Lo strumento dot blot è stato preparato con due strati di carta assorbente (M3 Whatman) su cui è stata posizionata la membrana di nitrocellulosa dopo averla reidratata. Lo strumento viene avviato e vengono "spottati" in ogni pozzetto 0,5 µg di proteina GST-WT1 (7,15 µg di proteina per cm 2 di membrana di nitrocellulosa).La membrana viene lasciata per 30' in camera umida e successivamente fatta saturare con siero di albumina bovina (BSA) al 5%. Vengono fatti 3 lavaggi con TBS-Tween 0,1% e dopo la membrana viene di nuovo posizionata nello strumento dot blot dove vengono "spottati" 20 µl di siero diluito in acqua 1:500 per i sieri murini e 1:2500 per i sieri umani.La membrana viene poi nuovamente lasciata per 30' in camera umida. Vengono fatti 3 lavaggi da 15' con TBS-Tween 0,1%. A questo punto la membrana viene incubata per 60' con un anticorpo anti-IgG umano coniugato con la perossidasi (ICN Biomedicals) per i sieri dei pazienti o anti-mouse coniugato con la perossidasi (Santa Cruz Biotechnology) per i sieri dei topi e poi viene lavata 4 volte per 10' con TBS-Tween 0,1%.Il prodotto della reazione viene rilevato mediante la soluzione ECL (Amersham Biosciences) e letto al luminometro (Victor, Perkin Elmer).