Nel 1895 ottenne da Roux la direzione dell'Istituto Pasteur di Lilla, che manterrà per 25 anni. Inizierà un periodo in cui si interesserà soprattutto della lotta alla tubercolosi, una malattia all'epoca molto diffusa, contro la quale non esistevano terapie efficaci e il cui trattamento prevedeva anche l'attuazione di interventi di tipo sociale. Nel 1901 fonderà un dispensario per la lotta alla tubercolosi, chiamato poi "Dispensaire Calmette", per la prevenzione della malattia e l'assistenza gratuita e generalizzata dei malati di tubercolosi. Nel 1904 fondò l'associazione ""Ligue du Nord contre la Tuberculose"", ancora esistente, per sensibilizzare la lotta alla tubercolosi. Riguardo alla profilassi della tubercolosi, Calmette realizzò una tecnica diagnostica della malattia basata su una reazione allergica alla tubercolina (oftalmoreazione di Calmette) e, in collaborazione con Camille Guérin, un metodo per la vaccinazione preventiva antitubercolare per mezzo di un batterio la cui virulenza fu attenuata mediante 230 passaggi in un terreno costituito da bile, glicerina e patata, per un periodo di tredici anni, dal 1908 al 1921 ("Bacillo di Calmette-Guérin" o BCG). Il vaccino BCG fu utilizzato per la prima volta nell'uomo nel 1921 e fu utilizzato massicciamente solo dopo la seconda guerra mondiale nel corso delle massicce vaccinazioni effettuate in Europa dal 1945 al 1948 nell'ambito della "International Tuberculosis Campaign or Joint Enterprises".