L'immunoistochimica è una tecnica che utilizza una sonda, l'anticorpo primario, per localizzare la presenza di un antigene specifico nelle cellule o nei tessuti oggetto dello studio. Questa reazione antigene-anticorpo deve poi essere rilevata, amplificata e visualizzata. La metodica impiegata per la rilevazione è di tipo indiretto: consiste in una seconda sonda anticorpale detta anticorpo secondario, che si lega all'anticorpo primario in quanto riconosce la sua regione Fc come antigene. Il sistema di amplificazione del segnale utilizza un polimero di destrano coniugato a molecole di perossidasi e di anticorpo secondario dirette contro l'anticorpo primario. Il reagente impiegato in questo studio unisce in un unico prodotto l'attività di rilevazione e di amplificazione. La dimostrazione citochimica dell'attività perossidasica si basa sull'ossidazione di un substrato cromogeno, la 3,3'-diaminobenzidina (DAB), in presenza di perossido d'idrogeno. L'ossidazione della DAB da parte dell'enzima ne determina una polimerizzazione e ciclizzazione: la molecola complessa così formata precipita nel sito di reazione come pigmento d'intenso colore bruno. La presenza del pigmento consente di visualizzare al microscopio le cellule o i tessuti che contengono la proteina con attività enzimatica. Il procedimento, manuale o automatizzato, prevede una serie d'incubazioni e lavaggi successivi, come descritto qui di seguito. Le reazioni immunoistochimiche di questo studio sono state eseguite utilizzando l'immunocoloratore automatico Benchmark-XT (Ventana Medical System, Inc.). I prelievi istologici provenienti dai casi clinici selezionati per lo studio, fissati in formalina tamponata al 4% ed inclusi in paraffina, sono stati tagliati al microtomo in sezioni di 3-4 μm di spessore e montati su vetrini portaoggetti Superfrost Plus; per ogni caso clinico sono state allestite due sezioni, una per ogni marcatore programmato. Le sezioni così allestite devono essere deparaffinate con solventi idonei (xilolo) e successivamente reidratate con soluzioni alcoliche a concentrazioni decrescenti. Prima di procedere alla colorazione, è necessario che le sezioni vengano sottoposte a due pretrattamenti. Il primo consiste nel blocco delle perossidasi endogene con acqua ossigenata; il secondo consiste nel recupero antigenico ("smascheramento antigenico") in tampone a temperatura elevata (in questo caso 40 min. in tampone citrato a pH 6). Al termine le sezioni vengono lavate con un tampone fosfato neutro (PBS, tampone fosfato sodio-azide), allo scopo di annullare la tensione superficiale e permettere un'omogenea distribuzione dell'anticorpo sulla superficie del vetrino. A questo punto si procede con la prima fase della colorazione, l'incubazione del tessuto con l'anticorpo primario diluito in maniera ottimale. Gli anticorpi primari qui utilizzati sono l'anticorpo policlonale di coniglio anti Human c-Kit in diluizione 1:200 (CD117; DakoCytomation, Glostrup, Danimarca) e l'anticorpo policlonale di coniglio anti protein gene product 9.5 in diluizione 1:1500 (PGP9.5; AbD Serotec, Oxford, Inghilterra). Dopo 30 min. d'incubazione le sezioni vengono lavate con PBS.La seconda fase consiste nell'incubazione del tessuto con anticorpo primario con il sistema di rilevazione ed amplificazione, in questo caso Dako EnVision HRP Rabbit (Dako, Glostrup, Danimarca), per 30 min; al termine lavaggio con PBS. L' attività perossidasica viene visualizzata mediante il reagente Dako DAB + Cromogen (Dako, Glostrup, Danimarca) diluito in tampone contenente perossido d'idrogeno; a reazione avvenuta si effettua il lavaggio con acqua. La metodica si completa con una controcolorazione di contrasto con ematossilina per evidenziare i nuclei cellulari. Le sezioni vengono quindi disidratate e, dopo esser state coperte con un vetrino portaoggetto, vengono osservate al microscopio per controllare l'avvenuta reazione.