In ogni soggetto è presente un ritmo circadiano di produzione di ACTH e conseguente cortisolemia che massima al mattino va calando progressivamente fino alla sera per poi rialzarsi nuovamente. Nelle forme cushingoidi più gravi questa tendenza scompare e la presenza di cortisolo ematico è costantemente su valori alti. Ne consegue un aumento della eliminazione dello stesso ormone e dei suoi derivati con le urine, aumento che valutato nell'arco delle 24 ore contribuisce alla diagnosi. Molto importanti sono gli esami ematici a varie ore del giorno o i test di soppressione del cortisolo con desametasone e metirapone a basse dosi (1 mg). Quest'ultima indagine serve a diagnosticare non tanto la malattia in sé ma la causa che la determina.