Nel 1528 Mattioli sposò una donna trentina, una tal Elisabetta della quale non è noto il cognome e gli diede un figlio. Cinque anni dopo pubblicò il suo primo libello, "Morbi Gallici Novum ac Utilissimum Opusculum", e iniziò a lavorare alla sua opera su Dioscoride. Nel 1536 Mattioli accompagnò come medico Bernardo Clesio a Napoli per un incontro con l'imperatore Carlo V. Tornato a Trento, con la morte di Bernardo Clesio, nel 1539, gli successe al soglio vescovile Cristoforo Madruzzo, il quale però aveva già un medico e così Mattioli decise di trasferirsi a Cles, dove tuttavia si trovò presto in ristrettezze finanziarie.