Guillaume-Benjamin Duchenne nacque in una famiglia di pescatori a Boulogne-sur-Mer il 17 settembre 1806. Duchenne andò in un liceo locale a Douai, dove si diplomò all'età di 19 anni. Dal 1827, all'età di 21 anni, studiò medicina sotto l'insegnamento di professori come René-Théophile-Hyacinthe Laënnec (1781-1826), il barone Guillaume Dupuytren (1777-1835), François Magendie (1783-1855), e Léon Cruveilhier (1791-1874). Si laureò in medicina a Parigi nel 1831 e presentò la sua "Thèse de Médecine", una monografia sulle ustioni, prima di ritornare alla nativa Boulogne dove iniziò il praticantato. Duchenne si sposò nel 1831, ma sua moglie morì di febbre puerperale durante una gravidanza due anni dopo. La matrigna di Duchenne fece circolare voce che la morte di sua moglie fu causata dal fatto che egli solo era presente al parto, e dopo ciò gli fu tolto il figlio dalla famiglia della moglie, il quale si riunì al padre solo quando egli stava per morire.