Come tutti i chinoloni la prulifloxacina agisce inibendo in modo selettivo i due tipi di enzima topoisomerasi, la DNA–girasi e la topoisomerasi IV. Questi sono enzimi vitali per la cellula batterica e fondamentali per la duplicazione, la trascrizione e la riparazione del DNA. La topoisomerasi IV è necessaria per separare le catene di DNA che deve essere replicato (cioè duplicato) prima che avvenga la divisione cellulare batterica.