Le sezioni di cell-blocks e di tessuto chirurgico incluso in paraffina sono state adese sui vetrini portaoggetti polilisinati, deparaffinate in xylene, reidratate in concentrazioni scalari decrescenti di etanolo e incubate per 10 minuti in PBS (pH 7,4). Per la valutazione dell'espressione di tutti gli antigeni selezionati è stata utilizzata una procedura di smascheramento dell'antigene basata sul calore, sottoponendo i vetrini portaoggetti a tre cicli consecutivi (5 min) di riscaldamento al forno microonde settato alla massima potenza (800 W) previa loro immersione in buffer citrato di sodio 0,01M (pH 6,0) per l'analisi di GAL3, HBME1 e KS o in EDTA buffer 0,01M (pH 8,0) per l'analisi di TPO e CK19. L'attività endogena perossidasica è stata inibita immergendo le sezioni in H2O2 al 3% per 10 minuti.Dopo essere state sciacquate in PBS, sono state incubate con la blocking solution (ChemMate Buffer Kit; DakoCytomation, Glostrup, Denmark) e successivamente con l'anticorpo primario in camera umida a temperatura ambiente per 45 min (HBME1 e CK19) o a 4°C per tutta la notte (GAL3, TPO e KS). Dopo alcuni prolungati lavaggi in PBS le sezioni sono state quindi incubate per 30 min a temperatura ambiente con un polimero di destrano pre-coniugato con molecole ad attività enzimatica e con anticorpi secondari anti-immunoglobuline di topo (sistema di rivelazione biotin-free -Envision System, DakoCytomation, Glostrup, Denmark). Si è quindi provveduto immediatamente a processarle per perossidasi coniugata con streptavidina (DAKO, Glostrup, Danimarca). Dopo un ulteriore lavaggio in PBS, i vetrini sono stati incubati con 3,3'-diaminobenzidina tetraidroclorato (DAKO) per 10 minuti. Tutti i campioni sono stati contrastati con una soluzione di emallume acido di Mayer, montati in Entellan (Merck, Darmstadt, Germany) ed esaminati con il microscopio DM-RBE Leica (Leica Microsystems AG, Wetzlar, Germany) dotato di obiettivi planapocromatici 16x e 63x. Come controlli positivi sono stati utilizzati istiociti per GAL3, un caso di mesotelioma per HBME1, tiroide normale per TPO, cute per CK19 e una metastasi linfonodale di carcinoma papillare della tiroide per KS, mentre i controlli negativi sono stati ottenuti omettendo l'anticorpo primario. L'associazione simultanea implica l'analisi di due o più marcatori allo stesso tempo al fine di ottenere una migliore sensibilità rispetto a quella fornita da ogni singolo marcatore. In questo caso quando uno solo dei marcatori valutati risulta positivo il test complessivo viene considerato positivo. L'associazione sequenziale implica, invece, l'analisi di un solo marker (il migliore per sensibilità e specificità) seguita dalla valutazione di un secondo marcatore solo nei casi che sono risultati negativi al primo test, in questo caso al fine di ottenere una migliore sensibilità e specificità mantenendo costi inferiori rispetto alla valutazione simultanea: il test complessivo viene considerato negativo solo quando i marcatori sono tutti negativi 160 .Tutti i parametri statistici sopra riportati sono stati calcolati confrontando i casi del gruppo degli adenomi con quelli dei carcinomi e successivamente il gruppo delle lesioni oncocitiche (benigne e maligne) con quelle non-oncocitiche (benigne e maligne).Possibili differenze dell'espressione di ogni singolo marcatore in funzione che venga applicato sul materiale citologico o il corrispettivo istologico, o possibili differenze di espressione tra gli adenomi e i carcinomi, così come tra i carcinomi papillari e quelli follicolari sono state analizzate per mezzo del χ 2 test, dove valori P  0.05 sono stati considerati statisticamente significativi, mentre le differenze d'espressione di ogni singolo marcatore nelle lesioni maligne oncocitiche rispetto a quelle non-oncocitiche sono state calcolate utilizzando il test di Fisher a due code, e in questo caso il riscontro di valori di P  0.01 sono stati considerati statisticamente significativi.