CNT1 e CNT2 sono espressi sull'orletto a spazzola delle cellule che compongono l'epitelio intestinale secondo un gradiente in decrescendo prossimale-distale (183) dal duodeno alla valvola ileo-ciecale.Studi effettuati sui ratti per analizzare la funzionalità dei trasportatori nucleosidici e la loro disposizione intestinale evidenziano che la ribavirina è assorbita dagli enterociti del piccolo intestino da parte di CNT2 in una maniera dose dipendente: la percentuale di assorbimento della ribavirina nella prima ora è significativamente inferiore alla dose di 25/mg/Kg rispetto a 1/mg/kg e 5/mg/Kg. (161). Studi clinici avevano già dimostrato che l'assorbimento della ribavirina a livello intestinale può essere saturato a dosi cliniche del farmaco (189). Il ritardo dello svuotamento gastrico non ha influito sull'assorbimento del farmaco. Inoltre, l'adenosina e l'inosina (substrati di CNT2) sono in grado di inibire significativamente l'assorbimento della ribavirina relativamente alle loro concentrazioni. Successivamente a questo dato, sono stati effettuati degli studi su volontari sani proprio per esaminare l'effetto delle purine esogene, assunte con la dieta, sulla farmacocinetica della RBV assunta per via orale: questi hanno rivelato una significativa riduzione dell'assorbimento del farmaco, suggerendo la necessità di una dieta a basso contenuto purinico durante il trattamento con RBV (190).L'uptake della ribavirina da parte delle cellule epatocitarie è il prerequisito essenziale perché il farmaco eserciti la sua attività antivirale nei confronti di HCV. ENT1 sulla membrana sinusoidale è risultato il principale contribuente all'entrata della ribavitina nelle cellule epatiche coltivate con tecnica a sandwich (185), facendosi carico in media dell'89% del trasporto. CNT2 è risultato un contribuente minore, probabilmente per la sua scarsa espressione a livello epatico, nonostante sia il principale responsabile dell'assorbimento intestinale.La ribavirina non subisce un intenso metabolismo intestinale e di conseguenza una certa quantità del farmaco è escreta nella bile, sempre ad opera di ENT1. La percentuale di efflusso biliare della ribavirina è del 30,3% negli epatociti coltivato con tecnica sandwich (191). Una voltà lì, la ribavirina subisce o un reuptake grazie a CNT2 (il quale è però saturabile), oppure rimane nella bile e si avvia un riassorbimento entero-epatico del farmaco, ad opera di CNT2.Quindi, mentre CNT2 facilita l'assorbimento intestinale della ribavirina ed, in parte, il suo reuptake canalicolare a livello epatico, ENT1 è il determinante delle sue concentrazioni epatiche ed eritrocitarie e, quindi, sia della sua efficacia antivirale che della sua tossicità.Forse, questa tossicità dose limitante della ribavirina, dovuta al suo accumulo eritrocitario, potrebbe essere ridotta se il farmaco fosse ampiamente estratto dagli epatociti durante il primo passaggio epatico dopo la somministrazione orale. La perdita della normale struttura epatica, caratteristica della fibrosi e cirrosi epatica, determina una importante perdita dell'espressione dei trasportatori nucleosidici epatici, contribuendo ad una ridotta estrazione dal circolo e alla presenza nel sangue -e, dunque, a contatto con gli eritrociti -di elevate concentrazioni di ribavirina.Fukuchi et al (167) hanno recentemente individuato 12 isoforme di ENT1 a partire da 4 regioni promoter alternative. Le isoforme più espresse a livello epatico sono risultate quelle tradotte dal promoter P3.Queste isoforme sono stte poi correlate ad un aumento dell'uptake di ribavirina nelle cellule epatocitarie di volontari sani. Questi risultati mostrano che le differenze interindividuali nell'uptake della ribavirina potrebbero dipendere dall'espressione di isoforme diverse di ENT1. I fattori di regolazione della trascrizione delle diverse isoforme non sono ancora conosciuti. Resta, inoltre, da capire se le diverse isoforme di ENT1 esprimano anche una diversa capacità di trasporto per la ribavirina e se le stesse isoforme siano espresse negli epatociti affetti da HCV, dal momento che Fukuchi et al si sono concentrati su cellule epatocitarie sane (192).Fino ad oggi, ENT1 è anche l'unico trasportatore nucleodisico individuato sulle cellule eritrocitarie. CNT3, che trasporta la ribavirina, è espresso sulle membrane delle cellule midollari ma non ci sono studi sulla possibilità che i precursori eritrocitari possano accumulare ribavirina già a questo livello.Infatti, la caratteristica della anemia indotta da RBV è proprio quella di essere una anemia "mista" determinata dalla contemporanea presenza di emolisi e soppressione midollare (193). Variazioni interindividuali dell'espressione o funzionalità di ENT1 e CNT3 potrebbero rendere conto della diversità di comparsa di questo grave effetto collaterale.Il recentissimo studio di Yamamoto et al. 2010 (194) dimostra che nelle cellule di Xenopus Laevis, esprimenti sia CNT3 che ENT1, l'utake della ribavirina è facilitato dall'inibizione di ENT1, anche ad alte concentrazioni extracellulari di ribavirina. Il rapporto CNT/ENT varia molto nei diversi organi. Secondo il modello proposto da Yamamoto et al.elevate concentrazioni intracellulari del farmaco sono più favorite se il rapporto CNT/ENT è a sfavore degli ENT.ENT1 è ritenuto responsabile dell'anemia emolitica successiva a somministrazioni per lunga durata di RBV (140). Clinicamente, dopo dosi multiple di ribavirina fino allo steady state, la concentrazione intracellulare di metaboliti fosforilati si accumula 60 volte di più rispetto alla concentrazione plasmatica e l'accumulo raggiunge un plateu dopo 7-14 giorni dall'inizio della terapia, vale a dire quando cominciano i primi segni di emolisi in pazienti predisposti (195). Nella simulazione di Endres et al. 2009 (196), le somministrazioni a lungo termine del farmaco determinano concentrazioni eritrocitarie di metaboliti della ribavirina 30 volte più alte rispetto al plasma se ENT1 è funzionante e non inibito farmacologicamente. Inoltre le concentrazioni sono risultate 15 volte più alte nei topi ENT1 (+/+) rispetto ai topi (-/-). Quindi i topi knock-out per ENT1, non accumulano ribavirina. Gli eritrociti umani presentano più alta attività di ENT1 rispetto a quelli dei topi. Gli autori hanno, però, hanno voluto mettere in evidenza il fatto che il tasso fosforilazione e di eliminazione della RBV fosfato contribuiscono in modo importante alla tossicità del farmaco e variabili interindividuali nel metabolismo intracellulare di questi composti possono contribuire alla tossicità.In vivo, l'accumulo negli eritrociti potrebbe essere ulteriormente intensificato dal dosaggio multiplo del farmaco e attenuato dall'eliminazione sistemica della ribavirina, dall'uptake epatocitario e dalla degradazione dei metaboliti fosforilati intracellulari.Le cellule eritrocitarie di individui affetti da Beta-Talassemia Maior presentano livelli significativamente inferiori di ENT1 sulla membrana (meno del 60% rispetto ai controlli) (197), ma non di altri trasportatori, come ad esempio GLUT1.L'attività di ENT sulle cellule eritrocitarie è inibita dallo stress ossidativo (198) e la riduzione della sua espressione è un sensibile marcatore di questa condizione. La riduzione selettiva dei trasportatori nucleosidici sulle cellule Beta talassemiche pone questioni sui meccanismi che controllano l'espressione di queste proteine a livello delle membrane. Nei pazienti talassemici che effettuano la terapia per l'epatite C, le trasfusioni necessarie a ripristinare i livelli ematici di Hb aumentano di circa il 40%, raggiungendo livelli storici per i pazienti (199)(200)(201).La RBV è stata recentemente autorizzata nel trattamento dell'epatite C cronica in pazienti italiani affetti da Beta talassemia (202).L'eliminazione della ribavirina avviene in parte per via urinaria ed in parte per via fecale. Non ci sono studi che si inoltrano nel ruolo dei trasportatori nucleosidici nell'eliminazione della ribavirina, tuttavia, data la presenza dei trasportatori concentrativi ed equilibrativi a livello renale ed epatico, è quasi sicura una loro implicazione in questo processo.La ribavirina esercita la sua attività antivirale mediante diversi meccanismi, quindi in teoria, l'unica forma di resistenza alla ribavirina può essere imputabile ad un suo impedimento all'entrata cellulare. Tale impedimento può verificarsi in vari modi: (203).• Una riduzione dei livelli della kinasi attivatrice, necessaria per la fosforilazione del nucleoside.• Un aumeno dei livelli di 5'-nucleotidasi, capace di defosforilare gli analoghi nucleosidici.• Una riduzione dell'espressione di ENT1 a livello epatico o una sua inibizione.Il trattamento per l'epatite C è di lunga durata e, similmente ai pazienti esposti a dosi prolungate di agenti chemioterapici, anche la terapia a base di RBV può innescare fenomeni di resistenza dovuti ad un ridotto uptake. Anche perché le cellule epatiche sono capaci di sintesi endogena di nucleodisi e, se sottoposti a grandi dosi di RBV, potrebbero ridurre l'espressione di ENT1, senza inficiare l'omeostasi dei nucleosidi endogeni. Lo svantaggio conferito dalla down regolazione di un trasportatore ad ampio spettro come ENT1 sarebbe superato dal vantaggio della sopravvivenza epatocitaria. Nello studio di Fukuchi, l'iperespressione delle isoforme epatocitarie di ENT1 si è dimostrata in grado di recuperare la sensibilità alla ribavirina nel tessuto epatico. (167).