1863년 8월 18일의 정변 후, 미부로시구미의 활약을 인정 받아 신센구미가 발족되었다. 부장의 위치에 있던 도시조는 막부에 정식으로 인정받는 낭사대가 되기 위하여 무사도에 맞는 법도를 정하고, 법도를 어길시 사도불각오에 의해 할복하도록 하였다. 그 후 그 정해진 법도에 의해 사도불각오라는 명목으로 니이미 니시키 할복하였고, 세리자와 카모 등을 암살하였다. 권력을 쥔 곤도 이사미가 국장이 되었다. 도시조는 국장 곤도 이사미의 오른팔로서 교토의 치안 유지를 위해 일했다. 신센구미는 부장 보조, 감찰 등의 직무 별로 계통적인 조직으로 발전되었다. 정점은 국장이지만 실제로 지휘명령은 부장인 도시조로부터 내려오도록 되어 있었다.

1864년 6월 5일 이케다야 사건 때에는 반대(半隊)를 이끌고 조슈 번사, 도사 번사가 빈번히 출입하는 니토라(시코쿠야) 방면을 탐색하여 돌아다녔지만, 그곳에는 아무도 없었다. 바로 이케다야의 지원을 급히 가서, 바로 돌입하지는 않고 이케다야의 주위를 포위하였으며, 그 후로부터 달려온 아이즈 번, 구와나 번의 병사를 이케다야로 들어가게 하지 않고, 신센구미 한 부대의 공을 지켰다. 아직 지위가 약했던 신센구미를 생각한 행동이었다. 도시조다운 냉정한 행동이었다. 그로 인해 이케다야 사건의 상은 파격적으로 행하여졌으며 신센구미의 이름도 천하에 퍼졌다. 거기에, 막부가 곤도를 '요리키' 상석(직위 중 하나)에, 부대를 요리키(행정, 사법, 경찰의 지위)로 임하도록 하였다. 도시조는 곤도에게 요리키보다는 다이묘(영주)를 노리기 위해, 다음 기회를 기다리도록 간언하여 설득하였고, 곤도도 이것을 받아들였다. 신센구미 내부에서는 언제나 신센구미의 규율을 대원들에게 엄수하도록 하여, 규율을 깬 대원에 대해서는 할복을 명하였고, 대원으로부터 두려움의 대상이었다. 이로 인해 신센구미 대원 사망원인 1위는 할복이었다라고 한다.

그 후, 부장이었던 야마나미 게이스케를 총장으로 삼아, 부장은 도시조 한명이 되었다. 부대에 설 자리가 없어진 야마나미 게이스케가 탈주해 할복하게 된 사건에는 야마나미와 히지카타의 대립이 있었다고 이야기되지만, 실제로는 사이가 좋았다는 설도 있다. 그 후에도 부대의 규율을 지키기 위해 가와이 기사부로, 다니 산주로, 다케다 간류사이 등을 할복 혹은 참살시켰다. 이토 가시타로가 신센구미에서 자신의 지지자들과 함께 탈퇴하여 조직한 '어릉위사(고료에지)'에 자신의 스파이인 사이토 하지메를 보내는 등을 통해 이토의 곤도 국장 암살 계획을 미연에 방지하였고, 이토, 도도 헤이스케를 암살하여 어릉위사를 파직시켰다.(아부라코지 사건)(어릉위사 및 이토, 사이토에 관한 서로 다른 학설이 있다.)
도시조의 설득으로 결국 곤도가 얻고자 결정한 직위는?
다이묘(영주) 다이묘 (영주) 영주