Tinbergen, terzo di cinque fratelli (uno dei quali, Jan, vinse poi nel 1969 il Nobel per l'Economia), mostrò già da piccolo un grande interesse per la natura. Durante i suoi studi di Biologia all'Università di Leida, conobbe il biologo Jan Verwey che fece nascere in lui l'interesse per il comportamento animale. Dopo le nozze con Elisabeth Rutten, continuò gli studi, principalmente su uccelli, pesci e insetti. Nel 1936 conobbe a Leida il collega Konrad Lorenz e ne divenne un allievo. Nel 1938 soggiornò per quattro mesi a New York.