La molecola è dotata di un ampio spettro di azione, molto simile a quello di altri composti della stessa classe (ad esempio la ciprofloxacina), e risulta efficace nei confronti di diversi batteri Gram–positivi e Gram–negativi. Come tutti i chinoloni la besifloxacina agisce inibendo in modo selettivo i due tipi di enzima topoisomerasi, la DNA–girasi (conosciuta anche come topoisomerasi II) e la topoisomerasi IV. Questi due enzimi sono fondamentali per la cellula batterica, regolando i processi di duplicazione, trascrizione e riparazione dell'acido deossiribonucleico (DNA) nei batteri. Il blocco di entrambi gli enzimi porta quindi alla morte del batterio.