Recenti studi hanno dimostrato che l'infezione da papillomavirus di tipo 16 richiede inizialmente l'interazione con gli eparansolfati proteoglicani di superficie [Shafti-Keramat et al., 2003]. Conseguentemente l'eparina inibisce l'infezione da HPV-16, competendo con gli eparansolfati per il legame al capside virale [Joyce et al., 1999]. Tuttavia l'eparina possiede un'attività anti-HPV però solo ad elevate concentrazioni; è inoltre dotata di una forte proprietà anticoagulante, esercitata attraverso il legame all'antitrombina III che aumenta l'azione di quest'ultima con la conseguente neutralizzazione della trombina. Tali caratteristiche impediscono un possibile utilizzo dell'eparina in terapia contro le infezioni da papillomavirus umani [ Giroglou et al., 2001. I polisaccaridi derivati dall'antigene capsulare K5 di Escherichia Coli sono formati da uno scheletro che ha la stessa struttura del precursore biosintetico dell'eparina, su cui i gruppi solfato sono inseriti in differenti posizioni e gradi. Tuttavia non contengono residui di acido iduronico e quindi sono strutturalmente più simili agli eparansolfati che all'eparina. Date le affinità strutturali con gli eparansolfati, i K5 derivati agiscono come inibitori efficaci di alcune molecole che interagiscono con gli HPSG, includendo tra queste anche le proteine virali [Rusnati et al., 2005].Partendo da tali presupposti, in questo lavoro abbiamo saggiato un numero di derivati di K5 Negli esperimenti in BIACORE l'eparina biotinilata è stata fatta reagire con il sensorchip rivestito da streptavidina e successivamente gli pseudovirioni di HPV-16 sono stati inoculati per consentire l'associazione delle proteine capsidiche con l'eparina immobilizzata.Dopodiché sono stati addizionati i derivati di K5 per studiare la loro capacità di competere con il complesso eparina/pseudovirione dimostrando che i derivati di K5 prevengono l'infezione virale attraverso il legame al virus, sequestrandolo nell'ambiente extracellulare.I risultati ottenuti mediante la tecnologia BIACORE sono in accordo con quelli ottenuti mediante i saggi cellulari di neutralizzazione: pertanto il saggio acellulare si è rivelato un valido sistema di screening primario per identificare un potenziale composto anti-HPV.Inoltre, tali composti mantengono la loro attività antagonista anche quando vengono aggiunti alle colture cellulari a differenti tempi dopo l'esposizione agli pseudovirioni di HPV (2, 4, 6 e 8 ore post-infezione). In questo caso, i derivati di K5 agiscono con un'inattivazione di postadesione simile a quella osservata con l'eparina e con gli anticorpi monoclonali [Christensen et 101 al., 1995;Giroglou et al., 2001]. Questa è una proprietà di grande interesse per lo sviluppo di un microbicida topico capace di prevenire un'infezione da HPV durante o immediatamente dopo un rapporto sessuale., K5-OS(H) è il derivato di K5 che meglio mantiene nel tempo la capacità di neutralizzare l'infezione nel saggio di post-adesione, sebbene nel saggio di adesione la sua attività sia comparabile con quella degli altri derivati di K5 bioattivi ((K5-N,OS(L) e K5-N,OS(H)). Si può ipotizzare che K5-OS(H), grazie alla sua più alta affinità per gli pseudovirioni di HPV-16, sia in grado di competere attivamente con gli eparansolfati proteoglicani di superficie e possa spiazzare i legami preformati.Nel saggio BIACORE, K5-OS(H) si è confermato essere il più potente inibitore dell'interazione tra pseudovirione ed eparina, in quanto in grado effettivamente di rompere questo legame.Oltre agli HPSG, altri recettori cellulari di HPV sono stati proposti , quali la proteina della matrice extracellulare laminina-5 e la proteina cellulare transmembrana integrina α-6. Si ritiene che tali proteine mediano le fasi secondarie dell'adsorbimento del virus alla cellula ospite [Culp et al., 2006]. Si può ipotizzare che i K5 derivati, che conservano un'attività antagonista per diverse ore successive all'infezione, possono agire sull'interazione del virus con eventuali recettori secondari.Recentemente sono stati eseguiti studi di mutagenesi sulla sequenza della proteina L1 di HPV-16, che costituisce quasi la totalità del capside virale, e dell'eparina, dimostrando che il loro legame è dipendente dai gruppi solfato presenti in posizioni ben definite dello scheletro polisaccaridico [Knappe et al., 2007]. In conformità con il lavoro di Knappe, abbiamo dimostrato che quando un derivato di K5 è altamente solfatato sull'ossigeno non sono essenziali gruppi solfatati in posizione N-al fine di esercitare una buona attività inibitoria. Gruppi solfatati in 102 posizione N sono invece necessari quando il numero di gruppi O-solfatati è basso come nel caso dei K5-N,OS(L); ciò significa che deve essere presente un certo numero di gruppi solfato per unità disaccaridica, e che per avere il massimo di attività di legame la maggior parte dei gruppi ossidrilici devono essere solfatati.Il coinvolgimento dei gruppi solfato carichi negativamente dei derivati di K5 nel legame al virus fa emergere la questione di quali domini funzionali delle proteine capsidiche ne mediano il contatto. E' stato dimostrato che le sequenze cariche positivamente presenti al C-terminale della proteina L1 di HPV-16 legano i recettori eparansolfati proteoglicani e mediano l'entrata del virus nelle cellule ospiti [Bousarghin et al., 2003]; al contrario i peptidi sintetici corrispondenti a tali sequenze cariche positivamente bloccano l'infezione [Bousarghin et al., 2004]. Studi recenti hanno dimostrato che i residui di lisina 278, 356, o 361 della proteina capsidica L1 di HPV-16 sono fondamentali per il legame e l'infettività degli pseudovirioni [Knappe et al., 2007]; tale scoperta supporta l'ipotesi che i "domini basici", presenti in numerose proteine leganti l'eparina, siano coinvolti nel legame agli eparansolfati di superficie [Rusnati et al., 2006] e possono essere considerati un bersaglio per lo sviluppo di efficienti inibitori polianionici. Gli aminoacidi basici, indispensabili per il legame del virus alla cellula, sono conservati nella sequenza di L1 dei principali tipi di papillomavirus umani che infettano le mucose genitali [Joyce et al., 1999;Knappe et al., 2007]; [Bousarghin et al., 2003]; [Bousarghin et al., 2004]. Ciò suggerisce che i derivati di K5 possono potenzialmente agire come inibitori di molti tipi di HPV genitali attraverso l'interazione con motivi basici ben conservati della proteina capsidica L1. La scoperta che questi composti sono attivi anche nei confronti di BPV-1 (papillomavirus bovino di tipo 1), il quale è filogeneticamente distante dagli HPV gentitali [De Villiers et al., 2004],103 rafforza ulteriormente l'idea di poterli impiegare in futuro come degli inibitori ad ampio spettro dell'infezione da papillomavirus.Inoltre si è evidenziato che l'attività dei derivati di K5 non è ristretta ad un tipo di papillomavirus umano, ma essi sono in grado di inibire potenzialmente l'infezione dei tre HPV più comunemente trasmessi per via sessuale (HPV-6, HPV-16, HPV-18), che possono causare lesioni genitali ed il cancro della cervice uterina. Questa proprietà rappresenta un importante vantaggio competitivo dei K5 rispetto ai nuovi vaccini profilattici che sono ristretti a determinati tipi di HPV e candidano tali composti come possibili componenti di un microbicida ad uso topico da impiegare come un utile adiuvante delle campagne vaccinali [Christensen et al., 2001]; [ Buck et al., 2006].A differenza di altri inibitori dell'infezione da HPV, quali i carraghenani, i pentosani polisolfatati e i destrani solfatati di origine estrattiva, i K5 derivati possono essere facilmente modificati chimicamente in struttura e peso molecolare, in modo da poter mimare il più possibile gli eparansolfati proteoglicani, conferendo a tali composti specificità e affinità di legame nei confronti del capside virale. A differenza dell'eparina, essi sono privi di un'attività anticoagulante in quanto non possiedono nelle loro sequenze glucidiche il pentasaccaride responsabile del legame con l'antitrombina III [Rusnati et al., 2005]. Sono inoltre molecole non tossiche: essendo infatti strutturalmente molto simili agli eparansolfati naturali, vengono metabolicamente riconosciuti e facilmente catabolizzati nell'organismo. Recenti studi eseguiti su sangue intero hanno dimostrato che, in presenza dei derivati di K5, non vengono mobilizzate citochine e chemochine [Coradin et al., 2007]; i derivati di K5 risultano pertanto privi di attività proinfiammatoria. K5-OS(H) e K5-N,OS(H) hanno anche mostrato una buona attività anti-HIV in vitro su ceppi di HIV-1 che utilizzano come co-recettori CCR5, CXCR4 o 104 entrambi in differenti cellule CD4+, includendo linee cellulari, linfociti T attivati e macrofagi derivati da monociti [Vicenzi et al., 2003]. K5-N,OS(H) è stata inoltre saggiata in un modello ex vivo di espianti di tessuto esocervicale; K5-N,OS(H) ha mantenuto la sua attività inibitoria verso HIV [Coradin et al., 2007]. Nel loro insieme queste caratteristiche candidano alcuni derivati dell'antigene K5 come molecole microbicide attive nel prevenire due delle più importanti infezioni virali trasmesse sessualmente.