Come altri antimicotici, ketoconazolo è strutturalmente simile all'imidazolo e precisamente si tratta di un derivato imidazoldiossolanico. Il farmaco agisce contro i funghi inibendo la sintesi di alcuni steroli necessari per la costruzione della membrana cellulare. In particolare inibisce l'enzima citocromo P450 14-alfa-demetilasi (P45014DM) conosciuto anche come lanosterol-14αdemetilasi, che catalizza un passaggio essenziale nella biosintesi degli steroli, e cioè la via metabolica che conduce dal lanosterolo all'ergosterolo, un costituente importante delle pareti cellulare fungina. Questa inibizione comporta un danno strutturale e funzionale a carico della membrana della cellula fungina, compromettendone la riproduzione e le attività infettive.