La rifampicina agisce direttamente sulla sintesi di RNA messaggero. Inibisce solamente l'RNA Polimerasi procariotica iniziata dal DNA, specialmente nei batteri gram-positivi, come il "Mycobacterium tubercolosis", che lo è leggermente. Infatti le prove mostrano che DNA in vitro trattato con una concentrazione 5000 volte maggiore della dose normale rimane inalterato; l'RNA e DNA Polimerasi in vivo di cavie eucariote hanno avuto a loro volta pochi problemi. La membrana della maggior parte di questi batteri Gram-positivi è acido micolico con peptidoglicano, il che permette un facile ingresso del medicinale nella cellula. La rifampicina interagisce con la subunità β dell'RNA Polimerasi quando questa è in un trimero α2β. Questo blocca la trascrizione dell'RNA messaggero, impedendo così la traduzione dei polipeptidi. Deve essere specificato comunque che non può bloccare l'allungamento dell'mRNA una volta che è iniziato il legame con il filamento senso di DNA.