In questo lavoro verranno presentati i risultati di uno studio prospettico di prevalenza della glicogenosi di tipo II in una popolazione di 102 soggetti affetti da ipercreatinfosfochinasemia (iperCPKemia) persistente, realizzato mediante l"utilizzo di una metodica innovativa di screening che permette la determinazione quantitativa dell"attività lisosomiale dell" -glucosidasi acida su spot di sangue adsorbito su carta bibula.Lo studio è stato condotto attraverso tre fasi: Il programma di screening da noi effettuato è stato realizzato grazie dalla possibilità di quantificare l"attività dell"enzima -glucosidasi acida su spot di sangue adsorbiti su carta bibula.Questa la descrizione di tale metodica di analisi enzimatica.Dallo spot su carta bibula si preleva un dischetto con diametro di 1/6 di pollice contenente 3 µl di sangue intero posto in micro piastre da 96 pozzetti.La reazione enzimatica utilizza come substrato il 4-metilumbelliferone-αglucoside in una soluzione tampone di fosfato bisodico 0,39M.Al fine di ottenere un pH finale della soluzione pari a 4 è si utilizza l"acido citrico 1M. Dopo aver agitato per 30 minuti in modo da permettere l"eluizione dello spot, i campioni sono incubati a 37°C per 20 ore.La reazione biochimica viene arrestata con 150 µL di una soluzione tampone d"arresto a PH 10,4 costituita da Glicina 0,5 Molare con aggiunta di NaOH.I campioni così preparati sono analizzati quantificando la fluorescenza dell"umbelliferone liberato durante la reazione glucosidasica allo spettrofluorimetro. (lunghezza d"onda d"eccitazione 495nm, ed emissione a 520 nm).I campioni vengono confrontati con una matrice costituita da sangue privato di leucociti mediante filtrazione selettiva, e quindi con attività enzimatica pari a zero, con uno o più controlli provenienti da pazienti noti e con una soluzione contenente una quantità nota di umbelliferone, pari a 20 mM/ml, in modo da escludere con ragionevole certezza dall"analisi qualsiasi interferenza attribuibile al materiale contenuto nel campione di sangue o all"umbelliferone stesso.In letteratura esistono altri approcci che eliminano l"interferenza da α-glucosidasi plasmatiche aspecifiche (maltasi-glucoamilasi, MGA), che potrebbero influire nella determinazione dell"attività dell"enzima GAA. Essi prevedono l"uso di anticorpi 121 o di inibitori competitivi 122 (maltoso o acarboso) che sono in grado di separare GAA da MGA . Tuttavia, attualmente gli anticorpi non sono disponibili a livello commerciale, e la loro produzione richiede altissime spese di produzione; oltretutto la separazione effettuata con questa metodica comporta una perdita dell"attività di GAA stimata in circa il 71% 41, 121 .La nostra esperienza non però ha rilevato alcun vantaggio nell"utilizzo degli inibitori a livello della sensibilità diagnostica del test, provocando, oltretutto, una riduzione dell"attività enzimatica specifica.L"analisi su spot di sangue risulta invece molto meno indaginosa e molto più rapida rispetto alle delle precedenti.Tale tecnica, completamente automatizzata, è stata applicata su una popolazione di controllo composta da 105 soggetti e su una coorte di 13 pazienti con diagnosi nota e confermata di glicogenosi tipo II al fine della definizione dei range di normalità all"interno dei quali può variare la titolazione dell"enzima.I valori dell" attività enzimatica lisosomiale alfa-glucosidasi acida analizzata sullo spot di sangue nei 105 soggetti di controllo vengono presentati nella tabella V. (**) : La ricerca delle mutazioni nel locus genico GAA viene effettuata mediante tecnica standard di sequenziamento diretto degli esoni codificanti la proteina alfaglucosidasi acida e delle regioni introniche adiacenti.