La vancomicina è in grado di legarsi tenacemente al dipeptide D-Ala-D-Ala che costituisce la parte terminale del pentapeptide del peptidoglicano. La modificazione sterica risultante comporta una compromissione dei meccanismi enzimatici (transpeptidasi) che stabiliscono i legami crociati della parete cellulare batterica. Il risultato finale è simile a quello provocato dalle penicilline, con distruzione della parete e lisi batterica.