Il sangue venoso periferico è stato prelevato dai pazienti tramite una provetta con anticoagulanti, indi idoneamente centrifugato a 1500g per 15 minuti, per separare la parte corpuscolata dal siero. Quest'ultimo, in seguito, è stato immediatamente stoccato a -80 °C per poi essere inviato, mantenendo inalterata la catena del freddo, al Settore Immunometria del laboratorio di Biochimica Clinica "Baldi e Riberi" del Presidio Molinette presso la Città della Salute e della Scienza di Torino, dove sono stati materialmente effettuati i dosaggi di KL-6.La procedura analitica ha utilizzato la piattaforma automatizzata LUMIPULSE G600II della ditta Fujirebio (Sankojunyaku, Japan) e i rispettivi reattivi specifici commercializzati dalla ditta produttrice (figura 16).In dettaglio la metodica utilizzata prevede la determinazione quantitativa del KL-6 su siero mediante ricorso alla tecnica CLEIA (ChemiLuminescent Enzyme Immunoassay) di immunodiagnosi. Il macchinario utilizza un esclusivo sistema di cartuccia mono-test per ogni singolo dosaggio impedendo in tal modo la cross-contaminazione tra campioni diversi dosati in sequenza (figura 17). La procedura di analisi mediante LUMIPULSE G600II ha una durata complessiva di circa 25 minuti. Il dosaggio del biomarcatore consiste in un test immunologico la cui metodica si basa sul principio immunoenzimatico "sandwich a due step" (figura 18) ed avviene con procedura totalmente automatizzata secondo il seguente schema:1. Il campione viene caricato sulla catena di accesso strumentale ed è immediatamente diluito con apposito diluente (diluizione 1:1) dal sistema per ammortizzare le interferenze di matrice;2. Una quantità fissa e standard del diluito viene immessa in una sezione della cartuccia di reazione dove sono presenti micro-biglie di ferro coattate con un anticorpo monoclonale specifico contro KL-6. Il tutto viene incubato per permettere la formazione dell'immunocomplesso antigene-anticorpo;3. Mediante l'ausilio di un campo magnetico che permette di immobilizzare alla parete della cuvetta di reazione i complessi Ag-Ab formati e legati al ferro, si procede ad un lavaggio per asportare i reattivi in eccesso che non hanno reagito;4. È aggiunta una quantità standard di fosfatasi alcalina (ALP) coniugata con un secondo anticorpo monoclonale contro KL-6 che si lega all'immunocomplesso già presente nella cuvetta. L'ALP fungerà da catalizzatore per sviluppare una luminescenza qualora sia messa a contatto con un substrato idoneo. L'intensità di essa sarà direttamente proporzionale alla quantità di enzima presente che, a sua volta, è direttamente proporzionale alla quantità di KL-6 presente nel siero di partenza che ha permesso la formazione del primo immunocomplesso;5. Viene effettuato un secondo lavaggio e allontanati i reattivi in eccesso; • LUMIPULSE G Soluzione di substrato: liquida, contiene 0.2 mg/mL di AMPPD come substrato in tampone di dietanolamina con stabilizzatore chimico. Il conservante è sodio azide;• LUMIPULSE G Soluzione di lavaggio: concentrata, contiene 342 mM di cloruro di sodio in tampone Tris con detergente. Il conservante è sodio azide;• LUMIPULSE G Campione di diluente: liquido, contiene 0.15 M di cloruro di sodio in tampone Tris con stabilizzatori proteici (bovini) e stabilizzatori chimici. Il conservante è sodio azide;• Sampling tips per LUMIPULSE SYSTEM ("in rack");• Sampling tips per LUMIPULSE SYSTEM;• Soda lime per LUMIPULSE SYSTEM;• Cartucce di diluizione LUMIPULSE G;• Acqua purificata;• Materiale di controllo;• Micropipette;• Cuvette. Figura 19. Reazione di trasformazione dell'AMPPD in seguito all'azione dell'enzima ALP [197].La sensibilità analitica e quella funzionale del dosaggio, determinate secondo le Linee Guida CLSI del Protocollo EP17-A [197] denunciate dalla ditta produttrice, sono entrambe di 13.47 U/mL. Il range di misurazione è compreso tra 50 e 10.000 U/mL (figura 20). La linearità del dosaggio è dichiarata sino a 10.000 U/mL, oltre la quale è necessario intervenire con diluizione manuale. Per quanto riguarda i valori di KL-6 riscontrati nei soggetti sani, da studi condotti dalla ditta produttrice del kit su volontari (età compresa tra 18 e 68 anni) si è ricavato un valore medio pari a 306 U/mL. Nessuno dei volontari sani presentava concentrazioni di KL-6 >500 U/mL. 