1474년 엔리케 4세가 죽자 후아나와 이사벨 간에 왕위계승 분쟁이 발생하였다. 후아나는 외삼촌 아폰수 5세에게 도움을 요청하였고 포르투갈의 아폰수 5세(1432~1481)는 서른 살 가까이 차이나는 후아나와 결혼하고 1475년 5월 카스티야를 침공했다. 이로써 카스티야 왕위계승전이 벌어졌다. 1476년 3월, 토로 전투에서 아폰수 5세가 패배하였으나 포르투갈의 주앙 왕자가 지원군을 이끌고 와서 양쪽은 다시 대치하였고 지리한 공방전이 지속되었다. 육상과 더불어 해상에서 벌어진 전투에서는 포르투갈에게 유리하게 진행되었다. 전쟁이 3년간 지속되자 포르투갈과 카스티야는 종전을 위해 알카소바스 조약을 맺었다. 

1479년에 체결된 알카소바스 조약에 따라 후아나는 이사벨의 아들 후안과 결혼하든가 수도원에 들어가든가 둘 중 하나를 선택해야 했다. 교황 식스토 4세로부터도 아폰수 5세와 후아나의 결혼은 근친혼이기 때문에 무효라는 결정이 내려진 상태였다. 남편과 왕위계승권을 잃은 후아나는 코임브라의 수도원에 들어갔고 이후 리스본의 상조르제성에서 머물렀다. 그녀는 죽는 날까지 자신이 쓴 편지에 여왕을 뜻하는 La Reina라는 서명을 했다고 한다.
후아나의 남편은 어디 출신인가?
포르투갈