In genere, la diagnosi precoce del melanoma è un fattore chiave per una buona prognosi e sopravvivenza dei pazienti. Se diagnosticato in uno stadio precoce (stadio 0/I/II), la sopravvivenza a 5 anni è stata stimata a circa il 98-100% (4). I trattamenti di prima linea impiegati per la cura del melanoma sono l'intervento chirurgico che prevede l'esportazione del tumore, e/o in caso di lesioni localmente avanzate o con interessamento linfonodale, l'uso della chemioterapia. Purtroppo quest'ultima opzione terapeutica è poco efficace nel controllo della malattia. Negli ultimi anni, il trattamento del melanoma è notevolmente migliorato, con l'introduzione di nuove cure, come l'immunoterapia e la terapia a bersaglio molecolare. Il primo approccio di immunoterapia prevedeva la somministrazione di interferone-2α (IFN-2α) o interleuchina 2 (IL-2), i quali però presentavano alta immunogenicità e tossicità e bassi tassi di risposta. Dal 2011 sono state approvate nuove strategie immunoterapiche per il melanoma metastatico basate sull'uso di inibitori dei cosiddetti immunocheckpoints. Se prima della loro introduzione i pazienti in stadio avanzato presentavano una sopravvivenza media di 8-10 mesi, adesso la sopravvivenza media a 5 anni è stimata a circa il 19%. Lo svantaggio è l'elevata presenza di effetti collaterali e la resistenza alla terapia in circa il 30% dei pazienti.Mutazioni di BRAF (chinasi che controlla la proliferazione cellulare), di cui la più comune è la sostituzione V600E, sono state trovate in circa il 50% dei melanomi. Sono state pertanto sviluppate terapie molecolari mirate, come ad esempio l'inibitore di BRAF Vemurafemib. Anche in questo caso il problema della resistenza dopo il trattamento, per l'insorgenza di nuove mutazioni, è una costante (5,6,7).Con lo sviluppo di queste nuove strategie, è aumentata anche la possibilità di terapie combinate, così da superare gli svantaggi della monoterapia e quindi aumentare il tasso di sopravvivenza globale. (5,8,9). Tuttavia, nonostante il miglioramento della prognosi, non si sono ancora raggiunti i seguenti obbiettivi:1. Ottenere migliori risultati nel controllo della malattia a lungo termine, evitando il problema della resistenza, 2. Aumentare la tossicità diretta contro le cellule tumorali, limitando l'insorgenza di effetti collaterali sistemici, 3. Trovare un adeguato bilancio tra costo e beneficio della terapia.La terapia fotodinamica (PDT) è un trattamento non invasivo già utilizzato per la cura di alcuni tipi di tumore (10). Essa prevede l'uso combinato di foto-sensibilizzatori non tossici (PS) e della luce visibile ad una lunghezza d'onda appropriata (11,12). L'eccitazione del PS da parte della luce fa sì che esso reagisca con l'ossigeno molecolare e quindi generi specie reattive dell'ossigeno (ROS), con conseguente danno alla zona irradiata, che può essere limitata al solo tumore (13).I ROS possono derivare sia da fonti endogene che esogene. Le principali fonti endogene sono il complesso I e il complesso III della catena di trasporto degli elettroni nel mitocondrio, e numerosi enzimi, tra cui la NADPH-ossidasi e la lipossigenasi (14). Le fonti esogene che promuovono la produzione di ROS sono i raggi UV, specifici farmaci e sostanze chimiche, l'ipossia. In condizioni fisiologiche la produzione e la detossificazione dei ROS sono in perfetto equilibrio dinamico (15). Bassi livelli di ROS sono vantaggiosi per mantenere il normale metabolismo e la crescita cellulare (16), invece ad alti livelli potrebbero interrompere la fisiologica omeostasi nella cute e favorire la comparsa di lesioni cutanee e tumori come il melanoma (17). D'altra parte, una dose molto alta di ROS generata all'interno della massa tumorale potrebbe indurre necrosi o apoptosi delle cellule tumorali, rappresentando una nuova strategia terapeutica.Nella terapia fotodinamica con l'eccitazione alla luce, il PS raggiunge lo stato di singoletto ( 1 PS *) e, successivamente, subisce la transizione allo stato di tripletto ( 3 PS *). Grazie alla sua lunga emivita (µs-ms), il 3 PS * può interagire con l'ossigeno molecolare dando potenzialmente origine a due diverse reazioni. La prima (reazione di tipo I) comporta un trasferimento iniziale di elettroni a 3 O2 e la conseguente formazione di anione superossido (O2-. ), da cui deriva il perossido di idrogeno (H2O2). Questo, a sua volta, può dare origine al radicale ossidrile (HO . ), anch'esso molto reattivo e tossico. La seconda (reazione di tipo II) comporta il trasferimento di energia da 3 PS * a 3 O2 con la produzione di ossigeno singoletto ( 1 O2), altamente tossico. Questa è la molecola chiave che genera la maggior parte di citotossicità nella PDT (12,18). L'irradiazione locale del tumore dopo la somministrazione sistemica del PS può portare alla produzione di ROS citotossici solo nel distretto del tumore, provocando la morte cellulare con un'elevata precisione spaziale.Una limitazione di questo approccio è che, il successo della PDT è strettamente correlato alla presenza di O2, essenziale per la produzione di ROS: molti tumori solidi hanno uno scarso afflusso di sangue e quindi presentano una bassa concentrazione di O2. Recentemente sono state proposte alcune strategie per superare questo ostacolo (19); una delle più interessanti si basa sull'uso del monossido di azoto (NO). NO è un radicale libero (20) che svolge ruoli chiave nella fisiologia e patofisiologia umana, essendo coinvolto in una serie di processi biologici, tra cui vasodilatazione, aggregazione piastrinica, neurotrasmissione, secrezione di ormoni, e immunità mediata dai macrofagi. (21). Oltre questi effetti sistemici, NO ha dimostrato di essere un ottimo antiossidante, (22) agente antibatterico, (23) e agente antitumorale. (23). L'emivita di circa 5 s, una dimensione molecolare molto piccola, la mancanza di carica, e un carattere lipofilo rendono NO in grado di diffondere per 40-200 µm nell'ambiente cellulare, (20) offrendo il vantaggio di limitare la sua reattività alla ristretta regione in cui viene prodotto (24). È stato dimostrato che basse concentrazioni di NO (nM) favoriscono la crescita della neoplasia mentre alte concentrazioni (µM) sono tossiche e ne riducono la progressione.Altri fattori, oltre alla concentrazione, possono influenzare gli effetti di NO sulla crescita tumorale, in particolare la durata dell'esposizione e la sensibilità cellulare (25,26).Gli effetti tossici di NO possono essere sia diretti che indiretti. I primi sono legati alla capacità di NO di reagire con i metalli di transizione presenti in alcune biomolecole essenziali per la vita cellulare (ad esempio i centri ferro-zolfo delle proteine e degli enzimi contenenti ferro). Gli effetti indiretti sono causati dalla capacità di NO di reagire con O2 o O2-. , formando così le specie reattive del monossido di azoto (RNS), con capacità di ossidare, nitrare e nitrosare una grande varietà di molecole biologiche (27,28). Il perossinitrito (ONOO-), che si genera dalla reazione tra NO con O2 . -, è uno di questi RNS ed è altamente tossico, infatti è un potente agente ossidante e nitrante.Nell'ambiente fisiologico ONOO-dà vita per omolisi a HO . e NO2 . , radicali che possono combinarsi per produrre nitrato.Sulla base di queste premesse, si è ipotizzato che l'applicazione di donatori di NO nella terapia antitumorale e nella PDT in particolare possa essere di grande rilevanza.Tuttavia, questo enorme potenziale mostra come principale limite la mancanza di un preciso controllo spazio-temporale della quantità di NO rilasciata che, come descritto sopra, è fondamentale per un risultato terapeutico positivo. Per questi motivi, attualmente esiste un grande interesse per i composti in grado di rilasciare NO sotto l'azione della luce, cioè gli NO foto-donatori (NOPD). Nei NOPD, l'NO è "ingabbiato" da un legame covalente in uno scaffold foto-attivabile che sfrutta l'energia di eccitazione per rompere i legami e liberare direttamente NO (29,30) o composti che, a loro volta, rilasciano spontaneamente NO (31,32). In questi casi, il rilascio di NO è limitato all'area irradiata e il controllo temporale del suo rilascio è ottenuto semplicemente sintonizzando la durata e l'intensità dell'irradiazione. L'applicazione dei NOPD nel campo della terapia fotodinamica antitumorale controllata dalla luce (NOPDT) è molto interessante, perché a differenza della PDT, può essere efficace anche contro i tumori solidi in condizioni ipossiche. La combinazione di PS e NOPDT rappresenta un approccio ideale verso metodiche nuove e non convenzionali, grazie alle proprietà di 1 O2 e NO, come: 1) attività multi-target;2) confinamento della loro azione in una regione dello spazio limitata a causa della loro breve emivita (5 s) e del loro basso raggio di diffusione (200 µm) (33).In questo lavoro di tesi abbiamo sviluppato e testato l'uso di NODPS in combinazione con la terapia fotodinamica su linee di melanoma umano A375 e SKMEL28. Nella Figura 1 possiamo vedere il composto 1, costituito da uno scaffold di boro dipirrometene (Bodipy) unito covalentemente al Cupferron (sale d'ammonio della nitrosofenilidrossilammina), che è in grado di rilasciare spontaneamente NO (32). Sotto l'azione della luce verde, il composto 1 rilascia NO a seguito del distacco della frazione di Cupferron. Per incorporare un NOPD e un PS all'interno dello stesso scheletro molecolare (34), si è ideato il 2,6-diiododerivato, chiamato composto 2 (Figura 1). In   