Il sangue venoso periferico è stato prelevato in una provetta priva di additivi, indi idoneamente centrifugato (4000g per 8 minuti), per separare il siero dalla parte corpuscolata ed in seguito immediatamente stoccato a -80°C per poi essere inviato, mantenendo inalterata la catena del freddo, al Settore Immunometria del laboratorio di Biochimica Clinica del Presidio Molinette presso la Città della Salute e della Scienza di Torino dove sono stati materialmente effettuati i dosaggi di KL-6. La procedura analitica ha utilizzato la piattaforma automatizzata LUMIPULSE G600II della ditta Fujirebio (Sankojunyaku, Japan) e dei rispettivi reattivi specifici commercializzati dalla ditta produttrice (figura 8).In dettaglio la metodica utilizzata prevede la determinazione quantitativa del KL-6 su siero mediante ricorso ad una tecnica CLEIA (ChemiLuminescent Enzyme Immunoassay) di immunodiagnosi.Il sistema utilizza un esclusivo sistema di cartuccia mono test per ogni singolo dosaggio impedendo in tal modo la cross-contaminazione tra campioni diversi dosati in sequenza (figura 9).La procedura ha una durata complessiva per ogni singolo dosaggio di circa 25 minuti.Figura 8 e 9. Dosaggio con il Sistema LUMIPULSE G600 II.Il dosaggio del biomarcatore consiste in un test immunologico la cui metodica si basa sul principio immunoenzimatico "sandwich" a due step" (figura 10 e 11) ed avviene con procedura totalmente automatizzata secondo il seguente schema:1) Il campione viene caricato sulla catena di accesso strumentale ed è immediatamente diluito con apposito diluente (diluizione 1:1) dal sistema per ammortizzare le interferenze di matrice.2) Una quantità fissa e standard del diluito viene immessa in una sezione della cartuccia di reazione dove sono presenti micro-biglie di ferro coattate con un anticorpo monoclonale specifico contro KL-6 ed il tutto viene incubato per permettere la formazione dell'immunocomplesso antigene-anticorpo.3) Mediante l'ausilio di un campo magnetico che permette di immobilizzare alla parete della cuvetta di reazione i complessi Ag-Ab formati e legati al ferro, si procede ad un lavaggio per asportare i reattivi in eccesso che non hanno reagito.4) E' aggiunta una quantità standard di fosfatasi alcalina (ALP) coniugata con un secondo anticorpo monoclonale contro KL-6 che si lega all'immunocomplesso già presente nella cuvetta. La ALP fungerà da catalizzatore per sviluppare una luminescenza qualora sia messa a contatto con un substrato idoneo. L'intensità di essa sarà direttamente proporzionale alla quantità di enzima presente che, a sua volta, è direttamente proporzionale alla quantità di KL-6 presente nel siero di partenza che ha permesso la formazione del primo immunocomplesso.  Figura 11. Schema di reazione strumentale che premette la determinazione quantitativa dell'analita KL-6.La sensibilità analitica e quella funzionale del dosaggio, determinate secondo le Linee Guida CLSI del Protocollo EP17-A [190] denunciate della ditta produttrice, sono entrambe di 13.47 U/mL.Il range di misurazione è compreso tra 50 e 10000 U/mL (figura 12).La linearità del dosaggio è dichiarata sino a 10000 U/mL, oltre la quale è necessario intervenire con diluizione manuale.Per quanto riguarda i valori di KL-6 riscontrati nei soggetti sani, da studi condotti dalla ditta produttrice del kit su volontari (età compresa tra 18 e 68 anni) si è ricavato un valore medio pari a 306 U/mL. Nessuno dei volontari sani presentava concentrazioni di KL-6 >500 U/mL. Nella coorte studiata, in 5 pazienti sono state effettuate più di 6 misurazioni. Tuttavia il numero di dosaggi del KL-6 per ogni paziente è stato in media 3.La tabella 9 riporta il numero dei dosaggi effettuati nei vari tempi successivi all'inizio della terapia.Tabella 9. Numero di dosaggi disponibili per ogni tempo T (mese).Trattandosi di uno studio prospettico di vita reale, la tempistica dei controlli, degli esami funzionali e dei prelievi è stata più "elastica" di quanto previsto negli studi clinici, questo anche al fine di migliorare sia qualità di vita sia aderenza terapeutica e persistenza in terapia; i vari controlli sono stati eseguiti con una variabilità che comporta una "finestra" di ± 3 settimane. Questo periodo, peraltro, non eccede in modo particolarmente evidente da ciò che è considerato tollerabile nel corso di studi randomizzati controllati di fase II-III. D'altronde, qualora il paziente abbia richiesto di poter essere controllato con una tempistica di follow-up esulante dai limiti sopra citati, la sua richiesta, accuratamente valutata, quando compatibile per una sua buona gestione, è stata accettata. Pertanto, non tutti i pazienti dello studio presentano lo stesso numero di dosaggi ed esami spirometrici con DLCO nel corso dei mesi totali di osservazione. Il 71% (30/42) dei pazienti sono uomini ed il 29% (12/42) donne. Dalla tabella si evince come l'età media ad inizio terapia sia di 72,4 anni, a conferma di come l'IPF si manifesti in età adulta avanzata. Il 76% (32/42) è un ex fumatore mentre il 7% (3/42) risulta ancora fumatore nonostante la diagnosi di IPF. Complessivamente l'83% (35/42) dei pazienti risulta avere una storia di tabagismo a conferma di come il fumo di sigaretta sia il principale fattore di rischio per lo sviluppo di IPF [1] [9].Come detto precedentemente, nella valutazione funzionale dei pazienti sono stati presi in considerazione i parametri prognostici definiti dagli studi di letteratura [61] [62] [63] [76] : FVC% del teorico, DLCO% del teorico e FEV1% del teorico. I valori della FVC e del FEV1 sono espressi in Litri e come percentuale rispetto ai valori predetti (pazienti con caratteristiche simili: altezza, età, sesso, razza e peso secondo i valori di riferimento stabiliti da ERS Eur Respir J 1993;6, S16:1-100). In generale valori oltre l'80% del predetto sono considerati normali.Trattandosi di uno studio di vita reale, durante i controlli trimestrali non per tutti i pazienti è stato possibile eseguire una spirometria completa con DLCO. In tabella 11 sono mostrati i valori baseline ad inizio terapia. La tabella 13 mostra i valori di FVC, FEV1 e DLCO utilizzati per valutare la funzionalità respiratoria prima dell'avvio della terapia antifibrotica e poi a 3,6 e 9 mesi.