In caso di prostatite batterica cronica vengono rilevati batteri nella prostata anche se non sono presenti altri sintomi. L'infezione della prostata è diagnosticata a seguito della coltura delle urine, dello sperma e del liquido prostatico, quest'ultimo ottenuto dall'urologo eseguendo un massaggio prostatico. Se a seguito del massaggio non è stato possibile raccogliere secreto prostatico, l'urina post-massaggio dovrebbe comunque contenere alcuni batteri prostatici. L'analisi del PSA (Prostate specific antigen) potrebbe mostrare un valore elevato nonostante l'assenza di neoplasie. I campioni di materiale biologico raccolto devono essere inviati in centri specializzati nella diagnosi e terapia delle malattie sessualmente trasmissibili. Occorre infatti eseguire uno screening approfondito per la ricerca di eventuali agenti patogeni. In particolare vanno ricercati nelle urine del primo getto al mattino i micoplasmi urogenitali, la Chlamydia trachomatis, il gonococco e i virus HPV, HSV 1 e 2; utile anche la ricerca delle IgA secretorie anti Chlamydia t. Eventuale esame colturale per germi comuni e miceti. Sullo sperma vanno eseguiti: la spermiocoltura per germi comuni e miceti e Trichomonas vaginalis, la ricerca del DNA di Chlamydia trachomatis e il gonococco mediante test di amplificazione (PCR), la ricerca dell'HPV DNA, HSV1 e 2 DNA, delle IgA secretorie anti Chlamydia trachomatis e dei mycoplasmi urogenitali. Indagini analoghe devono essere eseguite anche dall'eventuale partner.