La reazione più importante nella quale viene coinvolto l'enzima è la catalisi dell'isomerizzazione o modificazione geometrica del fosfoglucoso o glucosio-6-fosfato (G6P) a fruttosio-6-fosfato (F6P), durante la prima fase della glicolisi. Questo enzima sposta l'equilibro della reazione verso la forma enolica del glucosio la quale è idenica alla forma enolica del fruttosio, la reazione si completa quando la forma enolica si "trasforma" in fruttosio per opera dell'enzima.