L'ELISPOT (Enzyme Linked Immunospot) è una tecnica che permette l'identificazione di cellule T specifiche per l'antigene in base ad una risposta funzionale a quest' ultimo. Tale tecnica ha il vantaggio di individuare a livello della singola cellula solo le cellule T attivate o memoria e la produzione di citochine, permettendo una conta diretta delle cellule T reattive contro il peptide. Le cellule sono stimolate con l'antigene e, se sono presenti cellule T antigene-specifiche, esse possono riconoscere l'antigene ed attivarsi ad iniziare la produzione di citochine. Tali citochine vengono riconosciute e legate da un anticorpo monoclonale presente sulla piastra ed individuate tramite la presenza di un anticorpo secondario coniugato ad un fluorocromo. In particolare in questo studio è stata misurata la produzione di interferon-, citochina secreta dai linfociti T. In particolare i PBMC (Peripheral Blood Mononucleal Cell) sono stati ottenuti da sangue intero di pazienti trapiantati e di controlli sani. I linfociti sono stati separati mediante centrifugazione a 1000xg per 20 minuti, su gradiente Ficoll (Lymphoprep Sigma). Le cellule mononucleate del sangue così ottenute sono state quindi lavate due volte con soluzione fisiologica a 750xg per 5 minuti, il pellet ottenuto è stato risospeso in AIM-V (Invitrogen) e le cellule sono quindi state contate. In una piastra da 48 pozzetti sono stati seminati in 500 l di terreno 2 milioni di linfociti dei controlli sani o dei pazienti trapiantati. I PBMC sono quindi stati stimolati con l'antigene GAD (Dyamid) ad una concentrazione da 1 a 5 microM, ed incubati per 48 h a 37°C. Come controllo positivo è stata effettuata in parallelo la stimolazione con tetano tossoide (Pasteur Merieux, Meridenhead, UK) (concentrazione finale 10μg/ml), il Pentavac o Phorbol Myristate Acetate (PMA)/ ionomicina (rispettivamente ad una concentrazione di 50 ng/ ml e 70 ng/ml). Dopo le 48 ore di stimolazione, centomila cellule sono state seminate su una piastra a 96 pozzetti rivestita precedentemente con anticorpo monoclonale anti IFN-gamma. Il giorno successivo le cellule vengono lisate ed incubate per 1 ora a 37°C con anticorpo biotinilato ed in seguito con un anticorpo marcato anti biotina forniti dalla ditta (U-Cy Tech). L'ultimo passaggio consiste nell'aggiunta di un reagente (attivatore) legato ad un cromogeno che permette di rilevare gli spots. La dimensione e la morfologia degli spots riflettono la quantità di IFN-gamma prodotto dalle singole cellule. L'esperimento è stato eseguito in triplo e ripetuto 2 volte per ogni paziente. I risultati sono stati riportati come la media degli spots per pozzetto. In questo caso però non avendo avuto segni di rigetto, la sopravvivenza dell'organo trapiantato, è del 92% (12/13) a 2 anni. Il paziente, successivamente deceduto, G.G. è ritornato in dialisi dopo 20 mesi; il paziente V.M. è ritornato in dialisi 47 mesi dopo il trapianto combinato.