Dopo il risciacquo della membrana per rimuovere l'anticorpo primario non legato, alla membrana è associato un altro anticorpo, diretto a una specifica specie di anticorpo primario. Anticorpi provengono da animali (o colture ibride di provenienza animale, ibridomi), un anticorpo secondario del topo si legherà a qualsiasi anticorpo primario di topo, permettendo risparmi sui costi, consentendo a un intero laboratorio di condividere un'unica fonte di anticorpo prodotto, e fornisce risultati migliori. Questo è conosciuto come anticorpo secondario, e data le sue proprietà bersaglio, ci si riferisce a "anti-topo," "anti-capra," ecc. L'anticorpo secondario è legato solitamente alla biotina o all'enzima messaggero come fosfatasi alcalina o perossidasi Armoracia rusticana. Questo significa che diversi anticorpi secondari si legheranno a un anticorpo primario, aumentando il segnale. Comunemente, un legame-perossidasi Armoracia rusticana secondario è usato per dividere un agente chemiluminescente, e la reazione prodotta emette luminescenza proporzionale all'ammontare di proteina. Una pellicola fotografica è posta contro la membrana; esposta alla luce della reazione crea un'immagine di anticorpi legato al blot. Un sistema più economico utilizza un colorante 4-cloronaftolo all'1% di perossido di idrogeno; la reazione di radicali perossido con il 4-cloronaftolo produce colore porpora scuro, permettendo la fotografia senza l'utilizzo di pellicole specifiche.