Il dosaggio immunologico del cortisolo, e più in generale degli steroidi, nel siero/plasma, e successivamente nelle urine e nella saliva, è stato caratterizzato nell'ultimo ventennio da una continua evoluzione dei metodi di indagine. Da procedure analitiche eccessivamente laboriose, quali erano quelle estrattive, si è gradualmente passati agli attuali sistemi "diretti" la cui semplicità esecutiva ha ormai raggiunto l'obiettivo della completa automazione. Ciò ha sicuramente contribuito a una loro diffusione più capillare nei laboratori, ma soprattutto ha consentito un miglioramento della qualità analitica che ha comportato anche una maggiore omogeneità tra risultati ottenuti nei diversi laboratori. A fronte di questi innegabili vantaggi, il dosaggio diretto presenta ancora elementi di criticità, che sembrano in apparente contrasto con la facilità di esecuzione. A questa, in realtà, si è arrivati con una serie di accorgimenti atti a garantire un soddisfacente compromesso tra i numerosi problemi da risolvere, quali l'inibizione del legame con le proteine vettrici, l'interferenza degli alti livelli di steroidi coniugati, la differenza di immunoreattività tra ormone nativo e tracciante, la matrice dei calibratori e i disturbi nella rilevazione del segnale analitico connessi all'uso dei marcatori non isotopici. Nel dosaggio immunologico, l'antisiero svolge un ruolo fondamentale nel determinare il grado di accuratezza; infatti, affinché un metodo possa essere definito accurato, deve possedere la capacità di misurare esclusivamente il componente desiderato. La preparazione di antisieri a sempre più elevate caratteristiche di affinità e specificità ha avuto un peso determinante nell'eliminazione del passaggio estrattivo nel dosaggio degli ormoni steroidei nel siero/plasma. All'attuale stadio di semplificazione metodologica si è giunti con gradualità, in ragione di diverse problematiche esistenti. Un primo serio ostacolo è rappresentato dalla condizione in cui si ritrovano questi ormoni nel liquido biologico. Le forme circolanti sono di tre tipi e più precisamente: (1) la frazione libera, considerata la più importante in quanto biologicamente attiva;(2) quella legata alle proteine, che possono essere specifiche, come la CBG per il cortisolo, o non specifiche, come l'albumina che è capace di legarsi a tutti gli steroidi; (3) quella coniugata, cioè esterificata con acido glucuronico oppure solforico, insolubile nei solventi normalmente utilizzati per l'estrazione. Con il dosaggio immunologico, sia esso diretto che estrattivo, vengono misurate le prime due frazioni con l'esclusione degli steroidi coniugati, i più rappresentati nel siero, che con l'estrazione venivano completamente rimossi. Un altro aspetto da considerare in un dosaggio diretto è la necessità di rendere disponibile lo steroide nativo al legame con l'antisiero inibendo l'azione delle proteine specifiche. Al riguardo, il parametro più importante è l'affinità di legame del complesso steroide/proteina. In particolare, gli alti valori di affinità presentati dalla CBG non si discostano di molto da quelli di un normale antisiero. E' intuibile quindi come questa situazione non sia ottimale ai fini di un facile isolamento del cortisolo e come le soluzioni adottate al riguardo possano rappresentare indubbiamente degli elementi di criticità per il normale decorso della reazione immunologica.