Il principio di funzionamento non è molto diverso da quello di una TAC (o CT in inglese): la differenza principale è che mentre nella TAC la sorgente della radiazione è esterna alla persona, nella SPECT la sorgente delle radiazioni (il radiofarmaco) è interna alla persona e le immagini sono legate non tanto alla forma degli organi e dei tessuti, come nella TAC, ma soprattutto al modo in cui l'organismo trasforma il radiofarmaco. La SPECT quindi fornisce dettagli importanti sul funzionamento dei tessuti/organi in esame.