Caracterizacion de nuevos componentes de la regulacion transcripcional durante la germinacion de semillas de arabidopsis thaliana
La semilla es un organo fundamental para la supervivencia y la dispersion de las plantas. Al final de la fase de maduracion, la semilla seca puede entrar en un estado de dormicion que imposibilita la germinacion incluso en condiciones favorables. Una vez superado este estado, condiciones ambientales favorables induciran la germinacion. La transicion entre los estados de maduracion, quiescencia o dormancia y germinacion durante el desarrollo de la semilla estan regulados por factores ambientales y fisiologicos, donde principalmente dos fitohormonas: el acido abscisico (ABA) y las giberelinas (GAs) juegan un papel regulador antagonico. El trabajo descrito en esta tesis tiene como objetivo identificar nuevos componentes reguladores en la germinacion de semillas de Arabidopsis thaliana y se divide en dos capitulos que describen: 1) la caracterizacion de un factor de transcripcion de tipo DOF (DOF6) durante la germinacion de la semilla de A. thaliana y 2) la caracterizacion de motivos en cis reguladores del gen LIP1, que codifica una GDSL Lipasa y que se induce durante la germinacion, asi como de los factores de transcripcion que los reconocen. La dormancia favorece la dispersion de las semillas y permite que la germinacion ocurra cuando las condiciones ambientales son mas apropiadas para el crecimiento de la nueva plantula. La perdida de dormancia a traves del almacenaje en seco de la semilla, conocido como after ripening (AR) ocurre a traves de procesos aun no bien conocidos a nivel molecular. En este estudio se ha descrito un gen de Arabidopsis que codifica un factor de transcripcion de la familia DOF (DOF6) que reprime la germinacion de la semilla. Los niveles de transcritos de este gen se acumulan en la semilla seca y decaen a lo largo del AR asi como durante la imbibicion. Mientras que la sobre expresion constitutiva del gen DOF6 tiene efectos deletereos en el crecimiento y fertilidad de la planta, la sobre expresion inducida durante la imbibicion de la semilla, provoca un retraso en la germinacion, fenotipos hipersensibles a ABA y una induccion de la expresion del gen ABA1, que codifica un enzima clave de la ruta de biosintesis del ABA, asi como de otros genes de estres inducidos por esta hormona. Las diferencias en las cineticas de germinacion y en los niveles de expresion de estos genes desaparecieron en semillas con AR, a pesar de la sobre expresion del gen DOF6. Ademas DOF6 interacciona con TCP14, un regulador positivo de la germinacion de la semilla previamente descrito. Mutantes de perdida de funcion tcp14 tenian niveles mas altos de expresion de ABA1 y de genes de estres inducidos por ABA respecto al fenotipo silvestre. Todos estos resultados apuntan a que DOF6 afecta negativamente la germinacion de la semilla y tiene una funcion opuesta a TCP14 en la regulacion de un conjunto especifico de genes relacionados con el ABA. El estudio de genes que codifican hidrolasas en la aleurona post germinativa de semillas de cereales, ha puesto de manifiesto la existencia de elementos en cis conservados, a los que se unen factores de transcripcion de las familias MYB (R2R3 y R1) bZIP y DOF. Sin embargo, esta regulacion parece no estar conservada en semillas dicotiledoneas. Se ha identificado el gen LIP1, que codifica una GDSL Lipasa y que se induce fuertemente durante la germinacion de las semillas de Arabidopsis, observandose que tal induccion esta determinada por GAs. Un analisis filogenomico de la region promotora de LIP1 ha permitido la identificacion de dos regiones conservadas. Ensayos de un hibrido de levadura con un fragmento de 50 pb de una de estas regiones conservadas (elemento LIP1) demostraron que los factores de transcripcion AtML1 y PDF2 son capaces de unirse especificamente a una caja L1 localizada en el mismo. Se ha demostrado ademas que dicha caja L1 es imprescindible para la inducibilidad del gen LIP1 por GAs. Los genes AtML1 y PDF2, ademas de participar en distintos procesos del desarrollo, se expresan durante la germinacion de la semilla. Se ha demostrado que AtML1 interacciona consigo mismo y con PDF2, posiblemente formando homo y heterodimeros. Estos resultados sugieren que tanto la caja L1 como el factor de transcripcion AtML1, probablemente junto con otras proteinas reguladoras, participan en la induccion de la transcripcion mediada por GAs durante la germinacion de semillas de Arabidopsis thaliana.