Holley focalizzò dapprima le sue ricerche sull'isolamento dell'RNA transfer (tRNA), per poi dedicarsi specificamente alla determinazione di sequenza e struttura dell'alanil-tRNA, la macromolecola che permette l'inserimento dell'amminoacido alanina all'interno delle proteine. Il gruppo di ricerca di Holley determinò la struttura del tRNA utilizzando due RNAsi in grado di spezzare il tRNA in pezzetti. Poiché tali RNAsi sono in grado di tagliare la molecola solo presso specifiche sequenze nucleotidiche, il gruppo fu in grado di ricostruire, come per un puzzle, la struttura dell'intera molecola.