Lo strumento più accurato per la diagnosi prenatale di spina bifida è l'esame ecografico del feto. Esami di "screening" della spina bifida come il dosaggio dell'alfa-fetoproteina nel siero materno o nel liquido amniotico sono ormai obsoleti. La diagnosi ecografica può essere fatta con l'esame della colonna fetale, ma le metodiche più sensibili sono la valutazione della forma del cranio fetale, l'esame dei ventricoli cerebrali e la valutazione della fossa cranica posteriore con la misura e l'osservazione del cervelletto fetale e della cisterna magna. L'esame dei segni indiretti a livello cranico permette l'esclusione del 99% dei casi di spina bifida del feto. Vengono rilevati la deformazione del cranio, che assume una forma di limone nella scansione assiale ("segno del limone") e la deformazione della fossa cranica posteriore con la obliterazione della cisterna magna e la riduzione del diametro trasverso del cervelletto, che assume una forma caratteristica descritta come il "segno della banana".