La diagnosi di alcaptonuria può essere effettuata tramite cromatografia su carta o cromatografia su strato sottile, utilizzando egualmente il sangue o l'urina. Nei soggetti sani l'acido omogentisico è assente, mentre nei soggetti affetti i livelli plasmatici risultano mediamente intorno a 6.6 µg/ml e i livelli urinari risultano mediamente 3.12 mmol per ogni mmol di creatinina.