazione di genotipi inclusi nel nostro studio e da altri alla ridotta numerosità del nostro campione che limita la rappresentazione delle forme di mutazione esistenti alla base dell'ipercolesterolemia familiare.Analisi del DLCN Score Tali risultati confermano l'affidabilità del DLCN Score nella valutazione dell'ipercolesterolemia monogenica e indicano come la correzione del cutoff per la scelta dei pazienti da arruolare nello studio avvenuta tra l'invio del primo campione e la selezione del secondo campione abbia portato ad una diminuzione della sensibilità del 7% compensata però da un marcato aumento della specificità del 23%.Relazione tra DLCN Score e tipo di mutazione È stata inoltre valutata la correlazione tra i valori del DLCNS e la probabilità che la mutazione presente nel soggetto fosse classificata, sulla base delle evidenze presenti fin ora in letteratura, di natura patologica.Al fine di determinare la patogenicità della mutazione è stata utilizzata la classificazione delle evidenze sperimentali del portale NCBI ClinVar, che suddivide le mutazioni in cinque classi definendole di classe I quando sicuramente patologiche, di classe II quando probabilmente patologiche, di classe III quando è solo possibile che siano patologiche, di classe IV quando è improbabile che siano patologiche e di classi V quando benigne.È stata assegnata una grandezza ordinale crescente a ognuna delle classi in base alla gravità della mutazione con un valore di 1 per le mutazioni di classe IV (probabilmente non patologiche) crescendo fino ad un valore di 4 per le mutazioni di classe I (patologiche); nessuna delle mutazioni riscontrate nei nostri pazienti è risultata essere della classe V (benigna).Dapprima è stato eseguito un test di Kruskall-Wallis con analisi post-hoc tra soggetti, classificati per classe di patogenicità della mutazione, per andare a confrontare i valori di DLCNS di ciascun gruppo con quelli degli altri e valutare la presenza di differenze significative tra le classi.Il test ha indicato la presenza di differenze significative tra le varie classi con p<0,0001 confermata per ogni contrasto dai seguenti test di analisi post-hoc.Ciò indica che le varie classi di mutazione presentano valori di DLCN Score significativamente differenti.Successivamente è stata eseguita una correlazione tra ranghi (Rs) di Spearman, per valutare la correlazione tra il valore del DLCN Score e la classe della mutazione, la quale ha restituito un coefficiente di correlazione Rs=0,554, p<0,0001.Tali risultati indicano che i valori del DLCN Score non solo sono ben distinti nei vari gradi di mutazione ma anche direttamente correlati con la probabilità di patogenicità della mutazione che sta alla base di tale ipercolesterolemia.Tale risultato in prima battuta potrebbe risultare scontato. Il DLCN Score viene calcolato a partire dalle manifestazioni cliniche della mutazione che derivano dall'effetto che questa esercita sul metabolismo del colesterolo. Di conseguenza appare ovvio che una mutazione più grave sarà responsabile di manifestazioni più gravi e quindi di un DLCN maggiore.Dall'altro lato sappiamo che risultare positivi ad una mutazione legata ad FH non sempre comporta necessariamente un grave fenotipo di ipercolesterolemia e quindi è necessario affiancare al dato genetico il dato clinico che in questo caso viene ben sintetizzato nel DLCN Score.Questa considerazione porterebbe a preferire il DLCN Score ai criteri di Simon-Broome nella diagnosi di FH in quanto in questi ultimi la presenza di una mutazione dei geni interessati è sufficiente a porre diagnosi di ipercolesterolemia familiare mentre tale parametro nel DLCN Score ha un valore di 8 punti che da soli non sono sufficienti a porre diagnosi di FH certa ma solo di FH probabile.Un'ulteriore analisi è stata svolta al fine di valutare una possibile correlazione tra i livelli del DLCN Score e la probabilità di possedere una mutazione di un singolo nucleotide piuttosto che una delezione, una duplicazione, una delezione o un'inserzione così come è stata valutata una possibile relazione tra i livelli del DLCNS e la tipologia di mutazione proteica derivante dalla mutazione genetica.Il risultato di tale analisi è stato negativo indicando come non vi fossero differenze statisticamente significative tra i valori del DLCNS e la probabilità di avere una mutazione di delezione piuttosto che di sostituzione nucleotidica.La stessa analisi è stata eseguita anche in relazione all'effetto che la mutazione esercitava a livello proteico ed anche in questo caso non sono stati rilevati valori di DLCN significativamente superiori in soggetti la cui mutazione portava ad eventi di frameshift o di delezione esonica rispetto ai soggetti in cui portava alla sola sostituzione amminoacidica.Il risultato di queste analisi indica come il DLCN Score sia un valido strumento clinico al fine di predire la probabilità che l'eziologia dell'ipercolesterolemia del paziente sia di origini monogenica e che il punteggio di tale score sia suggestivo della probabilità di patogenicità della mutazione alla base dell'ipercolesterolemia ma come non sia in grado di predire la tipologia di mutazione né l'effetto proteico risultante.Sotto certi aspetti questo risultato potrebbe suggerire in accordo con i risultati visti precedentemente che nell'ambito della genetica dell'ipercolesterolemia monogenica piccole mutazioni determinanti alterazioni di singoli amminoacidi all'interno della struttura proteica potrebbero essere in grado di portare a severe conseguenze a livello clinico, sintetizzate diagnosticamente attraverso il DLCN Score, tanto quanto mutazioni più importanti quali grandi delezioni o mutazioni causative di fenomeni di frameshift.