Il nostro lavoro si inserisce in un contesto di letteratura ad oggi poco esplorato, sia per quanto riguarda l'obiettivo principale dello studio sia per quanto riguarda l'approccio molecolare da noi disegnato.La gran parte delle informazioni molecolari oggi disponibili relativamente al carcinoma tiroideo differenziato, ed in particolare riguardo al carcinoma papillare, sono in primo luogo informazioni di tipo genomico e mirate alla distinzione del carcinoma papillare da altre forme di carcinoma tiroideo o da patologie benigne, oppure mirate alla definizione di aspetti prognostici su casistiche operatorie. In secondo luogo, inoltre, pochi studi sono stati ad oggi disegnati per definire i profili di alterazioni epigenetiche nel carcinoma papillare, e, qualora effettuati, anche in questo caso non sono stati condotti su casistiche citologiche.Il nostro obiettivo è stato quindi specificamente disegnato su campioni citologici per definire la presenza ed il ruolo di marcatori molecolari epigenetici nel caratterizzare in fase preoperatoria una popolazione di pazienti affetti da carcinoma tiroideo e predire la presenza di caratteristiche di aggressività.Per questo motivo la casistica è stata selezionata unicamente sulla base di una caratterizzazione citologica secondo SIAPEC/IAP di TIR5 (esclusi i carcinomi anaplastici e midollari), ovvero in presenza di diagnosi di malignità per carcinoma papillare già codificata citologicamente, non considerando quindi categorie a rischio indeterminato. Inoltre, per evitare bias di selezione non legati strettamente alla disponibilità di materiale per l'analisi molecolare, la casistica è stata costruita in modo consecutivo, per quanto in questo modo la presenza dei vari parametri considerati sia risultata sbilanciata tra i gruppi sottoposti successivamente a correlazione statistica.Lo studio è stato quindi suddiviso in due bracci, ad esplorare due meccanismi alternativi di regolazione epigenetica quali la presenza di metilazione in un set di geni oncosoppressori e la regolazione dell'espressione genica regolata dai microRNA.Per quanto riguarda la prima fase dello studio, si è innanzitutto osservato che -almeno per quanto riguarda i 24 geni da noi analizzati -la presenza di metilazione è presente con una prevalenza molto bassa, e, nella maggior parte, con eventi non ricorrenti. Tra i geni analizzati, CDH13 e RASSF1A sono risultati i geni a maggiore frequenza di metilazione. Il primo è stato studiato nel carcinoma papillare in un unico studio recente in confronto a campioni di tessuto normale e di adenoma follicolare (105) , in un contesto quindi molto differente da quello disegnato per il nostro lavoro.Per quanto riguarda RASSF1A vi sono invece maggiori dati in letteratura, con prevalenze nel carcinoma papillare estremamente eterogenee sulla base del metodo di analisi utilizzato, dal 62% in un primo studio (106) al 20% in uno studio di pochi anni successivo (107) . In particolare, la presenza di metilazione di RASSF1A è stata inversamente correlata con la presenza di mutazione di BRAF (108) mentre in un unico studio di tipo esplorativo prognostico su casistica operatoria, la presenza di metilazione di RASSF1A è stata invece associata inversamente alla presenza di estensione extratiroidea (109) . I dati su casistiche citologiche sono invece molto scarsi. In una unica casistica citologica, la presenza di RASSF1A è risultata addirittura inferiore rispetto alle lesioni benigne (110) , ma anche in questo caso senza una analisi di tipo prognostico.La bassa prevalenza di metilazione generale da noi osservata non ha consentito quindi nella nostra casistica citologica una analisi di correlazione con le caratteristiche clinico patologiche riscontrate poi nei campioni operatori corrispondenti, che era l'obiettivo primario di questa parte dello studio. Abbiamo quindi considerato anche la presenza di varianti del numero di copie dei geni del pannello da noi utilizzato, sebbene queste rappresentino più probabilmente un fenomeno di instabilità genomica generico e non meccanismi gene-specifici.Analizzando complessivamente le caratteristiche clinico patologiche disponibili rispetto ai 9 geni con frequenza di alterazione superiore al 10%, non sono state osservate correlazioni statisticamente significative. L'unica associazione di rilievo è stata la presenza di alterazioni del gene PARK2, ricorrentemente in forma di delezione, con il riscontro di tiroidite cronica nel parenchima adiacente alla neoplasia sul campione operatorio corrispondente. Sebbene mai studiata specificamente nella tiroide, la perdita di funzione del gene PARK2 è state associata in altri modelli di neoplasia alla perdita di meccanismi di rimozione di mitocondri danneggiati, che sono la caratteristica delle cellule ossifile tiroidee frequentemente associate a tiroidite (111) ed alla induzione di infiammazione (112) . È quindi ipotizzabile che perdita di funzione di PARK2 sia un evento patogeneticamente associato alla insorgenza di tiroidite carcinoma-associata.Il secondo braccio dello studio è stato invece disegnato per verificare l'esistenza di profili di espressione di microRNA specificamente associati alla presenza di metastasi linfonodali, che possa risultare nell' identificazione di biomarcatori da utilizzarsi su campioni citologici.Differenti studi hanno analizzato il ruolo prognostico di microRNA e l'associazione con la presenza di metastasi linfonodali in particolare, nel carcinoma papillare tiroideo (113,114,115) .Tuttavia, non esistono studi specifici su casistica citologica mirati alla validazione di biomarcatori legati a meccanismi regolati da microRNA in fase preoperatoria, ma solo studi a carattere prognostico su casistiche di pazienti operati.Nel nostro studio abbiamo condotto prima una fase di screening attraverso una analisi di espressione globale di microRNA su campioni operatori e successivamente una fase di validazione dei profili specifici identificati sulla casistica consecutiva di campioni citologici di cui era poi disponibile il dato di presenza di metastasi linfonodali al campione istologico definitivo.La fase di screening è stata condotta su campioni con e senza metastasi linfonodali appaiati per stadio T e variante istologica, per ridurre al minimo la presenza di fattori di confondimento. In questa fase si è chiaramente evidenziato che il profilo globale di espressione di microRNA è in grado di sotto-classificare in modo indipendente i campioni con presenza o meno di metastasi linfonodali, a dimostrazione che i microRNA sono un meccanismo attivo e consistente di regolazione della disseminazione linfonodale nel carcinoma papillare tiroideo.In particolare, 21 e 24 geni sono stati identificati essere rispettivamente down regolati e up regolati nei campioni con stadio patologico N1 all'esame istologico successivo.Come atteso, l'analisi bioinformatica condotta successivamente ha mostrato che i pathway maggiormente regolati dai 45 microRNA complessivi identificati sono estremamente eterogenei, con una elevata prevalenza tuttavia dei pathway di segnalazione di MAPK e PI3K-Akt, che sono anche i principali pathway de-regolati dai più frequenti meccanismi genomici nel carcinoma papillare tiroideo, quali le mutazioni di BRAF e dei geni RAS.Per la parte di validazione su casistica citologica sono stati selezionati un microRNA downregolato nei casi pN1, il miR-483-5p, ed un gene, KLF12 regolato da 6 dei microRNA risultati up-regolati sempre nei casi pN1 della casistica pilota.La distribuzione di espressione di questi due biomarcatori ha mostrato un andamento molto interessante. Sebbene in entrambi i casi non si sia raggiunta la significatività statistica, molto probabilmente sulla base della limitata numerosità campionaria dei casi pN1 all' istologico definitivo e dello sbilanciamento di distribuzione tra i casi con stadio pN0 rispetto ai casi con stadio pN1, per entrambi i marcatori si è osservato che i casi a maggiore espressione erano presenti nei casi con stadio pN0 (o pNx considerati quindi N0 clinicamente). In questo senso, i due biomarcatori analizzati hanno entrambi un basso valore predittivo positivo ma un elevato valore predittivo negativo essendo quando presenti indicativi di basso rischio di metastasi linfonodali.Per quanto riguarda sia miR-483-5p sia KLF12 non vi sono dati in letteratura su un loro eventuale ruolo nel carcinoma tiroideo, motivo per cui i nostri risultati non sono direttamente comparabile con quanto presente in altri studi. Il ruolo da onco-soppressore di KLF12, per quanto controverso, è stato recentemente ipotizzato in modelli di carcinoma polmonare, sebbene non esistano evidenze in nessun modello tumorale di un suo ruolo nel regolare la disseminazione metastatica linfonodale (116) . Anche per quanto miR483-5p non vi sono dati sul carcinoma tiroideo. In un recente studio sul carcinoma esofageo, miR-483-5p ha mostrato una associazione inversa a quanto da noi osservato rispetto alla presenza di metastasi linfonodali (117) . Tuttavia, come per molti microRNA associati al cancro, miR-483-5p può manifestare effetti paradossi a seconda del modello tumorale e/o del tessuto da cui origina la neoplasia oggetto di studio. Ad esempio, miR-483-5p ha mostrato funzioni da oncosoppressore nel modello del glioma (118) .In conclusione, il nostro studio ha dimostrato che: a) la metilazione in geni oncosoppressori è un meccanismo poco prevalente nel carcinoma papillare della tiroide e non è associato a caratteristiche di aggressività, almeno nel set di geni da noi analizzato; b) la perdita del gene PARK2 è significativamente associata alla presenza di tiroidite cronica, in linea con l'effetto pro-infiammatorio di un suo deficit funzionale dimostrato in altri modelli tumorali; c) il profilo di espressione globale di microRNA è in grado di classificare in modo indipendente il carcinoma papillare con o senza metastasi linfonodali; d) KLF12 e miR-483-5p sono biomarcatori potenziali di presenza di metastasi linfonodale nel carcinoma papillare in fase preoperatoria, da validarsi su casistiche indipendenti.