A: l'enzima lega i recettori del mannoso-6-fosfato, grazie ai quali raggiunge il compartimento lisosomiale; qui viene immagazzinato e catalizza l'idrolisi del substrato accumulato L'identificazione dell'enzima carente nella malattia di Fabry 1 , l'isolamento e la determinazione della sequenza di DNA che codifica per l'αgalattosidasi A 28,29 , la produzione di enzima umano ricombinante in elevate quantità utilizzando specifiche linee cellulari e lo sviluppo di un modello murino della malattia 168,169 , hanno permesso di avere le basi per proporre e sperimentare la terapia enzimatica sostituitiva e avviare studi sperimentali per dimostrarne l'efficacia.Tramite uno studio comparativo tra i due farmaci 170 , Replagal ® e Fabrazyme ® , dal punto di vista strutturale e funzionale è stato dimostrato che il Fabrazyme ® ha una percentuale maggiore di catene fosforilate di mannoso e di oligosaccaridi costituiti da acido sialico. La maggiore presenza di residui glicosilati permette al Fabrazyme ® di legarsi più facilmente ai recettori per il mannoso-6-fosfato catione-indipendenti, che sono aumentati nei fibroblasti nella malattia di Fabry, e di concentrarsi maggiormente in rene, cuore e milza rispetto all'altra glicoforma. Queste differenze di glicosilazione, tuttavia, non riflettono diversi profili antigenici per quanto riguarda la cross-reattività anticorpale.Studi in cui l'α-galattosidasi A parzialmente purificata ricavata da fichi, chicchi di caffè e tessuti umani veniva aggiunta al terreno di coltura di fibroblasti cutanei di emizigoti affetti da malattia di Fabry, dimostrano la capacità dell'enzima esogeno di entrare nei depositi e catabolizzare il substrato accumulato in essi. Questi studi in vitro dimostrano che bassi livelli (<5%) di enzima esogeno possono normalizzare il metabolismo di globotriosilceramide.Studi sull'α-galattosidasi A ricombinante dimostrano che dosi multiple di αgalattosidasi A provocano l'idrolisi del globotriosilceramide accumulato nel fegato, cuore, rene e plasma. Dosi singole (0,3-10 mg/kg) dimostrano che il metabolismo dei glicosfingolipidi in fegato, milza, cuore, rene, è dosedipendente 171 . Ogni singola dose somministrata di α-galattosidasi A (0,3 -10 mg/kg) riduce i depositi epatici per più di 4 settimane in modo dosedipendente mentre per la pulizia di altri tessuti sono richieste dosi maggiori 172 . I glicosfingolipidi ricominciano ad accumularsi nel cuore e nella milza più precocemente (dopo tre settimane, 30 e 10% rispettivamente dei livelli precedenti il trattamento). Analisi ultrastrutturali dimostrano la riduzione dei depositi dopo il trattamento.La prima sperimentazione in vivo sull'uomo 173 conferma i risultati precedentemente ottenuti sui topi. L'enzima preparato a partire da fibroblasti umani è sicuro, biochimicamente attivo e ben tollerato a tutte le dosi testate. Analisi farmacocinetiche dimostrano che l'α-galattosidasi A infusa ha un'emivita plasmatica relativamente breve, ma supera le 24 ore nei tessuti, in cui si distribuisce in funzione della perfusione sanguigna e della concentrazione dei recettori per il mannoso-6-fosfato. La maggior parte di enzima, infatti, si ritrova nelle cellule del fegato in cui, peraltro, sono presenti i depositi più cospicui. Dopo l'infusione di una singola dose, la riduzione di globotriosilceramide nel fegato è di circa 30%, che corrisponde all'eliminazione del 3% dei depositi totali del corpo. È invece di minore entità la variazione della concentrazione di sfingolipidi plasmatici a causa della breve emivita dell'enzima nel plasma legata all'inattivazione parziale al pH sanguigno. Per quanto riguarda il rene, il riscontro di una riduzione significativa dei depositi, testimoniata dalla diminuzione di globotriosilceramide nel sedimento urinario, è più tardivo 173  Per quanto riguarda il sistema nervoso centrale, la terapia enzimatica sostitutiva riduce in modo significativo il flusso sanguigno cerebrale regionale, aumentato nei pazienti affetti da malattia di Fabry, nonostante non ci sia evidenza di vasculopatia occlusiva o ipoperfusione 175 , e migliora l'alterazione del sistema dell'ossido nitrico responsabile della sintesi di proteine anomale 176,177,178 , riducendo così il rischio di stroke. Inoltre diminuisce la permeabilità endoteliale cerebrale con conseguente riduzione del rischio di edema cerebrale, normalizza la velocità e i picchi abnormi del flusso sanguigno 176 , migliorando la risposta cerebrovascolare alla stimolazione visiva e farmacologica 179 .I risultati sul sistema cardiovascolare consistono nel miglioramento dei segni elettrocardiografici con accorciamento del complesso QRS, allungamento dell'intervallo PR 180 , riduzione dei segni di ipertrofia del ventricolo sinistro 181 e più in generale miglioramento della funzionalità cardiaca con aumento della frazione di eiezione del ventricolo sinistro 181 .Nel fegato vengono ripuliti quasi completamente i depositi presenti nelle cellule endoteliali dei sinusoidi e nelle cellule di Kupffer, che sono i due principali siti di accumulo dei glicosfingolipidi.Alcuni mesi dopo l'inizio del trattamento con α-galattosidasi A, i depositi renali di glicolipidi presenti nelle cellule dell'endotelio, della componente mesangiale del glomerulo e dell'interstizio della corteccia, vengono significativamente, se non addirittura completamente 72 , ripuliti. I risultati sulle cellule muscolari lisce delle arteriole, sui podociti e sull'epitelio del tubulo distale sono meno eclatanti, ma comunque ben evidenti, nonostante queste cellule contengano la maggior concentrazione di globotriosilceramide. Le cellule endoteliali e mesangiali hanno un rapido turnover, per cui sono esposte per un tempo relativamente breve (50-100 giorni) alle alte concentrazioni di sfingolipidi, e possiedono molti recettori per il mannoso-6-fosfato: questo spiega la rapida e consistente riduzione dei depositi di tali cellule 72,182 . Le cellule dell'epitelio parietale che costituiscono la capsula di Bowman e le cellule dell'epitelio viscerale (i podociti), hanno un turnover molto più lento e su queste cellule la terapia ha un minor successo 183 . L'aspetto istologico dopo il trattamento enzimatico, rispetto alla situazione precedente, dimostra un maggior numero di glomeruli sclerotici e minor proliferazione mesangiale 72 . Il risultato finale è un miglioramento dell'architettura renale che si traduce in un'attenuazione delle anomalie cliniche e di laboratorio 184 . Aumentano, infatti, la velocità di filtrazione glomerulare, la clearance della creatinina e dell'inulina, mentre diminuiscono i lipidi nel sedimento urinario, la proteinuria e la creatininemia 182 .In alcuni casi, invece, non c'è stato miglioramento della funzionalità renale, ma una stabilizzazione della situazione con mancata progressione del danno d'organo 72,185 .Nella maggioranza degli studi, le infusioni sono ben tollerate e le reazioni avverse eventualmente presenti sono per lo più di tipo lieve-moderato, suggestive dell'attivazione di un meccanismo di ipersensibilità, come febbre e brividi, ben controllati con basse dosi di antistaminici e corticosteroidi 172 . Queste reazioni possono essere ulteriormente ridotte e prevenute dalla somministrazione di farmaci antinfiammatori non steroidei prima dell'infusione dell'enzima e prolungando la velocità di tale infusione.Tuttavia, poiché è possibile che si formino anticorpi specifici (IgG non neutralizzanti) contro l'enzima somministrato, è importante determinare la natura della risposta immune per prevenire reazioni immuno-mediate e impedire il fallimento della terapia 186 . Non esiste evidenza di depositi di immunocomplessi.È stato anche riportato un lieve, transitorio aumento della pressione sanguigna che non richiede terapia medica.Per monitorare l'efficacia della terapia sono stati proposti vari metodi utilizzando la cromatografia, il test ELISA, la spettrometria di massa o anticorpi fluorescenti specifici per globotriosilceramide.