Inizialmente, l'enzima in questione si lega ad un tratto di DNA dove la doppia elica presenta una locale denaturazione. La separazione dei due filamenti è favorita dall'alta densità dei superavvolgimenti negativi della molecola. Uno dei due filamenti denaturati si lega ad un distretto dell'enzima che lo pone vicino alla tirosina. Ora è necessario che l'altro terminale del taglio sia tenuto saldamente dall'enzima. Dopo aver effettuato il taglio, la topoisomerasi è sottoposta ad un grande cambiamento strutturale che crea un'apertura all'interno del filamento tagliato. Il secondo filamento integro ora passa attraverso l'apertura e si lega ad un sito interno della proteina. A seguito del passaggio si ha la risaldatura del filamento con l'intervento di un OH sul legame fosfo-tirosina.