NO è prodotto per azione della nitric oxide synthase (NOS), che catalizza l'ossidazione dell'azoto contenuto nella L-arginina producendo NO e citrullina. La NOS è costituita da un omodimero, nel quale ciascuna subunità presenta un dominio C-terminale ad azione reduttasica, contenente NADPH e FAD, e un dominio N-terminale ad azione ossidasica, contenente eme, mentre in posizione centrale è situato il dominio di legame per il complesso calcio-calmodulina (Ca+2-CAM).