Una vasta gamma di fluorofori può essere utilizzata come marcatori nella citometria a flusso. I fluorofori, sono normalmente legati ad un anticorpo che riconosce un antigene bersaglio sulla superficie o all'interno della cellula. I fluorofori possono anche essere collegati a un'entità chimica con affinità per la membrana cellulare o un'altra struttura cellulare. Ogni fluoroforo ha una caratteristica lunghezza d'onda di eccitazione e di emissione, e gli spettri di emissione spesso si sovrappongono. Di conseguenza, la combinazione di marcatori che possono essere utilizzati dipende dalla lunghezza d'onda della/e lampada/e o laser utilizzati per eccitare i fluorocromi e dai rivelatori disponibili. Si ritiene che il numero massimo di marcatori fluorescenti distinguibili sia 17 o 18 e questo livello di complessità richiede una laboriosa ottimizzazione per limitare gli artefatti, nonché complessi algoritmi di deconvoluzione per separare gli spettri sovrapposti. La citometria a flusso utilizza la fluorescenza come strumento quantitativo; la massima sensibilità della citometria a flusso è ineguagliata da altre piattaforme di rilevamento fluorescenti come la microscopia confocale. La sensibilità assoluta alla fluorescenza è generalmente inferiore nella microscopia confocale poiché i segnali fuori fuoco vengono rifiutati dal sistema ottico confocale e poiché l'immagine è costruita in serie da misurazioni individuali in ogni punto della cellula, ciò riduce la quantità di tempo disponibile per raccogliere il segnale. 