Dopo sette anni di spostamenti della loro sede principale, da un luogo all'altro in Europa, i Cavalieri si insediarono quindi come feudatari a Malta nel 1530 per iniziativa di papa Clemente VII e dell'imperatore Carlo V, che era anche Re di Sicilia (l'isola a quell'epoca era parte del Regno di Sicilia). Il tributo annuale di vassallaggio per l'isola di Malta era un singolo falcone maltese, che essi dovevano dare nel giorno di Ognissanti al Viceré di Sicilia, che faceva le funzioni di rappresentanza del re (questo fatto storico fu utilizzato per la trama del famoso romanzo di Dashiell Hammett, "Il falcone maltese"). I Cavalieri possedevano in questo periodo ancora la città di Tripoli, l'attuale capitale della Libia, detta Tripoli di Berberia per distinguerla dall'altra Tripoli, detta di Siria, nell'attuale Libano. Questa città venne loro tolta da Dragut nel 1551.