Le sequenze primer fungono da innesco appaiandosi in modo complementare al filamento di RNA. I primer più comunemente usati sono gli oligo(dT), ovvero sequenze oligonucleotidiche di timidina pensate per appaiarsi alla coda poliadenilata degli RNA. Se invece si vuole amplificare un campione di RNA privo della coda di poliadenosina i primer più indicati sono gli "esameri casuali" (in inglese "random hexamers") o i "nonameri casuali" (in inglese "random nonamers"): sequenze casuali di 6 o 9 basi che essendo appunto casuali possono potenzialmente fungere da primer per qualsiasi sequenza stampo di RNA. Alcuni ricercatori utilizzano una combinazione di entrambi i primer per ottenere una miscela con le caratteristiche di entrambi. In alternativa, è anche possibile utilizzare un primer specifico, nel caso si voglia retrotrascrivere solo un ben determinato RNA.