In vitro, a diverse concentrazioni, la gentamicina è in grado di inibire la crescita di "Escherichia coli" ed altri coliformi, nonché di altri batteri Gram negativi ("Pseudomonas aeruginosa", "Proteus vulgaris", "Proteus morganii", "Proteus mirabilis", "Klebsiella pneumoniae", "Serratia marcescens", "Stenotrophomonas maltophilia", "Enterobacter sakazakii", "Aerobacter aerogenes"). Tra i batteri sensibili alla gentamicina sono compresi anche diversi Gram positivi (ceppi di "Staphylococcus aureus", compresi quelli produttori di penicillinasi). Sensibili in misura minore, alcuni Streptococchi, tra cui i beta-emolitici e alfa-emolitici di gruppo A). In genere resistenti a gentamicina ed altri amminoglicosidi sono alcuni germi anaerobi (Bacteroides, e diversi Clostridium) e alcuni Streptococchi (specie quelli del gruppo D).