I PBMC sono stati ottenuti da 40 ml di sangue intero prelevato in litio eparina con metodo di centrifugazione in gradiente di densità attraverso l'utilizzo del Ficoll-Pacque, già in precedenza descritto in letteratura (10).La separazione dei PBMC dal sangue intero richiede una diluizione 1:1 del sangue con soluzione fisiologica; una stratificazione di 20 ml della diluizione ottenuta con 15 ml di Histopacque in falcon da 50 ml seguita da una centrifugazione per 30 minuti a 1400 G. I PBMC ottenuti da questa prima centrifugazione vengono raccolti e lavati in fisiologica. Per l'analisi al FACS servono 8.000.000; le restanti cellule vengono congelate in siero (50.000.000/ml) addizionato al 10% di DMSO (dimetilsulfossido) e conservate in azoto liquido.In media, a partire da 40 ml di sangue periferico, abbiamo isolato circa 40.000.000 di cellule per paziente.  