Il pirosequenziamento (pyrosequencing o minisequenziamento) è una tecnica di sequenziamento del DNA, basata sul principio del "sequencing by synthesis", che permette di analizzare in maniera semplice e rapida tratti di DNA relativamente brevi, a partire da un primer di sequenziamento (primer elongation). L'ordine e il tipo di nucleotidi utilizzati per il sequenziamento sono decisi dall'operatore, permettendo un approccio diretto e ragionato. Il processo di sequenziamento utilizza il prodotto di amplificazione (PCR) della regione di interesse a singolo filamento ottenuto mediante denaturazione. Questa tecnologia si basa sull'utilizzo di quattro enzimi: la DNA polimerasi, la sulfurilasi, la luciferasi e l'apirasi. Quando viene dispensato il nucleotide trifosfato complementare al filamento di stampo, la DNA polimerasi catalizza l'incorporazione del dNTP nel filamento in fase di sintesi, determinando il rilascio di pirofosfato inorganico (PPi). Il PPi è utilizzato dalla sulfurilasi per produrre ATP. L' ATP generato consente la conversione della luciferina in ossiluciferina da parte della luciferasi. La luce prodotta da questa reazione viene captata dallo strumento e registrata come un picco sul pirogramma. I dNTP sono dispensati uno per volta e man mano che il processo di incorporazione continua viene sintetizzato un filamento complementare a quello di stampo. Quindi la sequenza nucleotidica di questo è riconoscibile dalla successione dei picchi registrati nel pirogramma. L'altezza di ogni picco registrato è proporzionale al numero di nucleotidi incorporati, che dipende sia dalla successione dei singoli nucleotidi nella sequenza, sia dalla presenza nel campione di esame di filamenti con differenze nucleotidiche (polimorfismi o mutazioni). Al termine del ciclo di incorporazione di ogni nucleotide, l'apirasi degrada l' ATP ed in nucleotidi che non sono stati incorporati (Figura 6). Determinante per il successo del pyrosequencing è l'utilizzo della deossiadenosina alfa-tiotrifosfato (dAαTP) in sostituzione della dATP, che interferirebbe con la reazione catalizzata dalla luciferasi.Nel presente lavoro l'analisi in pyrosequencing è stata effettuata per la valutazione quantitativa dello stato di metilazione di 10 siti CpG situati nella regione (chr10:131, 265, 507-131, 265, 556) dell'esone 1 del gene MGMT, utilizzando lo strumento PyroMark Q96 ID (Qiagen, Hilden, Germania). La preparazione dei campioni è stata ottenuta mediante l' utilizzo dello strumento VPW (Vacuum Prep Workstation), costituito da una spazzola (Vacuum Prep Tool) a 96 aghi filtranti collegata ad una pompa a vuoto, per la purificazione contemporanea di 96 prodotti di PCR a partire da una micropiastra a 96 pozzetti; tale processo richiede solo 15 minuti.Il protocollo di purificazione dell'amplificato per la reazione di pyrosequencing prevede l'aggiunta di una miscela di Binding Buffer (Qiagen, Hilden, Germania) e biglie (GE Healthcare) al volume delle PCR. Dopo 15 minuti in agitazione a 14000 rpm per permettere alle biglie ricoperte di streptavidina di legare i filamenti di DNA biotinilati si utilizza la Vacuum Preparation Tool per la purificazione. Le soluzioni necessarie per i passaggi nella Vacuum Preparation Tool (etanolo 70%, soluzione denaturante e soluzione di lavaggio) sono state preparate seguendo il protocollo fornito dalla ditta. Tutte le soluzioni per la reazione di pyrosequencing sono utilizzate a temperatura ambiente.Il primer di sequenziamento, è stato utilizzato ad una concentrazione finale di 0,4 μM nella miscela con Annealing Buffer (Qiagen, Hilden, Germania). La soluzione contenente il primer di sequenza e il DNA da analizzare viene posta a 80°C per 2 minuti e lasciata poi raffreddare a temperatura ambiente per 5 minuti perché possa avvenire la reazione di annealing. Per la fase di sequenziamento sono stati utilizzati i reagenti del kit PyroMark Gold Q96 Reagents (Qiagen, Hilden, Germania).Le condizioni di analisi in pyrosequencing sono determinate attraverso il software in dotazione allo strumento: dopo aver inserito la sequenza da analizzare il programma fornisce una possibile sequenza di dispensazione. Alla sequenza proposta dal software viene generalmente aggiunta la dispensazione di alcuni nucleotidi non presenti nella sequenza per controllare la presenza di aspecifici. L'analisi dei risultati ottenuti è stata effettuata prima automaticamente dal software del pyrosequencing e poi ricontrollata manualmente.Figura 6. Principi del pirosequenziamento. In termini generali si è osservato un aumento del numero di siti metilati nelle forme di alto grado rispetto al gruppo dei carcinoidi, senza però il raggiungimento di una significatività statistica (Figura 6). L' espressione dell'mRNA di MGMT è risultata significativamente differente nei vari istotipi, con una maggiore espressione nelle forme di carcinoma neuroendocrino di grandi cellule (p=0,024; Figura 7).   