In seguito, tornò a Rio de Janeiro e fece pungere alcune scimmie dagli insetti che aveva raccolto e nel sangue periferico di una di queste ritrovò poi i tripanosomi. Chiamò il parassita "Schizotrypanum cruzi" poi "Trypanosoma cruzi", in onore del suo maestro Oswaldo Cruz. Scoprì anche delle forme tissutali del parassita, gli amastigoti, che si dividevano per fissione binaria e formavano nidi e pseudocisti nelle fibre muscolari e cardiache. A Lassance successivamente Chagas segnalò il primo caso di forma acuta di una nuova malattia: trovò lo stesso parassita che aveva scoperto nel sangue di una bambina con febbre, anemia, epatosplenomegalia (poi questa bimba visse fino a veneranda età senza problemi). Dimostrò che quel parassita era la causa di una malattia molto comune nelle regioni rurali del Brasile: la tripanosomiasi americana.