benzilica sulla molecola della GTN modifichi il profilo di vasodilatazione. Queste variazioni sono confermate dagli esperimenti condotti in presenza di inibitori: il benomyl non sembra influenzare la potenza di questi composti, dal momento che le curve concentrazione-risposta così ottenute sono praticamente sovrapponibili a quelle di controllo. Si può quindi affermare che questi composti, a differenza della GTN, non sono bioattivati dall' ALDH-2. Inoltre, gli esperimenti ripetuti in presenza di ODQ hanno mostrato una diminuzione dell'attività vasodilatante dei composti, ma non la sua completa soppressione; lo spostamento osservato è di circa 15 volte. Questo potrebbe indicare un'abilità di questi prodotti di rilassare il tessuto con un meccanismo apparentemente non eme-dipendente. Viceversa, il profilo dei dinitrossi enantiomeri 2a e 2b ha rivelato maggiori analogie con quello della GTN. Entrambi presentano una curva concentrazione-risposta con andamento bifasico, anche se non molto evidente in quanto la seconda fase riguarda solo circa il 5% della vasodilatazione totale. Inoltre, i due composti risultano soltanto circa due volte meno potenti della GTN (Figura 27).L'ODQ ha diminuito l'attività vasodilatante in entrambi gli enantiomeri, senza sopprimerla completamente. Il dato più rilevante è stato ottenuto ripetendo gli esperimenti in presenza di benomyl: in questo caso infatti la curva concentrazione-risposta, che appare monofasica, è stata spostata di 3 volte indicando un possibile coinvolgimento dell'ALDH-2 nella bioattivazione. Per confermare questo andamento sono stati effettuati ulteriori esperimenti utilizzando il cloralio idrato (tricloroacetaldeide monoidrato, Figura 28), un inibitore competitivo, non selettivo, dell'ALDH-2 . In questo caso è stato osservato uno spostamento verso destra della curva concentrazione-risposta ancora più marcato rispetto a quello ottenuto con il benomyl; analogamente a quanto già osservato sulla GTN, si può quindi affermare che questi composti vengono bioattivati dall'ALDH-2.Il mononitrossi derivato 3 ha evidenziato un profilo analogo a quello dei derivati dinitrossilici, in quanto la curva concentrazione-risposta è bifasica e gli spostamenti in presenza di inibitori sono paragonabili (Figura 29).Questo quadro complessivo presenta analogie con i dati precedentemente ottenuti per i fenil derivati della GTN. Infatti, i mono e dinitrossi derivati di entrambe le serie presentano un comportamento analogo alla GTN con coinvolgimento dell'ALDH-2 nella bioattivazione. Viceversa, gli otto triesteri nitrici hanno evidenziato un profilo che si discosta significativamente da quello del lead di riferimento. Va comunque evidenziato che le caratteristiche GTN-simili sono più accentuate nei composti mono e dinitrossilici della serie fenilica. L'ipotesi che per i nitrossi derivati alifatici la selettività verso il pathway di bioattivazione dell'ALDH-2 fosse legata al numero di esteri nitrici per la loro influenza sull'elettrofilia, viene messa in discussione dai dati raccolti su queste due serie di esteri nitrici aromatici. Si è pertanto deciso di proseguire questo lavoro di tesi indagando, con metodi computazionali, le possibili interazioni tra i composti delle due serie e il sito attivo dell'enzima bioattivante.Un'importante fase del lavoro è stata l'attenta analisi della struttura dell'enzima e in particolare della cavità, confrontando tre diversi set di coordinate tridimensionali. Dal sito dell'RCSB Protein Data Bank è stato eseguito il download dei file di coordinate tridimensionali dell'enzima ALDH-2 umano, in particolare della proteina nativa (1O00) e dei complessi con l'inibitore daidzeina (2VLE) e con il substrato crotonaldeide (1O01). La struttura co-cristallizzata con la crotonaldeide è quella che sarà utilizzata per lo studio computazionale, dal momento che, per un lavoro di flexible docking, dove la struttura della cavità viene mantenuta rigida, è opportuno scegliere un enzima co-cristallizzato con un ligando il più possibile somigliante a quelli che verranno studiati.Visualizzando con il software MOE uno dei monomeri che costituiscono la coppia di tetrameri presenti nell'unità asimmetrica del cristallo (Figura 30), è possibile osservare come la struttura tridimensionale sia attraversata da un canale al centro del quale è collocata la Cys302. A un'estremità del canale si colloca il NAD + , che arriva in prossimità del gruppo tiolico della cisteina con il nucleo nicotinamidico; all'estremità opposta invece entrano i substrati e gli inibitori, come si può vedere dalla collocazione della crotonaldeide nel complesso. La posizione del NAD + , i cui gruppi fosfato complessano uno ione Mg 2+ , è conservata sia nell'oloenzima che in presenza della crotonaldeide. La daidzeina invece, molecola con una struttura rigida e ingombrante, sposta sia il NAD + che l'adiacente Glu268. Confrontando le cavità (Figura 31a) degli otto monomeri della proteina nativa e gli otto della cavità co-cristallizzata con la crotonaldeide (cerchio nero) si notano poche differenze: le due catene laterali della Met124 e Met174 sono ruotate (cerchi blu e rosso, in trasparenza la conformazione nell'enzima senza substrato); anche il gruppo tiolico della Cys301 è spostato (cerchio verde), le molecole di acqua all'interno della cavità sono presenti in numero minore, ma ne è evidenziabile una legata da ponti ad idrogeno con Glu476 e Thr244 presente in entrambe le strutture e quindi conservata. Nella cavità va evidenziata la posizione del Glu268 e dell'Asn169, che partecipano all'attività catalitica, rispetto alla Cys302, e la posizione delle Cys 301 e 303. La cavità e il suo ingresso (Figura 31b) sono delimitati dagli anelli aromatici delle catene laterali delle fenilalanine 170, 296, 401, 459, 465 e del triptofano 177, oltre alle catene laterali delle due metionine 124 e 174 sopracitate. La flessibilità delle catene laterali di Cys301, Met124 e Met174, unita all'assenza di loro specifiche interazioni con i residui circostanti, consente loro di mutare facilmente conformazione in risposta all'ingresso di un ligando nel sito attivo, permettendo così di accomodarlo più facilmente. Questo è uno dei motivi che hanno orientato la scelta della proteina target su cui effettuare il docking verso il complesso ALDH-2/crotonaldeide piuttosto che sull'oloenzima ALDH-2, dal momento che il complesso presenta un sito attivo in una geometria più adatta a ospitare un ligando.Per quanto riguarda i database conformazionali ottenuti dal flexible docking, le varie conformazioni sono divise in cluster e sono classificate in base a uno score. La suddivisione in cluster permette di raggruppare le conformazioni simili sulla base della deviazione quadratica media (RMSD) tra le posizioni degli atomi pesanti (ossia, diversi dall'idrogeno). Lo score calcolato da AutoDock (Goodsell et al., 1990(Goodsell et al., , 1996(Goodsell et al., e 1998 ha l'ambizione di riprodurre la variazione di energia libera (Figura 32) che accompagna laES ∆G = G ES -(G E + G S ) E + SFigura 32. Reazione di formazione del complesso. formazione del complesso enzima-ligando; il valore deve quindi essere negativo e il più grande possibile in valore assoluto affinché l'ingresso nella cavità sia termodinamicamente favorito.Occorre tenere presente che un calcolo accurato del ∆G di binding richiederebbe tecniche computazionali decisamente più sofisticate e dispendiose in termini di tempo-CPU di un semplice flexible docking. I software come AutoDock sono concepiti soprattutto per il virtual screening di grandi database di strutture, e sacrificano notevolmente l'accuratezza a favore della rapidità, per cui sarà opportuno evitare di trarre rigorose conclusioni quantitative, utilizzando piuttosto lo score come un criterio essenzialmente qualitativo per distinguere "buoni" da "cattivi" ligandi.Analizzando i database ottenuti per i triesteri nitrici, sia della serie benzilica (1a, 1b, 1c, 1d) che di quella fenilica (4a, 4b, 4c, 4d), gli andamenti sono simili nelle due serie.Il cluster dotato del miglior fit raccoglie pose caratterizzate da un ∆G(binding) debolmente negativo, intorno a -0,7 kcal mol -1 ; visualizzando le pose nel sito attivo (Figura 33) si nota che queste conformazioni presentano l'anello benzenico (cerchio rosso) all'interno della cavità in prossimità del gruppo tiolico di Cys302 (cerchio giallo), mentre il gruppo nitrato terminale (cerchio blu) rimane all'esterno. Questo significa che si tratta di pose non produttive, in quanto non possono dare luogo all'attività reduttasica dell'enzima, e quindi al rilascio di ossido di azoto; inoltre, sono notevoli i clash sterici con i residui della cavità.Figura 33. L'ingresso del triestere nitrico benzilico con l'anello benzenico in prossimità del gruppo tiolico di Cys302.