Le digestioni di DNA vengono effettuate grazie all'utilizzo di endonucleasi; enzimi in grado di tagliare le molecole di DNA a doppio filamento. La digestione viene solitamente allestita over night alla temperatura di +37°C. La quantità totale di enzima utilizzato non deve superare 1/10 del volume totale poiché gli enzimi sono conservati in glicerolo, la cui eccessiva presenza nella miscela di reazione potrebbe compromettere l'esito della digestione. Ogni enzima deve essere utilizzato con il proprio buffer che è ricco di sali e migliora l'efficienza della digestione.