La maggior parte dell'acetilcolina sintetizzata viene immagazzinata all'interno di vescicole sinaptiche, dalle quali si ha un rilascio attraverso l'esocitosi attivata dall'ingresso del calcio nella terminazione nervosa. Le vescicole colinergiche accumulano acetilcolina con un meccanismo di trasporto attivo per mezzo di una proteina trasportatrice specifica.