Le cellule, isolate dal sangue periferico e midollare dei pazienti, dei soggetti normali oppure ottenute dalle linee cellulari, sono state lavate in PBS e lisate con un buffer contenente 50 mM TrisHCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X100, 0,5 mM EDTA, 0,4 M EGTA, 100 µg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 µg/ml aprotinina, 1 µg/ml pepstatina, 1 µg/ml leupeptina e 1 mM sodio ortovanadato.I lisati cellulari sono stati incubati in ghiaccio per 30 minuti e centrifugati a 12000 g per 10 minuti a 4°C. Le resa proteica è stata determinata mediante l'utilizzo del Protein Assay Dye Reagent (laboratori Bio-Rad, Hercules, CA) e successiva lettura allo spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 595 nm; i valori rilevati sono stati normalizzati utilizzando una curva di taratura realizzata utilizzando concentrazioni scalari con dosi crescenti di BSA.50 µg dell'estratto proteico totale ottenuto, sono stati successivamente dissolti nel 3X SDS sample buffer (Bio-Labs), bolliti per 5 minuti a 99°C, caricati su un gel di poliacrilammide di SDS 8% e trasferiti su membrane di nitrocellulosa (membrane Hybond-ECL, Amersham). Le membrane, dopo un'ora di saturazione a temperatura ambiente con siero di albumina bovina (BSA) al 5% in 1X Tris-buffered saline (TBS), sono state incubate un notte a 4°C con l'anticorpo primario. Per valutare la presenza della proteina EphA3 è stato utilizzato un anticorpo policlonale diretto contro EphA3 (1:1000), gentilmente concesso dal Dr. Lackmann; per valutare invece lo stato di fosforilazione del recettore EphA3 è stato impiegato un anticorpo monoclonale diretto contro le tirosine fosforilate (Santa Cruz Biotechnology) 1:.1000. Tutti gli anticorpi sono stati diluiti nella soluzione tampone 1X TBS-Tween BSA 1%.La rilevazione è stata realizzata mediante incubazione di 1 ora a 4°C utilizzando anticorpi secondari anti-rabbit IgG (1:5000) e anti-mouse (1:2000) HRP-coniugati (Santa Cruz Biotechnology) ed il prodotto è stato rilevato dai reagenti di chemiluminescenza ECL utilizzati in rapporto 1:1 (Amersham Biosciences).Infine, per controllare ulteriormente che le quantità di lisato caricate fossero simili , i blot sono stati strippati con un buffer apposito (62,5 mM Tris HCl pH6,8 e 2% SDS) per 1 ora a 42°C e nuovamente incubati per 2 ore a 4°C con anticorpo monoclonale anti beta-actina (Sigma Aldrich) utilizzata come proteina di controllo, alla diluizione 1:1000.