Metotrexato è un antagonista competitivo dell'acido folico, che è necessario per la sintesi del nucleoside timidina, richiesto per la sintesi del DNA. Inoltre, il folato è necessario per la sintesi delle basi puriniche, in modo che tutta la sintesi di basi puriniche sarà inibita. Il metotrexato, quindi, inibisce la sintesi di DNA, di RNA, di timidilati e di proteine.