In una prima serie di esperimenti i CTL sono stati espansi secondo la metodica classica per la generazione di cloni EBV-specifici. (142) In breve: i PBMC del donatore (2 × 10  In primo luogo abbiamo testato le linee di osteosarcoma già stabilizzate (Tab. 9a) e 20 donatori sani (Tab. 9b) al fine di trovare dei soggetti HLA-A24 da utilizzare nella prima serie di esperimenti e soggetti con HLA compatibile a quello delle linee di osteosarcoma stabilizzate da utilizzare per la terza serie di esperimenti.In seguito abbiamo proceduto con 4 serie di esperimenti:1) generazione di CTL utilizzando cellule dendritiche di donatori sani pulsate con peptidi ristretti per HLA di classe I delle famiglie MAGE, SSX e SART-3 (esperimenti numero 1 -12).2) generazione di una linea CTL utilizzando cellule dendritiche di un donatore sano pulsate con il lisato cellulare di una linea già stabilizzata di osteosarcoma (HOS) (esperimento numero 13)3) generazione di una linea CTL utilizzando una linea di  La citofluorimetria eseguita il giorno dell'Elispot evidenzia un'espansione dei linfociti CD4+ (Fig. 6). Con l'ELISPOT Assay abbiamo ottenuto delle risposte molto forti verso tutte le linee di osteosarcoma, eccetto le MG63, e verso i peptidi MAGE-A2, SART-1, SART-3 a , SART-3 b , SSX-2, mentre una risposta moderata verso i peptidi MAGE-A3 a , MAGE-A3 b . Il dosaggio delle citochine ha evidenziato un lieve aumento di IFN-γ ed una discreta secrezione IL-12p70.13) L'esperimento numero 13 è stato effettuato stimolando i PBMC del donatore A1 con il lisato della linea HOS. Come APC sono state utilizzate le DC autologhe, ottenute con il metodo dell'aderenza, lento, e pulsate per 2 ore con il lisato tumorale prima di essere maturate ed irradiate a 30 Gy; tutte e tre le stimolazioni sono state effettuate ad un rapporto effettore stimolatore di 20:1. Con l'ELISPOT Assay si è ottenuta una risposta specifica molto forte, confermata anche dalla persistenza della risposta con la diluizione delle cellule effettrici; nessuna risposta è stata evidenziata verso le altre linee di osteosarcoma, verso le K562 e verso i PHA blasti autologhi. Non si sono evidenziate grandi variazioni di fenotipo tra le cellule iniziali e quelle finali dell'esperimento. Per rendere più facile la valutazione abbiamo riportato i grafici con i dati riassuntivi degli aspetti principali, quali le curve di crescita dei CTL (Fig. 11), la citofluorimetria (tabelle 11a e 11b e figura 12) e le concentrazioni delle citochine nei surnatanti, IFN-γ (Fig. 13), IL-10 (Fig. 14) ed IL-12p70 (Fig. 15).Abbiamo anche riprodotto un esempio dei PBMC CD14+ ottenuti dopo la separazione su colonnina magnetica (Fig. 16) e della citofluorimetria (Fig. 17), un esempio delle DC immature (Fig. 18) e delle DC mature nel giorno del loro utilizzo per la stimolazione dei CTL (Fig. 19) con la valutazione citofluorimetrica (Fig. 20