È sintetizzata nelle cellule follicolari della tiroide a partire da una grossa glicoproteina nota come tireoglobulina, accumulata nella colloide dei follicoli. Dopo la sintesi, è immessa nel circolo ematico assieme alla T3, dove viaggiano principalmente legate a proteine plasmatiche, che le proteggono dal metabolismo e dall'escrezione: la TBG (globulina legante la tiroxina, in inglese "thyroxine binding globulin") ne lega il 75%, il resto è legato all'albumina e alla prealbumina. Una piccola quota (circa lo 0,03% di T4 e lo 0,3% di T3) viaggia come ormone libero, le cosiddette fT4 e fT3 (f=free, cioè libere), che rappresentano la frazione fisiologicamente attiva, cioè capace di legarsi al proprio recettore.