Estudio de la lisina epsilon oxidasa LodA sintetizada por Marinomas mediterranea papel de la flavoproteina LodB en la generacion del cofactor quinonico de LodA mediante modificacion post traduccional
Las L aminoacido oxidasas (LAOs) son enzimas que oxidan aminoacidos generando el cetoacido correspondiente, amonio y peroxido de hidrogeno. Generalmente, estas enzimas tienen una flavina como cofactor. En la bacteria marina Marinomonas mediterranea se han descrito las dos primeras LAOs que poseen un cofactor quinonico. Este tipo de cofactores se generan mediante modificacion post traduccional de aminoacidos. La primera LAO descrita en M. mediterranea, LodA, es una novedosa L lisina epsilon oxidasa (EC 1.4.3.20) De forma paralela a la realizacion de este trabajo, se ha descrito GoxA, una glicina oxidasa con caracteristicas distintas a las glicinas oxidasas descritas previamente en otros organismos. Ambas proteinas son codificadas en operones. En el caso del operon lod, inmediatamente despues al gen lodA, se encuentra el gen lodB que codifica la flavoproteina LodB. Datos previos indicaban que en M. mediterranea ambas proteinas son necesarias para obtener LodA activa. El objetivo de este trabajo ha sido estudiar el papel de LodB en la generacion del cofactor quinonico de LodA. Asi mismo, se han abordado por primera vez estudios de relacion estructura/funcion de LodA para determinar residuos implicados en el proceso de generacion del cofactor quinonico y en la actividad enzimatica. El estudio presentado en esta memoria se ha llevado a cabo principalmente mediante expresion recombinante, solas o en combinacion, en Escherichia coli de las distintas proteinas de los operones que codifican las LAOs. Las proteinas recombinantes se analizaron mediante espectrometria de masas para detectar la masa molecular de la proteina completa y de los peptidos generados por digestion enzimatica, con el fin de identificar los residuos que son modificados post traduccionalmente durante la generacion del cofactor quinonico. Adicionalmente, el papel de los residuos seleccionados por estar conservados en LodA y proteinas similares o por su localizacion estructural, se ha estudiado mediante mediante mutagenesis dirigida. Finalmente, se ha realizado un analisis comparativo de las proteinas del operon lod y gox. Se ha determinado que LodA recombinante posee como cofactor cisteina triptofilquinona (CTQ) generado por modificacion de los residuos Cys516 y Trp581. La expresion de LodA en ausencia de LodB, genera una forma precursora de LodA, a la que se ha denominado PreLodA, que no muestra actividad enzimatica y esta monohidroxilada en Trp581. Este resultado indica que la sintesis de la proteina activa requiere la flavoproteina LodB que actuaria sobre PreLodA. Por su parte, los experimentos de mutagenesis han permitido determinar que el residuo conservado Asp512 es esencial en la generacion de PreLodA. Otros residuos analizados importantes para la actividad estan localizados en la entrada del canal del centro activo de LodA o en la proximidad del cofactor. Las deleciones realizadas en el extremo C terminal sugieren que esa zona podria participar en la generacion de la forma activa de LodA. Mediante analisis bioinformatico se ha detectado en genomas microbianos que los operones que codifican proteinas similares a LodA generalmente contienen, ademas del gen similar a lodA, un segundo gen que codifica una hipotetica flavoproteina similar a LodB. El estudio del operon gox ha revelado que, al igual que ocurre con LodA, cuando se expresa GoxA en ausencia de GoxB, se detecta una forma intermedia monohidroxilada sin actividad enzimatica que se ha denominado PreGoxA, por su similitud con PreLodA. Por ultimo, se ha demostrado que las flavoproteinas que acompanan a LodA y GoxA no son intercambiables, indicando una alta especificidad de la quinooxidasa que modifica. Este trabajo supone un avance en el estudio de la nueva familia de LAOs con cofactor quinonico. En concreto, se ha puesto de manifiesto un mecanismo novedoso de modificacion post traduccional de proteinas, ya que con anterioridad no se habia descrito la participacion de flavoproteinas en este tipo de procesos. L amino acid oxidases (LAOs) oxidize amino acids releasing ammonium, hydrogen peroxide and the corresponding alpha keto acid. The marine bacterium Marinomonas mediterranea synthesizes two novel LAOs which contain a quinone cofactor, in contrast to other LAOs that contain a flavin cofactor. Quinone cofactors are generated by post translational modification of amino acid residues. The first LAO described in M. mediterranea, LodA, is a novel L lysine epsilon oxidase (EC 1.4.3.20) During the realization of this work, it has been described GoxA, a glycine oxidase which is different from the glycine oxidases previously described in other organisms. Both proteins are encoded in operons containing two genes. The operon lod contains immediately downstream to the gene coding for LodA, a second gene coding for the flavoprotein LodB. Previous data have demonstrated that both proteins are required for the generation of the active form of LodA in M. mediterranea. The aim of this work has been to study the role of LodB in the generation of the quinone cofactor of LodA. In addition, studies about structure/function relationship of LodA has been carried out for the first time with the aim of determining the residues involved in the biogenesis of the quinone cofactor and the enzymatic activity of LodA. This work has been carried out by heterologous expression in Escherichia coli of the different genes coding for either LodA or GoxA, alone or in combination with the genes encoding LodB or GoxB. In order to identify which residues are post translationally modified, the recombinant proteins were analyzed by mass spectrometry to determine the molecular mass of the complete protein and that of the peptides generated by enzymatic digestion. In addition, the role of residues conserved in LodA and LodA like proteins has been studied by site directed mutagenesis. Finally, a comparative analysis of protein encoded by lod and gox operons has been also performed. It has been determined that recombinant LodA contains a cysteine tryptophyl quinone cofactor (CTQ) which is generated by post translational modification of residues Cys516 and Trp581. When LodA is expressed in absence of LodB, an inactive monohydroxylated intermediate of LodA, named PreLodA is generated. It is. This result indicates that LodB is required to obtain active LodA and that PreLodA would be its substrate. A critical role in the generation of this precursor of a conserved Asp residue has been revealed by site directed mutagenesis. Other important residues to obtain enzymatic activity are located at the entrance of the active site of LodA or in close vicinity to the quinone cofactor. Moreover, deletions in C terminal region of LodA suggest a role of that region in the generation of the active form of LodA. Using bioinformatic analysis it has detected that operons encoding LodA like proteins in microbial genomes usually contain a second gene encoding a hypothetical LodB like flavoprotein. The analysis of the recombinant synthesis of GoxA in absence of GoxB has revealed, similarly to LodA, a soluble inactive precursor with partial post translational modifications. This precursor has been named PreGoxA because of its similarity to PreLodA. Finally, it has been demonstrated that the roles of LodB and GoxB are not interchangeable and each flavoprotein acts specifically on its partner protein. This study gets insights in a novel family of LAOs with quinone cofactors. The data presented in this work have revealed a new mechanism of post translational modification of proteins involving a flavoprotein.