Nato in un villaggio del Linlithgowshire, Robert era figlio del pastore scozzese e inventore Henry Liston (1771-1836) e nipote di un altro Robert Liston (1730–1796), Moderatore dell'Assemblea Generale della Chiesa di Scozia. Liston studiò a Edimburgo, seguendo le lezioni di John Barclay (1758-1826) e terminando poi gli studi a Londra. Nel 1818 divenne docente di anatomia presso l'Università di Edimburgo e chirurgo alla "Royal Infirmary" della stessa città. Il suo carattere rude e a volte arrogante gli inimicò la classe medica della città, tanto che nel 1835 accettò la cattedra Clinica Chirurgica presso l'University College di Londra. Tuttavia la sua popolarità era tale che si organizzò una cena pubblica in suo onore prima della partenza. Era un chirurgo abile e veloce, specializzato soprattutto nella calcolosi vescicale e nelle amputazioni, per le quali inventò nuove tecniche e strumenti. Alcuni di questi strumenti, tra cui alcuni tipi di forcipe, sono in uso ancora oggi. Nel film "La vera storia di Jack lo Squartatore", con Johnny Depp, nel dialogo fra l'ispettore di polizia indagatore sugli omicidi commessi a White Chapel e il medico chirurgo della Regina Vittoria, quest'ultimo cita Liston e il suo coltello da amputazione, cioè il coltello di Liston. 