Ricordiamo come la maggior parte del cortisolo in circolo sia legato alla proteina CBG, all'albumina e solo una piccola parte rimanga libera e quindi attiva biologicamente. Si comprende, perciò, che un eventuale abbassamento dei livelli di albumina e CBG alteri il rapporto tra cortisolo legato e libero [49]: pertanto la misurazione del cortisolo totale sierico in questo frangente non ci dà una stima affidabile del cortisolo biologicamente attivo. Si potrebbe misurare direttamente la concentrazione di cortisolo sierico libero per quantificare l'attività dell'ormone: purtroppo questa procedura richiede molto tempo ed i suoi risultati dipendono in larga misura dai vari laboratori in cui viene eseguita e perciò non può essere utilizzata come indagine di routine [59]. Il dosaggio del cortisolo salivare è ormai ritenuto una buona metodica per verificare la corretta funzionalità dell'asse IIS, poiché trovandosi in equilibrio con il cortisolo sierico libero diventa un affidabile indicatore di quest'ultimo [60,61]; proprio come per la misurazione del cortisolo sierico anche per il dosaggio del cortisolo salivare sono necessarie misurazioni ripetute e l'utilizzo di prove da stimolo. In vari studi si evince che la concentrazione di cortisolo salivare non viene influenzata dalla quantità di saliva prodotta [59,62]. E' interessante notare che i cambiamenti a carico del cortisolo sierico libero si riflettono parallelamente in variazioni delle concentrazioni di cortisolo salivare, potendo quindi stabilire l'andamento di tale ormone tramite la raccolta di campioni di saliva ogni due o tre minuti e quindi disegnando una curva in base alle concentrazioni [59,62]. Uno dei primi studi in cui è stato valutato il dosaggio del cortisolo salivare, l'indice del cortisolo libero e del cortisolo libero calcolato, dopo stimolazione con basse dosi (1 microgrammo) e dosi standard (250 microgrammi) di ACTH sintetico in pazienti sani, fu quello di Elbuken: venne confermato che la saliva era un ottimo campione per poter valutare la funzionalità dell'asse IIS sia in condizioni basali sia dopo stimolazione e sono stati individuati valori soglia, a seconda della dose di ACTH utilizzata come test di stimolo [63,64]. E' stato possibile individuare dei valori soglia utili per la diagnosi di sindrome di Cushing ma i dati ottenuti non sono ancora sufficienti per poter definire il quadro di insufficienza surrenalica [63,65].Esistono surrogati del cortisolo libero: l'indice di cortisolo libero (FCI) e il cortisolo libero calcolato. FCI rappresenta il rapporto percentuale tra il cortisolo sierico totale e la concentrazione di CBG; il cortisolo calcolato viene ottenuto utilizzando la formula di Coolen basandosi sui valori di cortisolo sierico totale e di CBG [66,67]. I loro valori sono influenzati dai livelli di CBG e dal sesso del paziente: ad esempio l'assunzione di estrogeni esogeni nel sesso femminile comporta livelli maggiori di CBG [68]. Nello studio di Gozansky sono stati raccolti campioni di cortisolo salivare, analizzati tramite saggio immuno-enzimatico (E-IA), e campioni di cortisolo sierico totale: viene sottolineato come la metodica del cortisolo salivare permetta di valutare l'attività dinamica dell'asse IIS e le concentrazioni di cortisolo libero, quindi attivo, proprio quando queste ultime variano rapidamente potendo anche superare la soglia di legame con la CBG ovvero con un eccesso di cortisolo libero, situazione che è possibile ricreare con la somministrazione di CRH esogeno. Pertanto la misurazione del cortisolo salivare presenta alcuni vantaggi: viene evitato lo stress indotto dalla puntura del prelievo ematico per valutare il cortisolo sierico che comporta un rialzo di tale ormone [69]; viene misurata indirettamente solo la porzione libera dell'ormone; i campioni sono facili da raccogliere e in condizioni di libertà per il paziente ovvero senza la necessità di presidi medici e l'analisi di laboratorio risulta più agevole e con maggior risparmio di tempo rispetto a quella necessaria per ottenere la frazione del cortisolo sierico libero [70]. Il contributo di Gozansky et al apre le porte ad un potenziale maggior utilizzo di tale metodica poichè i dati riportati nel loro studio evidenziano una forte relazione esponenziale con il cortisolo sierico totale e una correlazione lineare con il cortisolo sierico libero calcolato attraverso i valori di CBG. Si evince, quindi, come questa metodica possa essere applicata per valutare il comportamento dell'assi IIS in popolazioni in cui possono esserci variazioni dei livelli di CBG (ad esempio in soggetti di sesso femminile che assumono o meno estrogeni orali [71]); in particolare è da sottolineare una certa superiorità della metodica del cortisolo salivare rispetto a quella del cortisolo sierico totale dato che è possibile ottenere dei valori affidabili anche in condizioni in cui viene saturato il legame ormone-CBG in seguito a stimolazioni dell'asse IIS [60], descrivendo quindi in maniera più aderente la quota di ormone attivo.Contreras et al proposero di indagare l'ipoattività surrenalica con questo tipo di metodica non invasiva, valutando le concentrazioni di cortisolo e aldosterone a livello della saliva, dopo stimolazione intramuscolare con ACTH esogeno, confrontando pazienti sani e pazienti con insufficienza primitiva o secondaria [64]: i dati evidenziarono che in tutti i pazienti con insufficienza primitiva della ghiandola le risposte sia di cortisolo che di aldosterone salivare erano ridotte e attenuate; inoltre, in tutti i volontari sani, la dose di ACTH iniettato intramuscolo portò ad un innalzamento dei valori dei due ormoni. Si comprende pertanto l'applicabilità e la relativa facilità di questo metodo per poter valutare situazioni di deficienza dell'attività dell'ACTH endogeno e quindi dell'asse IIS; inoltre in tale studio è stato possibile differenziare le situazioni di insufficienza surrenalica primitiva, in cui la risposta alla somministrazione di ACTH esogeno di cortisolo e di aldosterone era smorzata e ridotta, da quelle di insufficienza secondaria in cui i valori di aldosterone salivare risultavano nella norma, evidenziando l'integrità della zona glomerurale della ghiandola [64]. Per quanto riguarda la valutazione dell'attività dell'asse IIS nel paziente critico, in particolare nel paziente settico o con shock settico, è necessario ricordare quanto sia importante in questa tipologia di pazienti la quota di cortisolo libero circolante: esso descrive ottimamente lo stato di funzionalità del surrene [72]. Purtroppo una buona parte dei pazienti affetti da patologia critica presentano frequentemente livelli ridotti di albumina e CBG, le due proteine che veicolano il cortisolo nel torrente ematico. Si intuisce perciò quanto sia facile porre erroneamente diagnosi di insufficienza surrenalica in un paziente critico ipoproteinemico se si valutasse solo la concentrazione di cortisolo sierico totale. Infatti sappiamo che nel paziente con patologia critica, a prescindere dai suoi livelli di proteine circolanti, la quota di cortisolo libero attivo sarà molto elevata (rialzo da sette a dieci volte) caratterizzando la tipica risposta di attacco-fuga (a patto che l'asse IIS sia normofunzionante e in grado di fronteggiare lo stress indotto dalla patologia) [49]. Il problema riguarda il fatto che questo incremento impressionante del cortisolo libero non è percepibile con il solo rilevamento del cortisolo sierico totale, in particolare nella situazione di ipoproteinemia sopradescritta [59]. Risultano evidenti le potenzialità del dosaggio del cortisolo salivare quale marcatore del cortisolo sierico libero: nello studio di Arafah et al. [59] viene sottolineata infatti la superiorità del cortisolo salivare rispetto a quella del cortisolo sierico totale nel determinare il livello di secrezione dei GC nei pazienti con patologia critica, indicando un'attivazione dell'asse IIS e livelli ormonali molto più elevati rispetto a quelli del gruppo di soggetti sani di controllo; anche nel contesto di pazienti con patologia critica, tale metodica si è dimostrata di facile applicazione ed esecuzione. Il vero punto di forza delle metodica del cortisolo salivare riguarda la particolare situazione del paziente critico ipopotreinemico: infatti se in tali pazienti leggessimo i livelli di cortisolo totale sierico, basale e dopo stimolazione con ACTH esogeno, utilizzando i valori soglia tipici del soggetto sano normoproteinemico trarremmo delle conclusioni fuorvianti; viceversa, i livelli di cortisolo salivare correlano molto bene con i livelli di cortisolo sierico libero a prescindere dal livello di proteine sieriche, assumendo un ruolo di rilievo nella valutazione della funzionalità surrenalica nel paziente critico ipoproteinemico, in particolare nei pazienti settici [59]. Nonostante i molti punti a favore di tale metodica esistono anche delle criticità e dei limiti: la gran parte dei dati sul dosaggio del cortisolo salivare riguardano quadri diagnostici di sindrome di Cushing e disturbi psichiatrici mentre sono relativamente scarsi i dati riguardanti l'utilizzo di questa tecnica per la stima della funzionalità surrenalica nei pazienti con patologia critica [73], considerando che lo studio di Arafah del 2007 precedentemente citato rappresenta uno dei primi studi sull'applicazione della metodica salivare nel contesto clinico, oltre allo studio di Cohen del 2004. Inoltre esistono delle condizioni riferite al paziente che riducono le prestazioni di tale esame: per esempio, la presenza di sanguinamento orale attivo può inficiare il risultato poiché verrebbe dosato, oltre al cortisolo salivare, anche la percentuale di cortisolo sierico; negli stati di secchezza delle fauci, frequenti nei pazienti con patologia grave, la quantità di campione potrebbe essere insufficiente per poterla analizzare; infine la presenza di contaminazione del cavo orale di tipo batterico o fungino porterebbe ad una sottostima della concentrazione di cortisolo salivare [59]. Nonostante sia evidente il potenziale ruolo di spicco di tale metodica nella fase diagnostica e nello studio della funzionalità dell'asse IIS, sono senza dubbio necessari ulteriori studi che reclutino un maggior numero di pazienti critici per poter così ottenere una quantità maggiore di dati e conoscere a fondo i punti di forza e le criticità del dosaggio del cortisolo salivare.