I risultati del presente lavoro dimostrano come, utilizzando cellule che esprimono il recettore per gli estrogeni (ER), l"elastasi neutrofila sia in grado di indurre sferoidi morfologicamente e biologicamente analoghi a IMPC di tessuti mammari.L"idea di utilizzare l"elastasi neutrofila è derivata inizialmente da una semplice osservazione sulla similitudine morfologica tra gli sferoidi ottenuti con il trattamento con questo enzima [74] e le micropapille dei carcinomi umani, e ha poi dimostrato un fondamento biologico importante. È noto infatti che una grande varietà di serinoproteasi sono implicate nei processi di invasione e metastatizzazione nel carcinoma mammario [81] . In particolare, elevati livelli di elastasi neutrofila, rilevati con metodica ELISA su una larga casistica di carcinomi mammari, si sono dimostrati variabile indipendente di peggior prognosi; inoltre, essi correlano con un ridotto intervallo libero da malattia e con una morte precoce anche in pazienti che non hanno metastasi linfonodali [81] .I nostri risultati dimostrano che l"attività dell"enzima su cellule ER-positive induce la formazione di aggregati sferoidali morfologicamente sovrapponibili alle micropapille, e suggeriscono quindi che la genesi di tali tumori in vivo possa derivare da un"attivazione o da un"iperespressione di serino-proteinasi come l"elastasi.L"espressione di ER sembra essere fondamentale nella genesi degli sferoidi similmicropapillari, in quanto su cellule MDA-MB-231 e SKBR3, che sono ER-negative, l"elastasi non ne induce alcuna formazione.Il modello che meglio ha soddisfatto il nostro obiettivo è stato la linea cellulare MCF-7.Tale popolazione di cellule, analogamente a IMPC, può essere classificata nella categoria dei carcinomi luminali B, in quanto esprime alti livelli di ER e ha un alto indice proliferativo (iperespressione di Ki67), come abbiamo dimostrato nel nostro lavoro. La linea T-47D, seppur ER-positiva, è risultata meno idonea a rappresentare un buon modello di IMPC in vitro.Nell"esperimento di Yui e collaboratori [74] l"espressione della proteina di adesione E-caderina si è rivelata fondamentale per la formazione degli sferoidi; i risultati del nostro studio confermano questa osservazione. Solo le cellule E-caderina positive (MCF-7 e T-47D) si sono dimostrate attive nella formazione di sferoidi elastasi-indotti, mentre le cellule MDA-MB-231 e SKBR3, che sono E-caderina negative, non hanno prodotto tali strutture sotto stimolo enzimatico. La correlazione diretta tra l"espressione di ER e di E-caderina è stata recentemente dimostrata in cellule MCF-7 e T-47D, poiché il silenziamento del gene per ER determina una netta riduzione dell"espressione di Ecaderina [96] . La stretta adesione presente tra le cellule degli sferoidi elastasi-indotti è osservata anche nelle micropapille dei tumori umani e potrebbe giustificare il peculiare pattern di crescita e di invasione stromale e vascolare di IMPC. Le cellule tenacemente adese in micropapille, infatti, potrebbero essere coinvolte nella patogenesi del fenomeno della cosiddetta "Collective Cell Migration" [97] , recentemente considerata come un importante meccanismo di metastatizzazione di cluster cellulari e non di singole cellule, in analogia a quanto avviene nella migrazione embriogenetica.Il secondo obiettivo del nostro studio è stato valutare se alla morfologia similmicropapillare degli sferoidi corrispondesse anche una espressione in sede anomala della proteina MUC1. Utilizzando metodi di ICC e IF con anticorpi diretti verso diverse isoforme di MUC1, abbiamo dimostrato che gli sferoidi ottenuti da MCF-7 riproducono lo stesso pattern di espressione di IMPC.La mucina MUC1 è espressa sulla superficie luminale della maggior parte delle cellule epiteliali ma, nei carcinomi, soprattutto in quelli ovarici e della mammella, è iperespressa e glicosilata in modo aberrante. Le mucine espresse dai carcinomi mammari presentano infatti catene glicidiche laterali più corte e sono pesantemente sialilate; analisi condotte con ibridizzazioni in situ su tessuto di carcinoma mammario primitivo hanno evidenziato la presenza di una sialil-transferasi (ST3Gal I) responsabile dell"aggiunta di acido sialico al core di MUC1 [98] . L"aberrante glicosilazione di MUC1 sarebbe implicata nello sviluppo di metastasi e nella transizione dal tessuto normale alle lesioni maligne [24][99] , e sarebbe correlata ad una prognosi peggiore. È inoltre stato dimostrato che la proteina ipoglicosilata e sialilata ha una localizzazione anomala nelle cellule, presentandosi anche nel citoplasma o sulla membrana non apicale delle cellule tumorali [34] . Nel nostro lavoro abbiamo osservato una diversa espressione di MUC1 nei vari tipi cellulari a seconda dell"anticorpo utilizzato. Il clone E29 (anti-EMA), che viene detto "pan-mucina" perché riconosce la glicoproteina indipendentemente dal grado di glicosilazione, si lega a un antigene che è espresso solo focalmente dagli sferoidi ottenuti da MCF-7, analogamente a quanto osservato in IMPC; nelle cellule T-47D l"isoforma riconosciuta dal clone E29 è invece iperespressa sia nei controlli sia negli sferoidi. L"antigene riconosciuto dal clone Ma695 (anti-MUC1), che riconosce una forma pesantemente sialilata di MUC1, è iperespresso sulla superficie esterna degli sferoidi-MCF-7, proprio come osservato in IMPC in vivo. In uno studio attualmente in corso, abbiamo inoltre evidenziato l"espressione di questa variante in emboli neoplastici di carcinomi mammari, confermando che durante la progressione tumorale le cellule esprimono forme di MUC1 progressivamente meno glicosilate, e sempre più sialilate [100] .Un dato inaspettato da noi osservato all"ICC e IF è stato l"induzione dell"iperespresione di HER2 negli sferoidi elastasi-indotti ottenuti da MCF-7; tale osservazione potrebbe rientrare nell"ambito dei complessi riarrangiamenti del cromosoma 17 da noi evidenziati tramite FISH su cromosomi in interfase e metafase sia sugli sferodi-MCF-7 sia su IMPC. Particolarmente interessante è il rilievo della reciproca esclusione, nei siti di espressione, tra MUC1 ed HER2, come dimostrato dalle colorazioni doppie in IF.L"espressione di HER2 è infatti completamente assente sulla superficie esterna degli sferoidi, dove MUC1 è invece iperespresso. Tale risultato, da noi confermato anche su casi di IMPC iperesprimenti HER2, potrebbe essere considerato un ulteriore meccanismo di resistenza alla terapia a bersaglio molecolare con l"anticorpo umanizzato anti-HER2 (Herceptin) [101] e avere quindi importanti ricadute in ambito clinico.La valutazione del profilo di espressione genica (GEP) sulle colture cellulari è stata l"ultima fase del nostro studio. L"analisi preliminare dei dati suggerisce che alcuni dei geni sottoregolati negli sferoidi MCF-7 potrebbero essere correlati con lo sviluppo di chemioresistenza. Ad esempio, la sottoregolazione di SLCA19A1, che codifica per una proteina che riduce il trasporto di folati e veicola il Metotrexate all"interno delle cellule, potrebbe giustificare la resistenza ai farmaci chemioterapici in IMPC (studio in corso).Di particolare interesse potrebbe inoltre essere la sovraespressione di CD44, gene che codifica per una proteina considerata marcatore di staminalità. Un recente studio [100] ha dimostrato l"esistenza di una popolazione di cellule con fenotipo staminale/CD44+ tra le MCF-7 che esprimono MUC1 in forma ipoglicosilata e altamente sialilata, analogamente a quanto osservato negli sferoidi elastasi-indotti. Lo studio di CD44 sugli sferoidi potrà chiarire se nella cancerogenesi di IMPC intervengano fenomeni di selezione di cellule staminali.In conclusione, il nostro lavoro ha permesso di creare un modello in vitro che riproduce le caratteristiche morfologiche e biologiche dei carcinomi micropapillari della mammella, e potrebbe essere considerato per lo studio dei meccanismi di metastatizzazione sottoforma di "Collective Cell Migration" e di chemioresistenza.