Tra il 1541 e il 1542 Mattioli si trasferì di nuovo a Gorizia, dove praticò la professione di medico e lavorò alla traduzione del "De Materia Medica" di Dioscoride dal greco, aggiungendovi i suoi "discorsi" e "commenti". Poi, finalmente, nel 1544 pubblicò per la prima volta la sua opera principale, "Di Pedacio Dioscoride Anazarbeo Libri cinque Della historia, et materia medicinale tradotti in lingua volgare italiana da M. Pietro Andrea Matthiolo Sanese Medico, con amplissimi discorsi, et comenti, et dottissime annotationi, et censure del medesimo interprete", più comunemente conosciuto come i "Discorsi di Pier Andrea Mattioli sull'opera di Dioscoride". La prima stesura fu pubblicata a Venezia senza illustrazioni e dedicata al cardinale Cristoforo Madruzzo, principe-vescovo di Trento e Bressanone.