Lo strato esterno della membrana è funzionalmente simile alla membrana esterna dei Gram-negativi; tuttavia la colorazione di Gram non è idonea alla sua identificazione. Si utilizzano, infatti, colorazioni in grado di evidenziarne la caratteristica acido-alcol resistenza. La colorazione di Ziehl-Neelsen (carbolfucsina a caldo) avviene dopo raccolta su un vetrino porta oggetto di un campione idoneo (come espettorato fluidificato con N-acetilcisteina). Successivamente, il campione deve essere lasciato essiccare per alcuni minuti; passato questo tempo, si procede con la colorazione mediante carbolfucsina di Ziehl, colorante in grado di penetrare all'interno della parete dei micobatteri dopo opportuno riscaldamento (vetrino sopra al becco Bunsen fino ai primi vapori). Successivamente all'esposizione al becco Bunsen si procede con il lavaggio del vetrino mediante alcool e acido solforico; questa tappa consente di decolorare i batteri che non possiedono la struttura tipica dei micobatteri. Successivamente, il vetrino può essere colorato con un colorante di contrasto come il blu di metilene. La presenza di micobatteri è documentata dalla presenza di bacilli fucsia in campo blu. Tale metodica non è esente da problematiche riguardanti la specificità; la colorazione di Ziehl-Neelsen identifica, infatti, non tanto i micobatteri, quanto bacilli acido-alcool resistente (BAAR), che possono non essere patogeni o semplici contaminanti del campione.