La tripsina catalizza il taglio proteolitico con specificità per l'arginina e la lisina. Nel sito attivo presenta una sequenza specifica che prende il nome di triade catalitica, ovvero Ser195-His57-Asp102. Questi residui amminoacidici, nonostante siano distanti nella struttura primaria, si trovano vicini nella struttura terziaria della proteina. Il substrato della tripsina è rappresentato da una proteina basica. Il pH ottimale per l'attività catalitica della tripsina è in un range tra 7 e 9; in realtà ha attività catalitica anche ad altri pH ma l'idrolisi mediata da tale proteasi, a pH differenti da quello ottimale, risulta più lenta. 