L'analisi di sopravvivenza è stata condotta solo nella casistica dei carcinoidi, in considerazione del sostanziale differente comportamento biologico e clinico delle forme di alto grado.L'analisi univariata ha tenuto conto dei principali fattori clinici e patologici unitamente allo stato di metilazione del promotore di MGMT ed ai livelli di espressione genica. La espressione proteica non è stata compresa per l'esiguo numero di casi testati. È stata condotta una analisi unicamente di sopravvivenza libera da malattia in quanto solo tre pazienti erano deceduti, dato che avrebbe limitato la potenza statistica di un test di sopravvivenza globale (Tabella 10).Nella casistica completa dei carcinoidi (TC + AC), il sesso maschile, l'istotipo AC, il grado 2 secondo Rindi (Rindi et al., 2006) e la presenza di invasione vascolare sono risultati significativamente associati ad una più corta sopravvivenza. L'indice proliferativo, sia suddiviso secondo il cut-off proposto in letteratura del 4% sia considerando il valore medio della casistica, ha mostrato una associazione con la sopravvivenza pur non raggiungendo nella casistica oggetto di studio una significatività statistica.Tra i fattori significativi nella casistica globale, solo il sesso maschile ha mantenuto una associazione significativa con una peggiore prognosi nella casistica dei AC analizzata separatamente.Tabella 10. Analisi univariata di sopravvivenza libera da malattia.Legenda. M: maschi; F: femmine; Un primo punto cruciale del lavoro svolto è stato valutare la prevalenza di espressione di MGMT utilizzando metodiche differenti, in parte complementari ma anche in grado di fornire informazioni sui principali meccanismi di regolazione della espressione di MGMT stessa.Le metodiche scelte sono state la valutazione dell' espressione dell'mRNA specifico, lo stato di metilazione del promotore, l'espressione proteica e l'espressione di miR-409-3p, che ha tra i suoi geni target regolati anche MGMT. Ognuna di queste metodiche è in grado di fornire informazioni da un punti di vista differente, e la complementarietà delle informazioni ottenute è uno tra i principali punti di forza del presente lavoro.Gli unici dati di letteratura ad oggi disponibili sulle neoplasie neuroendocrine polmonari erano legati alla valutazione dell'espressione proteica di una casistica di 40 carcinoidi polmonari, nessuno dei quali risultato completamente negativo e quindi con un profilo definito "alterato" (Kulke et al., 2009). Nessun dato è invece stato mai pubblicato ad oggi in questo gruppo di neoplasie per quanto concerne l'espressione genica e lo stato di metilazione del DNA.I dati della presente tesi complessivamente dimostrano come anche le neoplasie neuroendocrine polmonari presentino un profilo di espressione di MGMT, inteso come alterata espressione a seguito di meccanismi di blocco della sua espressione, paragonabile alla controparte pancreatica, che rappresenta il modello più studiato nel contesto delle neoplasie neuroendocrine (Kulke et al., 2009;Schmitt et al., 2014).Infatti, la quota di casi con una percentuale di siti metilati nel promotore di MGMT superiore al 5% è stata del 51%, mentre il 70% dei casi ha mostrato un profilo "deficitario" di espressione proteica, inteso come una positività in meno del 5% delle cellule tumorali. Inoltre, l'analisi di espressione genica mediante PCR quantitativa ha mostrato livelli estremamente eterogenei del trascritto di MGMT, con valori sia prossimi allo zero sia centinaia di volte superiori rispetto al calibratore. Nel complesso si può affermare che l' espressione di MGMT è de-regolata in una rilevante percentuale di casi di neoplasie neuroendocrine polmonari, e che questo dato rappresenta, a differenza della letteratura esistente che sembrava dimostrare una assenza di alterazione della espressione di MGMT, il più forte elemento razionale per l'utilizzo di agenti alchilanti in questo tipo di neoplasie.Nel dettaglio dei profili di espressione, si è osservato un progressivo incremento della percentuale di siti di metilazione tra i carcinoidi tipici e i carcinomi di alto grado, sebbene i risultati non raggiungessero una significatività statistica. Questo dato fa supporre che, come per altri enzimi coinvolti nella riparazione del danno del DNA, anche MGMT perda progressivamente funzione nel corso della progressione neoplastica e sia maggiormente deficitario in forme tumorali scarsamente differenziate ed a maggiore attività proliferativa. Dal punto di vista invece dell' espressione genica, i livelli di trascritto, per quanto come detto eterogenei, non hanno mostrato significative differenze in media tra i differenti istotipi, ad eccezione di una più elevata espressione nel carcinoma neuroendocrino a grandi cellule che non ha giustificazioni in letteratura e il cui significato merita un approfondimento in studi successivi. Infine, il miR-409-3p è risultato maggiormente espresso nei carcinoidi, con una progressiva perdita di espressione nelle forme via via più aggressive, a suggerire che differenti meccanismi di regolazione della espressione di MGMT (metilazione del promotore e perdita di espressione di un microRNA regolatorio negativo) possono cooperare alternativamente nel corso della progressione tumorale. Tuttavia, l'espressione di miR-409-3p non è risultata direttamente correlata con l'espressione genica o proteica di MGMT, a dimostrare come nel modello dei tumori neuroendocrini polmonari MGMT non rappresenti il principale target di questo microRNA, a differenza di altri modelli neoplastici quali ad esempio il glioblastoma (Khalil et al., 2016).Dal confronto diretto delle metodiche, si è osservato che lo stato di metilazione del promotore e la positività immunoistochimica sono gli unici due metodi di analisi che mostrano una correlazione reciproca, peraltro, come atteso, inversa. Questo aspetto è particolarmente rilevante se si intende l'analisi di MGMT non esclusivamente come indagine volta ad uno studio patogenetico ma come potenziale analisi ancillare di impatto clinico per una determinazione di MGMT quale predittore di risposta 69 terapeutica. Lo studio di MGMT come biomarcatore predittivo di risposta terapeutica a farmaci alchilanti è stato condotto e riprodotto nella pratica clinica in differenti modelli tumorali, quali, tra gli altri, il glioblastoma ed il carcinoma del colon-retto, sia come analisi dell' espressione/de-regolazione a livello tessutale sia come analisi condotta su sangue/plasma (Cabrini et al., 2015;Minoo, 2013). Un recente studio sul glioblastoma ha mostrato come il ruolo predittivo di risposta della determinazione immunoistochimica di MGMT sia minore rispetto a differenti metodiche di analisi dello stato di metilazione del promotore, sebbene senza una significatività statistica, e soprattutto come l'analisi dello stato di metilazione del promotore sia di particolare aiuto quale marcatore complementare nei casi negativi con l'immunoistochimica (Hsu et al.,In questo contesto, la letteratura in ambito di neoplasie neuroendocrine come detto è scarsa. In generale, i pochi dati di letteratura, in particolar modo per quanto riguarda le neoplasie neuroendocrine pancreatiche, sono controversi sia per quanto concerne la correlazione tra la metilazione del promotore e l'espressione proteica di MGMT, con dati a favore di una correlazione reciproca (Cros et al., 2016;Walter et al., 2015) e dati contro (Schmitt et al., 2014), sia per quanto riguarda il potenziale ruolo predittivo con dati a favore (Walter et al., 2015) e dati contrari (Schmitt et al., 2014;Cives et al., 2016). L'ambito predittivo della espressione di MGMT nella casistica oggetto della tesi non è però stato esplorabile in quanto nessuno dei pazienti oggetto di studio è stato trattato con farmaci alchilanti, nonostante vi siano evidenze che la terapia con temozolomide, sia da sola sia in associazione con bioterapie, rappresenti una strategia efficace nei pazienti con carcinoide polmonare avanzato (Wolin, 2015).Un altro aspetto innovativo del presente lavoro è rappresentato dalla valutazione dell'impatto prognostico di MGMT nelle neoplasie neuroendocrine polmonari, con particolare riferimento ai carcinoidi, indipendentemente dall'effettuazione di un trattamento con farmaci alchilanti. Anche in questo caso, la letteratura disponibile è dedicata a modelli tumorali non neuroendocrini (Gao et al., 2016;Li et al., 2015;Fu et al., 2016;Martinelli et al., 2016;Che et al., 2015), con in generale un impatto prognostico sfavorevole in presenza di perdita di espressione proteica o in presenza di genotipo ipermetilato. Nelle neoplasie neuroendocrine pancreatiche, i dati di letteratura sono controversi, con una assenza di associazione statisticamente significativa con la sopravvivenza globale alla diagnosi per la determinazione dello stato di metilazione del promotore in uno studio (Walter et al., 2015), ed un impatto prognostico sfavorevole della perdita di espressione proteica di MGMT in un altro studio (Schmitt et al., 2014). Nel nostro caso, l'analisi di correlazione clinica e patologica e di sopravvivenza è stata ristretta al gruppo dei carcinoidi ed all' analisi di espressione genica e di metilazione del promotore, per il limitato numero di pazienti valutati con metodica immunoistochimica. La presenza di un genotipo metilato del promotore di MGMT è risultata significativamente associata ad uno stadio clinico inferiore ed alla assenza di metastasi linfonodali, sia nei carcinoidi come gruppo esaminato complessivamente sia restringendo l'analisi ai soli carcinoidi atipici; tuttavia lo stato di metilazione non ha mostrato una associazione significativa con la sopravvivenza libera da malattia. Risultati più interessanti in questo senso sono invece emersi dall' analisi di espressione genica, che ha mostrato una significativa associazione tra la presenza di varie caratteristiche di aggressività clinica e biologica (istotipo atipico, grado 2 secondo Rindi (Rindi et al., 2006), diametro maggiore, stadio clinico più elevato e presenza di metastasi linfonodali) e livelli di espressione del trascritto più bassi, analogamente al modello generale di altre neoplasie menzionate in precedenza. Inoltre, sebbene non raggiungendo una significatività statistica, livelli più bassi di espressione genica sono stati riscontrati in pazienti con malattia clinicamente aggressiva (vivi con malattia o morti di malattia) e con un tempo inferiore di sopravvivenza libera da malattia.