Karine Alain

Laurent Intertaglia

Philippe Catala

Philippe Lebaron
email: philippe.lebaron@obs-banyuls.fr

Umr6197

Eudoraea adriatica gen. nov., sp. nov., a novel marine bacterium of the family Flavobacteriaceae

Keywords:

number for the 16S rDNA sequence of Eudoraea adriatica AS/06/20a T is AM745437.

) are available in IJSEM online.

A novel aerobic, non-motile, Gram-negative bacterium designated AS06/20a T , was isolated from coastal waters of the Adriatic Sea and subjected to a polyphasic taxonomic analysis. Cells were rodshaped and formed non-pigmented punctiform colonies on agar plates. The novel isolate grew heterotrophically on a variety of carbon compounds, including organic acids, carbohydrates, polyols,

amino acids and complex organic substrates. Cells grew at temperature between 15-33°C (optimum 30°C), from pH 6.5 to 8.5 (optimum 7.5-8.0) and between 2 and 6% (w/v) NaCl (optimum 2%). The dominant fatty acids (> 5%) detected in strain AS06/20a T were iso-C 15:1 G, iso-C 15:0 , iso-C 15:0 3-OH, iso-C 17:1 ω9c and iso-C 17:0 3-OH. The major respiratory quinone was MK-6. The G+C content of the genomic DNA was 38.9 mol%. Phylogenetic analyses based on 16S rRNA gene sequences showed that strain AS06/20a T fell within the family Flavobacteriaceae, in the phylum Bacteroidetes. Comparative 16S rRNA gene sequence analysis indicated that strain AS06/20a T was most closely related to the genera Zeaxanthinibacter and Robiginitalea, sharing 92 to 93% 16S rDNA sequence similarity with representatives of these genera.

It is proposed, from the polyphasic evidence, that the strain should be placed into a novel genus, Eudoraea gen. nov., with Eudoraea adriatica sp. nov. as the type species. The type strain is AS06/20a T (= DSM 19308 T = CIP 109577 T = OOB 358 T ).

Bacteria belonging to the phylum Bacteroidetes are widely distributed in nature and have been found in almost every habitat of the biosphere, the lithosphere and the hydrosphere [START_REF] Bernardet | for the Subcommittee on the taxonomy of Flavobacterium and Cytophaga-like bacteria of the International Committee on Systematics of Prokaryotes[END_REF][START_REF] Kirchman | The ecology of Cytophaga-Flavobacteria in aquatic environments[END_REF]. They seem particularly common and abundant in marine surface waters, as indicated by fluorescence in situ hybridization analyses (Glöckner, 1999;Cottrell & Kirchman, 2000a;Simon et al., 2001;[START_REF] Alonso | Incorporation of glucose under anoxic conditions by bacterioplankton from coastal North Sea surface waters[END_REF]. Cultured isolates of Bacteroidetes are all heterotrophs and especially efficient in degrading complex biomacromolecules such as protein, chitin, pectin, agar, starch and cellulose.

In marine ecosystems, the heterotrophic prokaryotes are the main consumers of dissolved organic material (DOM) and represent a very dynamic compartment in global biogochemical cycles. Uptake of DOM is the first step in the microbial loop that ultimately mineralizes over half of the organic matter formed by photosynthetic bacteria and algae [START_REF] Cole | Bacterioplanktonic production in fresh and salt-water ecosystems: a crossover view[END_REF]. Although the importance of DOM uptake is well recognized, the relative contributions of the different phylogenetic groups to DOM uptake remain to be elucidated. Because of their abundance and heterotrophic metabolism, Bacteroidetes are thought to occupy a special place in the carbon cycling of oceans. They are obviously involved in the degradation and uptake of DOM, and likely to contribute to the degradation of the high molecular weight (HMW; > 1 kDa) fraction of the DOM [START_REF] Kirchman | The ecology of Cytophaga-Flavobacteria in aquatic environments[END_REF]. Indeed, the HMW fraction is composed of biopolymers; hydrolysis of these macromolecules requires specific extracellular enzymes which are produced by numerous known Bacteroidetes members. Using a method combining microautoradiography and hybridization of fluorescent rRNA-targeted oligonucleotide probes to whole cells from natural marine assemblages (MICRO-FISH), Cottrell and Kirchman (2000b) demonstrated that Bacteroidetes represented, for the considered habitats, a large fraction of the community efficient in degrading chitin, N-acetylglucosamine and protein, part of the HMW fraction of the DOM. All these data together suggest strongly that, in marine environments, Bacteroidetes are key players in the degradation of the high molecular weight fraction of the DOM, which has been demonstrated to be more bioreactive and more bioavailable than the low molecular weight fraction [START_REF] Amon | Bacterial utilization of different size classes of dissolved organic matter[END_REF]. As relevant work on cultured representatives from marine origin is lacking, there is a great interest in isolating and describing phenotypic and genotypic characteristics of marine Bacteroidetes known only by their 16S rDNA sequence. For example, there are notably very few sequence data on enzymes catalyzing biopolymer hydrolysis [START_REF] Kirchman | The ecology of Cytophaga-Flavobacteria in aquatic environments[END_REF]. The isolation of strains is still the easiest way to access to their physiological and genomic capital. This is probably the reason why the number of strains of Bacteroidetes from marine ecosystems described the last five years has increased exponentially.

In this study, a novel marine bacterium belonging to the phylum Bacteroidetes is described. Based on the results of a polyphasic taxonomic analysis, the strain AS06/20a T represents a novel species and genus, Eudoraea adriatica gen. nov., sp. nov.

In April 2006, marine surface waters were collected on the coast of the Adriatic Sea, Italy (44.690°N, 12.520°E). One subsample collected by 10 m depth was spread on a marine agar 2216 (MA; Difco) plate, and then incubated at 25°C. After 2 weeks, a small non-pigmented colony was picked and purified by repeated streaking on MA plates. It was referenced as strain AS06/20a T . Stock cultures were stored at ─80°C in marine broth 2216 (MB; Difco) supplemented with 5% (v/v) DMSO or 35% (v/v) glycerol, until characterization.

The almost complete 16S rRNA gene (1393 bp) of the strain was double-strand sequenced from one single colony, as described elsewhere [START_REF] Agogué | A survey on bacteria inhabiting the sea surface microlayer of coastal ecosystems[END_REF]. This sequence was compared to those in available databases by use of the BLAST program [START_REF] Altschul | Basic local alignment search tool[END_REF] and then aligned to its nearest neighbours using the CLUSTALX program [START_REF] Thompson | The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[END_REF]. Alignments were refined manually using the SEAVIEW program [START_REF] Galtier | SEAVIEW and PHYLO_WIN: two graphic tools for sequence alignment and molecular phylogeny[END_REF]. Phylogenetic trees were constructed by the PHYLIP (PHYlogeny Inference Package) version 3.63 software (http://evolution.genetics.washington.edu/phylip/getme.html) on the basis of evolutionary distance (neighbour-joining method with Jukes and Cantor corrections) [START_REF] Staley | The neighbour-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees[END_REF] and maximum likelihood [START_REF] Felsenstein | Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach[END_REF]. The robustness of the inferred topologies was assessed by bootstrap analyses based on 1000 bootstrap resamplings for the neighbour-joining and 100 replications for the maximum likelihood method [START_REF] Felsenstein | Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap[END_REF]. The 16S rRNA gene-based analysis located the strain AS06/20a T within the phylum Bacteroidetes. The novel isolate was affiliated to the family Flavobacteriaceae, one of the main phyletic lines of the phylum Bacteroidetes [START_REF] Reichenbach | Order I. Cytophagales leadbetter 1974[END_REF][START_REF] Bernardet | Cutting a Gordian knot: emended classification and description of the genus Flavobacterium, emended description of the family Flavobacteriaceae, and proposal of Flavobacterium hydratis nom. nov. (basonym, Cytophaga aquatilis Strohl and Trait 1978)[END_REF][START_REF] Bernardet | for the Subcommittee on the taxonomy of Flavobacterium and Cytophaga-like bacteria of the International Committee on Systematics of Prokaryotes[END_REF] (Fig. 1). The results of different phylogenetic reconstructions performed with different treeing algorithms were in accordance with each other. The novel isolate formed a distinct lineage together with Zeaxanthinibacter enoshimensis TD-ZE 3 T and Robiginitalea biformata HTCC 2501 T , but this lineage did not cluster robustly with any of the recognized genera in the family. Within this lineage, the novel isolate showed only a distant relatedness to its nearest phylogenetic neighbours, the most closely genus being Zeaxanthinibacter (93% 16S rDNA sequence similarity), followed by Robiginitalea (92%). These low 16S rDNA sequence similarities between the strain AS06/20a T and the genera described so far suggest that the novel isolate represents a new genus within the family Flavobacteriaceae.

The DNA G+C content was determined, by the Identification Service of the DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany), by HPLC analysis of deoxyribonucleosides as described by [START_REF] Mesbah | Precise measurement of the G+C content of deoxyribonucleic acid by high performance liquid chromatography[END_REF]. The G+C content of strain 26III/A02/215 T was 38.9 mol%.

Colonies on MA were non-pigmented and cream in colour. They were circular, punctiform, opaque, with an entire edge and possessed a smooth surface. After 1 week incubation, colonies were less than 1 mm in diameter. Morphological characteristics of the cells were determined by light microscopy (Olympus AX70)

and by transmission electron microscopy (Hitachi H-7500) after negative staining with uranyl acetate [START_REF] Raguénès | Vibrio diabolicus sp. nov., a new polysaccharide-secreting organism isolated from a deep-sea hydrothermal vent polychaete annelid, Alvinella pompejana[END_REF]. Gram-staining was determined using standard procedures. Gliding motility was determined using the hanging drop method on cells grown at 30°C in low nutrient medium (0.1% (w/v) marine broth solidified with 1% agar), as described in [START_REF] Bernardet | for the Subcommittee on the taxonomy of Flavobacterium and Cytophaga-like bacteria of the International Committee on Systematics of Prokaryotes[END_REF]. In summary, cells of strain AS06/20a T were Gram-negative, non-motile, straight rods of 1.48-2.99 µm in length (mean 2.22 ± 0.54 µm, n=8) and 0.61-0.78 µm in width (mean 0.70 ± 0.07 µm, n=8) in the mid-exponential phase of growth (see Supplementary Fig. S1 in IJSEM online). Gliding motility was not observed under the conditions tested.

Cells swell into balloon-like shapes during the late stationary growth phase.

In order to analyse respiratory quinones and polar lipids, strain AS06/20a T was grown for 5 days on MB medium at 30°C, and checked for purity. Analyses of isoprenoid quinones and polar lipids were carried out by the Identification Service (Dr. Brian Tindall, DSMZ culture collection, Braunschweig, Germany). As described for the other members of the family Flavobacteriaceae, the main respiratory quinone was menaquinone 6 (MK-6; 83%) [START_REF] Bernardet | for the Subcommittee on the taxonomy of Flavobacterium and Cytophaga-like bacteria of the International Committee on Systematics of Prokaryotes[END_REF]; Menaquinone 7 was also detected (MK-7; 17%).

Phosphatidylethanolamine was the only major phospholipid identified in strain AS06/20a T . Three other major unidentified polar lipids, two containing amino groups, were also present.

The determination of the whole-cell fatty acid composition was performed on cultures grown at 30°C for 72h on marine agar 2216. This analysis was carried out at the DSMZ according to the standard protocol of the Microbial Identification System (MIDI Inc., Del. USA, 2001). Extracts were analysed using a Hewlett

Packard model HP6890A gas chromatograph equipped with a flame-ionization detector as described by [START_REF] Kämpfer | Numerical analysis of fatty acid patterns of coryneform bacteria and related taxa[END_REF]. Results are summarized in Table 1. The dominant fatty acids in strain AS0620a T were iso-C 15:1 G, iso-C 15:0 , iso-C 15:0 3-OH, iso-C 17:1 ω9c, iso-C 17:0 3-OH and the fatty acids summed in feature 3.

Unless stated otherwise, physiological characterization was carried out aerobically in marine broth medium (MB 2216;Difco), in triplicate, and incubation were done in the dark and under agitation. Growth was routinely monitored by measuring the increase in optical density at 600 nm using a spectrophotometer. Cell numbers were determined by flow cytometry in order to calculate calibration curves 'Cell numbers = f(OD 600 )'. Growth rates were calculated using linear regression analysis of four to nine points along the logarithmic portions of the resulting growth curves. Growth temperature was tested over the range 9-44°C (i.e. 9, 15, 20, 25, 30, 33, 37, 44°C). The temperature range for growth was 15-33°C, with optimum growth rate at 30°C (see Supplementary Fig. S2a in IJSEM online). No growth was observed at 9 and 37°C. The pH range for growth was tested at 30°C in MB medium, buffered and adjusted to the required pH as described elsewhere [START_REF] Alain | Caminibacter hydrogeniphilus gen. nov., sp. nov., a novel thermophilic, hydrogen-oxidizing bacterium isolated from an East Pacific Rise hydrothermal vent[END_REF]. The pH range for growth was rather narrow (Fig. S2b); Growth was observed from pH 6.5 to pH 8.5, the optimum being around pH 7.5-8.0. Salt tolerance was tested at 30°C in MB medium prepared with various concentrations of NaCl (0.02, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 9% w/v). The isolate required NaCl for growth (Fig. S2c). This is congruent with the fact that this strain was isolated from brackish waters of the North Adriatic Sea. Growth was observed at salt concentrations ranging from 2 to 6% (w/v) NaCl, the optimum salinity being around 2%. No growth was observed at 1 and 7% (w/v) NaCl.

Strain AS06/20a T was found to be aerobic. Conventional phenotypic tests including those for oxidase, catalase, tween esterase and nitrate reductase were performed according to standard methods [START_REF] Smibert | Phenotypic characterization[END_REF]. The results are given in Table 1. Biochemical tests were performed at 30°C using api®ZYM (bioMérieux) and Biolog GN2 microplates (Oxoid). These tests were inoculated with cells grown on MA plates, swabbed from the surface of the agar plates and then suspended in ASW ½ (diluted artificial seawater) to the density specified by the manufacturer. Supplementary biochemical tests were also performed using api®20NE strips (bioMérieux), following the manufacturer's instructions. The data obtained are given in Table 1. Testing for oxidation of carbon sources with Biolog GN2 plates indicated that the strain was able to oxidize a range of sugars, organic acids and amino acids. To confirm these results and to test for the capability of the strain to catabolize different substrates as sole carbon and energy source, with oxygen as a terminal electron acceptor, the strain was grown aerobically, in the dark, on a mineral medium supplemented with one substrate. The defined medium had the following composition (l ─1 ): phosphate buffer, 30 mM; NaCl 20 g, MgCl 2 .6H 2 O 3 g, CaCl 2 .2H 2 O 1.0 g, NH 4 Cl 0.3 g, KCl 0.5 g, Na 2 SO 4 3 g, NaNO 3

1 g; trace element solution, 1 ml; selenite-tungstate solution, 1 ml; vitamin solution, 1 ml. The strain was found to grow chemoorganoheterotrophically on a variety of carbon compounds, including pentoses, hexoses, polyols, organic acids, amino acids and complex organic substrates (Table 1).

Antibiotic sensitivity tests were performed by using susceptibility discs (Biorad) or filter-paper discs impregnated with different antibiotics. Discs were placed on MA plates spread with a culture of the isolate and were then incubated at 30°C for one week. Susceptibility was scored as positive at zone diameters above 10 mm. The results are summarized in Table 1.

The phenotypic and genotypic characteristics of the novel isolate generally met the minimal standards for the family Flavobacteriaceae [START_REF] Bernardet | for the Subcommittee on the taxonomy of Flavobacterium and Cytophaga-like bacteria of the International Committee on Systematics of Prokaryotes[END_REF]. Nevertheless, strain AS06/20a T differed from other Flavobacteriaceae genera, with validly published names, in terms of a number of phylogenetic, genotypic, chemotaxonomic, morphological and physiological features (Table 2). In brief, in addition to the phylogenetic distance, the novel taxon can be distinguished from its closest relatives by some of its phenotypic features, including its absence of colonial pigmentation, the narrow NaCl and pH ranges for growth and its restricted degrading-capabilities regarding to the tested macromolecules. In addition to these phenotypic differences, the novel isolate is unambiguously distinct from its two closest neighbours by its genomic DNA G+C content which is more than 5% lower than those of Zeaxanthinibacter enoshimensis and Robiginitalea biformata. In conclusion, in view of all the above-mentioned distinctive features, we propose that the isolate AS06/20a T should be assigned as the type strain of a novel genus and species, for which the name Eudoraea adriatica gen. nov., sp. nov. is proposed.

Description of Eudoraea gen. nov.

Eudoraea (N. L. fem. n. Eudora was a sea goddess of the Greek mythology; N. L. fem. n. Eudoraea, named after Eudora).

Cells are Gram-negative, non-spore forming, non-motile, non-gliding rods. Pigments are not produced. Aerobic and chemoorganoheterotrophic. Catalase-and oxidase-positive. Mesophilic. Neutrophilic. Requires NaCl for growth. The predominant quinone is MK-6. Polar lipids include phosphatidylethanolamine. Major fatty acids are iso-C 15:1 G, iso-C 15:0 , iso-C 15:0 3-OH, iso-C 17:1 ω9c, iso-C 17:0 3-OH and summed feature 3. The G+C content of the DNA is close to 39 mol%. Phylogenetically, the genus Eudoraea belongs to the phylum Bacteroidetes, family Flavobacteriaceae, showing a distant relatedness to the marine genera Zeaxanthinibacter and Robiginitalea. The type species is Eudoraea adriatica.

Description of Eudoraea adriatica sp. nov.

Eudoraea adriatica (a.dri.a'ti'ca. L. fem. adj. adriatica, of the Adriatic Sea, where the type strain was isolated). In addition to the characters described for the genus, the following properties apply. Colonies on MA medium are punctiform, cream in colour, opaque and smooth. Optimal growth occurs at 30°C, with a growth range from 15 to 33°C.

The pH and NaCl ranges are 6.5-8.5 (optimum 7.5-8.0) and 2-6% (w/v) (optimum, 2% w/v NaCl), respectively.

Aesculin is hydrolysed but agar, cellulose, gelatin, starch and urea are not. β-galactosidase activity is positive. Glucose is not fermented. Nitrate is not reduced. A variety of carbon compounds are used as sole carbon sources, including pentoses, hexoses, polyols, organic acids, amino acids and complex substrates (Table 1). The G+C content of the type strain AS06/20a T is 38.9 mol%.

The type strain, AS06/20a T (DSM 19308 T , CIP 109577 T , OOB 358 T ), was isolated from coastal waters of the Adriatic Sea, Italy (44.690°N, 12.520°E). 38.9 § , Summed feature 3 comprises iso-C 15:0 2-OH and/or C 16:1 ω7c. * Fatty acids comprising more than 5% of the total content are listed. The following fatty acids were present in lesser amounts: iso-C 13:0 (0.48%), C 14:0 (0.17%), anteiso-C 15:0 (0.72%), C 15:1 ω6c (1.06%), iso-C 16:0 (0.25%), C 16:0 (0.67%), C 15:0 2-OH (0.30%), C 15:0 3-OH (1.33%), iso-C 17:0 (0.17%), C 17:1 ω8c (0.48%), C 17:1 ω6c (0.83%), iso-C 16:0 3-OH (1.38%), C 16:0 3-OH (0.37%), C 18:1 ω5c (0.70%), C 17:0 3-OH (0.20%) and three unknown fatty acids designated by their equivalent chain-length [ECL 11.54

TABLES and FIGURES

Fig. 1 .

 1 Fig. 1. Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of strain AS06/20a T and representative members of related genera within the family Flavobacteriaceae. Sequence data of reference strains were obtained from the GenBank/EMBL and/or RDP databases. Accession numbers are indicated in parentheses. The topology shown corresponds to an unrooted tree obtained by the maximum likelihood algorithm, established using the PHYLIP package. Bootstrap values (from 100 replicates) are indicated at the branch nodes. The positioning of the novel isolate was confirmed by the neighbour-joining method. The scale bar indicates 2.0 nt substitutions per 100 nt.

Fig. S1 .

 S1 Fig. S1. Transmission electron micrograph of cells of strain AS06/20a T in a state of division. Cells were grown at 30°C on marine broth and harvested during the mid-exponential phase of growth. The preparation was negatively stained with uranyl acetate. Bar, 0.5 µm.

Fig

  Fig. S2. Effects of temperature (A), pH (B) and salinity (C) on the maximum growth rate of strain AS06/20a T . Bars indicate confidence intervals.

Table 1 . Phenotypic and genotypic characteristics of strain AS06/20a T .

 1

	Legend: +, positive; ─, negative; PE, phosphatidylethanolamine; L, unidentified, polar lipid; AL,
	unidentified aminolipid.
	Characteristic					Eudoraea adriatica strain AS06/20a T
	Temperature range for growth (°C) [optimum]		15-33 [30]
	NaCl range for growth (%) [optimum]			2-6 [2]
	pH range for growth [optimum]			6.5-8.5 [7.5-8.0]
	Biochemical properties (API 20NE)
	Catalase, oxidase, aesculin hydrolysis, β-galactosidase production	+
	Denitrification, indole production, glucose fermentation, arginine	─
	dihydrolase, urease, gelatin hydrolysis
	Enzymatic activities (APIZYM)
	Alkaline phosphatase, esterase (C4), esterase lipase (C8), valine	+
	arylamidase,	leucine	arylamidase,	α-chymotrypsin,	acid
	phosphatase, naphthol-AS-BI-phosphohydrolase, β-galactosidase, β-
	glucosidase, N-acetyl-β-glucosaminidase, α-mannosidase
	Lipase (C14), cystine arylamidase, trypsin, α-galactosidase, α-	─
	glucosidase, α-fucosidase
	Substrate assimilation
	D-glucose, L-arabinose, D-mannose, D-mannitol, N-acetyl-	+
	glucosamine, potassium gluconate, m-inositol, acetic acid, citric
	acid, pyruvic acid, propionic acid, capric acid, adipic acid, malic
	acid, phenylacetic acid, L-arginine, yeast extract
	Formic acid, tween 40, tween 80, D-maltose			─
	Degradation of macromolecules
	Aesculin					+
	Agar, cellulose (filter paper), gelatin, starch, urea		─
	Susceptibility to antibiotics
	Vancomycin, rifampicin, tetracycline, polymyxin B		+
	Oxacillin, penicillin, ciprofloxacin			─
	Fatty acid composition (%)*			iso-C 15:1 G (15.97%), iso-C 15:0 (29.37%),
						iso-C 15:0 3-OH (7.27%), iso-C 17:1 ω9c
						(8.96%), iso-C 17:0 3-OH (14.13%) and summed feature 3 § (11.57%).
	Polar lipids					PE, L, AL1, AL2
	Quinones					MK-6 (83%), MK-7 (17%)
	DNA

G+C content (mol%)

  (0.21%), ECL 13.56 (2.26%) and ECL 16.58 (1.15%)].

Table 2 . Characteristics differentiating Eudoraea from related genera of the family Flavobacteriaceae.

 2 Robiginitalea biformata HTCC 2501 T ; 4, Pibocella ponti KMM 6031 T ; 5, Maribacter sedimenticola KMM 3903 T ; 6, Zobellia galactanivorans Dsij T ; 7, Arenibacter latericius KMM 426 T ; 8, Sediminicola luteus CNI-3 T .Legend: +, positive; ─, negative; ND, not determined; Y, yellow; O, orange; DO, dark orange; w, weak. The percentage of 16S rDNA sequence similarity is calculated in reference to the 16S rDNA sequence of the novel isolate AS06/20a T .

	Genera: 1, Eudoraea adriatica AS06/20a T (this study); 2, Zeaxanthinibacter enoshimensis TD-ZE 3	T ; 3,
	Characteristic	1	2	3	4	5	6	7	8
	Oxidase/catalase	+/+	+/+	+/+	+/+	+/+	+/+	+/+	+/ w
	Pigmentation	─	Y	O	Y	Y	Y	DO	Y
	Flexirubin	─	─	─	─	─	+	─	─
	pigments
	Gliding motility	─	+	─	+	+	+	─	─
	Growth in/at
	8% NaCl	─	─	+	+	+	─	─	─
	7% NaCl	─	+	+	+	─	─	+	+
	1% NaCl	─	ND	+	+	+	+	+	+
	4°C	─	─	─	+	+	─	─	─
	10°C	─	─	+	+	+	─	+	+
	42°C	─	─	+	─	─	+	─	─
	Hydrolysis of
	Agar	─	─	ND	─	+	+	─	ND
	Gelatin	─	+	─	+	+	+	─	+
	Starch	─	+	+	+	─	+	─	+
	Cellulose	─	─	─	─	─	ND	─	─
	Aesculin	+	+	+	ND	ND	+	─	ND
	Urease activity	─	─	─	─	─	─	+	─
	β-galactosidase	+	+	─	ND	─	+	+	ND
	Nitrate reduction	─	─	─	─	─	+	+	+
	DNA G+C content	38.9	46.5	56.4	35.5	37	43	37-38	38
	(mol%)
	16S rDNA	100	93	92	90	91	91	91	90
	similarity (%)

ACKNOWLEDGEMENTS

We thank Marie-Line Escande for assistance with the transmission electron microscopy. We acknowledge Prof. J. P. Euzéby for support in the Latin etymologies of the genus and species names. This work was financially supported by the Equipe Mixte de Recherche linking the University Pierre et Marie Curie and the Centre National de la Recherche Scientifique to the Pierre Fabre Laboratories. The project was also carried out in the frame of the MarBEF Network of Excellence 'Marine Biodiversity and Ecosystem Functioning' which is funded by the Sustainable Development, Global Change and Ecosystems Program of the European Community's Sixth Framework Program (contract no. GOCE-CT-2003-505446). This publication is contribution number MPS-07060 of MarBEF. It was also partly funded by the French program 'Biodiversité et Changement Global -project: development of a coastal microbial observatory' from the 'Institut Français de la Biodiversité'.

The GenBank/EMBL/DDBJ accession


Patrick Albéric
email: patrick.alberic@univ-orleans.fr

Les trois pertes-émergences (ou inversacs) du domaine de la Source (Loiret)

I. INTRODUCTION

Le val d'Orléans combine des caractéristiques fluviales évidentes à un fonctionnement karstique. Les cours d'eau de surface contribuent de manière importante à la recharge de l'aquifère. D'abord, en amont d'Orléans, au contact du lit de la Loire dont les pertes de débit enregistrées à partir de Sully sur Loire (http://www2.centre.ecologie.gouv.fr/SIEL) témoignent de l'importance du phénomène. En second, au niveau des petits cours d'eau drainant le val, la forêt d'Orléans ou la Sologne, à leur passage des terrains imperméables aux calcaires. Les principaux points d'émergence d'eau souterraine du système sont eux-mêmes directement influencés par le régime des eaux de surface, soit qu'ils se situent dans le lit même du fleuve (en aval d'Orléans) ou d'autres cours d'eau comme le Dhuy ou le Loiret, soit qu'ils se trouvent temporairement submergés par les écoulements de surface. Ces caractéristiques peuvent entrainer une variabilité importante du système à différentes échelles; à court terme ainsi que de manière saisonnière en fonction de la pluviométrie locale et du régime de la Loire, mais aussi à plus long terme par exemple en fonction de l'évolution de l'enfoncement du lit de la Loire. Dans les systèmes fluvio-karstiques, jugés instables, de petites variations du partage entre écoulement de surface et écoulement souterrain, diffus ou canalisés, sont tenues pour responsables de modifications géomorphologiques importantes et durables [START_REF] Phillips | Flow partitioning and unstable divergence in fluviokarst evolution in central Kentucky[END_REF]. Cet article, écrit à l'occasion du colloque tenu à la mémoire de Michel Lepiller, retrace différents travaux récents sur le fonctionnement des sources karstiques situées dans l'enceinte de l'ancien domaine de la Source, et connues comme la (les) source(s) de la rivière Loiret.

Situés dans un territoire profondément modelé par l'homme, les points d'émergence des sources du Loiret et le cours du Loiret lui même ont été à plusieurs reprises aménagés, particulièrement en ce qui concerne la relation entre écoulement de surface et émergence d'eau souterraine. Les documents les plus instructifs à ce sujet sont sans doute l'article rédigé en 1736 par l'abbé de Fontenu et les plans de Beaurain réalisés en 1739 et publiés ensemble dans les Mémoires de l'Académie Royale des Inscriptions et Belles Lettres [START_REF]Fontenu abbé de, 1736 -Réflexions historiques sur le Loiret[END_REF]. Le point important concerne l'écartement progressif du cours du Dhuy des points d'émergence karstique donnant naissance au Loiret (Figure 1). Outre l'attrait architectural apporté par ces aménagements, l'isolement des points d'émergence a créé des conditions privilégiées pour le prélèvement et accessoirement l'analyse des eaux résurgentes! Au début des années 90, de nouvelles campagnes de prélèvement avec un pas de temps plus court et ciblant un suivi des crues de Loire ont permis de montrer que c'était plutôt la totalité de la masse d'eau qui circulait rapidement en 3 jours, témoignant de l'importance de la karstification du système [START_REF] Albéric | Oxydation de la matière organique dans un système hydrologique karstique alimenté par des pertes fluviales (Loiret, France)[END_REF]. La Figure 3 présente la variation en chlorure des eaux de Loire et du Bouillon lors d'une crue suivie en 1993. La diminution des teneurs en Cl -avec la crue constitue un traçage naturel de l'ensemble de la mase d'eau du fleuve. On a pu constater qu'à partir d'une situation quasi stationnaire avant la crue (teneurs égales en Loire et au Bouillon), le transfert de la diminution de la teneur en Cl-se faisait avec un décalage de 3 jours à la résurgence, concordant donc avec les traçages artificiels. Ce résultat nouveau a permis de considérer le système hydrogéologique du val d'Orléans comme un réacteur biogéochimique fonctionnant sur 3 jours, dont on pouvait connaitre facilement (en période de faible impact de l'impluvium local) les concentrations des composés entrant (Loire) et sortant (résurgence du Bouillon). Il a ainsi été possible de montrer que les processus de dégradation de la matière organique apportée par les eaux de Loire pouvaient expliquer quantitativement la dissolution du calcaire dans l'aquifère (17; 18; 19). Cependant, en période de forte contribution des précipitations locales par infiltration diffuse ou par perte des ruisseaux drainant les eaux de ruissellement du val, la contribution d'au moins un troisième pôle chimique ne permet plus d'équilibrer facilement les bilans de matière. Le fonctionnement alternativement émissif ou absorbant des cavités du Bouillon, de l'Abîme et (anciennement) du Gouffre en font d'un point de vue terminologique des pertes-émergences ou bien encore des inversacs selon Gèze [START_REF] Gèze | Les mésaventures des sources de l'Estavelle et de l'Inversac en Languedoc méditerranéen[END_REF].

Si la disposition actuelle du Dhuy et du Loiret peut rendre surprenant le fonctionnement absorbant des cavités, le cours ancien naturel du Dhuy à l'aplomb des points d'émergence du Bouillon et de l'Abîme (Figure 1) autorise dans le passé leur fonctionnement beaucoup plus fréquent en perte, comme c'était le cas de la source du Gouffre avant son colmatage. Marboutin dans son rapport de 1902 conseille fortement de renforcer son isolement et même de détourner le fossé du Dhuy afin de protéger les eaux pompées au puits du Gouffre des pollutions absorbées avec les eaux du ruisseau [START_REF] Marboutin | Rapport sur les eaux de la ville d'Orléans[END_REF]. En ce qui concerne le fonctionnement ancien de la cavité du Bouillon, les dépôts de près d'un mètre d'épaisseur de sédiments argileux intercalés de lits de feuilles et disposés en banquette à l'entrée du conduit principal, témoignent de périodes d'absorption intense des eaux de surface. Deux lits de feuilles extraits d'une carotte prélevée en plongée (Figure 4) ont respectivement été datés à 1540 et 1610 BP (âges 14 C conventionnels). La vasque du Bouillon qui habituellement est un lieu important de résurgence des eaux de Loire infiltrées en amont d'Orléans, se transforme temporairement en une perte des eaux limoneuses du Dhuy. Un tel mode de fonctionnement porte le nom d'inversac.

Un épisode de ce type s'est déroulé du 12 au 13 décembre 1997 et a permis l'injection de 500 grammes de fluorescéine. Un autre épisode (apparemment de plus grande intensité) avait déjà été observé et relaté par la presse, la première semaine de juillet de la même année.

Bien qu'une masse importante du traceur injecté ait reflué de la source quelques heures seulement après l'injection, suite au rétablissement du sens d'écoulement normal des eaux, une quantité suffisante a été entraînée par la circulation souterraine pour donner lieu à des restitutions de traceur aux quatre points de résurgence surveillés. L'installation de préleveurs automatiques aux résurgences de Saint Avit et de la Pie a permis l'établissement de courbes complètes de restitution. On note l'arrivée du traceur un jour et six heures environ après le moment de l'injection, cela aussi bien à la fontaine de Saint Avit qu'aux sources de la Pie pourtant distantes de près de quatre kilomètres. Les concentrations maximales de traceur sont observées six heures après, soit un jour et demi après l'injection.

Les deux résurgences des Moulins de la Mothe et des Béchets ont également restitué une partie du traceur, mais l'espacement des prélèvements manuels n'a pas permis dans ce cas de suivre complètement la restitution.

Le premier résultat de ce traçage est de confirmer l'existence de liens de circulation souterraine directe entre la Source du Loiret au Bouillon d'une part et la Fontaine de Saint Avit et les sources de la Pie d'autre part, situées respectivement 5 et 8 km à l'ouest de la source du Bouillon. La simultanéité des restitutions à St Avit et à la Pie laisse penser que ces liens puissent être séparés, au moins sur une partie du trajet conduisant à St Avit. La vitesse de circulation des eaux serait dans ce cas supérieure dans la partie du drain conduisant aux sources de la Pie. Il faut noter aussi le peu de différences de concentration du traceur dans les eaux des deux résurgences, ce qui peut indiquer que les deux voies de circulation souterraines envisagées, n'offrent pas des conditions de mélange, avec d'autres types d'eaux, qui soient différentes l'une de l'autre.

Ces observations doivent par ailleurs faire comprendre la vulnérabilité de la qualité des eaux de résurgence et de captage du Val d'Orléans pendant les épisodes de fonctionnement de la source du Loiret en perte des eaux du Dhuy.

Figure 1 :

 1 Figure 1: Plans de Beaurain, In Abbé de Fontenu 1736. Réflexions historiques sur le Loiret. Mémoires de l'Académie Royale des Inscriptions et Belles Lettres, Tome XII, 153-163.

Figure 4 :Figure 5 :

 45 Figure 4: Description de la carotte de 35 cm prélevée en plongée le 25/11/2001 dans les banquettes de sédiment argileux situées au passage du conduit principal aux étroitures menant au porche d'entrée. L'analyse radiométrique des lits de feuilles (datations Beta Analytic Inc.) donne les âges conventionnels suivants: 1540 BP pour le niveau supérieur (A) et 1610 BP pour le niveau inférieur (B).

Figure 6

 6 Figure 6 République du centre, 13 février 1998

  années, seule la source amont du Loiret dite le "Bouillon" était demeurée active. Suite aux efforts de l'association Spéléologie Subaquatique Loiret et de son président Philippe Boismoreau la désobstruction du point d'émergence des conduits karstiques aboutissant à la source de l'Abîme a permis de réactiver la source historique (appelée Grande Source au XVIII ème siècle) située dans le cours du Loiret au pied du château.Dès 1736 (2), l'hypothèse d'une relation étroite entre la Loire et les sources du Loiret avait été formulée et même ensuite fortement étayée (4; 9). Ce n'est qu'à partir du début du XX ème siècle que les traçages artificiels, relatés dans plusieurs travaux particuliers ou de synthèse sur les sources du Loiret et l'hydrogéologie du val d'Orléans(10; 11; 12; 13; 14; 15), ont permis d'établir puis de préciser les liens entre les cours d'eau de surface (Loire principalement, mais également ruisseau de l'Anche) et les résurgences, sources du Loiret. Ces expérimentations ont permis de déterminer qu'environ 3 jours pouvaient suffire aux eaux perdues vers Jargeau pour atteindre le Bouillon.Après le décès accidentel de Michel Lepiller, le transfert dans le Val d'Orléans de l'école de traçage qu'il avait mis en place pour les élèves de Polytech Orléans dans le massif des Bauges (Savoie), a donné lieu à des opérations annuelles de traçage entre Jargeau et les résurgences qui perpétuent la transmission de l'état de l'art, et continuent à faire progresser la connaissance du système[START_REF] Joodi | Tests for modelling the unsteady behaviour of a karstic aquifer[END_REF].

	La troisième source, dite du Gouffre, mentionnée par les auteurs dès la fin du XVIII ème siècle
	(3) jusqu'à la fin du XIX ème siècle (4; 5) mais apparemment absente des plans et cartes datant
	de la première moitié du XVIII ème siècle (Beaurain, Cassini) se situait sur le bord du fossé du
	Dhuy en face de l'actuel captage AEP du puits du Gouffre, mis en service par la ville
	d'Orléans en 1876 (6). Cette troisième source dite du Gouffre, colmatée vers 1879 (5), devait
	correspondre à un effondrement des berges du fossé du Dhuy à l'aplomb d'un conduit
	karstique exploité ensuite par la prise d'eau du puits du Gouffre. Les descriptions faites du
	fonctionnement alternativement émissif ou absorbant de cette cavité (4; 6; 5) correspondent
	étroitement aux observations qui seront faites à partir de 1997 à la source du Bouillon puis à
	l'Abîme (7; 8).
		16				3
		14				2.5
	Chlorure (mg/L)	10 12				1.5 2	hauteur Loire (m)
		8				1
		6				0.5
		9/4/01	19/4/01	29/4/01	9/5/01	19/5/01

Bien que l'exploration spéléologique indique que ces trois points d'émergence (Bouillon, Abîme, Gouffre) correspondent à des regards accédant à des conduits karstiques différents, les prélèvements d'eau effectués aux trois points montrent une composition chimique unique au moins en ce qui concerne les éléments majeurs et le carbone organique dissous. La variation de leur teneur en chlorure lors d'une crue de la Loire est illustrée Figure

2

. La répercussion identique (en concentration et dans le temps) de la diminution des teneurs en Cl -aux trois sources indique l'origine commune des eaux. Au contraire, les sources situées plus en aval sur le cours du Loiret (Rigouillarde, St Avit, La Pie) présentent des teneurs légèrement différentes qui témoignent d'un mélange plus important entre les eaux de Loire et un ou plusieurs autres pôles.

Loire Bouillon -Abîme -Gouffre Rigouillarde -St Avit -La Pie Figure 2: Variation des teneurs en chlorure de la Loire et des sources du val d'Orléans lors d'une crue de la Loire. Bouillon, Abîme et Gouffre présentent des concentrations identiques et plus proches de celles de la Loire que le second groupe (Rigouillarde, St Avit, la Pie).

III. RELATIONS LOIRE -SOURCES DU LOIRET

Les relations hydrochimiques entre les eaux de Loire et les résurgences ont été particulièrement étudiées par Chéry

[START_REF] Chéry | Etude hydrochimique d'un aquifère karstique alimenté par perte de cours d'eau (la Loire): Le système des calcaires de Beauce sous le val d'Orléans[END_REF]

. La comparaison entre les teneurs en éléments majeurs de la Loire et des sources du Bouillon et de la Pie en fonction des cycles hydrologiques permet d'apprécier les similitudes (Na, K, Cl) et les différences (O 2 dissous, pH, Ca) entre les différentes eaux. Sur ces bases, un temps de transit moyen des masses d'eau entre la Loire et les résurgences de plusieurs semaines avait été envisagé pour tenir compte des différences probables de vitesse des eaux circulant grâce à la perméabilité moyenne de l'aquifère ou par les conduits majeurs nécessairement privilégiés par les traçages artificiels.


Patrick Albéric

Aline Fiala-Médioni

Jacques Boulègue

Acide diaminopimélique libre des bivalves symbiotiques Free diaminopimelic acid in symbiotic bivalves

Keywords: acide diaminopimélique, bivalves symbiotiques diaminopimelic acid, symbiotic bivalves

titre courant: Acide aminé

L'importance des relations symbiotiques entre bactéries chimiolithotrophes et invertébrés est une caractéristique essentielle des écosystèmes marins liés aux émergences hydrothermales ou aux suintements froids [START_REF] Jannasch | Geomicrobiology of deep-sea hydrothermal vents[END_REF][START_REF] Fiala-Médioni | Autotrophic processes in invertebrates nutrition: bacterial symbiosis in bivalve molluscs[END_REF]. Une place importante y est souvent occupée par des bivalves de grande taille [START_REF] Hessler | distribution and community structure and megafauna at the Galapagos Rift hydrothermal vents[END_REF][START_REF] Sibuet | Cold-seep benthic communities in the Japan subduction zones: geological control of community development[END_REF], chez qui les endosymbiontes bactériens sont localisés dans les branchies [START_REF] Cavanaugh | Symbiotic chemoautotrophic bacteria in marine invertebrates from sulphide-rich habitats[END_REF][START_REF] Fiala-Médioni | Mise en évidence par microscopie électronique à transmission de l'abondance de bactéries symbiotiques dans la branchie de Mollusques bivalves de sources hydrothermales profondes[END_REF][START_REF] Boulègue | Geochemical and biogeochemical observatios on the biological communities associated with fluid venting in Nankai Trough and Japan Trench subduction zones[END_REF]. Des composés aminés très singuliers (soufrés ou phosphorylés), probablement en relation avec l'état symbiotique des bivalves, ont été signalés dans les tissus de Calyptogena [START_REF] Albéric | Unusual compounds in the tissues of Calyptogena phaseoliformis (Japan Trench): possible link to symbiosis[END_REF]. Le pool d'acides aminés libres extrait des tissus révèle également la présence d'un composé typiquement bactérien (l'acide diaminopimélique) dont la teneur chez plusieurs espèces du genre Calyptogena et chez Bathymodiolus thermophilus fait l'objet de cette note.

Matériels et méthodes

Les spécimens de C. magnifica et B. thermophilus ont été récoltés sur deux sites hydrothermaux des Galapagos : "Rose Garden" et "Mussel Bed" entre 2450 et 2500 m de profondeur. Les spécimens de C. phaseoliformis ont été récoltés par 4000 m de profondeur dans le fosse du Japon (programme Kaiko) et ceux de C. sp. au niveau du prisme d'accrétion de la Barbade. Les tissus ont été disséqués et congelés à bord puis lyophilisés.

Acides aminés libres dans les tissus

La fraction soluble dans l'éthanol à 70% a été extraite au broyeur de Potter à 0°C, à partir d'environ 10 mg de tissus. L'extrait est ensuite successivement filtré, porté à sec, repris par 1 ml de tampon (citrate de Na) à pH 2 et filtré à nouveau avant d'être analysé (autoanalyseur Beckman 118 BL, détection à la ninhydrine à 570 et 440 nm). Pour l'acide diaminopimélique (élution entre valine et méthionine), le rapport des absorbances à 570 et 440 nm (4 pour ce composé et normalement 10 pour la plupart des autres acides aminés) permet de conforter la détermination qui ordinairement repose sur la comparaison des temps de rétention avec ceux des témoins. Cependant, compte-tenu de l'abondance des composés peu communs déjà rencontrés dans ce type d'extrait [START_REF] Albéric | Unusual compounds in the tissues of Calyptogena phaseoliformis (Japan Trench): possible link to symbiosis[END_REF] et des informations spécifiques pouvant être attachées à la présence de l'acide diaminopimélique, la détermination a été confirmée par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse (GC-MS) de la fraction correspondante, recueillie en sortie de la colonne de l'analyseur d'acides aminés. Après élimination du citrate de sodium (par passage sur une résine échangeuse de cations Dowex 50 W, forme H+, et élution par de l'ammoniaque 1,5 N), le di-methyl ester, di-Ndiméthyleaminométhylène du composé recherché a été formé et étudié selon Thenot et Horning [START_REF] Thenot | Amino acid N-dimethylaminomethylene alkyl esters. New derivatives for GC and GC-MS studies[END_REF] (Fig. 1).

Résultats Acides aminés libres totaux

La teneur totale en "acides aminés libres" (ensemble des composés extraits réagissant à la ninhydrine) des tissus des spécimens étudiés varie entre 230 et 1200 μmoles/g (Tableau 1). Bien que l'analyse de l'ensemble des acides aminés individuels présents dans les extraits des tissus sorte du cadre de cette note et ne soit pas présentée en détail, les observations générales suivantes peuvent être rapportées. Chez Calyptogena, certains composés représentent à eux seuls une part très importante du total. C'est le cas de la glycine, de composés aminés soufrés (thiotaurine et taurine) et de composés phosphorylés qui, ensemble, représentent couramment près de 75% du total. La variation des teneurs totales étant pour une large part due aux variations de ces seuls composés. Chez B. thermophilus, certains des composés déjà cités, plus d'autres non déterminés, dominent également l'ensemble des composés aminés, mais dans une moindre proportion.

Acide diaminopimélique

Chez C. magnifica l'acide diaminopimélique représente une fraction importante de la totalité des composés aminés extraits (jusqu'à 17% dans les branchies, voir tableau). Le spectre de masse (Figure 1) obtenu à partir du dérivé du composé isolé des branchies confirme ce résultat. L'acide diaminopimelique n'est cependant pas confiné aux branchies, même si chez le spécimen étudié en totalité, les teneurs y sont plus fortes que dans les autres tissus, en particulier par rapport aux gonades. Pour l'espèce provenant de la Barbade, les teneurs en acides aminés sont globalement plus faibles. Le diaminopimélate ne représente que 1 ou 2% du total dans les branchies, les teneurs les plus élevées s'observent au niveau du pied et des viscères, où elles peuvent représenter 9% du total. Chez C. phaseoliformis, le diaminopimélate est présent seulement en faibles quantités (< 0,1 μmoles/g), réparties dans l'ensemble des tissus. Chez Bathymodiolus thermophilus, le composé n'a pas été détecté.

Discussion

Si la présence d'acide diaminopimélique parait bien démontrée, l'interprétation des variations selon les espèces, les spécimens ou les organes considérés est difficile car encore trop d'inconnues régissent ces associations symbiotiques. Dans le cadre de cette brève étude comparative, la discussion peut porter sur la taxinomie générale des bactéries, leur activité et le niveau des échanges avec les bivalves. Dans cette perspective, il peut être utile de rappeler les points suivants.

L'acide diaminopimélique est un composé spécifique de la paroi de nombreux procaryotes et en particulier de la quasi totalité des bactéries à Gram négatif [START_REF] Schleifer | Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications[END_REF]. Il entre dans la composition du polymère rigide de la paroi -le peptidoglycaneconstitué de chaînes polyosidiques liées par des ponts peptidiques. Plusieurs structures du peptidoglycane (différentes par le type de pontage et la composition en acides aminés) ont été décrites chez les divers groupes taxinomiques bactériens [START_REF] Schleifer | Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications[END_REF][START_REF] Kandler | Cell wall structures and their phylogenic implications[END_REF]. Un polymère d'un type donné comprend cependant divers fragments (muropeptides) qui se distinguent par le nombre d'acides aminés et le nombre de ponts. La teneur de la paroi en peptidoglycane ainsi que la proportion des différents fragments peut varier en fonction de la vitesse de croissance des organismes [START_REF] Mengin-Lecreulx | Effect of growth conditions on peptidoglycan content and cytoplasmic steps of its biosynthesis in Escherichia coli[END_REF][START_REF] Tuomanen | Changes in peptidoglycan composition and penicillin-binding proteins in slowly growing Escherichia coli[END_REF]. Le diaminopimélate libre contenu dans le pool intracellulaire des bactéries constitue un précurseur des muropeptides de la paroi, sa teneur sous forme libre peut varier en fonction des souches, du milieu et des conditions de croissance des bactéries [START_REF] Wientjes | Kinetics of uptake and incorporation of meso-diaminopimelic acid in different Escherichia coli strains[END_REF]. La libération de fragments muropeptidiques dans le milieu peut également accompagner la croissance bactérienne, une certaine capacité de recyclage des fragments existant chez les bactéries à Gram négatif [START_REF] Goodell | Recycling of murein by Escherichia coli[END_REF]. De ce qui précède, il ressort que bien qu'une information relative aux biomasses bactériennes ne puisse être déduite de nos analyses, le diaminopimélate libre dans le pool intracellulaire ou le milieu extérieur n'en reste pas moins un précurseur (ou un produit de lyse) des muropeptides de la paroi et peut, en revanche, renseigner sur l'activité des bactéries et sur les modalités des échanges avec le bivalve. En ce qui concerne le groupe des bactéries auquel semblent appartenir tous les symbiontes des invertébrés hydrothermaux étudiés [START_REF] Distel | Sulfur-oxidizing bacterial endosymbionts: analysis of phylogeny and specificity by 16S rRNA sequences[END_REF][START_REF] Lane | Evolutionary relationships among sulfur-and iron-oxidizing eubacteria[END_REF][START_REF] Distel | Independant phylogenetic origins of methanotrophic and chemoautotrophic bacterial endosymbioses in marine bivalves[END_REF], une grande uniformité dans la composition du peptidoglycane est rapportée [START_REF] Schleifer | Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications[END_REF][START_REF] Kandler | Cell wall structures and their phylogenic implications[END_REF]. Les différences observées entre les bivalves ne peuvent donc probablement pas relever de types de peptidoglycan fondamentalement différents. Certaines différences génétiques, capables d'altérer l'incorporation et le recyclage du diaminopimélate sont cependant connues pour entraîner des variations de concentration dans le milieu de culture [START_REF] Wientjes | Kinetics of uptake and incorporation of meso-diaminopimelic acid in different Escherichia coli strains[END_REF][START_REF] Prats | Normal growth and division of Escherichia coli with a reduced amount of murein[END_REF]. Toutes les études ont jusqu'à présent montré la spécificité des associations symbiotiques et le invariant des symbiontes pour une espèce donnée de bivalves [START_REF] Distel | Sulfur-oxidizing bacterial endosymbionts: analysis of phylogeny and specificity by 16S rRNA sequences[END_REF][START_REF] Distel | Evidence for phylogenetic congruence among sulfur-oxidizing chemoautotrophic bacterial endosymbionts and their bivalves hosts[END_REF]. Les différences observées entres les différentes espèces de bivalves pourraient ainsi correspondre à des variations portant sur le recyclage des fragments muropeptidiques par des souches bactériennes différentes.

Chez Calyptogena, la présence du diaminopimélate dans les branchies et les autres tissus (dépourvus de bactéries) illustre, à l'évidence, l'importance des échanges entre les bactéries et l'hôte. Les écarts observés entre les espèces dépassent largement les différences entre individus et peuvent correspondre à des différences réelles concernant l'activité des bactéries ou le niveau des échanges trophiques, comme par exemple les différences d'adaptation structurale du tube digestif peuvent le suggérer [START_REF] Pennec | The role of the digestive tract of Calyptogena laubieri and Calyptogena phaseoliformis, vesicomyid bivalves of the subduction zones of Japan[END_REF]. Des différences portant sur les capacités de dégradation du composé par l'hôte peuvent également être envisagées. Chez B. thermophilus (et chez d'autres espèces du même genre [START_REF] Pranal | Amino acid related compound composition in two symbiotic mytilid species from hydrothermal vents[END_REF]), l'absence du composé dans les tissus pourrait être liée aux différences d'adaptations structurales caractérisant les deux familles de bivalves [START_REF] Fiala-Médioni | Trophic structural adaptations in relation to the bacterial association of bivalve molluscs from hydrothermal vents and subduction zones[END_REF]. Une forte activité lysosomique rapportée aux potentialités de digestion des bactéries symbiontes est cependant observée dans les deux cas [START_REF] Fiala-Médioni | Lysosomic and lysozyme activities in the gill of bivalves from deep hydrothermal vents[END_REF].

Compte tenu du nombre limité de spécimens étudiés par espèce (et par site), l'hypothèse d'une relation entre la teneur en diaminopimélate des individus et leur conditions de vie ne peut être qu'évoquée. Un grand nombre de paramètres caractéristiques des conditions physiologiques des individus (en particulier l'abondance des symbiontes) et de leur habitat serait necessaire pour poursuivre ce type d'étude [START_REF] Fisher | Variation in the hydrothermal vent clam, Calyptogena Magnifica, at the Rose garden on the Galapagos spreading center[END_REF]. On peut cependant noter que la faible variation du diaminopimélate observée chez les spécimens des Galapagos concorde avec les conclusions de l'étude de Fisher et al. [START_REF] Fisher | Variation in the hydrothermal vent clam, Calyptogena Magnifica, at the Rose garden on the Galapagos spreading center[END_REF] concernant la variation chez C. magnifica, tandis que la variation plus importante chez les spécimens de la Barbade pourrait correspondre à des microenvironnements plus variables (traduits par exemple par la variation importante des teneurs des tissus en soufre et en phosphore, ainsi qu'en taurines et en composés phosphorylés, résultats non figurés).

Conclusion

Bien que présentant toutes un degré élevé d'association symbiotique avec des bactéries, les différentes espèces de bivalves étudiées présentent des teneurs très variables en diaminopimélate. Dans l'état actuel de la connaissance de ces associations symbiotiques, plusieurs hypothèses peuvent être invoquées. S'il est confirmé que les symbiontes bactériens appartiennent bien tous au même groupe taxinomique général, les différences pourraient résulter: de variations entre souches concernant la synthèse de la paroi, de capacités différentes des bivalves concernant la dégradation du composé, ou de manière plus générale, des caractéristiques régissant les relations trophiques de chaque association symbiotique.

En ce qui concerne la variation entre spécimens d'une même espèce, il pourrait être intéressant d'analyser les relations entre la teneur en diaminopimélate des tissus et les variations de l'état physiologique des individus en rapport avec les microvariations de leur habitat.

Remerciements : les échantillons prélevés aux Galapagos ont été obtenus grâce à J. J. Childress et C. Fisher à bord de l'Atlantis II et de l'Alvin (mission GALAPAGOS 88).

ABRIDGED VERSION

Bivalve molluscs are pre-eminent inhabitants of deep-sea hydrothermal or cold seep ecosystems. They are known to relie on symbiotic associations with chemoautrophic or methanotrophic bacteria housed in their gills. Dissolved compounds in cells or tissues like free amino acids may inform about the functioning of the association. Ninhydrine reactive compounds were analyzed in cold ethanol extracts of ice-dried tissues of specimens of the genus Calyptogena collected from the Galapagos hydrothermal vent site and the subduction areas of Japan and Barbados, plus specimens of Bathymodiolus thermophilus from Galapagos. Total amino compound concentrations range between 300 and 1200 μmoles/g. Concentrations up to 80 μmoles diaminopimelic acid/g were found in the gills of C. magnifica. Confirmation of the determination of diaminopimelic acid was made by gas chromatography-mass spectrometry of the N-dimethylaminomethylene methyl ester (N-DMAM-ME) derivative. Nearly equal values were recorded in the other body parts, with the smaller found in gonads. The species from Barbados has less diaminopimelate (maximum value: 4 μmoles/g in the foot) and larger variation among individuals. Only trace amounts were observed in C. phaseoliformis and the compound was not detected in B. thermophilus. Diaminopimelic acid is a fragment of the peptidoglycan of the bacterial cell wall. Types of peptidoglycan are known to have taxonomic implications, all Gram-negative Eubacteria belonging to a unique group. Since, so far studied vent invertebrate-bacterial endosymbionts (athough species specific) belong to a closed subdivision of Proteobacteria (which includes most of common Gramnegatives), differences in diaminopimelate concentrations among bivalve species would not likely result from fundamentally different types of bacterial peptidoglycan. On the other hand, differences in concentration may depend on variation of diaminopimelic acid uptake and recycling by the different symbiont strains or may result from different ways of host-bacteria trophic exchanges. Similarity of lysosomic digestion is however observed, despite differences in structural adaptations of the digestive tract or location of bacteria in the gills.

Variation among specimens of the same species may correspond to different physiological status thrived by contrasted micro-environments. For C. magnifica on the Galapagos Rift, little variation was noticed for most parameters as for diaminopimelic acid. On the contrary, variation (including S and P contents of the results not shown) seems more important for Barbados specimens. In conclusion, by pointing out differences among species and among individuals, diaminopimelic acid may be a master compound for the study of the relationships between bacterial symbionts and host.

Légende de la figure:

Figure 1 .

 1 Figure 1. Chromatogramme (détecteur à piégeage d'ions, masse 328) du composé isolé des branchies de C. magnifica (fraction correspondant à l'acide diaminopimélique à l'autoanalyseur d'acides aminés) après réaction avec le mélange 1:1 diméthylformamide diméthylacétal (Pierce Methyl-8® Concentrate): acétonitrile.Colonne capillaire CP Sil 5 CB, 30 m, température initiale 130° C, gradient 3°/minute. Encadré : spectres de masse des composés élués vers 37 minutes dans le cas de l'extrait de branchies (haut) et du standard (Calbiochem®) (bas). Le pic de base apparait à m/z 128, l'ion moléculaire à m/z 328 correspond au di-méthyll ester, di-Ndiméthylaminométhylène de l'acide diaminopimélique.

Figure 1 .

 1 Figure 1. Chromatogram (ion-trap detector, mass 328) of diaminopimelic acid-di-N-DMAM-diME formed by reaction of the 1:1 mixture dimethylformamide dimethylacetal:acetonitrile with the compound extracted from C. magnifica (gill) and preliminary isolated by ion-exchange with the amino acid autoanalyser. Capillary column CP Sil 5 CB, 130°C-3°/min. Inset: mass spectrums of the compounds eluted at 37 minutes for the gill extract (top) and the standard (foot). Base peak is at m/z 128 and parent ion at 328.


Alexandre Baron
email: alexandre.baron@institutoptique.fr

Aleksandr Ryasnyanskiy

Vy Quynh

Sylvain Tran

Nicolas Combrié

C Dubreuil

Philippe Husko

Robert Delaye

Gérald Frey

Simone Roosen

Cassette

Quynh Vy

Q Vy Tran

S Combrié

N Dubreuil

C Husko

P Delaye

R Frey

G Roosen

S Cassette

A De Rossi

Fast nonlinear response in a GaAs photonic crystal waveguide in the picosecond regime

Introduction

Because of the strong transverse confinement in PC waveguides, of about 10 -9 cm 2 , optical nonlinearities are enhanced. Low operating power optical switches have been conceived and demonstrated in silicon [1], AlGaAs [2], and GaAs [3] PC microcavities. Bandgap engineering in III-V semiconductor-based devices grants access to electronic Kerr effects in order to minimise switching time. However, free carriers generated in nanostructured materials by two-photon absorption (TPA) can reveal fast refractive index changes, similar to optical Kerr effect, because of the short carrier-lifetime in such structures.

In this work, we study free carrier (FC) induced Kerr-like effects in GaAs PC waveguides, because the TPA absorption coefficient € β TPA of GaAs is ten times higher than that of silicon [4]. The guides are etched in thin suspended GaAs membranes of 250 nm in thickness. The lattice period of the W1 type guides, consisting of air holes of r=0.3a in radius, is a=410 nm [5]. To characterise the samples we used an optical parametric oscillator that emits short pulses (10 ps) delivering an average power of 80 mW. Two microscope objectives were used for injection in the TM mode and collection of the light. To analyse the beam, we used an optical spectrum analyser.

Discussion

In a first step, we measured the transmitted power through the guide as a function of the incident signal power (Fig 1). The theoretical curve for TPA takes the form:

€ P out = K 2 P in /(1+ Kf 4 β TPA LP in / A eff )
index. By exploiting the Fabry-Perot fringes of the guide facets on a linear transmission experiment, we were able to determine € n g = 1.84 × n 0 , which shows that we are in the presence of a slow mode, thus enhancing € f . Using € A eff =10 -9 cm 2 and € L =0.98 mm and € β TPA = 10 -8 cm/W [6], Fig 1 shows the good agreement between theory and experiment. We can thus conclude that TPA has been enhanced as a consequence of the photonic structure.

In a second step, we analysed the transmitted spectrum with a resolution of 0.05 nm (Fig 2). The thin (P H ) and solid curves (P L ) represent the spectra at high and low incident powers, respectively. Fabry-Perot modulations are present on both curves. P L is similar to the spectrum of the incident pulse. It is possible to eliminate these spectral oscillations by temporally filtering the signal autocorrelation function at half the round trip inside the guide (dotted curve P F ). We observe both a blue and red shift of the pulse after propagation inside the guide, which show a very fast Kerr-like phenomenon induced on both the rising and falling part of the pulse.

The carrier lifetime still needs to be determined, because it will enable us to conclude whether the observed spectra are due to fast FC recombination or both FC and Kerr effect.

Conclusions

By analysing transmission measurements in GaAs based photonic crystal waveguides, we have observed FC induced Kerr-like effects with a very fast time constant, which is on the same order of magnitude as the pulse duration (10 ps). Even though further investigation is necessary to determine the contributions of TPA and Kerr effect, these observations reveal the full potential of very fast nanostructured GaAs based optical devices.

  and € P out are the peak-powers at guide input and output, € A eff is the effective mode area, € L is the guide length, € K is the coupling efficiency at input and output and is determined with a linear measurement ( € K = 5.7 ×10 -3 ), € f = n g /n 0 is the local field factor with € n g , the group index inside the guide and € n 0 =3.37, the GaAs bulk

Fig 2 .

 2 Fig 2. Spectra of transmitted pulse