La diagnosi di pemfigo è tuttavia oggi basata sulla biopsia cutanea. L'esame istologico rivela tipicamente una bolla intraepiteliale acantolitica (per perdita delle giunzioni intercellulari) soprabasale nel pemfigo volgare, con scarso infiltrato infiammatorio. Nel pemfigo foliaceo invece la bolla è subcornea, anche qui con acantolisi e scarso infiltrato. Nei casi in cui vi sia infiltrato, questo è costituito da polimorfonucleati. L'immunofluorescenza mostra depositi di IgG intracellularie depositi di C3. Recentemente introdotti nella diagnostica i kit ELISA per il dosaggio degli anticorpi anti-desmogleina 1 e 3.