Per rispondere a questi interrogativi, Nirenberg intraprese i suoi studi ai NIH insieme ad Heinrich Matthaei nel 1960. Riuscirono a sintetizzare un filamento di RNA composto solo da uracile all'interno di un estratto cellulare di "Escherichia coli" costituito solo da DNA, RNA, ribosomi ed ulteriori componenti necessari alla sintesi delle proteine. Aggiunsero all'estratto anche DNAasi, per assicurarsi che il DNA venisse degradato e che le uniche proteine potessero provenire esclusivamente dal loro RNA sintetico. In seguito procedettero all'aggiunta dei venti amminoacidi (le unità fondamentali costituenti le proteine): uno di essi era "caldo" (cioè marcato radioattivamente), mentre i restanti 19 "freddi" (cioè non marcati).