Le reazioni immunoistochimiche sono state allestite su sezioni dello spessore di 5 μm.Secondo la procedura convenzionale, è stata eseguita sparaffinatura in diafanizzante, disidratazione in alcool e reidratazione in PBS pH 7.5. In seguito è stata effettuata la procedura di smascheramento antigenico con calore in pentola a pressione, mediante 3 cicli da 10 minuti ciascuno, in tampone citrato a pH 6.0. E' stata poi bloccata l'attività delle perossidasi endogene incubando le sezioni con HP block (hydrogen peroxide) per 15 minuti a temperatura ambiente. I campioni sono stati poi incubati con gli anticorpi primari in studio: il CTGF (goat anti-CTGF, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA) è stato incubato con una concentrazione di 1:100 per 1 ora in una cameretta umida a temperatura ambiente; mentre il TGF-(rabbit anti-TGF-, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA) ad una diluizione di 1:200 a 4°. La reazione antigenica è stata evidenziata utilizzando il sistema di rivelazione EnVision (Dako Glostrup, Denmark) e la 3,3'-diaminobenzidina (DAB Dako) come cromogeno substrato delle perossidasi. Le sezioni sono state contrastate con ematossilina, disidratate, e montate.Come controlli negativi sono stati utilizzati campioni in cui veniva omesso l'anticorpo primario. Come controlli positivi sono stati utilizzati campioni di cute e pleura con fibrosclerosi come suggerito dalla letteratura [154,167,168] .La positività delle reazioni si evidenziava come colorazione di tonalità marroncina degli spazi citoplasmatici contrastata dal blu del nucleo ed è stata valutata in termini di assenza o presenza della stessa e intensità della colorazione (lieve, moderata, intensa). 