Nella maggior parte degli organismi uni- o pluri-cellulari, la TMG viene biosintetizzata dalla colina in due passaggi ossidativi. Dapprima la colina viene convertita in betaina aldeide, nelle piante con una reazione catalizzata dall'enzima colina monoossigenasi e negli animali ed in molti batteri con una reazione catalizzata dalla colina deidrogenasi legata alla membrana plasmatica (numero EC 1.1.99.1) o dalla colina ossidasi solubile (numero EC 1.1.3.17). L'enzima coinvolto nel secondo passaggio, la betaina-aldeide deidrogenasi (numero EC 1.2.1.8), è lo stesso in piante, animali e batteri. In alcuni batteri, la TMG viene sintetizzata a partire dalla glicina, attraverso l'azione della glicina/sarcosina N-metiltransferasi (numero EC 2.1.1.156) e dalla sarcosina/dimetilglicina N-metiltransferasi (numero EC2.1.1.157).