Anche per i cluster che entrano nella cavità con gli esteri nitrici (Figura 34a, cerchio rosso) alcune pose hanno ∆G debolmente negativo (≅ -0.3 kcal mol -1 ), ma sono presenti anche qui evidenti clash sterici (cerchio nero) con i residui della cavità, la cui superficie è rappresentata in giallo in Figura 34b. I risultati del docking confermano quindi i dati farmacologici, che mostrano come i triesteri nitrici di entrambe le serie di fatto non subiscano metabolismo da parte dell'ALDH-2 in maniera apprezzabile. dell'anello sia altamente conservata. In particolare, l'anello benzenico si posiziona tra l'anello della Phe459 e quello della Phe170 (Figura 35a). Alla luce di quest'osservazione sono state riconsiderate le pose del monoestere benzilico 3; anche in questo caso si manifesta quella collocazione del nucleo aromatico, come mostrato in Figura 35b, ma in pose (score ≅ -2.8 kcal mol -1 ) nelle quali la catena alchilica assume una conformazione molto ripiegata. Consultando il database delle conformazioni ottenute mediante ricerca stocastica in soluzione acquosa (modello di Born), si nota che la differenza di energia di questo tipo di conformazioni rispetto al minimo globale è dell'ordine di 2.5 kcal mol -1 . Nel caso del composto 6 invece la differenza media di energia rispetto al minimo globale in soluzione è decisamente minore (0.8 kcal mol -1 ). La maggiore penalità energetica subita dal composto 3, e il contributo entropico più sfavorevole dovuto alla perdita di un maggior numero di gradi di libertà conformazionale nel formare il complesso con l'enzima, permettono di dare una spiegazione razionale del fatto che i due monoesteri interagiscano con affinità diversa con l'enzima. Il quadro fornito dal molecular modeling è in accordo con i dati farmacologici che mostrano come l'attività del composto 6 risenta maggiormente dell'inibizione dell'ALDH-2 rispetto al composto 3.Più complessa è la situazione dei quattro diesteri aromatici. Analizzando i database ottenuti dal docking si notano numerosi cluster; quello principale comprende in media 80 pose, con score da -2.5 a 0 kcal mol -1 . Questo indica che piccole variazioni conformazionali influenzano notevolmente la bontà del fit con il sito attivo, il che naturalmente complica l'analisi. Negli altri cluster la molecola entra dal lato dell'anello benzenico, in pose non produttive. Anche in questo caso l'anello benzenico si colloca tra i due residui Phe170 e Phe459 (Figura 36), ma per la serie benzilica le pose che la presentano sono in numero minore e subiscono una grossa penalità energetica rispetto al minimo globale in soluzione (4 kcal mol -1 ), vedendo la catena alifatica costretta in conformazioni decisamente ripiegate.Queste differenze tra i diesteri delle due serie suggeriscono una spiegazione qualitativa ai dati farmacologici, che evidenziano una minore bioattivazione da parte di ALDH-2 per la serie benzilica. Tuttavia, per tutti e quattro i diesteri, dalle pose del docking non è evidente quale dei due gruppi nitrossilici partecipi alla reazione. Infatti, le conformazioni fornite dal docking sono circa egualmente suddivise tra quelle che posizionano il gruppo nitrossilico primario in prossimità del gruppo tiolico di Cys302 e quelle che affacciano invece l'estere nitrico secondario. Per capire se, come nel caso del GTN, l'estere nitrico primario sia quello maggiormente reattivo si rendono necessari ulteriori studi di metabolismo. favorevole per l'attacco, il che è in contrasto con i dati di letteratura sul metabolismo che indicano come, per bioattivazione da parte dell'ALDH-2, si formi la 1,2-dinitroglicerina e non il derivato 1,3.Le pose ottenute per questa molecola sono divise in due cluster (∆G da -1.5 a -0.5 kcal mol -1 ) e presentano caratteristiche diverse, a causa dell'elevata flessibilità della struttura. Come mostrato in Figura 37a sono presenti pose con score simile (-1.5 kcal mol -1 ) ma con caratteristiche molto diverse, anche se la distanze dei gruppi nitrossilici dal gruppo tiolico di Cys302 sono costanti (≅ 3,5Å). La struttura arancione (penalità energetica conformazionale rispetto al minimo globale in soluzione ≅ 4 kcal mol -1 ) affaccia un gruppo estere nitrico secondario al gruppo tiolico di Cys302, mentre quelle azzurra e verde (penalità energetica conformazionale ≅ 2 kcal mol -1 ) affacciano un gruppo estere nitrico primario. Nel caso della GTN, che diversamente dai composti oggetto di questa tesi non possiede anelli aromatici, uno degli esteri nitrici sembra essere coinvolto in interazioni di van der Waals con gli anelli benzenici di Phe170 e Phe459 (Figura 37b). In conclusione, il comportamento e la potenza dei composti studiati non può essere correlato in maniera immediata né con la lipofilia né, in contrasto con quanto precedentemente pubblicato in letteratura, con il numero di gruppi nitrossilici. Infatti, il logP dei derivati (Tabella 2) è, in questa serie, poco modulato, mentre per quanto riguarda il numero dei nitrossigruppi, i dinitrossi derivati sono i vasodilatatori più potenti, seguiti dai trinitrossi-e dai mononitrossi-derivati. Il coinvolgimento dell'enzima ALDH-2 nella bioattivazione dei di e dei mono nitrossiderivati (rispettivamente circa 2 e 5 volte meno potenti della GTN), è in disaccordo con un lavoro di recente pubblicazione (Wenzel et al., 2007a), secondo cui è il numero dei gruppi nitrossilici a determinare il profilo di Tabella 2. LogP di tutti i composti calcolati con CLOGP v. 4.0 (BioByte corp.).