Oggi, invece, grazie al recente sviluppo di sequenziatori automatici che sfruttano la metodica di Sanger, il processo è effettuato molto più rapidamente. Il metodo automatico richiede l'uso di dideossinucleotidi marcati con fluorofori diversi a seconda della base azotata presente, che emettono fluorescenza quando sono sottoposti ad una certa lunghezza d'onda.Il risultato di questa reazione produrrà dei frammenti di DNA nei quali le diverse basi saranno identificate da quattro colori diversi e ogni colorante reagisce alla luce emettendo una propria fluorescenza.In sostanza, dopo l'avvenuta amplificazione, i campioni vengono purificati e inseriti nel sequenziatore; qui sono sottoposti ad una elettroforesi capillare, durante la quale il campione viene colpito da una sorgente luminosa (laser) e i vari coloranti emettono una fluorescenza che viene rilevata da un sensore; il segnale elaborato da un opportuno software mostra in forma grafica a quattro colori la sequenza del DNA (elettroferogramma).Nel seguente studio, è stata effettuata, innanzitutto, la quantificazione del template. In un gel di Agaroso al 2%, si sono fatti correre 2 µl di campione con 1 µl di colorante: per la quantificazione è stato utilizzato il marker Puc19 diluito 1:2. Dopo aver effettuato la diluizione del campione amplificato, si è purificato con ExoSAP-IT ® (Figura 21). 1 µl di ExoSAP-IT ® è stato aggiunto a 2,5 µl di campione amplificato diluito: si è lasciato incubare 15 minuti a 37°C per consentire la degradazione dei primers e dei nucleotidi residui da parte dei due enzimi. Per inattivare i due enzimi, si è poi incubato a 80°C per 15 minuti.A questo punto, è stato utilizzata per la reazione di sequenza, una particolare miscela, detta Mix Terminator Ready Reaction, del kit BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems). Questa miscela contiene una particolare polimerasi, la AmpliTaq DNA polimerasi FS, simile all'enzima prodotto dal Thermus aquaticus, ma ottenuta da un gene con due mutazioni puntiformi sito-specifiche.Una di queste mutazioni determina la sostituzione dell'aminoacido fenilalanina con una tirosina nel sito catalitico dell'enzima, portando ad un aumento di affinità nei confronti dei dideossinucleotidi, substrato non naturale per l'enzima. L'altra mutazione elimina l'attività esonucleasica 5'-3', evitando così che i nucleotidi appena inseriti nel filamento di nuova sintesi vengano eliminati. La polimerasi viene associata ad una pirofosfatasi stabile al calore che determina il taglio del pirofosfato inorganico (PPi) generato dalla reazione di estensione del DNA, impedendone l'accumulo. Se così fosse, si favorirebbe infatti la reazione inversa alla polimerizzazione, cioè i nucleosidi monofosfato marcati potrebbero staccarsi dal filamento in crescita ed essere sostituiti da quelli non marcati, impedendo l'identificazione del nucleotide in quella posizione.La Mix Terminator contiene, oltre alla polimerasi, un tampone Tris HCl a pH 9, magnesio, deossinucleosidi trifosfato e i quattro dideossinucleotidi marcati.Tra i deossinucleotidi è incluso dITP al posto di dGTP e dUTP al posto di dTTP per facilitare l'incorporazione di ddTTP.La miscela finale della reazione di sequenza ha un volume totale di 10 µl ed è costituita da:-2 µl di primer diluito 1:20 (1,6 pM) -X µl di campione da valutare in seguito alla concentrazione di DNA presente -Y µl di acqua deionizzata per raggiungere il volume finale stabilito.La reazione di sequenza è stata introdotta in un termociclizzatore automatico (TProfessional Thermocycler, Whatman-Biometria) e sottoposta ad un programma di amplificazione che prevede, dopo 1 minuto a 96°C per la denaturazione iniziale, 28 cicli così programmati:-Denaturazione: 96° C per 10 secondi -Ibridazione del primer: 50°C per 5 secondi -Estensione: 60°C per 4 minuti.Una volta terminata l'amplificazione, il prodotto di PCR deve essere purificato prima di essere sottoposto ad elettroforesi. La purificazione è necessaria per eliminare eventuali residui di tampone, sali e nucleotidi marcati che potrebbero interferire con la rivelazione della fluorescenza durante l'elettroforesi.Per tale processo sono state utilizzate delle particelle in silice paramagnetiche di diametro compreso tra 1 e 3 µm costituite per l'80% da ferro per permettere una rapida attrazione da parte del magnete. Alla miscela di reazione da purificare è stata aggiunta una miscela formata dalle particelle paramagnetiche e da una soluzione di etanolo. L'uso di un supporto magnetico ha permesso ai frammenti di DNA, legati alle particelle, di essere rapidamente separati dal resto dei componenti della miscela. Una serie di lavaggi con una soluzione di etanolo ha completato la purificazione del materiale genetico: i frammenti purificati sono stati alla fine eluiti dalle particelle mediante l'aggiunta di buffer.Dopo la denaturazione, i frammenti di DNA, contenenti all'estremità 3' uno dei quattro dideossinucleotidi marcati, sono pronti per essere analizzati dallo strumento ABI PRISM 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems). Tale strumento realizza l'elettroforesi e analizza, con l'aiuto di un software adeguato, l'emissione della fluorescenza. L'apparecchio è costituito da due unità: una camera elettroforetica dotata di un raggio laser fisso e un computer esterno collegato alla camera. La camera è suddivisa in una zona contenente un carrello removibile su cui vengono posti i tubi con la miscela da sequenziare, i contenitori del tampone e dell'acqua, il catodo ed un'estremità del capillare in cui avviene l'elettroforesi.Un'altra zona contiene un recipiente con il tampone di corsa in cui è posto l'anodo ed un sistema costituito da una siringa che inietta un polimero nel capillare.L'ultima zona, infine, è quella in cui il capillare giunge in prossimità del raggio laser. Il capillare è un tubo di vetro di 50 µm di diametro e di lunghezza variabile, con un rivestimento opaco per tutta la sua lunghezza, eccetto che nella zona attraversata dal laser. Durante l'elettroforesi, i frammenti di DNA marcati a singolo filamento si muovono all'interno del capillare contenente il polimero POP-6 (Performancer Optimizer Polymer 6%) in direzione dell'anodo e, colpiti dal laser, emettono fluorescenza. A contatto con il capillare e con gli elettrodi si trova il tampone di corsa (Genetic Analyzer Buffer), in modo tale che si possa generare la differenza di potenziale necessaria alla corsa elettroforetica. Una volta generata questa differenza di potenziale, gli elettrodi e il tampone vengono a contatto con il primo campione, il quale è iniettato all'interno del capillare per via elettrocinetica, cioè grazie a un flusso di corrente che si genera dal catodo verso l'anodo.Successivamente il catodo e il capillare sono di nuovo immersi nel tampone per generare una nuova differenza di potenziale che permetta la migrazione dei frammenti di DNA attraverso il polimero. Il sequenziatore è anche dotato di un contenitore con acqua deionizzata per lavare il capillare quando questo si sposta da un campione all'altro.In prossimità della "zona finestra" del capillare, i frammenti di DNA Alla fine i dati raccolti sono riportati su tipici grafici caratterizzati da picchi di quattro colori diversi, ognuno dei quali rappresenta l'intensità di fluorescenza emessa dai vari fluorocromi, riportata sull'asse y. L'asse x riporta invece la lunghezza della sequenza esaminata in paia basi.La sequenza consensus di ciascun amplificato, ottenuta dal confronto tra il filamento senso e quello antisenso, è stata confrontata con quella presente sul database Ensembl, che può essere trovato nel sito www.ensembl.org: Ensembl transcript ID: ENSG00000134982.   E' stata confrontata la frequenza dei portatori eterozigoti dei 4 polimorfismi rilevata in questo studio con i dati presenti nel database NCBI Reference Sequence Assembly (Tabella 13).