Le MPN sono malattie clonali, originate da cellule staminali pluripotenti e caratterizzate dall' espansione dei progenitori di una o più linee differenziative mieloidi a livello midollare, che si riflette poi con l'aumentato numero di cellule mieloidi a livello periferico.Le MPN più frequenti sono la leucemia mieloide cronica (CML), la policitemia vera (PV), la trombocitemia essenziale (ET) e la mielofibrosi primitiva (PMF); le ultime tre sono anche definite MPN Philadelphia negative (MPN Ph-).A livello fenotipico, le MPN condividono la conservazione quasi completa del processo maturativo delle cellule, tanto che queste, pur presentando alcune alterazioni funzionali, mantengono un'attività nel complesso conservata, e le diatesi infettiva ed emorragica, notevolissime nelle leucosi acute, sono decisamente rare.Questo fenomeno è in parte spiegabile a livello patogenetico: la maggior parte delle MPN sembra essere dovuta ad aberrazioni che, direttamente o indirettamente, promuovono un'eccessiva attivazione dei pathways delle tirosin chinasi, rendendo le staminali ipersensibili ai normali fattori di crescita, e stimolando una loro proliferazione indipendentemente da questi ultimi. La CML è sicuramente l'esempio principe: nella fase cronica, essa sembra essere sostenuta solamente da BCR-ABL e, se si riesce ad inibire quest'ultimo, la malattia è estremamente rallentata. Purtroppo BCR-ABL comporta anche un'instabilità genomica che favorisce ulteriori mutazioni, che, a loro volta, possono portare alla fase blastica [1]. Nell'ambito delle MPN Philadelphia negative, invece, non è ancora stata trovato il primum movens della malattia, e si suppone ci siano altre alterazioni oltre a JAK2 (la tirosin chinasi più frequentemente mutata nelle MPN Ph-). Una o più di queste mutazioni potrebbero essere responsabili dell'instabilità genomica che provoca la comparsa di JAK2 mutato; altre potrebbero svilupparsi in un clone neoplastico con un antenato comune al clone con JAK2 mutato; altre potrebbero svilupparsi insieme a JAK2 e modularne il fenotipo. In qualsiasi caso, se esse contribuiscono alla proliferazione cellulare, potrebbe essere importante cercare di inibirle in modo specifico. Come già detto, individuare la mutazione genetica che sta alla base delle MPN o che ne accelera la progressione, sembra essere, ad oggi, la strada migliore per tentare di combatterle.Ipotizzando che questi difetti genetici siano a carico delle tirosin chinasi, nel nostro laboratorio è stato condotto uno studio preliminare che ha valutato l'espressione genica di 93 proteine ad attività tirosin chinasica nelle diverse MPN Ph-, grazie all'utilizzo delle microfluidic card (PCR real time). Fra queste proteine è emerso il recettore EphA3, il cui gene è risultato significativamente iperespresso in diversi campioni analizzati.Il recettore EphA3 è un recettore ad attività tirosin chinasica (RTK), ed appartiene alla famiglia dei recettori Eph. I membri di questa famiglia sono particolari rispetto agli altri RTK: innanzitutto non hanno ligandi solubili, come i classici fattori di crescita: essi si legano alle efrine, ancorate alle membrane cellulari, e ciò induce un segnale bidirezionale.Inoltre questi recettori intervengono principalmente su morfologia, adesione e migrazione cellulare, essendo fondamentali nello sviluppo, mentre il loro ruolo nello stimolare la proliferazione è secondario: fisiologicamente, anzi, molti di questi recettori inibiscono la via Ras-MAPK. Ma la peculiarità più importante di questi recettori è forse l' estrema complessità del loro funzionamento: a seconda della cellula, dell'intensità e della modalità con cui vengono attivati, del microambiente e delle condizioni della cellula stessa (sana, tumorale, in adesione, in sospensione..), un solo recettore può produrre effetti completamente diversi. A livello neoplastico, ad esempio, possono promuovere sia la progressione sia la soppressione del tumore. La deregolazione di questi recettori è stata evidenziata appunto in diversi tumori, soprattutto solidi, dove gli Eph sono implicati soprattutto in processi di invasione e metastatizzazione; oggi comunque, diversi studi hanno ormai decretato che alcuni Eph, in particolari condizioni, possono stimolare la proliferazione cellulare. [42] L'EphA3 è stato isolato in una linea cellulare di leucemia linfoblastica acuta pre-B; da allora, l'iperespressione, e talvolta la mutazione dell'EphA3, è stata evidenziata in diversi tumori solidi. In ambito ematologico, l'iperespressione dell'EphA3 è stata rilevata in diverse linee cellulari e in alcune patologie, ma sempre nel compartimento linfoide; per quanto riguarda la linea mieloide, sono presenti rare segnalazioni riguardanti la AML, ma nessuno studio ha mai preso in considerazione le MPN. [62] Lo studio a tappeto sulle tirosin chinasi ha quindi portato ad un risultato inaspettato: esso ha messo in evidenza un RTK diverso dagli altri, apparentemente poco coinvolto nella proliferazione, la cui iperespressione non era mai stata indagata nelle MPN: esso sembra in parte discostarsi dal modello di 'ipersensibilità ai fattori di crescita' tipico di altre MPN; bisogna tenere presente, tuttavia, che gli effetti dei recettori Eph possono essere estremamente diversi da cellula a cellula, e che quindi il suo ruolo nelle cellule di MPN possa essere in parte diverso da quelli descritti finora, ad esempio a livello proliferativo.Da queste premesse è nato il presente studio, volto ad indagare il coinvolgimento dell' EphA3 nell'emopoiesi fisiologica e nelle MPN, ed all'individuazione di un eventuale bersaglio terapeutico.Innanzitutto è stata valutata l'espressione genica del recettore su un'ampia casistica di pazienti, soggetti normali e linee cellulari: lo studio ha confermato quanto osservato nello studio preliminare a minore casistica: il 20% di tutti i campioni patologici, infatti, hanno presentato una significativa iperespressione del gene EphA3 rispetto a quella osservata nei normali, che presentano valori minimi. L'iperespressione è evidente soprattutto nei campioni di sangue midollare (40,42%), in particolar modo a livello delle MPN Ph-(60% dei campioni midollari) o nelle CML in fase accelerata/ blastica (casistica molto esigua, ma virtualmente il 50% dei campioni midollari). Non sembra esistere, invece, una correlazione tra la mutazione di JAK2 e l'iperespressione dell'EphA3.All'aumento dell'espressione genica di EphA3, corrisponde un incremento della traduzione proteica, come dimostrato mediante analisi Western Blot, IF e FACS con specifici anticorpi monoclonali. Questi stessi test ci hanno permesso di vedere che la proteina è correttamente localizzata in membrana ed in grado di attivarsi mediante fosforilazione in tirosina. La proteina, quindi, è presente in quantità maggiori e funzionalmente attiva, suggerendo un forward signaling chinasi dipendente.La popolazione midollare ha evidenziato un livello di trascritto ancora maggiore rispetto alla popolazione periferica, tendenzialmente più differenziata; questa supposizione è stata confermata dall'analisi dell'espressione proteica (IF e FACS) nella popolazione CD34+: la frazione cellulare CD34+, ottenuta da pazienti affetti da MPN, risulta esprimere il recettore EphA3 sulla superficie cellulare, a differenza delle CD34+ provenienti da soggetti normali. Questo dato è estremamente importante, in quanto dimostra che l'EphA3 non è un marcatore di maturazione; permette inoltre di ipotizzare un ruolo patogenetico di questo recettore nelle MPN e di proporlo come bersaglio di una target therapy.A questo punto abbiamo cercato di capire i meccanismi responsabili dell'aumentata trascrizione e dell' aumentata espressione. Le ipotesi sono diverse: sono possibili amplificazioni geniche, mutazioni, traslocazioni e modificazioni epigenetiche; infine, un'ultima possibilità da considerare è che l'iperespressione non sia 'primitiva', ma sia la risposta ad un aumento del ligando.Amplificazione o riarrangiamenti non sono stati rilevati in nessuna delle linee cellulari tumorali linfoidi in cui era stata inizialmente evidenziata l'elevata espressione di EphA3 [63]. Fino ad oggi, le uniche mutazioni a carico del gene EphA3 sono state identificate in linee cellulari e campioni di pazienti affetti da tumori solidi. Nel presente studio è stata valutata la presenza di mutazioni o traslocazioni interessanti il dominio tirosin chinasico in pazienti che presentavano alti livelli di trascritto EphA3, in analogia alla mutazione di BCR-ABL: in nessuno dei campioni analizzati sono state evidenziate alterazioni. Non possiamo escludere, tuttavia, che siano presenti mutazioni in altre parti del gene, ad esempio a livello del promotore o della sequenza codificante il dominio iuxtamembrana inibitorio.Un' ulteriore possibilità da considerare è che l'aumento di EphA3 sia dovuto all'iperespressione di un suo ligando, che potrebbe innescare l'up-regolazione del recettore; questo meccanismo, oltretutto, avrebbe anche potuto spiegare la fosforilazione del recettore stesso. Per questo abbiamo effettuato un'analisi dell'espressione dei ligandi, tramite PCR, a livello delle cellule verosimilmente deputate alla produzione del ligando, ossia cellule stromali e cellule emopoietiche, e non sono state evidenziate differenze significative rispetto ai controlli normali. In alcuni casi abbiamo anche valutato l'espressione di queste proteine nelle cellule emopoietiche in citofluorimetria: è risultata un'espressione molto bassa, probabilmente a suggerire un'attivazione ligando indipendente.Infine potrebbero verificarsi alterazioni nel controllo trascrizionale o alterazioni epigenetiche. A tale proposito, Dottori et al. hanno messo in evidenza una correlazione inversamente proporzionale fra lo stato di metilazione di una regione ricca di dinucleotidi CpG, a valle del promotore basale, ed il livello di espressione genica del recettore EphA3, in linee cellulari tumorali emopoietiche [76]. La trascrizione di EphA3, secondo questa teoria, potrebbe essere deregolata da un meccanismo di ipometilazione del DNA, risultante dalla trasformazione neoplastica. Numerosi lavori presenti in letteratura evidenziano il ruolo della metilazione nella regolazione trascrizionale ed il suo coinvolgimento nei processi neoplastici [78] [79], tra cui patologie oncoematologiche [80], ma nella maggior parte dei casi vi è un'ipermetilazione di geni oncosoppressori, e non un'ipometilazione di oncogeni. Anche nelle MPN si riscontra più frequentemente il meccanismo dell'ipermetilazione, responsabile del silenziamento genico: questo è infatti il razionale all'utilizzo degli agenti demetilanti (azacitidina e decitabina) in alcune di queste patologie. Per valutare i possibili effetti indotti dall'iperespressione di EphA3, abbiamo transfettato due linee cellulari in adesione nelle quali l'EphA3 non è espresso.Le cellule transfettate, in cui il recettore si localizza correttamente a livello transmembranario, presentano delle modificazioni nella morfologia e nell'adesione cellulare. Innanzitutto perdono la capacità di raggrupparsi in cluster cellulari, risultando maggiormente isolate le une dalle altre rispetto a quelle non transfettate; a livello morfologico, poi, si assiste alla retrazione dei processi cellulari e all'assunzione di una forma arrotondata.Effetti analoghi, associati a formazione di vescicole a livello della membrana e distacco dalla matrice, erano stati precedentemente descritti in linee cellulari di melanoma che presentavano elevati livelli di espressione di EphA3 e in cellule epiteliali transfettate con il recettore [74]. I risultati sovra descritti hanno creato i presupposti per una strategia terapeutica basata sull'inibizione selettiva di questa chinasi, più specifica di quella ottenibile col dasatinib: è stato creato un anticorpo umanizzato ad alta affinità per l'EphA3, chiamato KB004(Kalobios Pharmaceuticals Inc., California). Questo anticorpo in vitro ha dimostrato una notevole azione pro-apoptotica verso il clone leucemico (dati non presentati): KB004 induce infatti l'apoptosi dei blasti leucemici CD34+, CD38-CD123+ provenienti da pazienti affetti da AML, e delle cellule Ph+ di pazienti affetti da CML resistente a tutti gli inibitori di tirosin-chinasi attualmente disponibili. Inoltre l'anticorpo inibisce l'attività clonogenica di queste stesse cellule, mentre non ha effetti sulla popolazione di cellule normali [82].Questi dati hanno portato allo sviluppo di un protocollo clinico di fase 1 per il trattamento delle malattie mieloproliferative esprimenti EphA3, ad oggi in corso presso l'MD Anderson Cancer center, Huston, Texas.