解析プラン納品データご用意いただくものよくある質問と回答Inquiry★データ解析アップデート★これまで有料オプション(追加解析)としていました「検体間比較テーブル作成」を標準解析メニューにてご提供いたします。gRNAライブラリを使用したゲノムワイドスクリーニングにご利用いただける次世代シーケンス解析サービスです。gRNA領域のPCR産物をご提供いただき、ディープシーケンス、gRNAのリードカウントを行います。サービス内容gRNA領域のPCR産物をご提供いただき、ライブラリ調製、Illuminaシーケンスデータ取得、gRNAのリードカウントを実施いたします。比較対象のサンプルがある場合は、比較テーブル作成も承ります。約330万リードペア(1Gb)単位で、ご希望のリード数にて承ります。・gRNAのリードカウントお問い合わせください。ご希望のリード数をお知らせいただけましたらお見積りいたします。納品データシーケンスで得られたリード配列からgRNA領域を切り出し、各gRNAのリード数を集計します。Control、Treatの比較実験の場合は、gRNAリード数集計後、各サンプルで算出されたgRNAカウント情報に基づき、ControlサンプルとTreatサンプルのカウント比較テーブルを作成します。selection情報も算出します。下記1~4の条件を必ずご確認ください。ご提供いただくPCR産物の量は5ng(0.2ng/μL)以上を目安にご用意ください。弊社指定のリンカー配列(※配列はお問い合わせください)を付加したプライマーでPCRを行っていただき、リンカー配列の付いたPCR産物をご提供ください。PCR産物(リンカー配列を除くインサートサイズ)は200~400bp程度、その内5’側の100bp以内にgRNA領域を含むようプライマーを設計してください。PCR産物の精製を行ってください。gRNAリストgRNAのID、配列、対象Geneの対応表をご提供ください。データ解析(gRNAのリードカウント)で使用いたします。GeneCよくある質問と回答Q:コントロールサンプルは必要ですかスクリーニング前後でgRNAのカウント数を比較するために、スクリーニング前(gRNAエンリッチ前)のコントロールサンプルが必要になります。コントロールサンプルがない場合でも、各検体のgRNAリードカウントを行うことは可能です。Q:コントロールにはどのようなサンプルが使用されますかコントロールサンプルには、トランスフェクション前のgRNAライブラリ、またはトランスフェクション後の培養細胞のday0(未処理)サンプルなどが使用されます。Q:レプリケートは必要ですかgRNAのエンリッチ状況について、信頼性のある統計情報を算出するためには、レプリケートサンプルをご用意いただくことを推奨いたします。レプリケートが無い場合でも、解析を行うことは可能です。Q:取得データ量(リード数)はどのように決めたら良いですか1リードペア=1分子のPCR産物に相当し、「リードペア数/gRNAの種類数」がカバレッジとなります。一般的に、CRISPRスクリーニング解析には×100~500カバレッジ程度の深度が推奨されています。リードペアとなります。(Illumina)」に沿って実施いたします。PCRおよび精製の方法につきましてはこちらのプロトコルをご参考いただき、詳細はお問い合わせください。