La struttura originaria dell'edificio non è conosciuta, in quanto i primi lavori di rinnovamento veri e propri, risalenti al 1579, comportarono una modifica radicale dell'edificio e degli ambienti circostanti. Infatti, dopo un iniziale coinvolgimento di Baldassarre Peruzzi negli ultimi anni della sua vita (1534 - 1536), la facciata fu infine rinnovata dal giovane Giorgio da Coltre, sotto la guida di Antonio da Sangallo il Giovane che ne redasse il progetto già negli anni 1538 - 1546. Il progetto diede vita alla struttura definitiva dell'ospedale, che ancora oggi conserva queste caratteristiche. A testimonianza della primitiva architettura, vi è un portale esterno sormontato dallo stemma Colonna: sopra questo elemento vi è la rara rappresentazione del cappello cardinalizio del secolo XIV. I lavori iniziarono nel 1579 con l'architetto Francesco Capriani e si conclusero nel 1592 con Carlo Maderno.