L"incubazione secondaria per HER2 è stata effettuata al buio usando invece un anticorpo anti-rabbit Alexa Fluor 488 (diluizione 1:50; Invitrogen, San Diego, CA) coniugato con fluoresceina isotiocianato (FITC), un fluorocromo il cui spettro di assorbimento è massimo intorno a 480 nm con emissione nello spettro della luce verde, con un massimo a 520-530 nm.Dopo un ulteriore lavaggio in PBS-1X i vetrini sono stati montati in glicerolo e 4',6diamidino-2-phenylindole (DAPI 1000 ng/ml; Vysis, Downers Grove, IL) e conservati a 4°C prima delle analisi.Per la colorazione doppia HER2-EMA, dopo lo smascheramento antigenico le sezioni sono state incubate prima con l"anticorpo primario anti-EMA alle stesse condizioni descritte in precedenza e, in seguito, con l"anticorpo secondario anti-mouse specifico per EMA. È stato quindi effettuato un lavaggio in PBS 1X con lo scopo di eliminare l"eccesso di reagenti. Successivamente, sugli stessi preparati è stata effettuata una seconda incubazione utilizzando l"anticorpo primario anti-HER2, riconosciuto a sua volta dall"anticorpo secondario specifico anti-rabbit aggiunto da ultimo.Le immagini in IF sono state acquisite con un apposito microscopio (AxioObserver Z1, Zeiss, Oberkochen, Germany) e analizzate con il software ISIS.