Le proteine del campione sono separate usando l'elettroforesi in gel. La separazione di proteine può avvenire per punto isoelettrico (pI), peso molecolare, carica elettrica, o una combinazione di questi fattori. La natura della separazione dipende dal trattamento del campione e dalla natura del gel. Questo modo è il più usato per identificare una proteina. Il tipo più comune di elettroforesi in gel impiega gel di poliacrilammide (Elettroforesi su gel di poliacrilammide) e tamponi caricati con laurilsolfato di sodio (SDS). La SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) mantiene polipeptidi in uno stato denaturato una volta trattato con agenti riducenti forti per rimuovere strutture secondiarie e terziarie (esempio disolfuro e gruppi mercaptani [SH e SH) e permettere la separazione di proteine in base al loro peso molecolare. Le proteine campionate legano il SDS che conferisce loro carica negativa e si muovono in questo modo verso l'elettrodo positivo attraverso le "mesh" del gel. Le proteine più piccole migrano più velocemente attraverso questa "mesh" e le proteine vengono separate in base alla dimensione (misurata in kiloDalton, kDa). La concentrazione di acrilammide determina la risoluzione del gel - maggiore la concentrazione, migliore la risoluzione di proteine a basso peso molecolare. Le proteine viaggiano solo in una dimensione lungo il gel per diversi blot. I campioni sono caricati in "wells" (pozzetti) nel gel. Una striscia è usualmente riservata per un "marcatore" o "scala", una miscela commerciale di proteine con peso molecolare definito, tipicamente colorate così da formare bande colorate visibili. Quando la tensione elettrica è applicata lungo il gel, le proteine migrano attraverso esso a velocità differenti, in funzione della loro dimensione. Queste differenti velocità di avanzamento ("mobilità elettroforetica") permettono la separazione in "bande" dentro ciascuna "corsia".