Il campione biologico da sottoporre allo strumento di analisi consiste nell'aria espirata e può essere raccolto con due modalità principali. I documenti ATS/ERS raccomandano l'utilizzo del cosiddetto metodo on-line o del respiro singolo, in cui durante l'espirazione l'aria viene continuamente campionata dall'analizzatore e i dati vengono mostrati in tempo reale. In alternativa, il metodo off-line prevede che l'aria espirata venga prima raccolta in una sacca e poi solo successivamente analizzata, cosa che limita una tempestiva rilevazione di eventuali errori occorsi durante la manovra espiratoria, ma aumenta la potenziale utilità di questo esame in una maggior varietà di contesti clinici (e.g. reparti ospedalieri, domicilio, luogo di lavoro/studio).La misurazione del FeNO prevede due fasi, una inspiratoria e una espiratoria.Nella prima, è consigliabile che il soggetto sottoposto al test inspiri un'aria priva di NO (i.e. (TLC); una volta raggiunta, il soggetto deve iniziare immediatamente la fase di espirazione per evitare l'accumulo di FeNO che si verifica, in corso di apnea (126), prevalentemente nelle vie aeree superiori e può alterare il risultato.Durante la fase di espirazione devono essere presi ulteriori accorgimenti volti a limitare errori di campionamento. In particolare, devono essere escluse le cavità nasali e dev'essere mantenuto un flusso espiratorio costante.Il NO viene prodotto non solo nelle basse vie aeree, ma anche nelle alte vie, dove il tasso di produzione risulta maggiore soprattutto nelle cavità nasali; dal momento che le molecole di NO diffondono lungo un gradiente di concentrazione, la produzione nasale è di per sé in grado di alterare il FeNO (125,126). Questa contaminazione è impedita dall'inserimento nel circuito analizzatore-paziente di un resistore che ostacoli il flusso d'aria espirata. Si raccomanda l'uso di resistori di almeno 5 cmH2O, ma non superiori ai 20 cmH2O, in grado di determinare la chiusura del velo del palato senza creare eccessivo fastidio nel soggetto.La dinamica di scambio del NO, a differenza di quella per altri gas come l'ossigeno (O2) o l'anidride carbonica (CO2), è fortemente dipendente dalla velocità del flusso espiratorio (125). Più rapido è il transito dell'aria nelle vie aeree, più limitato è il tempo di diffusione del NO dalla parete al lume, minore è il valore di FeNO registrato dall'analizzatore a pari FeNO. Misurazioni ottenute a un flusso di 50ml/s sono anche riportate con la dicitura FeNO50.La durata dell'espirazione deve essere sufficiente ad ottenere un washout delle vie aeree e raggiungere il plateau: in genere negli adulti si richiede un'espirazione di almeno 6 secondi, corrispondente a un volume di circa 300 ml, ma non di rado è necessario estenderla fino a 10 secondi.Nell'interpretazione dei risultati sono da tenere in considerazione numerosi determinanti individuali, non necessariamente correlati a patologie.Innanzitutto, l'ampiezza della superficie di scambio: è stata notata una correlazione tra FeNO e corporatura, e tipicamente le donne presentano valori di FeNO più bassi degli uomini così come i bambini rispetto agli adulti (127); anche il calibro delle vie aeree è considerato fattore modificante in quanto il FeNO risulta variabile in base al grado di ostruzione o dopo broncodilatazione (128).L'assunzione di cibi o bevande contenenti nitrati è stata correlata ad aumentati livelli di FeNO; è infatti stato dimostrato che la quota del NO esalato ascrivibile a una produzione orofaringeapari circa al 10-30% (102) -dipende dall'azione della normale flora commensale orale sui nitrati presenti fisiologicamente nel secreto salivare. Una maggior assunzione di nitrati con la dieta pertanto determina una maggior disponibilità di substrato per questi batteri, che li riducono a nitriti, precursori del NO attraverso una trasformazione non enzimatica. In studi di ricerca è consigliato sottoporre il soggetto esaminato per il FeNO a uno sciacquo del cavo orale con soluzioni antibatteriche (e.g. clorexidina) prima della misurazione, per limitare questo eventuale bias e identificare più precisamente la produzione a livello delle basse vie aeree (129); tuttavia, nella pratica clinica è considerato superfluo a meno di recenti ingestioni di grandi quantità di nitrati, dato lo scarso impatto di questa produzione in confronto alla quota derivata dall'attività della iNOS anche in soggetti sani (123).Un altro fattore che altera il FeNO è l'abitudine tabagica: l'esposizione al fumo di sigaretta può determinare in modo transitorio riduzione o aumento del FeNO, ma l'abitudine è associata a riduzione dei valori in modo cronico, con effetti che perdurano anche in seguito a sospensione soprattutto nei forti fumatori. 