È sintetizzata a partire dal 3-dimetilamminofenolo che, fatto reagire con l'N-dimetilcarbamoil cloruro, forma il relativo dimetil-carbammato. Il prodotto è successivamente metilato con dimetilsolfato a dare la neostigmina come sale metilsolfato, approvato per uso parenterale mentre per via orale viene impiegato il bromuro.