1526 р. королівство Богемія перейшло до рук Габсбургів, ревних католиків, у той час як жителі Праги симпатизували протестантам. При імператорі Рудольфі II Прага знову стала столицею Священної Римської імперії. Рудольф II був меценатом, запрошував до себе астрологів, магів, науковців, музикантів та митців, а тому Прага стала культурним центром Європи. В той час у Празі мешкали астрономи Тихо Браге та Йоган Кеплер, художник Джузепе Арчімбольдо тощо.