I campioni di latte umano sono stati raccolti da donne che avevano partorito, prima del termine, ad un'età gestazionale compresa tra le 23 settimane e le 36 settimane di età gestazionale.Il latte fresco, donato dalle donne, dopo adeguato consenso informato, è stato raccolto all'interno di contenitori (Flormed, Napoli, Italia) costituiti da un materiale in polietilene ad alta densità, sterilizzati per mezzo dell'ossido di etilene.Il campione di latte materno è stato ottenuto facendo svuotare completamente un solo seno, mediante l'utilizzo di un tiralatte elettrico.Dal latte ottenuto sono stati prelevati 4 ml, successivamente suddivisi in due frazioni da 2 ml ciascuna.Una delle frazioni è stata immediatamente congelata a -20°C, mentre l' altra è stata prima pastorizzata e poi successivamente congelata, sempre a -20°C.La pastorizzazione è stata eseguita con un Pastorizzatore Sterifeed della Medicare Colgate Ltd (Cullompton, England). Per pastorizzare i campioni di latte umano si è utilizzato il metodo Holder che consiste nel portare la temperatura del latte fino a +62,5°C per 30 minuti. (31;61) La fase seguente di questo ciclo richiede un rapido e preciso raffreddamento dei campioni di latte fino a raggiungere una temperatura di 10° C in approssimativamente 20 minuti, attraverso l'immersione in acqua fredda.La preparazione dei campioni: il latte congelato è stato rapidamente decongelato, ponendolo sotto un flusso di acqua tiepida.Il latte è stato poi diluito con rapporto 1:1 con aceto-nitrile.Dopo essere stato mescolato, il campione è stato centrifugato a 4000 rpm per 15 minuti. Il supernatante è stato poi diluito in proporzioni di 1:50 (v/v) con acqua ultrapura (acqua PLUS da HPLC) e filtrato attraverso una membrana di 0,22µm (Millipore, Bedford, MA, USA).Metodi analitici: un campione di latte di 25µm è stato iniettato, per mezzo di un campionatore automatico Dionex (Sunnyvale, CA, USA), in un sistema di cromatografia liquida ad elevata risoluzione (High Performance Anion Exchange Chromatography, HPAEC) DX 500 Dionex.Questo sistema è costituito da una colonna di CarboPac PA-1 (4x250mm), da una seconda colonna CarboPac PA (3x25mm) e da un detettore elettrochimico (ED40) con un elettrodo in oro, il tutto supportato da un software PeakNet.La separazione è stata ottenuta brevemente come segue, come descritto da Coppa et al (237) :Eluente 1 -a 100mM di soluzione di NaOH Eluente 2 -a 100mM di soluzione di NaOH con 1M di Na-acetato Il sistema è stato eluito con una velocità di flusso di 0,7 ml min -1 attraverso un Modulo di Pompa a Gradiente (GP50) che utilizza i gradienti che seguono:- La composizione dei picchi è stata identificata attraverso il tempo di scorrimento di ciascun elemento, e quantificata attraverso la comparazione delle aree dei picchi dei campioni con l'area dei picchi standard ( riportati di seguito in Tabella 6).La comparazione tra latte umano fresco e pastorizzato è stata eseguita considerando solamente il latte di madri di gruppo secretore 1 (Secretore +;Lewis +), perché il loro latte contiene più fucosil-oligosaccaridi rispetto agli altri gruppi.  Tale metodica, infatti, è in grado di distruggere la flora patogena del latte, compreso il Mycobacterium tuberculosis, oltre che alcuni virus ( HIV-1, HTLV 1-2, Cytomegalovirus,Herpes Simplex e Rubella) (62;63;64) , ma a questi effetti positivi si associa l'inattivazione di alcuni fattori immunologici e anti-infettivi, come la riduzione delle IgA e delle IgG, del lisozima e della lattoferrina,e la distruzione delle IgM e del complemento (65;66). Tuttavia, con la pastorizzazione Holder rimangono invariati alcuni importanti fattori nutrizionali (lattosio, PUFA, acidi grassi, gangliosidi) e altri fattori biologici (amilasi) e le vitamine A,D,E. (67;68) Il nostro studio indica che gli oligosaccaridi e per conseguenza anche gli effetti clinici di questo componente biologicamente attivo del latte umano, sono preservati anche dopo la pastorizzazione.Gli oligosaccaridi del latte umano possiedono un effetto prebiotico, dimostrato da tempo. Avendo la caratteristica peculiare di essere formati da legami particolari fra i monosaccaridi, resistono all'azione enzimatica esercitata su di loro a livello dell'intestino del neonato e del bambino e, per conseguenza, gran parte degli oligosacccaridi ingeriti con il latte materno passa indigerito per il piccolo intestino, raggiungendo integri il colon. Qui gli oligosaccaridi indigeriti vengono metabolizzati dalla microflora con la produzione dell'"effetto biomassa" caratterizzato dal selettivo sviluppo di flora bifidogena (166) . Sono molti i benefici derivati da una microflora dominata da Bifidobatteri, quali:Inibizione della crescita di batteri patogeni da parte degli stessi Bifidobatteri e Lattobacilli attraverso la produzione di acido lattico, acetico e di altri acidi organici, con conseguente riduzione del pH intestinale.Competizione con i batteri patogeni per quanto riguarda l'adesione epiteliale e i nutrienti Recupero di substrati da parte della flora residente attraverso la fermentazione di carboidrati non digeribili e il "salvataggio" dell'azoto.Promozione della maturazione mucosale e miglioramento dell'assorbimento di acqua e nutrienti Modulazione della fisiologia, della funzione di barriera e delle risposte infiammatorie ed immunitarie (156) .Inoltre, il processo di fermentazione batterica porta alla produzione di acidi grassi a corta catena (acetato, propionato, butirrato) i quali possiedono effetti trofici sulla mucosa, oltre ad essere utilizzati per il riassorbimento dell'acqua (167;168;241) .Gli oligosaccaridi del latte umano competono con i recettori cellulari per il legame di agenti patogeni. Infatti gli oligosaccaridi sono degli analoghi dei ligandi di adesione: la loro struttura mima la porzione di carboidrati, delle glicoproteine e dei glicolipidi presenti sulle membrane cellulari dell'epitelio, inibendo così il legame dei microorganismi patogeni alla superficie degli epiteli. Questa funzione biologica degli oligosaccaridi è dovuta al fatto che lo stesso tipo di glicosil-transferasi responsabile della sintesi dei glicani di superficie delle membrane cellulari umane, sintetizza anche gli oligosaccaridi del latte umano. In questo modo i due prodotti di sintesi hanno gran parte delle componenti strutturali comuni.La maggior parte dei patogeni enterici utilizza le glicoproteine di superficie per identificare e legare le cellule target nel primo critico passaggio della patogenesi. Quindi gli oligosaccaridi solubili del latte umano sono in grado di inibire competitivamente la capacità dei patogeni di legare i recettori intestinali, proteggendo il neonato da svariati microorganismi, bloccando all'origine lo sviluppo di tutti i loro potenziali patogenetici (242;243) . Gli agenti infettivi che vengono attivamente inibiti dagli oligosaccaridi, non sono solo patogeni enterici, come l' E.coli, il Norovirus, il Rotavirus, la Salmonella, lo Pseudomonas aeruginosa, il Vibrio colerae e il Campylobacter, ma sono anche patogeni che vanno a colpire altri organi e apparati, quali lo Streptococcus pneumoniae, la Listeria monocytogenes, l'Helicobacter pylori, l'Haemophilus influenziae, la Neisseria meningitidis, e molti altri. Gli effetti anti-adesivi e anti-microbici sono, quindi, sia locali (laringofaringe, polmoni, SNC stomaco, piccolo intestino, colon) che sistemici.Infine l'escrezione renale di questo componente attivo del latte materno è stato dimostrato chiaramente, sottolineando un effetto potenzialmente protettivo verso le infezioni del tratto urinario (129) .Inoltre, gli oligosaccaridi del latte umano hanno un effetto immunomodulatore, sono in grado di ridurre: la formazione dei complessi piastrine-neutrofili selectina mediati. Si pensa siano coinvolte le selettine e le integrine di membrana. Probabilmente gli oligosaccaridi impediscono la creazione del ponte di legame tra CD62P e una selettina dei neutrofili, la quale attiva un segnale a cascata portando a un aumento di espressione delle integrine e all'attivazione del complesso.l'attivazione e la migrazione dei leucociti. L'eccessiva infiltrazione dei leucociti nei tessuti causa ingenti danni in una grande varietà di patologie infiammatorie. I leucociti per fuoriuscire dai vasi necessitano di selettine.Gli oligosaccaridi sono i recettori fisiologici delle selettine ed è per questo che gli oligosaccaridi del latte umano riescono a interagire con i leucociti inibendone l'adesione endoteliale e il rolling (244) .Gli effetti antimicrobici e immunomodulatori hanno un ruolo rilevante nell'alimentazione del neonato pretermine, più vulnerabile, con latte materno e, in accordo con i nostri risultati, anche con il latte umano donato pastorizzato. Esso può essere un valido sostituto del latte materno fresco mantenendo inalterati gli agenti di questi effetti antimicrobici e immunomodulatori.Due meta-analisi hanno rilevato una riduzione di incidenza di enterocolite necrotizzante nei neonati pretermine o di basso peso, alimentati con latte umano donato rispetto a quelli nutriti con latte artificiale (17;18) . Sebbene l'eziopatologia della NEC non sia del tutto chiarita, si ipotizza l'associazione di più fattori quali: l'immaturità dell'intestino, le difese immunitarie immature, l'alimentazione enterale e la colonizzazione batterica dell'intestino.Gli oligosaccaridi del latte umano svolgono un ruolo protettivo attraverso il loro effetto trofico sulla mucosa intestinale, i loro effetti anti-adesivi e anti-microbici e il loro effetto favorente lo sviluppo selettivo di una flora microbica bifidogena (166) . Ha, inoltre, un ruolo importante nella propagazione della NEC la risposta infiammatoria del bambino a livello dell'insulto primario (245) . Poiché gli oligosaccaridi del latte umano inibiscono l'adesione leucocitaria al sito di infiammazione e riducono la formazione di complessi piastrine-neutrofili ad elevata attività, possono contribuire attivamente, anche attraverso questa via, alla protezione del bambino allattato al seno, dalla NEC, così come dalle altre patologie infiammatorie (43;222;246;247) .Inoltre, i recenti studi di Ronnestad e di Schanler (35;20) hanno rilevato come, nel neonato pretermine, un'alimentazione basata su latte umano di banca riduca l'incidenza di sepsi e l'indice di mortalità associata alla sepsi, rispetto a un'alimentazione con formula.Quindi, gli effetti protettivi del latte umano contro le infezione di varia natura, sono molto maggiori rispetto a quelli che può offrire un latte artificiale. Parte di questo effetto protettivo, svolto dal latte umano, è dovuto alla presenza di diversi tipi di oligosaccaridi in varie concentrazioni, date le loro caratteristiche anti-microbiche e immunomodulatorie.Il nostro studio, dimostrando che gli oligosaccaridi non subiscono variazioni statisticamente significative nelle concentrazioni prima e dopo la pastorizzazione del latte umano, mette in evidenza come il latte di banca sia un valido sostituto del latte materno, se necessario, e come gli oligosaccaridi, non subendo variazioni rispetto a molti altri elementi immomodulatori e anti-infettivi, siano alla base di molti dei vantaggi propri del latte umano rispetto ai latti artificiali.In conclusione il nostro studio conferma, per quanto concerne gli oligosaccaridi, la persistenza del valore biologico del latte umano anche dopo la pastorizzazione.