Soggetti presi in esame, campionamento e manipolazione dei campioni 40 bambini italiani in salute, di età compresa fra i 6 e i 12 anni, sono stati sottoposti a visita odontoiatrica: nessuno di essi presentava patologie sistemiche nè aveva subito in precedenza estrazioni di elementi dentari a causa di patologie a carattere locale.I pazienti in esame sono stati suddivisi in due gruppi: pazienti privi di lesioni cariose (caries-free, CF) e pazienti con lesioni cariose in atto (caries-active, CA). I pazienti CA presentavano un numero di lesioni compreso tra 2 e 10 e necessitavano di terapie endodontico-conservative.Il gruppo di pazienti CA era composto da 20 bambini di cui 11 femmine e 9 maschi di età media di 7,9 + 0,3 anni Il gruppo dei pazienti CF era costituito da 20 bambini di cui 8 femmine e 12 maschi di età media di 8,4 ± 0,4 anni.10 pazienti tra quelli che esibivano lesioni cariose sono stati sottoposti ad un secondo controllo, effettuato da venti giorni a sei mesi dopo il termine delle cure.Le terapie endodontiche sono state necessarie solo su denti decidui e sono state eseguite con cemento riassorbibile compattato a livello camerale con un otturatore a pallina.I restauri coronali sia dei decidui sia dei permanenti sono stati eseguiti in composito fotopolimerizzante previa preparazione della cavità, mordenzatura con acido ortofosforico e applicazione e polimerizzazione dell'adesivo.I tempi di mordenzatura e di polimerizzazione seguiti sono quelli indicati dalla casa produttrice.Ai pazienti senza lesioni cariose è stata proposta la sigillatura dei solchi dei primi molari permanenti e coloro che hanno accettato sono stati sottoposti a un secondo prelievo a quindici giorni per valutare un'eventuale interferenza del materiale utilizzato (resina di-e trimetacrilato).Lo studio è stato approvato dal comitato etico locale, i genitori sono stati informati riguardo agli scopi di tale ricerca ed hanno acconsentito al prelievo di saliva.Tutti i partecipanti allo studio sono stati istruiti a non mangiare, bere o effettuare sciacqui con soluzioni rinfrescanti per almeno due ore prima del prelievo.I soggetti si presentavano alla visita dopo aver eseguito una regolare igiene orale; seguita da un risciacquo con acqua.I prelievi sono stati eseguiti tra le 8 e le 11 della mattina, raccogliendo 5 ml di saliva non stimolata, che veniva lasciata colare all'interno di una provetta sterile di plastica Falcon (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).Il contenuto è stato immediatamente processato per ridurre al minimo la degradazione delle proteine 53 .Ai campioni, mantenuti in ghiaccio, è stato aggiunto un cocktail di inibitori di proteasi (protease inhibitor cocktail set III, Calbiochem-Novabiochem Corporation, CA: 100 mM AEBSF, 80 µM aprotinina, 5 mM bestatina, 1.5 mM E-64, 2 mM leupeptina, and 1 mM pepstatina).I campioni di saliva così trattati sono stati quindi centrifugati a 12000 rpm per 15 minuti a 4°C al fine di rimuovere il materiale insolubile, cellule e detriti 54 .Si sono poi prelevati 2 ml del campione, che sono stati desalinizzati attraverso un processo di gel-filtrazione (PD-10 column, Amersham International, Piscataway, NJ) in ammonio bicarbonato 12 mM, pH 7,1.Gli eluati ottenuti sono stati poi liofilizzati e mantenuti a 70°C fino al momento dell'analisi elettroforetica.