Nonostante i suoi sforzi, ormai nelle Università dominavano delle nuovi correnti di pensiero, quella atea, quella materialista e soprattutto quella positivista. Il positivismo era il movimento più numeroso, polemico e battagliero e si basava sulla totale adesione ai fatti, ai dati sperimentali e all'osservazione. Ad una prima analisi, potrebbe sembrare che il metodo sperimentale di Bufalini fosse vicino al positivismo scientifico, ma in realtà il medico cesenate aveva una visione metodologica radicalmente diversa, aliena dai filosofismi e legata solo all'indagine medica; pertanto si trovò in contrasto anche con loro, il cui maggior esponente era Jacob Moleschott, residente a Torino, dove presiedeva alla cattedra di Fisiologia.