La citometria a flusso o citofluorimetria è una tecnica di misurazione multiparametrica di caratteristiche fisiche e/o chimiche condotta su una sospensione cellulare marcata con sonde fluorescenti e monodispersa all'interno di un sistema fluidico di trasporto.Essa rappresenta una metodica essenziale per l'analisi citologica qualitativa e quantitativa.Nei citometri a flusso, sospensioni cellulari (come pure di nuclei, cromosomi ed altri materiali biologici) vengono iniettate in un filetto liquido, il quale tende, grazie al PRINCIPIO DI FOCALIZZAZIONE IDRODINAMICA, a trasportare le cellule in maniera separata ed ordinata in un punto in cui arriva un fascio di luce focalizzata sfruttando la differenza di pressione tra il campione ed il fluido di trasporto (figura 18).Il principio di funzionamento dei citometri a flusso prevede che le cellule di una popolazione eterogenea, provenienti da sangue periferico, aspirato midollare, agoaspirati di diversa natura da tessuti solidi dissociati…, vengano aspirate da una provetta e siano convogliate da un sistema fluidico di trasporto fino ad un sistema di rilevazione ottico/elettronico a livello del quale esse possano incontrare un fascio luminoso focalizzato.Quando il raggio di luce intercetta il flusso cellulare (stream) vengono generati segnali legati alle caratteristiche fisiche di ogni singola cellula ed alla presenza di molecole fluorescenti.Una volta emessi, i segnali sono raccolti da un sistema di lenti, specchi dicroici e filtri ottici, ed inviati ad un sistema di rivelazione costituito da sensori (fotodiodi e fotomoltiplicatori) che ne misurano l'intensità.I segnali analogici provenienti da ogni sensore, opportunamente amplificati, digitalizzati ed associati tra loro sono inviati ad un elaboratore di dati che provvede alla rispettiva presentazione su monitor e definizione statistica (figura 17).  • separazione dei linfomonociti su gradiente• conta dei mononucleati con la camera di Burker• separazione della sottopopolazione linfomonocitaria CD4+• marcatura con anticorpi• analisi citofluorimetrica.Separazione dei mononucleati su gradiente: la frazione mononucleata viene isolata da PB raccolto in provetta contenente un anticoagulante (Litio-Eparina, o EDTA), mediante stratificazione del campione, diluito 1:2 con soluzione fisiologica, su un gradiente 1:3 di Ficoll (Lymphocytes Separation Medium, Eurobio Biotechnology).Dopo centrifugazione a 1600 rpm per 20 minuti, la popolazione linfomonocitaria si presenta sottoforma di anello dal colore biancastro che separa globuli rossi, granulociti, piastrine ed il Ficoll dal siero (figura 19).La frazione isolata viene sottoposta ad un lavaggio in soluzione fisiologica, tramite centrifugazione a 1600 rpm per 5 minuti.     