La GSK-3 esiste in due isoforme: GSK-3α (51kDa) e GSK-3β (47 kDa). Esse presentano un'omologia complessiva dell'84%, che diventa del 98% considerando i siti catalitici, e pertanto hanno simili proprietà biochimiche. La differenza va ricercata nella loro distribuzione: per quanto siano enzimi ubiquitari, nella maggior parte delle aree cerebrali la GSK-3β è risultata essere l'isoforma predominante 13 .Per questa ragione, ai fini di questo studio sarà presa in considerazione l'isoforma β.Come avviene per la famiglia delle chinasi, la struttura della GSK-3β è costituita da due domini collegati tra loro da una serie di amminoacidi di cerniera (Fig. 5). Il dominio N-terminale (residui 25-138) è organizzato a foglietto β e si presenta come un "barilotto" in cui sette foglietti β si ripiegano in modo antiparallelo su loro stessi conferendogli questa particolare forma, che non compare nei rispettivi domini delle altre serin/treonin-chinasi.Il dominio C-terminale (residui 139-343), invece, è organizzato ad α elica ed ha una topologia paragonabile a quella di numerose altre chinasi.Il sito di legame per l'ATP si trova all'interfaccia dei due domini, racchiuso da un loop ricco di glicine (Fig. 5, G loop). Nella GSK-3β il loop di attivazione (Fig. 5, A loop, residui 200-226) si trova sulla superficie del sito di interazione con il substrato, in faccia al loop catalitico (Fig. 5, C loop, residui 88-100). In questo caso c'è un unico amminoacido, Tyr 216, capace di aumentare tramite fosforilazione l'attività catalitica di più di duecento volte. Esso funge infatti come una sorta di gate per l'entrata del substrato nel sito di legame: quando il residuo è fosforilato la sua catena laterale, stericamente piuttosto ingombrante, si apre verso l'esterno garantendo l'accesso del substrato 14 (Fig. 6). Una peculiarità che contraddistingue la GSK-3β dalle altre chinasi è quella di saper raggiungere una conformazione cataliticamente attiva anche in assenza della fosforilazione del segmento di attivazione 15 . Pertanto, la rilevanza biologica del residuo Tyr 216 non è ancora del tutto chiarita. Certo è che la proteina si trova fisiologicamente fosforilata in vivo nelle cellule a riposo e che la fosforilazione aumenta notevolmente l'attività catalitica dell'enzima, benché non ne costituisca un requisito assoluto 16 . Un ulteriore aspetto non chiaro riguarda l'origine del fosfato: esso potrebbe derivare da altre chinasi, non ancora identificate, o da un meccanismo di tipo autocatalitico, come già dimostrato avvenire nelle cellule batteriche 17 .Un'altra differenza rispetto alle altre chinasi è la mancanza di un secondo sito di fosforilazione: questo fatto giustifica la preferenza da parte della proteina per i substrati già fosforilati, come accennato in precedenza.La GSK-3β riconosce nella sequenza del substrato la combinazione S-XXX-Sp, ovvero l'amminoacido serina (o treonina) seguito da altri tre residui amminoacidici e da un'ulteriore serina (o treonina) già fosforilata da altre chinasi. Nello specifico, la prima costituisce il punto in cui l'enzima effettua la fosforilazione, mentre la seconda funge da "aggancio" per l'interazione enzimasubstrato, aumentando l'attività catalitica di dieci/mille volte. In particolare, tre residui basici (Arg 96, Arg 180 e Lys 205) formano una tasca carica positivamente in grado di ancorare la carica negativa del fosfato (Fig. 7). Diversi studi hanno dimostrato che la serina fosforilata (Sp) va ad occupare la posizione corrispondente nelle altre chinasi al secondo sito di fosforilazione e contribuisce in questo modo al corretto allineamento tra i due domini. In assenza dell'anione, l'intenso potenziale positivo generato da questa tasca non verrebbe adeguatamente neutralizzato e per l'enzima sarebbe complicato mantenere la conformazione attiva 10 . Bisogna però sottolineare che non tutti i substrati necessitano di un fosfato preesistente sulla struttura per interagire con la proteina. Tra le eccezioni rientrano l'axina, la β-catenina e la proteina τ 14 . In particolare per quest'ultima sono previsti entrambi i meccanismi di azione, ma in caso di fosforilazione, l'attività catalitica è aumentata di circa cinquanta volte 18 .Caratterizzazione La tasca positiva costituita da Arg 96, Arg 180 e Lys 205 è sfruttata dall'enzima anche per il suo meccanismo di regolazione. La GSK-3β è infatti in grado di attuare un processo di autoinibizione: qualora una chinasi vada a fosforilare il residuo Ser 9, il tratto dell'N-terminale su cui esso è localizzato funge da pseudosubstrato, ovvero va ad interagire con la suddetta tasca occupandola e precludendo in questo modo l'accesso al substrato. Si tratta di un meccanismo di inibizione di tipo competitivo, pertanto una sufficiente concentrazione di substrato basterà a riattivare la proteina 19 .Un'ultima importante considerazione: il sito di legame per il substrato è ostruito all'interazione monomero-monomero nella conformazione down, la sua fosforilazione e conseguente rotazione nella conformazione up potrebbe interferire con la dimerizzazione 10 .