Nato il 29 giugno 1851 a Le Sueur, cittadina del Minnesota, fu il primo figlio di William Worrall Mayo e fratello maggiore di Charles Horace Mayo. Visse la maggior parte della sua vita a Rochester. Era un giovane snello dai capelli chiari sempre in cerca di compagnia, orgoglioso e molto impetuoso. Era un ottimo studente in quasi tutte le materie, ad eccezione della matematica che proprio non padroneggiava. Amava cavalcare, passione ereditata dal padre, trascorreva lunghe ore assieme al fratello a leggere e pescare, andavano al circo e di rado mancavano ad una mostra di animali in città. Frequentò la scuola alla Rochester Central e data la passione del padre per i libri, fu incoraggiato a leggere assieme al fratello i romanzi di Charles Dickens, Walter Scott, le Leatherstocking Tales di James Fenimore Cooper, che ricordavano al padre le sue avventure con gli indiani. Proprio per quest'ultima lettura e per i racconti del padre, i due fratelli si interessarono allo scheletro che il dr.Mayo aveva nel suo ufficio, quello di Cut Nose, un indiano. Osservando quello scheletro, i due studiarono per la prima volta l'anatomia del corpo umano. Fu introdotto ad altre scienze con la stessa casualità: botanica e astronomia furono apprese dalla madre, chimica e fisica dal padre, che raccontava loro del suo incredibile tutore John Dalton. Col tempo le letture di Will aumentarono e durante gli anni del liceo lesse Charles Darwin, Thomas Henry Huxley ed Herbert Spencer. Sebbene avesse imparato ad assistere il padre durante le visite ai pazienti, la sua vera prima esperienza in ambito medico avvenne poco prima della sua iscrizione alla facoltà di medicina. Il dr. Mayo aveva deciso di eseguire un esame post-mortem, così lui ed il figlio maggiore si recarono in un hotel abbandonato, in cui il paziente viveva solo. Era già notte per cui per illuminare la stanza utilizzarono la luce di una candela. Il dr. Mayo però ricevette un urgente richiesta da un paziente e disse a Will di chiudere da solo l'addome del paziente e portare gli organi nel suo ufficio. La sala settoria della facoltà di medicina non poté incutergli timore dopo questa esperienza. In seguito Will lesse l'Anatomia del Gray di Henry Gray, James Paget i cui scritti lo introdussero a John Hunter, idolo del giovane Will come dimostrato dal ritratto nel suo ufficio alla Mayo Clinic.