La diagnosi di difterite è effettuata principalmente tramite coltura e test di Elek. Dal momento che l'identificazione certa del batterio richiede tempo la terapia deve essere effettuata in base alla diagnosi clinica senza aspettare i risultati delle analisi di laboratorio. L'analisi al microscopio di materiale clinico prelevato dalla nasofaringe o dall'orofaringe colorato con blu di metilene non è attendibile pertanto si preferisce la coltura in agar-sangue arricchito e in un terreno selettivo come agar cisteina-tellurito. Il terreno selettivo agar cisteina-tellurito è molto utile nell'identificazione del batterio in quanto non permette la crescita della maggior parte dei batteri infettanti le vie aeree superiori e dei batteri Gram-negativi, mentre permette quella di Corynebacterium diphteriae che riduce il terreno producendo un pigmento nero. È possibile sospettare la presenza di C. diphteriae qualora i test biochimici rivelino la presenza di cisteinasi e l'assenza di pirazinamidasi. I ceppi di C. diphteriae isolati vanno sottoposti ad un test di Elek per verificare la produzione di tossina difterica. In alternativa si può utilizzare la PCR per individuare il gene "tox" nei campioni, tuttavia alcuni ceppi potrebbero non esprimerlo perché presentano il repressore della tossina difterica attivato.