Lo scopo di questa tesi è stato valutare la variazione del carico mutazionale di JAK2 in un gruppo selezionato di pazienti affetti da TE trattati con idrossiurea, anagrelide e interferone alfa o non sottoposti a terapia citoriduttiva; inoltre si è analizzata l'associazione tra il carico mutazionale di JAK2 e il rischio di trombosi, considerando anche la presenza eventuale di uno stato trombofilico.Si è ricercata infine una eventuale correlazione tra leucocitosi alla diagnosi, trombosi e carico mutazionale.Per quanto riguarda l'effetto del trattamento citoriduttivo sulla variazione del carico mutazionale abbiamo notato un aumento del 21,3% nei pazienti non trattati e un aumento del 10,2% nei pazienti trattati con HU, del 4,6% nei pazienti trattati con anagrelide e una riduzione del 27,1% di quelli trattati con interferone alfa.Sono stati condotti recentemente altri studi per valutare l'impatto della terapia citoriduttiva sul carico mutazionale di JAK2V617F. I risultati sono stati discordanti. 3 studi (Richsten A et al del 2009 (169) , Spanoudakis E et at del 2009 (170) , Girodon F et al del 2008 (171) ) hanno riscontrato una diminuzione nel carico mutazionale dopo terapia con HU in un periodo di follow-up di 12-23 mesi. Il numero dei pazienti era però scarso (18 pazienti in due studi e 36 nell'altro) e sono stati analizzati sia pazienti affetti da TE che da PV. Altri 2 studi (di Larsen TS et al del 2009 (172) e di Theocharides A et al del 2008 (173) ) hanno dimostrato un'efficacia limitata dell'HU nel ridurre il carico mutazionale evidenziando una stabilità del carico mutazionale in corso di terapia citoriduttiva. Anche questi studi avevano un numero limitato di pazienti affetti sia da TE che da PV (24 l'uno e 48 l'altro) e un periodo medio di follow-up di 24-36 mesi.Nel nostro lavoro unicamente in pazienti con TE, si è riscontrato un aumento statisticamente significativo del carico mutazionale nei soggetti in terapia con HU, in un follow-up medio di 21 mesi. Le metodiche di estrazione del DNA sono differenti nei diversi studi: il nostro ha utilizzato il DNA da sangue periferico intero, altri hanno estratto il DNA da granulociti presenti nel sangue periferico o dai leucociti non frazionati periferici. Diversi sono anche i kit per l'analisi del carico mutazionale di JAK2: nel nostro lavoro i risultati del carico sono derivati da un'analisi semiquantitativa mentre negli altri studi si è effettuata un'analisi quantitativa o un'analisi PCR-allele specifica. Questa differenza nella metodica, tuttavia, difficilmente spiega la discrepanza dei risultati tra i lavori. I dati del nostro studio non permettono di escludere che vi sia una possibile risposta molecolare all'idrossiurea nel primo anno di terapia in quanto la nostra analisi è avvenuta in media dopo 21 mesi di trattamento.Tuttavia, è noto che l'efficacia dell'HU sia di breve durata (vi è infatti un immediato aumento della conta piastrinica e leucocitaria appena viene sospeso il farmaco) e questo ci fa supporre che una risposta molecolare importante e prolungata non possa essere ottenuta con un agente citostatico come l'idrossiurea che è attivo in fase S sui precursori mieloidi e non ha alcun vantaggio selettivo sul clone mutato. I dati ottenuti sono discordanti da quelli presenti in letteratura; una possibile spiegazione dell'aumento del carico mutazionale nei nostri pazienti in terapia con HU potrebbe essere da correlarsi anche alla presenza di una scarsa risposta clinica al farmaco. Infatti alcuni pazienti hanno richiesto dosi crescenti di HU per mantenere la conta piastrinica inferiore a 600.000/mm 3 .Per quanto concerne il trattamento con anagrelide attualmente non vi sono dati disponibili che riguardano l'influenza di questo farmaco sul carico mutazionale di JAK2V617F. Sebbene nel nostro studio il numero limitato di pazienti non permetta solide conclusioni, 3 pazienti sono rimasti stabili e uno ha avuto un aumento del carico mutazionale, evidenziando che questo farmaco soppressivo della sola linea megacariocitaria abbia una scarsa efficacia nel ridurre il carico mutazionale di JAK2. Nello studio di Larsen (172) sono stati valutati solamente 4 pazienti in terapia con anagrelide e in tutti si è riscontrato un aumento dei livelli di carico mutazionale.Per quanto riguarda l'interferone alfa, nel nostro lavoro è emersa una riduzione del carico mutazionale di JAK2 in 21,5 mesi di follow-up, anche se i dati erano disponibili solo per 2 pazienti. In un lavoro recente di Quintas-Cardama A et al del 2009 (174) si è dimostrato un alto tasso di risposta molecolare e di completa risposta ematologica nei 79 pazienti studiati. Altri 2 lavori di Kiladjian del 2008 (175), (176) su pazienti affetti da PV sono in linea con i risultati ottenuti da Quintas. Un solo studio del 2006 di Samuelsson (177) ha dimostrato un'efficacia limitata dell'interferone alfa nel ridurre il carico mutazionale dei pazienti con PV e TE. Importante è notare il ristretto numero di pazienti (25) che sono stati valutati.Dalla letteratura emerge che l'interferone alfa è in grado di eradicare i progenitori midollari JAK2-positivi in gruppi selezionati di pazienti con TE e PV. Si sta cercando di capire se i risultati ottenuti siano una conseguenza diretta dell'efficacia dell'interferone nell'inibire la proliferazione dei precursori emopoietici e fibroblastici o ci sia un effetto preferenziale sul clone mutato per JAK2.Nessuno studio sulla variazione del carico mutazionale di JAK2 è stato condotto nei pazienti con TE non sottoposti a terapia citoriduttiva. I nostri dati dimostrano che in assenza di una terapia soppressiva il clone mutato tende ad espandersi facendo aumentare il tasso di alleli mutati per JAK2.Se questo aumento possa in qualche modo definire una categoria di pazienti a maggior rischio di complicanze e quindi orientare verso un trattamento precoce potrà essere dimostrato in studi futuri.A proposito invece della correlazione tra carico mutazionale e trombosi è emerso da questo studio che esiste un'associazione tra i due fattori: per carico mutazionale maggiore di 12.5% si ha un aumentato rischio di trombosi e se il paziente è portatore inoltre di un'alterazione trombofilica il rischio aumenta, per una possibile interazione additiva tra il carico mutazionale di JAK2 e la trombofilia. Anche in altri studi si è dimostrato che la presenza di un carico mutazionale più alto è correlato ad un rischio più elevato di trombosi, soprattutto nei pazienti giovani (178) .Per quanto riguarda la correlazione tra leucocitosi, carico mutazionale e trombosi possiamo affermare l'esistenza di associazione tra la presenza di leucocitosi alla diagnosi ed evento trombotico, come si evince dalla letteratura.Nello studio di Carobbio et al del 2008 (95) su 657 pazienti con TE seguiti per 4,5 anni in media è emerso che la leucocitosi alla diagnosi esponeva i pazienti ad un maggior rischio trombotico e che il valore che era maggiormente in grado di predire l'evento era un valore medio di leucociti di 9,4 x10 9 /L. La correlazione con la presenza di leucocitosi alla diagnosi e carico mutazionale di JAK2 è risultata significativa solo per carico maggiore di 31%. In più lavori sta emergendo la conferma che la leucocitosi alla diagnosi sia un fattore di rischio importante e indipendente per gli eventi trombotici nei pazienti con TE. Molti meccanismi possono spiegare il ruolo trombogenico dei leucociti nelle malattie mieloproliferative: i neutrofili circolano in uno stato attivato e sono in grado di legare le piastrine in un processo dinamico che rispecchia l'attivazione sia delle piastrine che dei leucociti (89) . In altre patologie, quali la drepanocitosi, i leucociti rivestono un ruolo chiave nell'eziologia dell'evento trombotico. In questi pazienti un aumento della conta leucocitaria basale è risultata essere un fattore di rischio indipendente per la sindrome coronarica acuta e l'ictus cerebrale e la riduzione dei leucociti durante il trattamento con idrossiurea si è correlato con un miglior outcome clinico (177) . I risultati suggeriscono l'opportunità di una revisione della stratificazione del rischio, utilizzando anche la leucocitosi come parametro aggiuntivo all'età > 60 anni e ai precedenti eventi trombotici.Concludendo, il nostro lavoro vuole essere solo l'inizio di uno studio che verrà ampliato nel numero dei pazienti e nella durata del follow-up. La metodica di quantificazione del carico mutazionale di JAK2 è diventata ora di routine nei pazienti JAK2 positivi; si potranno così seguire nel tempo i pazienti tramite una valutazione seriata del carico, valutarne la categoria di rischio per l'insorgenza di trombosi e la risposta alla terapia in termini non solo clinici ma anche molecolari. In questo modo si potrebbe scegliere la terapia più appropriata per il singolo paziente, modificando il trattamento attuale in base alla risposta molecolare ottenuta.