ステップ間接続にチェックマークを付けないでください。データ]を選択します。解析タブで、プロットの下の表で実験データを選択し、減算された参照センサからの信号との関連付けと解離曲線を確認します。フィットを選択します。[カーブにフィット]を選択します。プロットを分析して、曲線フィッティングを確認します。ドキュメント、生データと分析データのプロット、および計算された解離定数を保存します。Results膜受容体FhuAは、実験室大腸菌株で発現される。外膜分率は遠心分離によって収穫され、タンパク質は2段階の洗剤抽出を用いて可溶化される。可溶化膜タンパク質は、プラスチックカラムに詰め込まれたNi-NTAアガロースビーズにロードされ、プロトコルに示されるPeptiQuickワークフローが続きます。サイズ排除クロマトグラフィーを使用した品質管理の後、バイオペプチディスク粒子をストレプトアビジンコーティングピンに固定化します。BLI分析は、FhuAとColM間の相互作用の運動を測定するために行われます。この実験の概略の概要を図1に示します。溶出分数に対応する画分のアリコートがSDSゲルにロードされ、PeptiQuick法の成功を評価します。流れを通る分率におけるFhuAの枯渇は、溶出画分の濃縮と相関し、タンパク質の精製が有効であることを示す。微小な汚染物質タンパク質バンドは、溶出画分で観察される。SDSゲル分析は、SEC分析の前にプールする必要がある分数を決定するために使用されます。溶出したFhuAバイオペプチディス粒子の天然ゲルもFhuA溶解性を確認するために実行されます(補足図1)。再構成されたタンパク質を天然ゲルに移行することは、洗剤のない環境におけるタンパク質溶解性を示す。SEC分析は、ペプチド粒子の溶解度を評価するために行われる。10/300カラム上の8.0mLの空隙体積を6mL過ぎて)で溶出する単一の対称ピークを示す。このピークの位置は、ボイド体積を過ぎて、FhuAバイオペプトディスク粒子の溶解性を確認する。参考までに、図3Bは理論的に最適でないペプチドディスク調製を示す。この場合、クロマトグラムは、空隙体積で溶出するより大きなタンパク質ピークを示し、タンパク質凝集体の存在を示す。メインペプチディスクピークを過ぎた直後の小さなピークは、過剰なペプチドペプチドに相当する。FhuAと検体ColMとの相互作用は、ペプチディスクをストレプトアビジン被覆センサに取り付けた後に決定される。Bio-Peptidiscsを含むバッファーに転送されます。FhuAバイオペプティディスクの濃度と先端でインキュベートされる時間の長さは、この実験の前に最適化されています(補足図1)。荷重および洗浄ステップに続いて、アソシエーションステップは、ロードされたチップとコリシンMの4つの異なる濃度との間の相互作用を測定します。その後の先端のバッファへの移動は解離をもたらし、先端から反射する白色光の波長シフトによって測定される。図4Aは、この実験からの生データセンサグラム出力を示す。すべてのトレースは、黄色の参照トレースを除き、読み込みおよびベースラインステップで均一に表示されます。参照先端にはリガンドがロードされていないが、非特異的結合のアッセイに検体にさらされ、これは重要な負のコントロールである。結果のより詳細な分析のために、参照先端からのシグナルは、非特異的結合を考慮する実験ヒントのトレースから差し引かれます。ステップの先頭に揃えて、視覚的に直接比較できるようにします。この比較は、コリシンMの濃度を増加させる波長シフトの増加を示す。フィッティングと実験データの違いを説明する残差図プロット(図4B、下)は、3つの低濃度に比べてコルム(28nM)の最高濃度のフィッティングが悪いことを示す。曲線自体のプロファイルは、典型的な結合実験における結合部位飽和の特徴である結合曲線プラトーを欠いている。高原の欠如は、高コルム濃度のアーティファクトである可能性が高い異種結合を示唆している。したがって、この最も高いColM濃度は分析から割引され、他の3つの濃度は解離定数を決定するために使用されます(図4C,D)。両側の学生のt-検定は、95%の信頼度で、この実験から観察された解離定数が異なる技術を用いて得られた値と有意に異ならないことを発見した(図4E)16。ワークフローの概要この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。ワークフローを通じて収集された開始、フロースルー、洗浄、および溶出分数の。約10μLのサンプルを各レーンに積み込み、定電流60mAで30分間走った。ゲルをクマシーブルーで染色し、脱色し、ゲルスキャナーで可視化した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。kDa)を再構成した。IMAC溶出分率F3−F7は、30kDaカットオフ遠心濃縮器を〜1mLに用いてプールおよび濃縮した。この濃縮試料を、TSG緩衝液中のゲル濾過S200(10/300)カラムに0.25mL/minで注入した。最適でないペプティクイック再構成の理論的SECプロファイルこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。参照センサートレースを黄色で示す生データセンサーグラム。フィッティングを持つ関連付けおよび解離ステップ。実験データと計算フィッティングの違いを示す残留ビュー。(C)コルムの最高濃度を除外した(B)の再プロット。(D)観測された関連性と解離率(それぞれkonおよびkoff)および解離定数(Kd)。(E)ペプチディスクおよびBLI(本実験)、ペプチドディスクおよびマイクロスケール熱泳常性(サヴィル、未発表データ)、およびナノディスクおよび等温滴定熱量測定16によって得られたFhuA-ColM解離定数の比較。誤差範囲は不確実性の1つのSDを表し、n.s.は95%信頼水準で有意差を示さない。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。使用できるバイオペプチディスク(>95%純度)を滅菌dH2Oに溶解します。ペプチド溶液の濃度および体積は、再構成プロセスにおけるステップに依存する。注:このバイオペプチディスクペプチドストックは、4°Cで1ヶ月以上安定しています。補足図1:PeptiQuickワークフローから収集された溶出画の4%~16%の明確なネイティブゲル分析。約10μLのサンプルを各レーンに積み込み、定電流30mAで40分間走った。ゲルをクマシーブルーで染色し、下剤を塗布し、スキャナーで可視化した。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。補足図2:単一ピンを用いたリガンド濃度最適化(A)バイオペプチディスクにおけるFhuAの6つの異なる濃度を、単一のストレプトアビジンコーティングピンに結合するために試験した。これは、リガンド濃度の間のウェル内のバッファーを持つ96ウェルプレートに設定されました(セットアッププロトコルについては補足ファイル1を参照)。(B)リガンド最適化実験のための生データセンサグラム。ピンは最大の応答を与え、さらに濃度番号4(または2.5μg/mL)で飽和に達します。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください)。多くの望ましくない影響を及ぼす可能性があります。4,5,6,7,8,9.これらの困難は、洗剤の存在を最小限に抑え、可能な限りネイティブの膜環境を複製しようとする膜模倣体の開発を動機づけています2,3,4、5、6.しかし、再構成方法の大部分は、再構成条件の大幅な最適化を必要とし、多くの場合、最終的な収量7、8を減少させる追加の精製ステップを必要とする。ペプチドは、標的膜タンパク質に自発的に適応し、比較的、最適化および下流精製9、10をほとんど必要としない。このプロトコルでは、PeptiQuickは、下流タンパク質間相互作用解析のための再構成プロトコルを合理化する簡単な手段として提示される。簡単ですが、再構成の失敗につながる可能性のある実験的な注意事項がいくつかあります。これらの中で最も一般的なのは、タンパク質凝集によるものである。したがって、再構成プロセスを監視するためにサイズ排除クロマトグラフィーを実行することが重要です。ボイド体積で溶出するサイズ排除ピークは、タンパク質凝集体(図3B)17、18を示す。膜蛋白質凝集体は、通常、再構成前に最適でない洗剤条件に長時間さらされると形成される。遠心装置上の限外濾過により濃縮すると、洗剤中の膜蛋白質が凝集体を形成する傾向があることが分かりました。この場合、感受性膜タンパク質は、真空超濾過を用いて濃縮され得るが、フィルターへのタンパク質の吸着が減少するので、より穏やかで均質な濃度の方法である。一般に、タンパク質濃度を避けるために、溶出されたIMAC画分をプールし、その再構成品質をチェックするためにサイズ除外カラムにアリコートを注入する必要があります。主ペプチドディスクピーク直後に未組み込み遊離ペプチドが溶出する(図3B)。無料足場は必ずしも下流の実験を妨げるものではありません。必要に応じて、この過剰は、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去することができる。再構成中に洗浄量を増加させ、かつIMAC樹脂からの溶出の前に、遊離ペプチドペプチドの大部分を効果的に除去するのに十分である。したがって、再構成品質を確認する迅速かつ簡単な手段として、サイズ排除クロマトグラフィーが推奨されます。BLI実験では、リガンド濃度と検体濃度の両方を慎重に最適化する必要があります。リガンド結合は明確な信号を得るのに十分でなければならないが、過負荷は信号飽和を引き起こし、先端表面の過密および立体障害によるデータアーティファクトをもたらす。したがって、リガンド溶液にチップが費やすリガンドの濃度と時間の長さの両方を、タンパク質サンプルごとに最適化する必要があります(補足図2)。検検濃度も最適化する必要があります。解離定数が知られている場合、濃度範囲を近似することができるので、このステップは容易になる。この分析の良い出発点は、予想されるKd19の0.1倍から20倍のタンパク質濃度を使用することです。BLIデータ取得後、誤解釈を避けるために慎重なデータ分析を行う必要があります。解離定数の計算は、結合曲線の適合度に依存します。結合型式論が既に知られていない限り、初期フィッティングには古典的な1:1二分子相互作用モデルを使用する必要があります。異種結合曲線は、多くの場合、複雑な結合モデルとして誤解され得る高い分析物濃度によって引き起こされるアーティファクトおよび非理想的な挙動の結果である。したがって、センサーグラムプロファイルが1:1結合型トイチオメトリーを表示するまで検体濃度を下げることは、より複雑な相互作用から異種結合を区別するのに役立ちます。420に示すように割引されます。このレポートでは、FhuA-ColM相互作用に対して2.28±0.74nMの解離定数が測定される。この値は、ITCまたはMSTを用いたナノディスクまたはペプチドを用いたグループで以前に決定された解離定数と一致する(図4E)16.この一貫性は、相互作用運動を決定する手段として、ペプチディス再構成およびBLI分析に関する信頼を提供する。重要なことに、タンパク質は、通常、大腸菌ビオチンリガーゼBirA21を用いたビオチン化学架橋または部位特異的添加を介してストレプトアビジンバイオセンサに固定化される。明らかに、ペプチドス足場をビオチン化することは、標的膜タンパク質の代わりに、多くの利点を有する。足場ビオチニル化は時間を節約し、重要なタンパク質結合部位を破壊する可能性を最小にする。PeptiQuickは、Gタンパク質共役受容体(GPPCR)、イオンチャネル、βバレル膜タンパク質など、幅広いタンパク質標的クラスに適用可能であることがわかりました。一般に、膜蛋白質の初期洗剤抽出物を凝集性のない状態にすることは重要であり、かつペプチディスにおける即時再構成は下流凝集問題を減少させるということに留意すべきである。シンプルさを考えると、PeptiQuickは、表面プラズモン共鳴(SPR)、ELISAアッセイ、ストレプトアビジンビーズを使用したアフィニティプルダウンなどの他のストレプトアビジンベースの結合アッセイに拡張されることを想定しています。CIHR奨学金を保有しています。出資した南西バイオサイエンス博士訓練パートナーシップ[トレーニング補助金リファレンスBB/M009122/1]によって支援されました。FDはティアIIカナダリサーチチェアです。reserved×-1::1。