In seguito a tanta fama e successo, Ferdinando I chiamò Mattioli a Praga come medico personale del suo secondogenito, l'arciduca Ferdinando. Prima di partire, tuttavia, gli abitanti di Gorizia decisero di donagli una preziosa catena d'oro che si può vedere in molte delle sue raffigurazioni, come segno di stima e affetto. Nel 1555 Mattioli si trasferì a Praga, anche se già l'anno successivo fu costretto a seguire, suo malgrado, l'arciduca Ferdinando in Ungheria nella guerra contro i Turchi.