Le tecniche di citogenetica molecolare sono complementari all'analisi del cariotipo con tecniche di bandeggio Le sonde utilizzabili per la FISH disponibili in commercio sono in costante aumento; inoltre un laboratorio attrezzato può anche costruirsi le sonde di cui necessita autonomamente.Ci sono, in generale, tre tipi di sonde molecolari, ciascuna con differenti campi di applicazione:• le sonde WCP• le sonde a sequenza ripetitiva (RS)• le sonde LSI, o a sequenza unica Le sonde WCP sono complesse sonde a DNA derivate da un singolo tipo di cromosoma: solitamente sono impiegati cromosomi microsezionati, amplificati e marcati per mezzo di una tecnica chiamata degenerate oligonucleotide polymerase chain reaction (DOP-PCR). È così prodotto un "pigmento" in grado di colorare l'intero cromosoma omogeneamente per tutta la sua lunghezza. Sono anche disponibili sonde per parti di cromosoma (braccio-specifiche o regione-specifiche). Questo tipo di sonda è il più utile quando si devono identificare aberrazioni numeriche o strutturali già visualizzate con il G-banding, ma non del tutto chiarite (83) .Le sonde RS sono invece in grado di riconoscere regioni cromosomiche particolari, in cui una determinata sequenza di DNA sia presente in molte migliaia di copie. Alcuni esempi sono le sonde specifiche per il centromero (chromosome enumeration probe, CEP), le sonde pancentromeriche e le sonde pantelomeriche. Le CEP sono particolarmente utili quando sia necessario identificare rapidamente anomalie numeriche in metafase, o meglio ancora in interfase. Le pancentromeriche sono sonde in grado di identificare aspecificamente tutti i centromeri dei cromosomi umani, così come le pantelomeriche identificano sequenze ripetitive presenti su tutti i telomeri (83) .Le sonde LSI identificano sequenze specifiche presenti in una sola copia (sequenze uniche) su un cromosoma. Queste sequenze sono clonate con l'uso di diversi vettori: plasmidi (1 -10 kb) o i vettori PAC, YAC, BAC (80 kb -1 Mb). Le LSI sono sonde utilizzate per identificare specifiche traslocazioni, inversioni o delezioni sia in interfase che in metafase (83) .Nel primi anni '80 si iniziò a marcare il DNA con tecniche alternative: la procedura più utilizzata prevedeva l'incorporazione di nucleotidi di dUTP marcati con biotina nella sonda di DNA. Per il rilevamento della sonda si utilizzava l'avidina, inizialmente accoppiata con una perossidasi; per il rilevamento del segnale era sufficiente un microscopio ottico. Questo sistema enzimatico fu migliorato dall'impiego dei fluorocromi, che, legati all'avidina, erano visibili in corrispondenza delle sonde ibridate, all'osservazione con un microscopio a fluorescenza. Questo tipo di rilevamento del segnale è detto indiretto, poiché la sonda è marcata con una molecola che di per sé non è fluorescente. Altri apteni indiretti utilizzati in passato sono il dinitrofenolo, la digossigenina e l'estradiolo, che vengono legati da anticorpi marcati con flurocromi. I marcatori diretti sono invece molecole di dUTP legati direttamente ai fluocromi: in questo caso, dopo l'incorporazione nella sonda e l'ibridazione, la sonda fluorescente è visibile senza bisogno di altre procedure. In molti casi, l'intensità delle sonde marcate con sistema diretto è più debole rispetto alle sonde indirette, ma poiché il lavoro richiesto per visualizzare la sonda diretta è notevolmente minore, e poiché quasi tutti i laboratori dispongono oggi di sistemi di rilevamento digitale del segnale in grado di intensificarne di molto la luminosità, le sonde dirette sono oggi utilizzate molto più frequentemente. Le sonde indirette sono tuttavia ancora preferite quando devono essere analizzate ibridazioni con sonde molto piccole (84) . I nucleotidi di dUTP marcati con apteni o direttamente con un fluorocromo sono di solito incorporati nella sonda con metodiche di nick-translation o di DOP-PCR (reazione polimerasica a catena con primers degenerati). Nella nick-translation la sonda a doppia elica è tagliata da una DNAsi e parzialmente digerita. Quindi l'elica è riparata da una polimerasi che incorpora i nucleotidi mancanti e anche il dUTP marcato. La nicktranslation è di solito utilizzata per marcare il DNA clonato, come i BAC e gli YAC. La DOP-PCR è usata invece per marcare sonde complesse come quelle ottenute dal flow-sorting o dalla microdissezione (84) .Per gli esperimenti di FISH, generalmente i vetrini sono trattati con un colorante fluorescente di contrasto che lega aspecificamente il DNA. Il contrastante più comune è il DAPI (4',6-diamidino-2-phenyl-indol) che è eccitato nella gamma degli ultravioletti e dà origine a una fluorescenza azzurra. Un altro contrastante relativamente diffuso è lo ioduro di propidio che ha una fluorescenza rossa (84) .La prima generazione di sonde, basata su librerie di DNA fagico cromosoma-specifico, erano scarsamente efficienti, a causa di un rapporto inserto/vettore basso, che spesso portava ad ottenere una colorazione aspecifica, con molto "rumore di fondo" (background noise). Alcune di queste limitazioni furono superate con l'avvento delle librerie plasmidiche, che disponevano di un rapporto inserto-vettore maggiore; la qualità delle ibridazioni era già migliore, tuttavia persistevano alcune imperfezioni, come il fatto che certe regioni cromosomiche (in particolare le zone telomeriche) erano colorate troppo debolmente. Alla fine degli Anni '90 furono proposti due nuovi metodi per la produzione di sonde cromosomiche fluorescenti, la prima basata su un procedimento di flowsorting cromosomico con successiva DOP-PCR, la seconda basata sulla microdissezione di normali cromosomi metafasici, anch'essa seguita da procedure di amplificazione del DNA; entrambe portano all'ottenimento di sonde di alta qualità, in grado di fornire un segnale ben distinguibile dal background noise. La prima tecnica permette di produrre principalmente sonde WCP, la seconda anche sonde regione-specifiche (85) .Le prime applicazioni della FISH avevano come obiettivo la determinazione delle anomalie numeriche nelle cellule mitotiche ed in quelle in interfase, nonché l'identificazione delle aberrazioni cromosomiche strutturali, visualizzabili facilmente su piastre metafasiche.Solo in seguito divenne possibile identificare traslocazioni cromosomiche in cellule in interfase (86) . Nell'approccio standard vengono utilizzate due sonde: una prossimale rispetto al breakpoint sul primo cromosoma coinvolto nella traslocazione ed un'altra distale rispetto al punto di rottura sull'altro cromosoma; le due sonde sono legate a fluorocromi di colori differenti. I nuclei positivi per la traslocazione presentano un segnale di fusione in doppio colore ("dual color fusion"), in corrispondenza di uno dei cromosomi derivativi, più due segnali distinti in corrispondenza dei due cromosomi normali; il secondo cromosoma derivativo non lega alcuna sonda. Nella FISH "dual-fusion, la sonda si lega al DNA cellulare sia distalmente che prossimalmente rispetto ad entrambi i breakpoints sui due cromosomi coinvolti; le sonde hanno fluorocromi di colore diverso sui due cromosomi: nei nuclei positivi per la traslocazione si osservano due copie del segnale di fusione e una copia per ognuno dei due cromosomi normali (87) .Una terza strategia FISH fu progettata per facilitare l'indagine citogenetica su casi in cui un gene chiave viene traslocato in maniera promiscua talora su un cromosoma talora sull'altro: si conosce cioè uno solo dei due cromosomi coinvolti nella traslocazione. Si tratta della tecnica "breakapart", in cui la sonda comprende sequenze di DNA prossimali e distali rispetto al breakpoint, marcate con fluorocromi diversi tra loro su un singolo cromosoma. In questo caso i due segnali fusi identificano una cellula normale, mentre i nuclei in cui è presente la traslocazione evidenziano un segnale di fusione e due segnali isolati, uno per ognuno dei due cromosomi derivativi (87) .Oltre alle innovazioni nella produzione di sonde molecolari, è opportuno ricordare che anche il progresso tecnologico informatico ed elettronico ha contribuito in maniera rilevante al miglioramento delle tecniche citogenetiche, nelle quali il microscopio a fluorescenza e i sistemi di acquisizione ed elaborazione digitale dell'immagine svolgono un ruolo fondamentale. Oggi è possibile infatti, con l'uso di apposite attrezzature di hardware e con l'ausilio di software dedicato, osservare i vetrini direttamente al computer, migliorare la qualità dell'immagine acquisita ed elaborarla digitalmente, rendendola appropriata a studi e pubblicazioni.