Per estrarre il DNA bisogna rompere le cellule trattandole con sostanze litiche e detergenti. Le molecole di DNA, separate dalla miscela di cellule con tecniche purificanti, vengono tagliate in frammenti più piccoli. Per effettuare ciò si utilizzano enzimi di restrizione, o endonucleasi di restrizione. Esse non tagliano la doppia elica a caso, bensì agiscono in sequenze bersaglio di nucleotidi creando delle estremità appiccicose/coesive (che contengono delle sequenze palindrome). Il taglio avviene mediante idrolisi. Si ottengono un numero variabile di filamenti di DNA di lunghezza variabile, legato alla presenza di sequenze bersaglio che si trovano nei plasmidi. I frammenti di DNA plasmidico e quelli di DNA eucariotico vengono legati insieme grazie alle sequenze coesive con l'intervento di DNA ligasi.