Il coinvolgimento del NADH nell'azione GTN-reduttasica dell'enzima è stato escluso perché la reazione avviene anche in assenza del cofattore, anzi è la presenza del NAD + a favorire il pathway ALDH-dipendente.Nel 2002, Chen e colleghi hanno rilevato che l'aggiunta di NAD + (20-1000 µM)aumenta di dieci volte la velocità di formazione di 1,2-dinitroglicerina (Chen et al., 2002).Larson e colleghi, indagando il ruolo dei residui Arg475 e Glu487, hanno evidenziato come sia importante la presenza del cofattore legato all'enzima per modificare la cavità e rendere accessibile, e quindi reattivo, il sito attivo (Larson et al., 2007). I mutanti studiati ALDH-2*2 e Arg475Gly (R475Q) presentano una minore affinità per il cofattore e una diminuita attività enzimatica. Il 40% delle popolazioni asiatiche che esprime il gene per l'ALDH-2*2 presenta una minore responsività rispetto ai trattamenti con trinitroglicerina e l'assenza di metabolismo detossificante verso l'acetaldeide. Nell'ALDH wild-type (wtALDH) le funzioni esterasica e GTN-reduttasica non richiedono l'intervento del coenzima; tuttavia quest'ultimo, se presente, causa un incremento dell'attività. Nei mutanti, in presenza di concentrazioni fisiologiche di cofattore, l'attività catalitica verso queste reazioni è ridotta della metà nel R475Q e di dodici volte nell'ALDH-2*2. Se gli enzimi mutati vengono saturati di coenzima, forzando quindi la formazione del complesso, l'attività è ripristinata.Nel mutante R475Q è l'affinità verso il coenzima ad essere maggiormente diminuita rispetto all'attività catalitica; questo può sembrare contraddittorio dal momento che il residuo 475 è quello più vicino al sito reattivo e ci si aspetterebbe una maggiore diminuzione dell'attività. Analizzando la struttura 3D di un dimero, è stato evidenziato che i residui 466-475 sono posizionati tra i residui 268-270 di una subunità e i residui 260-264 di quella opposta, e sono coinvolti in interazioni di van der Waals. Il residuo 487 ha una posizione centrale in questa sottostruttura locale e stabilizza le varie catene. L'assenza di questo residuo perturba la regione, crea disordine e cambiamenti conformazionali, visibili nella struttura 3D dell'ALDH-2*2 rispetto a quella wild-type (Figura 15). Il legame, seppur forzato, con il cofattore favorisce il trasferimento dell'idruro dall'aldeide, attiva la Cys302 e riordina la struttura ripristinando la cavità del sito attivo. L'incapacità dei mutanti di legare correttamente il coenzima sembra essere dunque la causa della diminuita attività catalitica.Figura 15. Le interazioni sull'interfaccia del dimero di wtALDH-2 (Larson et al., 2007).Per quanto riguarda il ruolo del NAD(H) nella bioattivazione della GTN da parte dell'enzima ALDH-2, i dati sperimentali evidenziano come l'attività GTN-reduttasica aumenti notevolmente in presenza del coenzima (Beretta et al., 2008), sebbene quest'ultimo non partecipi chimicamente al meccanismo. Un'ipotesi proposta per spiegare l'aumentata bioattivazione è che il coenzima favorisca la ionizzazione del gruppo tiolico della Cys302, stabilizzando la forma anionica mediante interazioni elettrostatiche, aumentandone quindi la reattività nei confronti degli esteri nitrici (Larson et al., 2007;Marchal, et al., 1999).