Deve essere eettuato in provette a freddo, per evitare la proteolisi dell'ormone, e con metodi di dosaggio immunoradiometrici che siano in grado di riconoscere adeguatamente concentrazioni inferiori a 10 pg/mL (2 pmol/L) [50]. Livelli di ACTH inferiori a tale soglia, in presenza di elevate concentrazioni di cortisolo, suggeriscono una causa ACTH-indipendente, sebbene in alcuni casi di malattia iposaria si possano trovare dei valori nella norma [90] e in alcuni casi di sindrome di Cushing surrenalica i livelli di ACTH possano risultare non del tutto soppressi. Nell'esperienza del gruppo di studio della Società Italiana di Endocrinologia, questi risultati sono imputabili nella maggior parte dei casi a problemi tecnici con il dosaggio dell'ACTH [50], anche se è possibile sia implicata un' incompleta soppressione della secrezione iposaria di ACTH da parte dei glucocorticoidi circolanti [90].  [92]. In realtà i risultati falsi positivi possono essere dovuti al fatto che le cellule di alcuni carcinoidi presentano recettori per i glucocorticoidi, rispondendo quindi allo stesso modo di tumori surrenalici [94]. I test di soppressione con desametasone ad alte dosi sono in grado di dierenziare la malattia iposaria dalla sindrome ectopica, con una sensibilità variabile tra il 65-100% per il test di 2giorni, e tra il 59-92% per l'overnight [92], ma con un'insoddisfacente specicità (29-60%) [90] quando sia usata la soglia della soppressione dei livelli di cortisolo (serici o urinari) maggiore del 50% rispetto al basale. La specicità può essere migliorata, senza mai raggiungere il 100%, utilizzando una soglia di soppressione maggiore di 80% (a scapito, però, di una grossa riduzione in termini di sensibilità) [50].L'accuratezza diagnostica del test è del 70-80% e può essere inuenzata da diversi fattori come un'incompleta raccolta delle urine, uttuazioni giornaliere dell'escrezione steroidea, errori nel tempo dei prelievi dopo somministrazione di desametasone, inaccuratezza del dosaggio degli steroidi urinari per assenza di compliance da parte dei pazienti, patologie renali ed epatiche concomitanti, limiti del laboratorio [92].Nessuna variazione del protocollo di somministrazione o delle soglie di soppressione è in grado di garantire una completa dierenziazione della sindrome di Cushing ACTH-dipendente nella pratica clinica [50] [92].Test di stimolo con CRH Il test al CRH si è dimostrato essere una metodica valida, con una percentuale di mancata diagnosi inferiore al test con desametasone ad alte dosi (HDDST) [93].Questi risultati in realtà non hanno raggiunto una rilevanza statistica perché valutati su un numero esiguo di pazienti, ma sono clinicamente rilevanti.Va però ricordato che alcuni tumori ectopici ACTH-secernenti possono avere recettori per il CRH e quindi dare una risposta positiva al test; il test quindi non raggiunge in 100% né di sensibilità, né di specicità, ma, da un'analisi combinata di tutti i risultati ottenuti, è stata evidenziata una percentuale di falsi (sia positivi che negativi) dal 7 al 15%, anche quando sono stati applicati i criteri migliori. Di conseguenza, per raggiungere una diagnosi dierenziale il più possibile corretta nella pratica clinica, spesso si utilizzano più test in associazione. Questa strategia però non è unanimamente condivisa. In alcune serie di studi si è visto che, combinando il criterio di una soppressione di più del 30% al test a basse dosi di desametasone con un incremento del cortisolo di più del 20% al test con CRH, si ha una sensibilità del 94% e una specicità del 97% nel distinguere le forme di malattia di Cushing dalle forme di secrezione ectopica [97]. Questo fatto non è però stato dimostrato in altri studi; in alcuni infatti è emerso come l'uso di test combinati per la diagnosi dierenziale aumenti la percentuale di errori nella diagnosi, riducendo l'accuratezza diagnostica del CRH test [94].