Dall'analisi della struttura tridimensionale di molte topoisomerasi I è stato determinato il meccanismo della loro reazione. La topoisomerasi I umana è costituita da 4 domini, disposti intorno a una cavità centrale con diametro di 20 Å, dove è presente un residuo di tirosina (Tyr 723). La molecola di DNA si lega all'interno di questa cavità, dove il gruppo ossidrilico della tirosina forma un legame fosfodiestere con un gruppo fosforico di uno dei due filamenti di DNA. In seguito a questo taglio, il DNA è libero di ruotare attorno all'altra catena, con un movimento favorito dall'energia contenuta nello stesso superavvolgimento; l'enzima controlla la rotazione perché non avvenga troppo velocemente.