Per gli esperimenti di R-EMSA sono stati utilizzati estratti proteici ottenuti dalla linea cellulare COV434 (cellule immortalizzate di granulosa ovarica umana); il protocollo utilizzato per la preparazione degli estratti proteici prevede la preparazione separata di estratti nucleari e citoplasmatici. La purezza di queste preparazioni è stata saggiata tramite Western Blot attraverso la ricerca di specifiche proteine marcatori di entrambe le frazioni (-tubulina per la frazione citosolica e istone H3 per quella nucleare).Per l'allestimento delle reazioni di legame RNA-proteine, le sonde radioattive S ed L nella quantità di 20fmoli sono state incubate, separatamente, con quantità crescenti di estratti nucleari di COV434 (da 1 a 8g). Le reazioni di binding sono state allestite in presenza di tRNA, in eccesso molare 100X rispetto alla quantità delle sonde, utilizzato come competitore aspecifico in grado di limitare la formazione di legami non specifici, ed in presenza di eparina, che migliora la definizione delle bande durante la corsa elettroforetica.Come è mostrato in figura 3.4, nelle reazioni condotte con la sonda L non si osserva la presenza di bande di ritardo ma, in corrispondenza della reazione condotta con 4 e 8 g di proteine nucleari, si può notare la progressiva scomparsa della radioattività a livello della sonda libera. Non è tuttavia possibile evidenziare una netta banda di ritardo, in quanto sembra che gran parte della reazione rimanga a livello del pozzetto. Questo risultato potrebbe suggerire che i complessi formati tra la sonda L e gli estratti nucleari siano troppo grandi per poter essere separati tra le maglie del gel d'acrilamide. Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando la sonda S; si può notare anche in questo caso un progressivo accumulo di segnale radioattivo nei pozzetti del gel al crescere della quantità di estratti proteici utilizzati ma, contrariamente agli esperimenti condotti con la sonda L, non si evidenzia mai il completo esaurimento della sonda libera, neanche in presenza della massima quantità di estratti nucleari.Figura 3.4: corsa elettroforetica degli esperimenti di R-EMSA su gel di acrilamide al 6%. Le frecce indicano la distanza di corsa delle sonde libere (S ed L). Gli esperimenti sono stati condotti in presenza di quantità crescenti di estratti proteici nucleari delle COV434 (da 1 a 8 g), di tRNA e di eparina. Ub: unboundAl fine di poter visualizzare la eventuale comparsa di bande di ritardo, i successivi esperimenti di legame RNA-proteine sono stati separati su gel di agarosio alla concentrazione dell'1,5%. La quantità di sonda utilizzata in questi esperimenti è di 20fmoli e la scala di estratti è sempre compresa tra 1 e 8 g. Gli esperimenti di R-EMSA sono stati condotti in presenza di estratti proteici sia nucleari che citoplasmatici al fine di evidenziare se esistessero delle differenze di legame tra proteine di origine nucleare/citoplasmatica e rCGG.Negli esperimenti condotti con la sonda L (fig. 3.5) è possibile osservare la progressiva formazione di una banda di ritardo all'aumentare della quantità di proteine nucleari ed in presenza di 4 e 8 g di estratti proteici nucleari si osserva la comparsa di una netta banda di ritardo con contemporanea completa scomparsa della quota di sonda non legata alle proteine (sonda libera). Nelle reazioni condotte con 1 e 2 g di fattori proteici nucleari pur non essendo presente una definita banda di ritardo si riscontra una graduale diminuzione del segnale emesso a livello della sonda libera. Lo stesso esperimento condotto con estratti citosolici mostra la formazione di complessi di ritardo diversi, infatti, le bande di ritardo ottenute dopo incubazione delle sonde con gli estratti nucleari migrano più lentamente rispetto ai complessi ottenuti dopo incubazione con i fattori citosolici delle cellule COV434. Inoltre una volta formati, i complessi ottenuti con gli estratti citosolici migrano sempre alla stessa distanza anche al crescere della quantità di proteine, come ad indicare il verificarsi di una saturazione dei siti di legame a livello dell'RNA e/o la scarsa formazione di complessi proteina-proteina che porterebbero alla creazione di aggregati proteici di dimensioni sempre maggiori e quindi alla formazione di complessi di ritardo più lenti, condizione che invece si verifica negli esperimenti condotti con gli estratti proteici nucleari. Come già osservato negli esperimenti condotti con i fattori nucleari, anche negli esperimenti di R-EMSA con gli estratti citosolici si osserva una diminuzione di segnale a livello della sonda libera al crescere di quest'ultima.Per quanto riguarda gli esperimenti di band-shift effettuati con la sonda S incubata con gli estratti nucleari si nota la formazione di una banda di ritardo ben definita solo in presenza di 8 g di estratti, senza però una completa deplezione della sonda libera. Inoltre nelle incubazioni con gli estratti citosolici solo una piccola quota della sonda è sottratta da parte delle proteine citosoliche, mentre la maggior quantità di sonda S migra a livello della sonda libera (fig. 3.5).I risultati ottenuti suggeriscono una diversa affinità tra le due sonde analizzate e gli estratti proteici delle COV434. In particolare la sonda L nella quantità di 20fmoli è completamente legata da 4 g di estratti nucleari delle COV4343, mentre la sonda S, sempre nella quantità di 20 fmoli, non viene mai completamente sottratta neanche dopo l'incubazione con 8 g di estratti proteici. Per verificare la specificità delle interazioni tra l'RNA composto da 76 ripetizioni e le proteine nucleari di origine ovarica, sono stati allestiti esperimenti di competizione omologa ed eterologa in cui ad una quantità fissa di proteine (4g) e di sonda marcata (20 fmoli) è stato aggiunto, in quantità molari crescenti,(fino a 100 volte rispetto alla quantità della sonda), il competitore. Come competitore omologo è stata utilizzata la sonda L non marcata con isotopi radioattivi, mentre come competitore eterologo, la sonda S non marcata; l'eterogeneità di quest'ultimo rispetto alla sonda calda è quindi rappresentata da un diverso numero di ripetizioni e non da una differenza di sequenza in basi.In caso di specificità di legame tra la sonda 32 P-L e i fattori nucleari ovarici, l'aggiunta del competitore L freddo in eccesso molare dovrebbe inibire la formazione dei complessi 32 P-L-proteine. Nella figura 3.6 è mostrato il risultato degli esperimenti di competizione omologa: il saggio è stato condotto con l'utilizzo di una scala di quantità di competitore che è stato aggiunto in quantità equimolare rispetto alla sonda calda (1X) e poi in un eccesso molare di 10, 50 e 100 volte sempre in presenza di tRNA 100X. I risultati ottenuti mostrano una diminuita capacità di legame della sonda L all'aumentare del competitore omologo, evidenziata come un progressivo aumento della quota di sonda libera.L'esperimento di competizione eterologa è invece volto a valutare la possibilità che la sonda L ed S vengano legate da pool di proteine differenti; infatti nel caso in cui il competitore eterologo aggiunto alle reazioni di binding in eccesso molare fosse in grado di inibire il legame della sonda L sarebbe verosimile ipotizzare che le due sonde siano in grado di legare le stesse proteine. Al contrario, nel caso in cui la sonda S, che differisce solo per il numero di ripetizioni CGG dalla L, non fosse in grado di competere con la reazione di binding si potrebbe supporre che le due sonde siano legate da differenti specie proteiche oppure che la sonda L sia molto più affine della S alle stesse proteine. I risultati ottenuti rispecchiano la seconda situazione: l'RNA da 28 rCGG aggiunto in eccesso molare alla reazione di binding non è in grado di impedire la formazione di complessi tra l'RNA 32 P-L e gli estratti nucleari delle COV434.Nel complesso i risultati degli esperimenti di competizione omologa ed eterologa suggeriscono che l'RNA costituito da 76 rCGG sia in grado di legare in modo specifico proteine nucleari di origine ovarica e che questo legame sia più affine, oppure coinvolga specie proteiche differenti, rispetto a quello dell'RNA composto da 28 rCGG.  Tali indagini hanno permesso di identificare varie isoforme delle proteine appartenenti alla superfamiglia delle hnRNPs. Successivamente, è stata estesa l'identificazione di tutte le maggiori bande presenti nel gel con tecnica ESI, in collaborazione con il Prof. Santoro e la Dott.ssa Cavaletto dell'Università del Piemonte Orientale. In tabella 3.1 sono riassunte le proteine identificate dei campioni analizzati. Per confermare i risultati ottenuti dall'analisi in spettrometria di massa le reazioni di pull down effettuate in presenza della sonda L ed S sono state separate per SDS-PAGE, trasferite su filtro di nitrocellulosa e sottoposte aWestern Blotting (WB) utilizzando gli anticorpi diretti verso alcune delle specie proteiche identificate (Hsp27, CRYAB, hnPNP A1, hnRNP A2/B1, hnRNP H e hnRNP F) come mostrato in figura 3.8. Si può notare come alcune delle proteine testate per WB leghino maggiormente la sonda L, ma nessuna in modo esclusivo ad eccezione della hnRNP A2/B1. Nel caso di questa proteina, la banda rilevata per WB è molto debole nell'esperimento di legame con la sonda L ed il fatto di non rilevare nessun segnale nell'esperimento condotto con la sonda S non è quindi indice che questa proteina non leghi la sonda ad RNA più corta. Si può però affermare che nel caso in cui il legame tra la proteina hnRNP A2/B1 la sonda S avvenga, è minore la quota di proteina che partecipa a questo legame rispetto alla quantità che si lega alla sonda L.  Queste osservazioni sono in accordo con i dati presenti in letteratura, si pensa infatti che la presenza di un numero di ripetizioni nel range della premutazione abbiano un effetto negativo sullo fase iniziale della traduzione a causa della struttura secondaria assunta da questa regione (Primerano et al., 2002;Chen et al.,2003). È possibile quindi affermare che questa condizione si presenta anche in cellule di derivazione ovarica.Successivamente sono stati allestiti esperimenti di immunofluorescenza per valutare la distribuzione della proteina Hsp27. Nelle cellule transfettate con il   Le proteine sono state estratte con RIPA buffer, che è un tampone in grado di lisare sia la membrana cellulare che quella nucleare; il procedimento prevede la lisi in ruota a 4C e la centrifugazione a freddo per separare le proteine estratte (nel surnatante) dalle membrane e dagli organelli cellulari che rimangono nel pellet. E' noto che una parte delle proteine, la frazione più insolubile rimane nel pellet per questo motivo è stato deciso di analizzare sia gli estratti solubili presenti nel surnatante che gli estratti insolubili che rimangono nel pellet delle cellule lisate con il RIPA buffer.Negli estratti insolubili si trovano tutte le proteine che sono maggiormente complessate a livello nucleare, e quindi probabilmente possibili aggregati RNAproteine indotti dalla presenza di elevati livelli di RNA premutato, se presenti, potrebbero essere maggiormente rappresentati dalla frazione insolubile.Le proteine sono state separate tramite Western blot e successivamente il filtro di nitrocellulosa è stato fatto reagire con gli anticorpi anti-Hsp27 (Santa Cruz),anti-B-cristallina (Santa Cruz) e anti-GAPDH (NOVUS bio). Le bande ottenute sono state quantificate con il software image-J.L'intensità delle bande dell'Hsp27 e di B-cristallina sono state rapportare all'intensità della GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) che è stata utilizzata come normalizzatore poichè è un gene housekeeping.I costrutti utilizzati sono: il CMV-FMR1(CGG) 0 -EGFP rappresentante il controllo negativo che permette di valutare se la sola espressione del costrutto crea tossicità all'interno della cellula, ed CMV-FMR1(CGG) 76 -EGFP che permette di mimare la condizione patologica all'interno delle cellule di derivazione ovarica.Lo studio sulla proteina B-cristallina riportato nel Figura 3.12, evidenzia come al secondo giorno dopo la transfezione aumenta la quantità di questa proteina nella frazione proteica solubile, mentre al sesto giorno l'aumento della proteina sembra spostarsi nella frazione insolubile; questo risultato avvalora l'ipotesi della formazione di aggregati tra RNA e proteine.   I dati riportarti riguardano l'analisi dei primi due cloni esprimenti il costrutto CMV-FMR1(CGG) 76 -EGFP, i risultati del terzo clone sono ancora in fase di elaborazione.Come si può notare dalle figure 3.17 e 3.18 i livelli degli mRNA di B-cristallina e Hsp27 risultano significativamente aumentati, suggerendo che la presenza di ripetizioni CGG nel range della premutazione alteri l'espressione di questi geni da stress.    