Nel 1659 divenne padre di Thomas Bartholin il Giovane, che avrebbe poi svolto la professione di antiquario. Appartenente alla scuola olandese di anatomia, Thomas Bartholin sostenne la teoria della circolazione del sangue del medico inglese William Harvey. Ha insegnato all'Università di Copenaghen (1646-1661) e fu medico del re Cristiano V (1670-1680).