Un cambiamento radicale si ebbe quando Cosimo I, il 18 settembre 1545, subordinò l'ospedale di Pisa a quello di S. Maria Nuova di Firenze per risolvere i numerosi problemi finanziari. Questa dipendenza tra i due ospedali durò per ben 225 anni, fino al 1771. In questo periodo l'ospedale fu retto dagli Spedalinghi. Questi, promossero diverse iniziative, edificando nuovi edifici, istituendo scuole di medicina e chirurgia, migliorando le rendite patrimoniali e rendendo più idonee le infermerie dei malati.