Dapprima viene sintetizzata una molecola di DNA a doppio filamento a partire dalla molecola di cDNA, conducendo la reazione a una temperatura adatta a permettere l'annealing dei primer al DNA. Successivamente portando la temperatura a 95 °C, la nuova molecola di DNA si denatura e i due filamenti così separati sono pronti per un nuovo appaiamento dei primer e per la sintesi da parte della polimerasi, a un nuovo abbassamento della temperatura (72 °C circa 1000 bp/minuto). Dopo circa 30 cicli, saranno stati prodotti milioni di copie della sequenza di interesse.