A seguito di somministrazione per via inalatoria il farmaco raggiunge le basse vie respiratorie ed una frazione non trattenuta nell'erogatore si deposita nell'orofaringe e viene quindi ingerita e rapidamente assorbita dal tratto gastrointestinale. Salmeterolo agisce localmente a livello del polmone e le concentrazioni plasmatiche raggiunte non sono in alcun modo predittive dell'attività terapeutica. Nell'organismo salmeterolo viene ampiamente trasformato, mediante ossidazione alifatica, nel metabolita α-idrossisalmeterolo. La biotrasformazione si compie ad opera del citocromo P450 isoenzima 3A4 (CYP3A4). La co-somministrazione di salmeterolo, alle dosi usuali, e di un inibitore del citocromo CYP3A4, ad esempio ketoconazolo, può dar luogo ad un significativo aumento della concentrazione del beta agonista nel plasma.