Nel 1915 fu chiamato dal Ministro della Marina di Roma e assegnato al servizio attivo. Poco prima che l'Italia dichiarasse guerra all'Austria (24 maggio 1915), partì per Salonicco, dove si fermò solo due giorni per poi ripartire verso la Macedonia e la Serbia, luoghi in cui la guerra aveva già causato numerose perdite. In Serbia fu aggregato all'ospedale militare anglo-serbo, per poi spostarsi in Macedonia agli inizi del 1917. Il 17 ottobre del 1917, in seguito all'umiliante sconfitta a Caporetto, il Governo italiano richiamò tutti gli ufficiali medici in servizio presso i Paesi Alleati, compreso Castellani che si occupò principalmente della prevenzione della malaria.