La molecola si comporta come un antimetabolita. I virus a DNA e gli herpes virus utilizzano la timidina nella sintesi dell'acido desossiribonucleico (DNA). Trifluridina interferisce con la sintesi del DNA virale ed incrementa il tasso delle mutazioni. La molecola viene utilizzata come substrato per la DNA polimerasi virale e porta alla formazione di DNA 'difettoso' poiché TFT viene incorporata nel filamento di DNA sostituendo molte delle normali basi di timidina. Viene così inibita la formazione delle proteine codificate dal DNA del virus e ne viene quindi ostacolata quindi la replicazione.