La Dacarbazina fu per più di tre decadi il termine di confronto della terapia sistemica dopo la sua approvazione da parte del' US Food e Drug Administration (FDA) nel 1975. Mentre nel passato molti tentativi per aumentare la sopravvivenza nel melanoma metastatico fallirono, negli ultimi anni, degli studi di fase III hanno riportato un aumento significativo di anni di vita grazie a diverse terapie innovative. (Balch CM et al, 2009;Bhatia S et al, 2009;Hodi FS et al, 2010;Chapman PB et al, 2011) La disponibilità di questi nuovi agenti sul mercato ha dato inizio a una nuova era di terapie sistemiche per questa neoplasia. Le nostre conoscenze sul melanoma metastatico continuano ad aumentare e, come risultato, molte altre alternative terapeutiche sono comparse all'orizzonte. La terapia sistemica è il principale trattamento del melanoma metastatico in stadio IV, essa è utile sia per controllare le metastasi clinicamente visibili sia quelle subcliniche.Questo tipo di trattamento può essere suddiviso in tre famiglie: chemioterapia citotossica, terapia molecolare target, e immunoterapia. Le prime due categorie comprendono i farmaci che lavorano direttamente contro le cellule del cancro, di solito interferendo con processi cellulari importanti per la proliferazione. I farmaci immunoterapici, invece, lavorano indirettamente modulando la risposta immunitaria contro le cellule del cancro. Storicamente, gli agenti chemioterapici citotossici che hanno avuto una modesta efficacia antitumorale nel melanoma metastatico sono stati: gli agenti alchilanti (Dacarbazina, Temozolamide, Nitrosuree), agenti anti-microtubuli (Paclitaxel) e gli analoghi del platino. Le combinazioni degli agenti citotossici determinano una migliore risposta rispetto alla monoterapia ma portano ad una più alta tossicità e non aumentano in modo significativo la sopravvivenza generale (OS). (Bhatia S et al, 2009) Tra i vari farmaci appartenenti alla famiglia dell'immunoterapia, l'IL2 ad alte dosi (HD IL-2) porta in alcuni pazienti a una risposta completa di lunga durata (CR), ma il suo utilizzo è limitato dalla bassa risposta obiettiva (ORR), dalle tossicità associate al trattamento, e dalla scarsità di biomarkers predittivi.Gli storici tentativi di combinare la chemioterapia citotossica con l'immunoterapia (il regime "biochemioterapia") hanno portato a un'alta risposta obiettiva e a un significativo aumento della sopravvivenza generale, ma senza una buona riproducibilità. (Ives NJ et al, 2007) Fortunatamente, negli ultimi anni sono stati fatti numerosi passi avanti sul fronte della terapia molecolare e della immunoterapia le quali hanno portato a un notevole miglioramento della sopravvivenza globale. 6.3. Terapia convenzionale 6.3.1. Chemioterapia Nel 1970, la Dacarbazina (DTIC) venne approvata dall'FDA come primo agente chemioterapico per il trattamento del melanoma metastatico. (Cheng S et al, 2012) La Dacarbazina svolge la sua azione antitumorale mediante l'alchilazione delle molecole del DNA. Il suo meccanismo d'azione consiste nel formare legami sia tra i filamenti di DNA sia al loro interno creando una denaturazione locale della doppia elica del genoma. In questo modo il farmaco è in grado di interferire con la forma e funzione della molecola portando alla morte delle cellule maligne. (Almeida VL et al, 2005) Attualmente la Dacarbazina deve essere somministrata alle dosi di 2-4.5 mg/kg/die per via endovenosa per 10 giorni, tale trattamento può eventualmente essere ripetuto ogni 4 settimane. In alternativa si possono somministrare 250 mg/m2/die endovena per 5 giorni da ripetere ogni 3 settimane. (Dacarbazina, 2007) Dati recenti mostrano che DTIC, da sola o in combinazione con altri farmaci, è usata per trattare il 40-80% dei pazienti con diversi tipi di cancro (Neves AP et al, 2011) anche se il farmaco in monoterapia produce una risposta globale limitata (15-25%) con una risposta media di 5-6 mesi, una risposta completa del 5% (Lee B et al, 2012), una sopravvivenza libera da progressione inferiore ai 2 mesi e appena il 25% dei pazienti vivi a 1 anno. (Korn EL et al, 2008) Nonostante la scarsa risposta, DTIC è stata usata come terapia sistemica di prima linea nei pazienti con melanoma metastatico e contemporaneamente, negli ultimi anni, sono stati fatti molti tentativi per ottenere dei migliori risultati in polichemioterapia. (O'Day S et al, 2006) Per esempio, tra i classici antineoplastici, la Temozolamide (un analogo della Dacarbazina), il Cisplatino, la Carmustina, la Fotemustine, la Vinblastina, e il Tamoxifene sono stati combinati con la Dacarbazina in vari regimi. Come risultato, la DTIC ha dato una buona risposta in lesioni metastatiche nel fegato, nell'osso e nel cervello ma non è stata capace di produrre un aumento della sopravvivenza. (Eggermon AM et al, 2011;Ji Z et al, 2012) Uno fra gli schemi più usati è il CVD dato dall'associazione di Cisplatino, Vinblastina, Dacarbazina che sebbene abbia determinato un tasso di risposta tra il 20% e il 35% (Bajetta E et al, 2006) non ha portato a un miglioramento della sopravvivenza complessiva se confrontato con la Dacarbazina da sola. (O' Day SJ et al, 2002) Con l'introduzione degli agenti anti-CTLA4 (Ipilimumab), sono stati fatti degli studi per mostrare l'efficacia di una possibile associazione di chemioterapia con immunoterapia. (Robert C et al, 2011) Attualmente, l'NCCN (National Comprehensive Cancer Network) non raccomanda la somministrazione di Ipilimumab con Dacarbazina nel melanoma avanzato a causa di una mancata prova di efficacia clinica rispetto all'Ipilimumab in monoterapia e per una dimostrata tossicità epatica. (Robert C et al, 2011) Nonostante sia privo di superiorità se paragonato ad altri trattamenti, DTIC è ancora considerata la prima scelta in regime di chemioterapia in molti pazienti con melanoma. (O'Day S et al, 2006) Tra le tossicità da Dacarbazina sono state osservate nausea, vomito, malattia simil-influenzale (freddo, febbre, malessere, mialgia) e in più del 90% dei pazienti, dopo 1-3 ore dal trattamento, si è presentata una mielosoppressione di grado lieve e moderato (leucopenia e trombocitopenia). Altri effetti collaterali evidenziati sono: una epatotossicità, alopecia, flushing facciale, neurotossicità e reazioni cutanee. (Lee B et al, 2012) La Temozolamide è un altro chemioterapico usato nel trattamento del melanoma metastatico. Essa è stata approvata dalla FDA per il trattamento del glioma ed è anche usata nella pratica clinica nel melanoma avanzato. La sua somministrazione si è dimostrata vantaggiosa rispetto alla Dacarbazina sia perché passa la barriera ematoencefalica sia perchè è somministrabile per via orale. (Quirt I et al, 2007;Kim KB et al, 2010) La dose a cui viene somministrata attualmente è 200mg/mq/day per 5 giorni ogni 28 giorni.Un trial clinico randomizzato e controllato ha confrontato la Temozolomide con la Dacarbazina e ha dimostrato che nei pazienti in trattamento con Temozolomide, rispetto al gruppo in trattamento con la Dacarbazina, vi è un modesto miglioramento della sopravvivenza media libera da progressione di malattia o sopravvivenza libera da malattia (PFS) (1.9 vs. 1.5 mesi; p = 0.012), ma non vi sono differenze in termini di sopravvivenza complessiva (7.7 vs. 6.4 mesi; p = 0.20) o tassi di risposta obiettiva (21% gruppo Temozolomide vs 18% gruppo Dacarbazina). (Middleton MR et al, 2000) Un ultimo farmaco in uso per la terapia chemioterapica ma non registrato in tutti i continenti è la Fotemustina. Essa è somministrata alla dose di 100mg/mq (al giorno 1, 8, 15) seguito da 5 settimane somministrata alla dose di 100 mg/mq ogni 21-28 giorni. 6.4. Target therapy 6.4.1. Inibitori di BRAF Nel 2002 è stato scoperto che circa il 60% dei melanomi ha origine da una mutazione del gene codificante per la proteina serina/treonina chinasi BRAF. Nel 90% dei casi, la valina è sostituita dal glutammato a livello dell'amminoacido in posizione 600 (V600E). (Davies H et al, 2002) Altre frequenti mutazioni di BRAF nel melanoma sono V600K (16% dei melanomi mutati) e V600D/R (approssimativamente il 3% di tutte le mutazioni). La frequenza con cui si presentano le differenti alterazioni di BRAF è età dipendente: esiste una relazione inversa tra l'età e la frequenza della mutazione di BRAF e tra l'età e il numero di melanomi BRAF V600K mutati.  Il gene BRAF mutato può essere costitutivamente attivato dalla via della MAPK, causando un aumento della proliferazione, angiogenesi e una diminuzione dell'apoptosi e dando così inizio al processo di cancerogenesi del melanoma. Da questa scoperta, sono stati iniziati molti studi per sviluppare degli inibitori di BRAF. (Eisen T et al, 2006;Hauschild A et al, 2009) Il primo inibitore selettivo e potente di BRAF che blocca la forma della serinatreonina chinasi mutata in V600E è stato Vemurafenib (PLX4720, ZELBORAF).Il farmaco ha ottenuto l'approvazione dell'FDA il 17 Agosto 2011, dell'EMA il 17 Febbraio 2012ed dell'AIFA il 20 Maggio 2013. (Chapman PB et al, 2011 Questo farmaco è somministrato per via orale giornalmente alla dose di 960 mg due volte al giorno. Vemurafenib venne co-cristallizzato con una proteina construtturata contenente il dominio chinasico di BRAF V600E che è capace di legare il dominio ATPasico di BRAF mutato. (Bollag G et al, 2010), (Figura 2) Figura 2: Via del segnale della MAPK e inibitori (Bollang G et al, 2010) Gli studi preclinici mostrarono che Vemurafenib inibisce l'attività chinasica di BRAF mutato in V600E con una concentrazione massima dimezzata (IC50) di 13 nM; il risultato è un arresto del ciclo cellulare e un' induzione dell'apoptosi delle cellule di melanoma. (Tsai J et al, 2008) Basandosi sui dati preclinici, fu iniziato uno studio randomizzato controllato prospettico di fase I per valutare la farmacocinetica, la sicurezza e l'efficacia di questo farmaco. (Flaherty KT et al, 2010) Lo studio in questione fu fatto per determinare la dose da somministrare ai pazienti senza indurre tossicità (si è optato per una dose massima tollerata di 960 mg due volte al giorno).Nella fase II del trial, BRIM-2, la stessa dose è stata somministrata ad una corte più estesa di pazienti con melanoma metastatico mutato in BRAF V600E. La risposta osservata è stata del 53% e la sopravvivenza libera da malattia di 6.2 mesi. (Ribas A et al, 2011) Un lungo follow up ha mostrato una sopravvivenza media di 15,9 mesi. (Sosman JA et al, 2012) Nella fase III del trial, BRIM-3, i pazienti con melanoma non precedentemente trattato sono stati assegnati casualmente a Vemurafenib alla solita dose o Dacarbazina (1000 mg/m2 ogni 3 settimane). (Chapman PB et al, 2011) Nella prima analisi, 81% dei pazienti trattati con target terapy hanno avuto una sopravvivenza libera da malattia di 5.3 mesi contro 1.6 mesi di Dacarbazina (HR=0.26%; p < 0.001). La sopravvivenza a 6 mesi è stata del 84% nel braccio di Vemurafenib contro 64% di quello di Dacarbazina. Il tasso di risposte globali fu del 48,4% per Vemurafenib (incluse due RC) contro 5,5% per Dacarbazina. (Chapman PB et al, 2011) I dati promettenti di BRIM-3 portarono a una precoce conclusione di questo trial clinico e l'FDA approvò in Agosto 2011 il Vemurafenib per il trattamento del melanoma metastatico o irresecabile mutato in V600E. Durante i vari studi, fu richiesta una riduzione o un'interruzione di dose a causa della tossicità in circa il 45% dei pazienti. I più comuni effetti avversi osservati con l'uso del farmaco sono: alopecia, fatigue, dolore alle articolazioni, rash di grado 1 e 2, perdita di capelli, anomalità della funzione epatica, cheratosi alle estremità. Le due tossicità che più frequentemente alterano la qualità della vita dei pazienti sono: la fotosensibilità e l'insorgenza di nuovi tumori della pelle. Quest'ultimo inaspettato effetto collaterale da Vemurafenib può essere spiegato dalla riattivazione della via di MAPK nelle cellule non mutate in BRAF e può essere trattato mediante una escissione chirurgica. (Flaherty KT et al, 2010;Chapmann PB et al, 2011) Il tempo medio d'insorgenza dei carcinomi squamosi è di 8 settimane dopo l'inizio del trattamento, ma il loro potenziale invasivo e metastatico è praticamente nullo. (Flaherty KT et al, 2010) Le reazioni di fotosensibilità di grado 2 e 3 sono state osservate nel 12% dei pazienti e in particolare, le reazioni di grado 3 ad insorgenza violenta, possono essere evitate con l'uso di protezioni solari. (Flaherty KT et al, 2010;Chapman PB et al, 2011;Lee B et al, 2012) Sfortunatamente alcuni pazienti, dopo un'iniziale risposta nei primi 2 mesi di trattamento, hanno manifestato meccanismi di resistenza al farmaco, così da far precipitare la sopravvivenza libera da malattia tra i 5 e i 7 mesi. (Kim KB et al, 2012;Nijenhuis CM et al, 2012) Ci sono due diversi meccanismi di resistenza alla terapia con inibitori di BRAF: intrinseci ed estrinseci. Tra i primi i più frequenti sono: l'amplificazione della ciclina D1 nel ciclo cellulare, la perdita del gene soppressore PTEN e la produzione di EGFR). (Smalley KS et al, 2008;Paraiso KHT et al, 2011;Straussman R et al, 2012) I meccanismi di resistenza estrinseci consistono invece nel segnale di riattivazione di ERK-MAP chinasi e nell'attivazione di un pathways di un segnale alternativo (PDGFR, PI3K/AKT, IGFR1). (Villanueva J et al, 2010) Per quanto riguarda questi ultimi meccanismi di resistenza, l'uso di un inibitore di BRAF in cellule con BRAF wild type potrebbe portare a una riattivazione paradossa del pathway a valle di MEK-ERK, specialmente se ci sono degli attivatori pre-esistenti a monte (come mutazioni di RAS) nelle cellule. In questi pazienti, dopo la somministrazione del farmaco, si ha una rapida proliferazione a causa proprio della attivazione a valle del segnale di ERK nelle cellule con BRAF non mutato ma spesso mutate in RAS. (Curtin JA et al, 2005;Cichowski K et al, 2010;Su F et al, 2012), (Figura 3) Figura 3: Biologia molecolare del melanoma, cascata del segnale (www. thelancet.com) Se da una parte ci sono dei pazienti che diventano rapidamente resistenti a questa terapia, dall'altra ce ne sono altri con risposte persistenti per un lungo periodo, fino a 18 mesi, e che pertanto permettono terapie prolungate. (Dummer R et al, 2012;Sosman JA et al, 2012) Il secondo inibitore di BRAF che è stato approvato dall'FDA il 30 Maggio 2013 per il trattamento di melanomi metastatici mutati in BRAF V600E è Dabrafenib (GSK2118436).Questo farmaco è somministrato alla dose di 150 mg due volte al giorno.Per permettere la sua commercializzazione, sono stati fatti numerosi studi. I primi due trials eseguiti (fase I per testare la sicurezza, la tollerabilità del farmaco e fase II, BREAK-2) hanno permesso di evidenziare una sopravvivenza libera da malattia e una globale più lunga nei pazienti con mutazione in V 600E (6.3 e 13.1 mesi rispettivamente). Tutti questi dati sono stati importanti perché hanno mostrato la centralità di un'analisi mutazionale prima dell'inizio del trattamento.  Un altro studio importante è stato BREAKmb grazie al quale è stato reso noto che Dabrafenib a differenza delle altre target therapy, agisce anche sui melanomi metastatici a livello cerebrale. (Long GV et al, 2012) Infine in BREAK 3 (fase III del trial), Dabrafenib è stato messo in confronto con Dacarbazina in uno studio a due bracci ed è stata dimostrata una diminuzione del 70% del rischio di progressione di malattia nei pazienti trattati con la target therapy rispetto a quelli in trattamento con la chemioterapia, una sopravvivenza libera da malattia mediana di 5.1 mesi per Dabrafenib e 2.7 per la Dacarbazina. (Hauschild A et al, 2012;Harding JJ et al, 2012) Gli effetti collaterali trovati in questi studi furono lesioni cutanee (carcinoma a cellule squamose), piressia e frequentemente fatigue, nausea e dolore. Lo sviluppo di fotosensibilità, effetti cutanei alla pelle e carcinoma squamocellulare sembrano essere meno frequenti rispetto ai pazienti trattati con Vemurafenib sebbene un confronto diretto non sia mai stato fatto.LGX818, un altro potente inibitore di BRAF attualmente in sviluppo, ha mostrato risultati promettenti in trials clinici precoci. L'efficacia di questo farmaco è stata dimostrata da uno studio di fase I con una risposta del 67% nei pazienti non trattati con altro inibitore di BRAF. (Stuart DD et al, 2012) 6.4.2. Inibitori di MEK Con l'espansione del target therapy si è osservato, purtroppo, un aumento dei pazienti resistenti a queste nuove terapie e in contemporanea sono iniziati molti studi per capire i meccanismi alla base della resistenza agli inibitori di BRAF. (Nazarian R et al, 2010;Whittaker S et al, 2010;Nijenhuis CM et al, 2012) Vi è, pertanto, una forte esigenza di ricercare delle combinazioni farmacologiche mirate a colpire contemporaneamente le diverse vie oncogeniche effettrici, con l'intento sia di superare le tossicità associate all'utilizzo di un inibitore di BRAF sia di potenziare l'effetto dei due farmaci. Sembrerebbe che i pazienti in trattamento con Vemurafenib, sviluppino mutazioni dei geni NRAS15 o MEK34, che potenziano il segnale attraverso la via RAS-MEK-ERK da riattivazione di MEK. Questa osservazione ha permesso di fare dei progressi nella terapia dei pazienti resistenti e si è provato a combinare inibitori di BRAF e MEK per potenziare l'inibizione della crescita cellulare tumorale. Mentre gli inibitori di BRAF possono solo inibire il segnale di ERK nelle cellule con la mutazione, gli inibitori di MEK inibendo la medesima via sia nelle cellule tumorali sia in quelle normali bloccano la proliferazione delle cellule e inducono un'apoptosi. (Adjei AA et al, 2008;Dummer R et al, 2010;Nijenhuis CM et al, 2012;Neuzillet C et al, 2014) Nonostante l'azione di questi farmaci sia simile agli inibitori di BRAF e siano stati addirittura scoperti prima, gli inibitori di MEK hanno mostrato, nel I trial, una limitata attività nei pazienti con melanoma (forse a causa di una mancata selezione dei pazienti con BRAF mutato prima della somministrazione del farmaco).Una volta scoperto l'errore, nei nuovi trials sono stati selezionati pazienti con melanoma BRAF mutato e i risultati sono stati sorprendenti: i farmaci inibitori di MEK hanno avuto una ottima attività clinica e un minor rischio di sviluppare una resistenza contro i farmaci anti-BRAF.Tutto ciò ha fatto sì che il 29 Maggio 2013 l'FDA approvasse il primo inibitore di MEK1/2 per melanoma BRAF mutato in USA: Trametinib (GSK1120212). Il 10 Gennaio del 2014 l'FDA ha approvato ad uso terapeutico tale associazione farmacologica per il trattamento dei pazienti con melanoma avanzato non resecabile o metastatico BRAF mutato. (Weber JS et al, 2012) In Europa per l'uso di Trametinib in terapia combinata arrivò solo nel 2015. (Mekinist, 2014;Tafinlar, 2014) Prima dell'immissione in commercio del farmaco, sono stati fatti degli studi che hanno evidenziato come l'analisi mutazionale di BRAF sia molto importante quando viene fatta la selezione per trattare i pazienti con Trametinib poiché, coloro che presentano la mutazione di V600E/K rispondono meglio alla terapia. (Falchook GS et al, 2012) In un altro trial di fase II, Trametinib è stato testato su pazienti che avevano eseguito o no un trattamento precedente con l'inibitore di BRAF. Nei pazienti mai trattati, la risposta è stat del 25%, mentre negli altri non è stata osservata alcuna risposta. Questi dati suggeriscono che, dopo lo sviluppo di una resistenza alla terapia con gli inibitori di BRAF, i pazienti non potranno più beneficiare di inibitori di MEK in monoterapia. (Flaherty KT et al, 2012;Johnson DB et al, 2014) Vista quest'ultima evidenza, attualmente Trametinib viene combinato con un inibitore di BRAF, Dabrafenib sia per evitare che si sviluppino delle resistenze a questo farmaco (date dall'insorgenza di mutazioni di NRAS e MEK) e sia per poter sfruttare l'efficacia di Trametinib. Infatti, in vitro i modelli di Greger et al. hanno provato che la combinazione di questi due inibitori determina un forte arresto della crescita grazie all'instaurarsi di una variazione trascrizionale a valle. (Greger JG et al, 2012;Nijenhuis CM et al, 2012) Per provare l'efficacia di questa combinazione, è stato fatto uno studio clinico di fase I/II condotto su un numero esiguo di pazienti e che ha mostrato come l'associazione dei due farmaci sia sempre vincente rispetto alla monoterapia (tassi di risposta del 76% contro il 54%). Infante JR et al, 2012;Flaherty KT et al, 2012;Weber JS et al, 2012;Nijenhuis CM et al, 2012) Da questi studi si può anche vedere come la terapia combinata di Dabrafenib-Trametinib determini una migliore tolleranza e una minore incidenza di lesioni iperproliferative rispetto alla monoterapia. (Weber JS et al, 2012) Sebbene l'uso di BRAF inibitori sia associato con seri eventi avversi, in particolare lesioni cutanee nel 25% dei pazienti che usano Vemurafenib, questi effetti collaterali appaiono essere meno frequenti nei pazienti che ricevano la combinazione Dabrafenib/Trametinib. I più frequenti effetti collaterali legati al Trametinib includono rash, diarrea (42%), nausea, prurito, fatigue, edema periferico i quali possono essere gestiti con una riduzione della dose o una interruzione del farmaco. (Infante JR et al, 2012;Kim KB , 2013) Meno frequenti ma ugualmente importanti tossicità sono quelle cardiache (diminuzione della frazione di eiezione o disfunzione ventricolare) e quelle oculari (offuscamento della vista e retinopatia reversibile) mentre solo in un 2% dei trattati si sono osservati carcinomi squamocellulari e lesioni premaligne.Un altro possibile uso di inibitori di MEK è nei melanomi uveali. Questi ultimi hanno mutazioni a livello degli oncogeni GNAQ e GNA11. (Van Raamsdonk CD et al, 2009) A differenza dei melanomi cutanei e mucosi, i melanomi dell'uvea non presentano apparentemente le mutazioni di BRAF, c-KIT e NRAS. (Batus M et al, 2013) GNAQ e GNA11 sono delle proteine G1 e la loro mutazione provoca l'attivazione della via del segnale RAF/MEK che culmina nella stimolazione della proteinachinasi ERK1/2. L'inibizione combinata di queste vie enzimatiche con il MEK inibitore Selumetinib (AZD6244) e l'inibitore di AKT MK2206 ha indotto una diminuzione sinergica della vitalità cellulare. (Van Raamsdonk CD et al, 2009) Questi risultati suggeriscono che l'inibizione di MEK e AKT possa rappresentare un approccio promettente anche per la terapia mirata di pazienti con melanoma uveale metastatico. (Ambrosini G et al, 2013) 