Per ciascuna fettina è stata eseguita un'analisi combinata da parte di due osservatori indipendenti (Jasenka Mazibrada e Luisa Longo) sulla colorazione in E&E e sulla colorazione dei vari marcatori. Per confermare la riproducibilità dei dati, il 25% di queste fette è stato scelto in modo casuale ed è stato valutato due volte, ottenendo risultati simili. L'espressione [71] immunoistochimica di tutti i marcatori (eccezione fatta per p16) è stata valutata tramite H score, ottenuto dal prodotto dell'intensità di colorazione (0,1,2,3) per la percentuale di tessuto colorato.L'espressione di Ifi16, Ki67, pSTAT3 e Sox2 è stata determinata in base alla percentuale di immunoreattività nucleare delle cellule squamose, mentre l'espressione di HER2/neu è stata valutata sull'immunoreattività della membrana e saltuariamente al citoplasma. La presenza di p16INK4a nel nucleo e/o nel citoplasma è stata considerata positiva in presenza di almeno una cellula immunoreattiva a p16 con alterazioni morfologiche (Denton, Bergeron et al. 2010).