L'atomo di cobalto (un elemento altrimenti estremamente tossico per l'organismo) nell'idrossicobalamina si trova nello stato di ossidazione +3. Per ottenere la forma attiva, interviene una flavoproteina reduttasi, utilizzante NADH, che riduce il cobalto prima a +2 e poi a +1. Sotto questo stato di ossidazione il cobalto si può legare al C5 di una molecola di ATP, spiazzandone i tre gruppi fosfato, e dare origine alla 5-deossiadenosilcobalamina.