Il primo a osservare "P. knowlesi" fu probabilmente l'italiano Giuseppe Franchini nel 1927, che, esaminando il sangue di "Macaca fascicularis", notò la presenza di plasmodi che differivano da "Plasmodium cynomolgi" e "Plasmodium inui". "P. knowlesi" fu quindi isolato alla Scuola di Medicina Tropicale dell'India, a Calcutta, all'inizio degli anni 1930, in un campione di sangue di un macaco dalla coda lunga importato da Singapore. I ricercatori, che stavano lavorando sulla leishmaniosi, inocularono il sangue infetto da "P. knowlesi" in tre esemplari di macaco, tra cui un macaco rhesus ("Macaca mulatta"), riscontrandone l'infettività in entrambe le specie e osservando una maggiore parassitemia per il macaco rhesus, che non è l'ospite naturale del plasmodio. Lo studio fu proseguito da Robert Knowles e Biraj Mohan Das Gupta, che descrissero la specie in dettaglio e dimostrarono l'infettività di "P. knowlesi" attraverso inoculi nell'uomo. La frequenza della febbre, che indica che "P. knowlesi" ha un ciclo eritrocitico di 24 ore, fu confermato successivamente. Dai primi anni del 1930 al 1955, "P. knowlesi" fu usato come agente piretico per il trattamento di pazienti affetti da neurosifilide. Nel 1957 Garnham "et al". suggerirono che "P. knowlesi" potesse essere la quinta specie in grado di causare la malaria endemica negli esseri umani.