È proprio in questo periodo, precisamente nel 1660, che si colloca la prima vera grande scoperta fatta da Malpighi e che renderà il suo nome famoso in tutto il mondo. All'inizio di quell'anno infatti l'Anatomico attraverso lo studio e la sperimentazione sui polmoni, formula, per primo nel mondo, un'ipotesi vicina alla realtà sulla loro funzione, suscitando così l'ira dei medici ippocratici-galenici. Nella medicina galenica i polmoni erano considerati costituiti di sangue coagulato e la loro funzione era quella di rifornire il cuore di pneuma. Malpighi non si mostrò solo seguace della filosofia meccanica e maestro di microscopia ma riuscì anche a penetrare con vari artifizi anatomici nell'interno delle strutture e a svelare il sottile meccanismo del loro funzionamento. La scoperta del funzionamento dei polmoni viene subito comunicato a Borelli con una lettera datata 4 gennaio.