Concluso il primo ciclo di studi filosofici si iscrisse alla facoltà di medicina e chirurgia presso "La Sapienza" laureandosi a pieni voti nel 1869, ed ottenendo anche una menzione per aver discusso in latino la sua tesi. Dopo una breve esperienza come assistente medico presso l'ospedale di S. Spirito, nel 1871 entrò con la qualifica di settore nell'istituto universitario di anatomia patologica diretto da Corrado Tommasi Crudeli. In queste circostanze il giovane Marchiafava realizzò le sue prime osservazioni e una volta ottenuto il posto come responsabile delle esercitazioni pratiche di anatomia patologica (nell'anno accademico 1873-74), si avviò di fatto alla carriera accademica.