La pirazinamide entra nella cellula del micobatterio attraverso un trasporto attivo presente sulla membrana cellulare. Nel citoplasma del batterio è presente un enzima, detto Pirazina Amidasi, che converte la pirazinamide in acido pirazinoico. Avendo l'acido un gruppo carbossilico, al pH 7,4 del citoplasma, sarà deprotonato e quindi il protone viene rilasciato nell'ambiente cellulare, facendo sì che il pH citoplasmatico diventi acido. Il pH acido inattiva l'enzima FAS1 (Fatty Acid Sintase di tipo 1), un enzima vitale per la sintesi degli acidi grassi, e distrugge il batterio.