Gli autori, nella discussione, ipotizzano che l'aumento di HGF indotto dall'eparina possa essere il responsabile dell'osteoporosi che si sviluppa dopo prolungati trattamenti con l'eparina, a causa dell'azione pro-osteoclastica dell'HGF (descritta nel capitolo relativo).Un limite di questo studio è il mancato utilizzo di controlli che non assumano eparina con l'impossibilità di verificare l'eventuale presenza di ritmi circadiani nella concentrazione sierica di HGF.Un ulteriore studio del 2000 (Salbach PB et al., 2000) ha confermato l'aumento di concentrazione sierica dell'HGF in seguito a somministrazione di eparina.In questo studio sono stati arruolati 18 volontari maschi sani. Durante lo studio sono stati confrontati diversi trattamenti con un disegno di tipo cross-over e almeno 6 giorni di wash-out tra un trattamento e l'altro:- In questo studio sono stati dosati anche il VEGF e il bFGF, entrambi, come l'HGF, appartenenti agli heparin-binding growth factors (HBGF); nessuno dei due, però ha mostrato una modificazione nella concentrazione a seguito della somministrazione di eparina.Infine, un articolo apparso nel 2003 sul Kidney International (Borawski J et al., 2003) ha riportato i risultati del dosaggio di HGF in pazienti sottoposti ad emodialisi e quindi in trattamento con eparina. Vennero analizzati 25 pazienti in trattamento cronico con emodialisi ai quali vennero misurati HGF, follistatina e activina A (rispettivamente un agonista ed un antagonista dell'azione organotrofica renale dell'HGF) all'inizio, dopo 10 minuti e dopo 180 minuti dall'inizio dell'emodialisi scoagulata con enoxaparina. Successivamente i pazienti sono stati divisi, con una procedura casuale, in due gruppi: un gruppo ha continuato ad usare l'enoxaparina come anticoagulante, mentre l'altro ha ricevuto UFH.Come controlli sono stati utilizzati volontari sani.Dei 25 pazienti arruolati, 23 sono stati seguiti per tre mesi.L'HGF è stato qui analizzato su campioni di plasma.Nei pazienti sottoposti cronicamente a dialisi l'HGF risulta aumentato rispetto ai soggetti sani (Sugimura K et al., 1995): anche in questo studio è stata osservata una concentrazione mediana precedente alla somministrazione di eparina di circa 1840 pg/ml nei soggetti dializzati rispetto ad una concentrazione di 600 pg/ml nei soggetti sani di controllo (p<0,0001). Il livello di HGF è risultato, poi, ancora enormemente aumentato durante le sedute di emodialisi (con un aumento del 1631% a 10 minuti e del 377% a 180 minuti, P<0,0001).Il passaggio dall'uso della LMWH come anticoagulante all'uso dell'UFH ha condotto ad un ulteriore aumento della concentrazione di HGF (p<0,05), mentre nei pazienti che hanno continuato la somministrazione di enoxaparina l'aumento dell'HGF durante la dialisi è risultato costante nel tempo.Durante il periodo di follow up non si sono registrati episodi emorragici, trombotici o infettivi in alcuno dei due gruppi; anche tutti i parametri di laboratorio (ed in particolare il numero delle piastrine) non hanno subito alterazioni di rilievo.Sebbene questo sia l'unico studio che abbia indagato l'effetto della somministrazione di eparina sulla concentrazione di HGF a lungo termine, le problematiche particolari dei pazienti presi in esame (soprattutto la presenza di insufficienza renale) costituiscono un notevole confondimento riguardo alle variabili farmacocinetiche.Meccanismo di aumento dell'HGF da parte dell'eparina 5.7 Come descritto nel capitolo sull'HGF, esso è in grado di legare sia l'eparina, sia l'eparan-solfato, sebbene con un'affinità 10 volte minore rispetto al suo recettore cellulare MET.L'eparina è in grado di spiazzare l'HGF dal legame con l'eparan solfato sulla superficie cellulare e nella matrice extracellulare (Naka D et al., 1993).La diversa affinità per l'HGF dell'UFH e della LMWH può venire spiegata alla luce della differente struttura di queste due preparazioni e, in particolare, al diverso peso molecolare medio ed alla diversa carica negativa dovuta alla presenza di più o meno gruppi solfato. Inoltre, possono avere un ruolo la differente affinità per le proteine sieriche e per le cellule endoteliali, così come la diversa via di eliminazione (completamente renale per la LMWH e sia renale sia tramite l'internalizzazione nel sistema reticolo-endoteliale per l'UFH) (Hirsh J, Levine MN, 1992).La somministrazione di UFH provoca in tutti gli studi analizzati un aumento maggiore nella concentrazione dell'HGF rispetto alla LMWH: questo potrebbe essere dovuto al suo maggior peso molecolare ed alla presenza di più gruppi solfato, caratteristiche che possono entrambe determinare un maggior legame alle cellule endoteliali e alle molecole di HGF, oltre ad una minore clearance epatica del complesso bioattivo HGF/UFH dal circolo sanguigno (Kato Y et al., 1994).La clearance dell'HGF è effettuata soprattutto dal fegato, in parte attraverso un meccanismo di endocitosi del complesso recettore-ligando, in parte attraverso il legame dell'HGF ai proteoglicani eparan solfato, che, a loro volta, promuovono l'internalizzazione e la degradazione dell'HGF (Liu KX et al., 1997-Hartmann G et al., 1998.Il meccanismo con cui l'eparina aumenta la concentrazione sierica di HGF non è del tutto chiarito. Essa, come accennato precedentemente, potrebbe agire spiazzando l'HGF dal suo legame con i proteoglicani della superficie cellulare e della matrice extracellulare; in questo modo, l'eparina potrebbe o aumentare la clearance dell'HGF dal circolo sanguigno o, al contrario, sottrarlo da uno dei suoi meccanismi fisiologici di clearance, costituito dal riassorbimento da parte degli epatociti del complesso HGF-proteoglicani (Seidel C et al., 1999). Inoltre, l'eparina è in grado di aumentare la concentrazione di HGF attraverso meccanismi di regolazione post-trascrizionali, in quanto a seguito di somministrazione di eparina in vitro, nonostante non si registri un aumento dell'mRNA dell'HGF, si ha un forte aumento della sintesi di HGF come dimostrato con l'utilizzo di metionina marcata (Matsumoto K et al., 1993).L'eparina aumenta la produzione di HGF in diversi tipi cellulari, tra cui fibroblasti, cellule leucemiche e cellule endoteliali delle vene del cordone ombelicale (Matsumoto K e Nakamura T, 1996).L'eparina, oltre ad aumentare la concentrazione sierica di HGF, ne aumenta anche l'attività, come dimostrato da Matsumoto K e Nakamura T nel 1996 (nel cui studio l'eparina, aumentando la concentrazione di HGF di 2,5 -5 volte ha provocato un aumento paragonabile anche nella rigenerazione epatica postepatectomia) e da Zioncheck TF et al., (1995) i quali hanno dimostrato un aumento nell'autofosforilazione di c-met dopo l'aggiunta di eparina, eparan solfato e destrano solfato alle colture cellulari esprimenti HGF e MET. In questo studio si è ipotizzato che l'eparina possa stabilizzare degli oligomeri di HGF, facilitando la dimerizzazione di MET e la sua attivazione.I risultati di uno studio del 2001 suggeriscono, infine, che l'eparan solfato possa facilitare la via di segnalazione intracellulare dell'HGF attraverso un'interazione con MET indipendente dall'interazione MET-HGF. L'eparan solfato, quindi, tramite il legame con MET potrebbe contribuire al reclutamento di effettori intracellualri in grado di modulare la risposta mitogenica e di motilità cellulare all'HGF (Rubin JS et al., 2001).L'azione dell'eparina, perciò, oltre ad aumentare la concentrazione di un HGF biologicamente attivo, potrebbe aumentarne l'attività e rendere maggiormente disponibile l'HGF nei tessuti che ne hanno bisogno (come per esempio tessuti danneggiati dall'ischemia) (Salbach PB et al., 2000). Studi in questa direzione sono stati compiuti, per esempio in ambito cardiovascolare, partendo dall'osservazione che sia l'HGF sia l'eparina determinano la formazione di vasi collaterali in pazienti Nel presente studio si intende determinare l'entità della mobilizzazione del fattore di crescita HGF in seguito alla somministrazione sottocutanea di eparina a basso peso molecolare (Low Molecular Weight Heparin -LMWH).Si vuole, inoltre, indagare l'effetto sul livello sierico dell'HGF da parte della somministrazione di LMWH a scopo profilattico anticoagulante per un mese, in quanto questo aspetto non è stato finora chiarito oltre i tre giorni di trattamento, se non in pazienti sottoposti a dialisi cronica e con terapia eparinica endovena.I risultati di questo studio porranno le basi per eventuali studi randomizzati nei quali valutare l'aggiunta di LMWH alla chemioterapia con carboplatino e paclitaxel a basse dosi nel trattamento del Tumore Maligno Epiteliale dell'Ovaio (TMEO).Disegno dello studio 6.2 Il disegno dello studio prevede una prima fase durante la quale sono stati calcolati l'area sotto la curva (area under the curve, AUC), la concentrazione massima (Cmax), la concentrazione minima (Cmin), la concentrazione media (Caverage) dell'HGF e il tempo corrispondente alla Cmax (Tmax) a seguito della somministrazione di LMWH. Queste variabili farmacocinetiche non erano state studiate approfonditamente in nessuno degli studi sul rapporto tra somministrazione di eparina e concentrazione di HGF.Nella seconda fase saranno valutati nel lungo periodo sia il livello di HGF raggiunto al Tmax (calcolato nella prima fase), sia il livello basale di HGF dopo un mese di trattamento quotidiano con LMWH. Grazie a questi dati sarà possibile identificare la corretta distribuzione nel tempo della somministrazione di LMWH durante la chemioterapia (CT) con carboplatino e paclitaxel a basse dosi.Si è deciso di arruolare le pazienti del guppo in studio partecipanti alla prima fase tra le donne sottoposte ad interventi chirurgici per patologia ginecologica pelvica benigna presso il Reparto di Ginecologia dell'Ospedale Mauriziano -Umberto I di Torino e quindi trattate a scopo profilattico anticoagulante con LMWH. I controlli sono stati scelti tra volontarie sane e tra pazienti sottoposte ad intervento chirurgico per patologia ginecologica pelvica benigna ma non trattate a scopo profilattico con LMWH (a causa della tipologia dell'intervento e dell'età).Il calcolo della numerosità del campione è stato effettuato esprimendo le ipotesi nulla (H0) ed alternativa (H1) sotto forma di variabili quantitative, con valori di α (errore di tipo I) pari a 0,05 e β (errore di tipo II) pari a 0,20, per una potenza statistica pari all'80%:  H0:-nessuna differenza tra il valore sierico di HGF nelle pazienti trattate con LMWH a scopo profilattico antitrombotico e quello nelle pazienti di controllo (non trattate con LMWH)-nessuna differenza nella singola paziente tra il valore basale di HGF sierico e il valore misurato dopo la somministrazione di LMWH  H1: differenza attesa in base agli studi precedenti (Salbach P.B. et al., 2000):differenza fra l'AUC (0-24 h) media dell'HGF dopo somministrazione diLMWH sottocute e l'AUC (0-24 h) media dell'HGF dopo somministrazione di placebo, pari a 4804 pg/ml*24h.Il disegno sperimentale prevedeva pertanto di arruolare nella fase preliminare un numero minimo di 4 pazienti nel gruppo in trattamento con LMWH e di 4 pazienti nel gruppo di controllo. Nella seconda fase si prevede di arruolare un numero minimo di 14 pazienti affette da TMEO.Sono stati individuati i seguenti criteri di inclusione: età ≥18 anni  ECOG Performance Status ≤ 1  Neutrofili ≥ 1500 μl -1 , piastrine ≥ 150000 μl -1 , creatinina 0,6-1,2 mg dl -1 , bilirubina totale ≤ 1 mg dl -1 , AST ≤ 35 U l -1 , ALT ≤ 45 U l -1 Per le pazienti arruolate nella seconda fase dello studio (in modo da poter effettuare la somministrazione di LMWH per 30 giorni dopo l'intervento):rischio moderato-alto di trombosi venosa profonda (anestesia generale > 30 minuti, laparoscopia + almeno un fattore di rischio quale un'età > 40 anni, obesità, varici venose, precedente episodio di trombosi venosa profonda e/o tromboembolia polmonare, trombofilia, neoplasia maligna, immobilità prolungata, insufficienza cardiaca congestizia)I criteri di esclusione utilizzati sono: Epatopatie gravi  Patologie renali  Diabete  Iperlipidemia  Osteoporosi marcata trattamento in corso con: terapie immunosoppressive, contraccettivi, ipolipemizzanti, antiaggreganti, recenti patologie acute infiammatorie o infettive (<3 settimane) possibili confondenti: caffeina, tabacco, etanolo (non devono essere stati assunti nelle ultime 24 ore prima del primo prelievo) elevato rischio di sanguinamento: presenza di ulcera peptica, anamnesi positiva per ictus emorragico o alterazioni della coagulazione, ipertensione arteriosa severa, aneurismi cerebrali, malformazioni arterovenose, metastasi cerebrali Diatesi emorragica  Altre neoplasie precedenti o concomitanti  Precedenti CT o RT  Gravidanza in corso o allattamentoPer ogni paziente sono stati raccolti dati riguardanti la patologia alla base del ricovero, eventuali comorbilità e la terapia farmacologica in corso. Ogni paziente, dopo essere stata dettagliatamente informata sul protocollo di studio, ha firmato un consenso informato.Alle pazienti del gruppo in trattamento con eparina sono state somministrate quotidianamente per un periodo di 7 -30 giorni (a seconda del tipo di intervento)2850 UI anti-Xa di nadroparina calcica sottocute in 0,3 ml con siringhe preriempite (Fraxiparina®, GLAXOSMITHKLINE SpA). I prelievi, durante la prima fase dello studio, sono stati fatti il giorno dopo l'intervento chirurgico dal momento dell'iniezione di eparina e per le successive 12 ore. Per effettuare i prelievi è stata posta una cannula venosa nel braccio libero dalle eventuali terapie infusionali in corso. Il sangue venoso è stato prelevato subito prima della somministrazione di LMWH e poi a distanza di 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min, 180 min, 4 ore, 5 ore, 6 ore, 8 -12 ore dalla somministrazione di nadroparina calcica.Anche nel caso dei controlli il sangue venoso è stato prelevato da una cannula venosa inserita nel braccio a partire dal mattino (del giorno dopo l'intervento per le pazienti operate) fino alla sera. La tempistica dei prelievi è stata calcolata in riferimento al prelievo basale, il quale a sua volta è stato fatto alla stessa ora del mattino in cui è stata somministrata la LMWH nelle pazienti trattate. Anche nel caso dei controlli i prelievi sono stati effettuati a distanza di 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min, 180 min, 4 ore, 5 ore, 6 ore, 8 -12 ore dal prelievo basale.I campioni di sangue sono stati raccolti in provette del tipo BD Vacutainer® senza additivi e, dopo averli lasciati coagulare, sono stati centrifugati per 10 minuti a 1500 rpm. Il siero è stato poi aliquotato in quattro parti da 150 μl l'una e immediatamente congelato a -65°C fino all'analisi di laboratorio.Le analisi per misurare la concentrazione dell'HGF nei campioni di siero sono state effettuate presso il Laboratorio di Analisi chimico-cliniche dell'Ospedale Mauriziano -Umberto I di Torino. E' stato utilizzato un kit di dosaggio basato sulla tecnica ELISA (Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay) prodotto dalla BioSource (Camarillo, California, USA). Si tratta di un kit in fase solida nel quale un anticorpo monoclonale specifico nei confronti dell'HGF umano è adeso alle pareti dei pozzetti della piastra. La linearità del dosaggio dell'HGF con questo kit è compresa tra 20 pg/ml e 8000 pg/ml. Il coefficiente di variazione intra-assay indicato dalla BioSource è minore del 6.2 % e quello inter-assay minore del 7 %. Il kit è in grado di misurare il 94% dell'HGF umano aggiunto ad un campione di siero (recovery). Le seguenti sostanze sono state testate dai produttori del kit e non si è dimostrata cross-reattività con il dosaggio: IL-1ra, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-γ, GM-CSF, OSM, MIP-1α, MIP-1β, LIF, MCP-1, TGF-β, EGF, VEGF, GRO-α, RANTES. Il valore di riferimento medio atteso su campioni di siero è di 1283 pg/ml (range 475 -3083 pg/ml).Tutte le analisi sono state effettuate in duplicato e la densità ottica è stata letta con uno spettrofotometro UV-Vis a 450 nm. La curva standard è stata ricavata a 8 punti.Oltre ai campioni sono stati analizzati un controllo positivo ed uno negativo.Le analisi farmacocinetiche e statistiche sono state effettuate presso la sezione di Medicina Nucleare del Dipartimento di Medicina Interna dell'Università di Torino con l'utilizzo dei software Kinetica 4.1.1 (InnaPhase Corp., Philadelphia, USA) ed SPSS 13.01 (SPSS Inc., Chicago, USA).La seconda fase dello studio (ancora in corso e quindi non oggetto della presente tesi) prevede l'arruolamento di pazienti affette da TMEO che devono essere sottoposte ad intervento di citoriduzione primaria e stadiazione. Verranno arruolate pazienti a moderato-alto rischio di eventi tromboembolici secondo le linee guida della settima conferenza ACCP sulla terapia antitrombotica e trombolitica esposte nel capitolo relativo all'eparina (Geerts WH et al., 2004). Le pazienti appartenenti a questo gruppo vengono trattate con LMWH a scopo profilattico anticoagulante per circa quattro settimane dopo l'intervento chirurgico. Ad ogni paziente arruolata verrà fatto un prelievo basale prima della somministrazione di LMWH ed un prelievo successivo alla somministrazione ad un tempo corrispondente al Tmax calcolato nella prima fase dello studio. Questi due prelievi saranno effettuati il giorno precedente l'intervento (alla prima somministrazione di LMWH), il giorno in cui verranno rimossi i punti e, infine, a circa un mese dai primi prelievi (in occasione della visita post-ricovero).Anche durante questa seconda fase i campioni di sangue saranno raccolti in provette del tipo BD Vacutainer® senza additivi e, dopo averli lasciati coagulare, verranno centrifugati per 10 minuti a 1500 rpm. Il siero sarà aliquotato in quattro parti da 150 μl l'una e immediatamente congelato a -65°C fino all'analisi di laboratorio.Le analisi di laboratorio e quelle statistiche verranno effettuate con le stesse modalità della prima fase.La seconda fase dello studio ha lo scopo di verificare se l'aumento di concentrazione sierica dell'HGF a seguito della somministrazione di LMWH si mantiene nel tempo ed in particolare durante e dopo un mese di terapia con nadroparina calcica nelle pazienti affette da TMEO. La differenza in termini di AUC tra pazienti trattate con eparina e controlli è risultata inferiore a quella dedotta dalla letteratura (anche perchè quest'ultima è stata calcolata su 24 ore) e quindi la numerosità campionaria è risultata troppo piccola per superare la soglia della significatività statistica.