Questo livello è necessario per lavorare con agenti pericolosi ed esotici che presentano un elevato rischio di trasmissione di infezioni in laboratorio per via aerea, con agenti che causano gravi malattie mortali in esseri umani per le quali non sono disponibili vaccini o altri trattamenti, come ad esempio le febbri emorragiche boliviane e argentine, Marburg virus, virus Ebola, Virus Lassa, febbre emorragica Congo-Crimea e varie altre patologie emorragiche. Questo livello è utilizzato anche per lavorare con agenti quali il vaiolo che sono considerati pericolosi abbastanza da richiedere ulteriori misure di sicurezza, indipendentemente dalla disponibilità di vaccinazione. Quando si tratta di rischi biologici a questo livello l'uso di un tuta personale a pressione positiva, con una fornitura di aria separata è obbligatoria.