Nel 1834 Papa Gregorio XVI stabilì nell'ospedale le Suore ospedaliere della misericordia e nel 1842 affidò l'amministrazione dei religiosi dell'Ordine ospedaliero di San Giovanni di Dio (chiamati comunemente "Fatebenefratelli"). In questi anni, dal 1842 al 1849, l'Ospedale conosce una fase di grande ristrutturazione, iniziata da Gregorio XVI con fondi in parte forniti dalla Camera Apostolica e in parte personali.