I segni clinici evocatori più caratteristici dell'osteosarcoma sono rappresentati da dolore, tumefazione della sede colpita e talora da limitazione funzionale.Un'evenienza non infrequente è infine la frattura in seguito a trauma del segmento osseo che è sede di malattia.La neoplasia accresce rapidamente, il tempo medio intercorrente dalla comparsa dei sintomi alla diagnosi è di circa tre mesi. Le metastasi diffondono elettivamente per via ematogena. Le sedi più frequenti di localizzazione metastatica sono il polmone (90% dei casi) ed altri segmenti scheletrici (pelvi, corpi vertebrali, ossa lunghe). Raro è in genere l'interessamento linfonodale. Al momento della diagnosi le metastasi evidenti sono polmonari nel 10-20% dei casi e ossee nel 3%, tuttavia la maggior parte dei pazienti si presenta con metastasi già esistenti ma non ancora clinicamente evidenziabili. A dimostrazione di ciò, in alcuni studi clinici è emerso che tra i pazienti con malattia localizzata trattati con la sola escissione chirurgica della lesione primitiva solo l'11% non presentava recidiva di malattia o metastasi al followup.Il sospetto diagnostico si pone sulla base del peculiare aspetto radiologico di lesione litica (10%), addensante (30%) o mista, in genere localizzata a livello delle metaepifisi delle ossa lunghe ed interrompente la corticale. Segni indiretti sono rappresentati dalla presenza del triangolo di Codman, di immagini radiopache a denti di pettine, a barba, a sole radiante. La Tomografia Computerizzata e la Risonanza Magnetica del segmento colpito definiscono meglio l'estensione del tumore, l'interessamento del canale midollare, i rapporti con il fascio vascolo-nervoso, l'eventuale coinvolgimento delle parti molli circostanti e la presenza di altre lesioni isolate lungo il segmento osseo (dette "skip metastasis"), rilevabili nel 5% dei casi di osteosarcoma.L'esame istologico tramite esecuzione di biopsia ossea conferma l'esatta natura della lesione.Le indagini strumentali indispensabili alla stadiazione comprendono TC e RMN dell'osso colpito, RX e TC torace, studio completo dello scheletro mediante scintigrafia ossea con 99 Tc. , alla comprensione della risposta istologica alla chemioterapia preoperatoria quale principale fattore prognostico che permette di variare la chemioterapia postoperatoria 91,92 .La prognosi dei pazienti con osteosarcoma in recidiva resta ancora molto severa ed è strettamente correlata a diversi fattori prognostici: il trattamento iniziale, l'intervallo tra la diagnosi e l'insorgenza delle metastasi, la sede, il numero e le dimensioni delle lesioni, la presenza di metastasi viscerali o ossee 93,94 . Il ruolo della chemioterapia nell'osteosarcoma in recidiva non è ancora ben chiaro, soprattutto nei pazienti pesantemente protrattati 95,96,97 . Nuove strategie devono essere ricercate nel tentativo di migliorare la prognosi dei pazienti recidivanti, soprattutto controllare la malattia minima residua e la remissione clinica ottenuta.La strategia più esplorata è stata quella dell'intensificazione delle dosi di chemioterapia con supporto di cellule staminali autologhe, la quale ha permesso di ridurre la tossicità del ciclo terapeutico, permettendo di incrementare le dosi dei farmaci. L'Italian e lo Scandinavian Sarcoma Group (ISG-SSG) hanno delineato un protocollo di fase II (ISG-SSG-I) con alte dosi di chemioterapia e reinfusione di cellule staminali periferiche autologhe 98 .Ancora, l'utilizzo del trapianto di cellule staminali allogenico non mieloablativo nei pazienti affetti da tumori solidi si propone di generare una risposta immune T-mediata verso le cellule tumorali, definita effetto "trapianto contro tumore" 99,100,101.La terapia cellulare T ha suscitato negli ultimi anni molto interesse.L'osservazione della presenza di linfociti T citotossici verso il tumore circolanti nel sangue periferico di pazienti con osteosarcoma fa ipotizzare un loro utilizzo dopo espansione in vitro. Questa ipotesi terapeutica innovativa andrebbe associata o alternata a quella tradizionale. Tuttavia l'espansione di cellule T reattive verso cellule tumorali è resa difficile dall'insorgenza di meccanismi di tolleranza tumorale. I linfociti T riconoscono gli antigeni tumorali in modo limitato rispetto ai linfociti specifici per gli agenti patogeni e, presumibilmente, falliscono nell'attivazione in vivo ignorando le cellule tumorali 102 .Nell'ottica di esplorare nuove strategie di immunoterapia antitumorale, altri studi descrivono l'infusione di linfociti infiltranti il tumore (TIL) 103 , la vaccinazione con peptidi tumorali 104 o con cellule dendritiche pulsate con lisati tumorali o peptici 105,106 . A causa della difficoltà di generare linee cellulari di osteosarcoma, di espandere linfociti T citotossici e di identificare antigeni specifici per l'osteosarcoma, un'immunoterapia per questo tumore è stata valutata solo tardivamente. La recente scoperta di antigeni delle famiglie MAGE, SSX, SART hanno avviato lo sviluppo di strategie immunoterapiche anche nell'osteosarcoma, finora considerato poco immunogenico 107,108 .La famiglia di antigeni MAGE è espressa a livello dell' mRNA in molti tumori di differente tipo istologico, ma non è presente in tumori benigni o nei tessuti sani, eccetto per il testicolo (sito immuno-privilegiato) e la placenta. La perdita del controllo della metilazione di questi geni porta alla loro espressione nelle cellule tumorali. Gli antigeni MAGE 1-3 sono chiamati "tumor-rejection antigen" perché i tumori che esprimono questi antigeni sono rigettati dai CTL dell'ospite [109][110][111][112] .Sudo e collaboratori hanno studiato l'espressione degli antigeni MAGE-1,2,3,4 e 6 a livello dell'm-RNA e di MAGE-1 e 4 a livello proteico in 20 linee di osteosarcoma ed in 8 campioni di tumore fresco, ottenendo rispettivamente una positività del 47-52% e 62-75% a livello dell'm-RNA e del 4,8-38% a livello proteico 113 .I geni SSX sono membri della famiglia "cancer/testis antigen". Gli antigeni SSX 1,2,4,5 sono espressi in molti tumori ma non sono presenti nei tessuti sani, eccetto per il testicolo e la tiroide a bassi livelli 114 . Naka e collaboratori hanno testato 17 campioni di tumore freschi per SSX-1 e 2, ottenendo una positività del 76% a livello dell'm-RNA 115 . Ayyoub e collaboratori hanno testato 2 linee ed 1 tessuto fresco di osteosarcoma, ottenendo positività per SSX-1, 2 e 4 su una delle due linee cellulari ed positività per SSX-1 e 5 sul tessuto fresco a livello genico 116 .I geni della famiglia SART-3 giocano un importante ruolo nella proliferazione cellulare e non sono espressi nei tessuti sani, ad eccezione del testicolo e del fegato fetale 117 .Tsuda e collaboratori hanno testato 20 linee di osteosarcoma e 9 campioni tumorali freschi per SART-3 a livello proteico, rilevando una positività rispettivamente del 100% e 67% 118 .Un altro "tumor-rejection antigen", SART-1, è stato identificato da Ishida e collaboratori a livello del citoplasma del 62% delle linee e del 38% dei tessuti freschi di osteosarcoma analizzati 119 . SART-1 non può tuttavia essere utilizzato come fonte di antigeni tumorali in quanto è espresso da tutte le cellule in attiva proliferazione, nonché per la sua localizzazione citoplasmatica e non di membrana.I maggiori ostacoli nello sviluppo di un'immunoterapia comprendono l'identificazione degli antigeni che suscitano una risposta tumore-specifica ed il superamento dei meccanismi di evasione del sistema immune. Studi preliminari devono pertanto essere eseguiti per ottimizzare le condizioni di coltura, il tipo e la concentrazione di citochine stimolanti la proliferazione cellulare, la captazione, presentazione degli antigeni e la costimolazione da parte delle cellule dendritiche.Scopo di questo lavoro è stato quello di determinare gli eventuali effetti immunosoppressivi indotti in vitro da cellule di osteosarcoma.In particolare, essendo la presenza delle molecole co-stimolatorie sulla superficie delle cellule dendritiche di cruciale importanza nel determinare la sorte anergica o produttiva dei linfociti T, è stata presa in analisi la maturazione delle DC in base alla valutazione dell' aspetto immunofenotipico ed alla produzione di specifiche citochine.Le tre sottopopolazioni di cellule dendritiche (DC 14+, DC1 di origine mieloide, DC2 di origine linfoide) sono pertanto state analizzate e confrontate, in presenza ed assenza di linee di osteosarcoma, nei seguenti aspetti:-il livello di espressione immunofenotipica da parte delle cellule dendritiche dei marcatori di maturazione coinvolti nella presentazione Abbiamo inoltre indagato uno spettro di potenziali strategie di reversibilità attraverso l'introduzione in coltura di tre sostanze che, per meccanismi differenti, sono dotate di proprietà immunostimolanti:" " #  I surnatanti di tutte le condizioni di coltura sono stati prelevati per la misurazione dei livelli di IL-10 e IL-12p70 in sandwich ELISA.