La catena L è una metalloproteasi il cui sito attivo si trova coperto all'interno della struttura proteica circostante; i substrati della BoNT sono 3 proteine SNARE, coinvolte nel processo di esocitosi cellulare: VAMP/sinaptobrevina, SNAP-25 e la sintaxina 86 .La sintaxina e SNAP-25 si trovano sulla membrana plasmatica neuronale, mentre la VAMP si trova sulla membrana della vescicola sinaptica. Durante il processo di esocitosi le proteine SNARE interagiscono tra loro e formano dei fasci (ogni fascio è formato da una α-elica della VAMP, due α-eliche della SNAP-25 e una della sintaxina), che avvicinano la membrana della vescicola a quella del neurone tirandole reciprocamente 87 .La specificità della BoNT verso queste proteine è dovuta a multiple interazioni della catena L con le proteine SNARE sia a livello del sito di clivaggio sia a livello di altri siti contigui 88 .Le BoNT hanno una struttura che permette alla catena L di arrivare a livello del citosol della cellula bersaglio, dove può svolgere la sua attività di metalloproteasi 89 .Il meccanismo d'azione può essere suddiviso in 5 fasi 89 :1. Legame al terminale nervoso  le tossine botuliniche si legano con alta affinità e specificità a due recettori della membrana pre-sinpatica presenti sui terminali del sistema somatico e autonomo 90    Grazie a questo meccanismo, il rilascio dell'acetilcolina è bloccato ed essa rimane intrappolata dentro le vescicole sinaptiche; l'attività muscolare diminuisce determinando una denervazione chimica. Il blocco neuromuscolare stimola la gemmazione di nuovi terminali assonici che formano nuove giunzioni neuromuscolari.L'attività muscolare ritorna in modo graduale dopo circa 3-6 mesi.Un aspetto importante della neuroparalisi indotta dalla BoNT è la sua completa reversibilità; questo è dovuto al fatto che la tossina botulinica non ha effetto citotossico né neurodegenerativo 91 .La durata della paralisi dipende da vari fattori tra cui il tipo di BoNT, la dose utilizzata, la modalità di somministrazione e il tipo di terminale nervoso 89 . La durata delle varie tossine botuliniche disponibili è maggiore per la BoNT/A e la BoNT/C 92 ; sono stati riportati anche casi in cui la BoNT/A ha mantenuto la sua attività per un periodo di 1 anno 93 .Una tossina con durata maggiore permette di effettuare meno iniezioni e di utilizzare dosi minori, limitando la possibilità di una risposta immunitaria contro la tossina stessa 89 .