Proporzionalmente al dosaggio, il teniposide provoca rotture (a singolo o a doppio filamento) del DNA oltre a cross-link tra DNA e proteine. Il meccanismo d'azione prevede l'inibizione della topoisomerasi II, poiché il teniposide non si intercala nel DNA né si lega saldamente a esso. Gli effetti citotossici del teniposide sono commisurati al numero di rotture a doppio filamento prodotte nelle cellule; ogni rottura corrisponde infatti a un'interruzione dell'azione della topoisomerasi II al momento della formazione dell'intermedio DNA-topoisomerasi II.