Durante il digiuno, quindi, il glucosio non entra più in circolo dal tratto gastrointestinale mediante l'assunzione alimentare, ma deriva principalmente dal catabolismo del glicogeno epatico (glicogenolisi epatica), e, mediante gluconeogenesi (conversione del glucosio da substrati non glucidici), ricavandolo da molecole quali lattato, amminoacidi e glicerolo, un processo che avviene per la maggior parte nel fegato, ma in minima parte può avvenire anche nel rene e negli intestini in periodi di digiuno molto avanzato. Il lattato è prodotto dal metabolismo del glucosio nei tessuti periferici in equilibrio col piruvato, che a sua volta deriva da molteplici vie metaboliche e dagli aminoacidi, venendo riconvertito tramite il Ciclo di Cori. Dei vari aminoacidi glucogenetici (alanina, treonina, glicina, acido glutammico), l'alanina prodotta dal catabolismo delle proteine nel muscolo scheletrico gioca una ruolo preminente. Il catabolismo proteico è reso possibile dalle riduzioni di insulina circolante. Infine, un importante substrato glucogenetico durante il digiuno è il glicerolo, che deriva dall'idrolisi dei trigliceridi nel tessuto adiposo. In questa fase, gli acidi grassi liberi (FFA) provenienti dall'idrolisi dei trigliceridi depositati nel tessuto adiposo diventano il carburante principale per sostenere le richieste energetiche. Alcuni tessuti, come il muscolo scheletrico e il fegato, sono in grado di aumentare l'utilizzo di FFA a scapito del glucosio per aumentarne la disponibilità al sistema nervoso centrale (SNC) e altri tessuti strettamente dipendenti dal glucosio (tessuti glucosio-dipendenti).