Lo studio è stato effettuato in accordo con le linee guida della Dichiarazione di Helsinki ed è stato formalmente approvato dal Comitato Etico Ospedaliero. Ogni partecipante ha firmato il consenso informato.In questo lavoro è stata analizzata una popolazione costituita da 27 pazienti affetti da azoospermia secretoria. Tali pazienti si erano rivolti al Servizio di Andrologia dal gennaio 2008 al maggio 2009 per un problema di infertilità di coppia secondaria ad azoospermia. I criteri di eleggibilità all'analisi mutazionale sono stati i seguenti:• FSH aumentato• Cariotipo 46,XY • Assenza di microdelezioni del cromosoma Y • CFTR negativi• Azoospermia documentata da almeno due Spermiogrammi I pazienti sono stati esclusi in caso di:• Ipogonadismo ipogonadotropo o abuso di steroidi androgenici• Ostruzione accertata bilaterale della via seminale (azoospermia ostruttiva OA)• Pregresso trattamento con agenti chemioterapici o radioterapia • anestesia locale mediante un'infiltrazione dei tessuti perifunicolari con Naropina al 7%• una piccola incisione della parete scrotale, apertura della tunica vaginale comune e della tunica albuginea• prelievo di un frammento di parenchima testicolare (microframmenti di 5 mg o macroframmenti di 1g).Il tempo operatorio è di pochi minuti ed il paziente viene dimesso dopo un'ora circa (Fig. 29).Parte del materiale estratto veniva posto in una provetta Falcon contenente come terreno di trasporto 5 mL di HTF modificato con HEPES (Irvine Scientific -Santa Ana CA. USA -1:1, vol/vol).      Il numero di triplette CAG è compreso tra 8 e 28 (Fig. 38), il numero di GGN è compreso tra 16 e 26 (Fig. 39).  Sempre ai fini dell'analisi statistica, abbiamo inoltre diviso i pazienti in base al risultato dell'analisi genetica:• pazienti in cui è presente la variante 995G• pazienti in cui è presente la variante 995A  [126]. Ciò è coerente con la scoperta che i polimorfismi nella lunghezza del tratto CAG si correlano con la concentrazione di spermatozoi negli uomini sani [141]. Comunque, studi precedenti che hanno esaminato il numero delle ripetizioni CAG in pazienti infertili, hanno dato risultati contrastanti: alcuni [221][222][223][224][225][226] non mostrano espansioni; mentre altri [126,127,128,[227][228][229][230][231] mostrano una lunghezza maggiore (ma sempre nel range di normalità) rispetto al gruppo di controllo. Questi risultati discordanti potrebbero legarsi alla diversa etnia dei pazienti, perchè il numero di ripetizioni CAG è inferiore negli Afro-Americani, medio nei Bianchi, e maggiore negli Asiatici. Altri fattori che possono influire sono: il ridotto campione, la scelta del gruppo di controllo e i criteri di selezione dei pazienti.Viceversa, tratti di CAG più corti nell'AR, e perciò un AR più attivo nella trascrizione, sono stati associati con un maggior rischio di cancro alla prostata [144,145,[232][233][234][235][236], anche se questo è ancora oggetto di discussione.Le conseguenze funzionali delle ripetizioni GGN sono meno chiare, anche se la riduzione del tratto di poliglicina riduce l'attività trascrizionale nei test di transfezione in vitro [237]. Solo due studi hanno analizzato la distribuzione della lunghezza delle triplette GGN in soggetti infertili, però, non sono state riscontrate differenze rispetto alla popolazione generale [126,238].In più, l'effetto combinato delle ripetizioni CAG e GGN sulla spermatogenesi è sconosciuto, e le distribuzioni negli uomini italiani non sono mai state riportate.Nell'esone 1 è inoltre presente un polimorfismo con una frequenza elevata nella popolazione infertile (17,8%) [143] cosituito dalla sostituzione G>A al nucleotide 995, senza cambiamento aminoacidico nella Glicina 211. Questa variante è stata anche riscontrata nella popolazione normale, ma con una frequenza nettamente minore (8%) (Androgen Receptor Gene Mutation Database -http://androgendb.mcgill.ca/AR23C.pdf-).Date queste premesse, con questo studio abbiamo voluto valutare l'associazione delle varianti del gene AR sulla gravità dell'azoospermia.Dai risultati del nostro lavoro, risulta che la lunghezza delle triplette CAG e GGN non mostra apprezzabili correlazioni con i valori di FSH, LH e Testosterone e con la gravità del reperto istologico.Il ruolo del numero di triplette CAG/GGN nell'eziologia dell'infertilità è stato indagato in molti studi, ma con risultati controversi. I nostri dati, che mostrano valori medi simili nei diversi gruppi di pazienti, sembrano escludere un ruolo per questi polimorfismi, in accordo con lavori precedenti in soggetti Europei [222,224,226,[239][240] edAsiatici [241].Nonostante sembri probabile che le variazioni CAG e GGN nel gene AR esercitino indipendentemente una minima influenza sull'attività di AR, la loro combinazione può modificare la suscettibilità all'infertilità maschile [239][240]. La combinazione di GGN = 23 e <21 CAG può conferire un ridotto rischio di infertilità, con un'incidenza di questa combinazione CAG/GGN tra i soggetti fertili di quattro volte superiore (16%) rispetto ai pazienti infertili (4%), come osservato in uno studio recente su maschi svedesi [240].I nostri risultati tuttavia non indicano che qualche variante CAG/GGN nell'AR abbia una prevalenza diversa tra i gruppi di pazienti.La variante 995A è associata ad un piccolo aumento medio di FSH e LH ed una diminuzione di Testosterone e Johnsen Score.Confrontando questa variante con gli indici di gravità della malattia, si osserva che nei pazienti con un esame istologico testicolare grave(SCOS e arresto maturativo), i pazienti con la variante 995A hanno valori significativamente più bassi di testosterone e più alti di LH rispetto ai pazienti 995G. La variante 995A non ha influenza sui livelli ormonali dei pazienti con spermatogenesi conservata.Questi risultati sono in accordo con i dati della letteratura, in cui un recente lavoro analizza la correlazione tra gli aplotipi (sequenza di polimorfismi su uno stesso cromosoma) del gene AR e l'infertilità nei maschi [143]. Analizzando sei SNP (Single Nucleotide Polymorphism) situati nel gene AR e regioni limitrofe, lo studio individua tredici diversi aplotipi di cui i quattro principali comprendono circa il 90% dei soggetti. Due di questi aplotipi, HAP3 e HAP4, comprendono la variante 995A : i dati riferiti a questi due aplotipi sono paragonabili ai dati dei nostri pazienti 995A. La somma delle frequenze di HAP3 e HAP4 nei pazienti infertili (17.8%) è sensibilmente superiore alla frequenza nei soggetti di controllo (7,6%). Nel nostro studio la variante 995A è presente nel 25.9% dei pazienti.Lavori precedenti avevano già suggerito che la variante 995A fosse associata con un rischio aumentato di infertilità maschile [143].Il nostro studio suggerisce che nei pazienti con un quadro grave di azoospermia, la variante 995A sia correlata con i valori ormonali sierici ed i nostri risultati possono contribuire a chiarire le cause di azoospermia secretoria idiopatica. Poiché la variante in posizione 995 non cambia l'aminoacido, sono necessari ulteriori studi per comprendere l'influenza del polimorfismo sul gene AR e sui geni limitrofi e/o sulla funzione della proteina e sulla possibile patogenesi dell'azoospermia secretoria idiopatica.Abbiamo descritto una nuova variante, 1244C>T (GAC>GAT al codone 294), mai precedentemente riportata. Dal momento che la sostituzione nucleotidica non altera la sequenza amminoacidica nella proteina, si può presumere che questa variante non interferisca con la normale funzione del gene AR, tuttavia ulteriori studi sono necessari al fine di comprendere l'influenza che essa ha nell' azoospermia secretoria idiopatica.In conclusione:• In base ai nostri risultati, non paiono importanti gli effetti da parte dei polimorfismi CAG⁄GGN nell'eziologia dell'azoospermia secretoria.• Abbiamo descritto per la prima volta, in pazienti azoospermici, l'associazione della variante 995A con la presenza di livelli ormonali sierici maggiormente alterati nei pazienti con quadro istologico più grave (sindrome a Sole cellule di Sertoli e blocco maturativo).• Abbiamo evidenziato la presenza di una nuova variante (1244C>T) mai precedentemente descritta in letteratura (e non inserita nel data base "Androgen Receptor Gene Mutation Database") associata ad azoospermia con quadro istologico di SCOS.• Il quadro che emerge è di complessa interrelazione tra livelli degli androgeni, proteine leganti l'androgene, AR ed espressione del fenotipo legato all'androgene. Sono quindi necessari ulteriori studi epidemiologici per confermare questi dati e per delimitare con maggior precisione la/e regione/i genica che modula l'azoospermia escretoria. 