0,5 x 10 5 cellule sono state coltivate su vetrini sterili e incubate con il composto 5 per 4 ore. In seguito sono state lavate con PBS, fissate con paraformaldeide al 3,7% (diluita in PBS) per 5 minuti, rese permeabili con 0,1% TritonX-100 e incubate per 1 ora a temperatura ambiente con un anticorpo anti-porina/VDAC (1: 100, Abcam, Cambridge, Regno Unito), per marcare i mitocondri. È stata poi effettuata una incubazione con un anticorpo secondario coniugato con TRITC (tetrametil rodamina isotiocianato) (1:50, Abcam) Le cellule sono state lavate tre volte con PBS, poi i vetrini sono stati trattati con 10 µl di Gel Mount Aqueous Mounting (Sigma). I campioni sono stati analizzati con un microscopio confocale a scansione laser Olympus FV300 dotato di un laser Blue Argon (488 nm), un laser Green Helium Neon (543 nm) e il software FluoView 300 (Olympus Biosystems, Amburgo, Germania). Per ciascuna condizione sperimentale sono stati esaminati 5 campi. Questo composto è stabile per 4 settimane a temperatura ambiente e al buio. Al contrario presenta una chiara fotodegradazione quando esposto alla luce verde con una lunghezza d'onda di 532 nm. Con l'analisi HPLC eseguita sulla soluzione irradiata si è rilevata la presenza di due prodotti privi della frazione cupferron ma accompagnati dalla presenza di nitrosobenzene (36). La presenza di nitrosobenzene come prodotto di fotolisi, suggerisce una rapida perdita di NO dal cupferron. Questi risultati ci fanno comprendere come il composto 1 sia stabile al buio ma generi NO in seguito ad un'esposizione a luce verde biocompatibile. (36) Il composto 2, rispetto al composto 1 presenta due sostituenti di iodio, i quali dovrebbero stimolare la popolazione dello stato di tripletto, fondamentale per la generazione di ROS tramite le reazioni di tipo I e II. Questo non dovrebbe precludere le proprietà di foto-rilasciare NO (36). I composti 3 e 4 sono stati scelti come composti modello (privi del gruppo che rilascia NO) per l'1 e il 2 rispettivamente. (36) Il composto 5 è stato progettato per un rilascio di NO solo in seguito ad irradiazione con luce verde. La sua fluorescenza, osservata tramite microscopio confocale è nella regione del verde. ( 35)