Finiti gli studi in seminario, Pavlov decise però di non diventare prete e si iscrisse invece alla facoltà di Medicina dell'Università di San Pietroburgo. Durante gli studi universitari ebbe grande influenza su di lui il suo insegnante di fisiologia, il prof. Ilya Cyon. Quest'ultimo consigliò a Pavlov di collaborare con M.I. Afanasiev, con il quale fece infatti i suoi primi esperimenti sulla fisiologia dei nervi della ghiandola pancreatica, sui quali pubblicò un lavoro che gli valse numerosi riconoscimenti. In seguito lavorò spesso con Ivan Romanovich Tarkhanov, un sostituto di Cyon, con cui ebbe però un rapporto conflittuale.