Gli anticorpi primari sono generati quando la specie ospite o le colture di cellule immunitarie sono esposti alla proteina di interesse (o parte ad essa vicina). Normalmente questo è parte della risposta immunitaria, dove essi sono coltivati e usati come dispositivi specifici di rilevamento che legano la proteina direttamente. Dopo il "blocking", una soluzione diluita di anticorpo primario (generalmente tra 0.5 e 5 µg/ml) è incubato con la membrana agitandolo delicatamente. Tipicamente, la soluzione è composta da una soluzione tampone con una piccola percentuale di detergente, e qualche volta con latte in polvere o BSA. La soluzione anticorpo e la membrana possono essere sigillate e incubate assieme per 30 minuti o una notte intera. Può inoltre essere incubata a differenti temperature (a temperature più calde si associano legami più forti) sia sulla specifica proteina (target, il "segnale") e non-specifica ("rumore").