Separazione di linfociti CD4+ da sangue periferico I campioni di sangue, prelevati in provette con EDTA, sono stati sottoposti alla separazione dei linfomonociti su gradiente di densità di Ficoll. I campioni di sangue, precedentemente diluiti in soluzione fisiologica, sono stati stratificati su Ficoll (Fycoll-Hypaque, Sigma, Milano) e sottoposti a centrifugazione a 1800 rpm per 30 minuti, a temperatura ambiente. I linfomonociti così isolati sono stati sottoposti a successivi lavaggi con soluzione fisiologica ed eventuale lisi dei globuli rossi (metodo dell'NH 4 Cl) e quindi sottoposti alla metodica del bigliaggio paramagnetico. Le cellule sono state risospese in un'apposita soluzione (PBS, BSA 0.1% e siero fetale bovino -FCS -Gibco, Milano), cimentate con il mix di anticorpi specifici (Antibody Mix Dynal Biotech, OSLO, Norvegia) ed incubate a 4 I risultati sono stati espressi in µg/ml secondo la seguente formula: I campioni sono stati preparati in ghiaccio, incubati 10 minuti a temperatura ambiente, passati sul vortex e retrotrascritti su apparecchio GeneAmp R PCR System 9700 (Applied Biosystems) secondo il seguente programma:• 10 min 20 Quarantanove casi (43%) sono stati trattati con successo (remissione di lunga durata) soltanto con steroidi; in 53 casi (46%) allo steroide è stato associato un ciclo di agente alchilante (ciclofosfamide nel 97% dei casi, clorambucile in soli due casi); in 20 (38%) di questi casi la ciclosporina ha ottenuto una remissione. Gli altri 33 bambini (62%), a causa di una risposta insoddisfacente con corticodipendenza, hanno richiesto l'inserimento in terapia della ciclosporina A; soltanto 3 di loro (9%) non hanno avuto una risposta adeguata (figura 6.19). Dodici bambini (10%) hanno presentato un quadro di corticoresistenza; nessuno di questi ha ottenuto risultati soddisfacenti dal trattamento con ciclosporina (figura 6.19).Trentuno casi, a causa della resistenza alla terapia o dell'atipicità della presentazione, sono stati sottoposti ad agobiopsia renale percutanea. Tra questi pazienti, selezionati quindi negativamente, 6 (19%) presentavano un quadro istologico di glomerulonefrite a lesioni minime, 10 (32%) di glomerulosclerosi focale e segmentaria, 9 (29%) di glomerulonefrite a depositi mesangiali di IgM, 2 (7%) di sclerosi mesangiale infantile, uno di nail-patella syndrome ed un altro di "full house nephropathy" (figura 6.20). Due bambini (7%) sono invece risultati essere affetti da glomerulonefrite membranosa, causa di sindrome nefrosica molto rara in età pediatrica [75,77,88]; entrambi hanno risposto ad un trattamento con steroidi associati ad agente alchilante (metilprednisolone 10 mg/kg e.v. in 3 boli, seguiti da prednisone 0.5 mg/kg per un mese e clorambucile 0.2 mg/kg per un altro mese; l'intero ciclo è stato ripetuto per 3 volte).In due pazienti la funzionalità renale è peggiorata fino a richiedere il trattamento dialitico sostitutivo ed in altri due si è osservata un'insufficienza renale di grado medio (clearance creatininica 50 ml/min/1.73 m 2 ); tutti gli altri bambini risultano al momento ancora normofunzionanti, con valori di clearance creatininica superiori a 90 ml/min/1.73 m 2 .