膜タンパク質の精製と再構成を1つのクロマトグラフィー工程でペプチディスに組み合わせる方法を提示する。ビオチン化足場は、バイオレイヤー干渉法を介したタンパク質リガンド相互作用の直接表面付着および測定に使用されます。Abstractトランスポーター、チャネル、受容体を含む膜タンパク質は、細胞プロテオームのほぼ4分の1を構成し、現在の薬物標的の半分以上を構成する。スクリーニング戦略は、これらのタンパク質が水溶性状態である必要が高いことです。問題に対する「ワンサイズフィットオール」アプローチを提供する膜模倣体であるペプチドディスクを開発しました。ここでは、タンパク質精製とペプチディス再構成を1つのクロマトグラフィーステップで組み合わせた合理化されたプロトコルを提示します。このワークフローはPeptiQuickと呼ばれ、ポリスチレンビーズによる透析およびインキュベーションをバイパスすることができ、それによって洗剤、タンパク質変性、およびサンプル損失への曝露を大幅に減少させます。ペプチクイックは、ビオチン化足場で行われるとき、調製物はストレプトアビジンコーティングされた表面に直接取り付けることができる。膜タンパク質標的をビオチン化または改変する必要はありません。PeptiQuickは、膜受容体FhuAおよび抗菌リガンドコリシンMと共にここで展示され、バイオ層干渉測定を用いて、その相互作用の正確な動態を決定する。PeptiQuickは洗剤のない環境で1日以内に膜タンパク質リガンド相互作用を調製し、分析するための便利な方法であると結論付けられている。Introduction膜タンパク質は、脂質二重層環境の外で凝集する膜タンパク質の傾向に起因する薬物または抗体発見研究プログラムから除外されることが多く、特に洗剤1の存在下で。そのため、近年、完全に洗剤のない環境(ナノディスク、SMALPs、アンフィポールなど)における膜タンパク質の単離と尋問を容易にするために、いくつかの膜模倣体(スキャフォールドと呼ばれます)が開発されています。2、3、4、5、6.しかしながら、これらの模倣体における膜タンパク質の再構成は、多くの場合、時間がかかり、一般的にタンパク質回収の喪失を伴う広範な最適化を必要とする7、8。これらの制限を克服するために、私たちの研究室は最近、peptidisc9として知られている「ワンサイズフィットオール」製剤を開発しました。kDa両path性バイヘリックペプチドの複数のコピーが標的膜タンパク質の疎水性表面に結合するときに形成される。ペプチディスの安定な再構成は、洗剤の除去時に起こり、内因性脂質と可溶性膜タンパク質の両方を水溶性粒子に捕捉する。これらの安定化された粒子は、現在、多くの下流アプリケーションに適しています。ペプチディスク法にはいくつかの利点があります。再構成は、標的へのペプチドス足場の結合がタンパク質テンプレート自体9、10によって導かれるので簡単である。ペプチド化学量論も自己決定され、高因性脂質の添加は必要ない。13.最終的なペプチドディスクアセンブリは、耐熱性が高く、異なる緩衝液または二価陽イオン(例えば、Ni2+)の存在下で常に可溶性である。足場の純度および構造均質性も高く(例えば、エンドトキシンフリー)、およびペプチドは、異なる位置に配置された官能基でカスタマイズすることができる。ここでは、オンビーズ再構成9とも呼ばれるPeptiQuickと呼ばれる実験室のワークフローを紹介します。このプロトコルは、膜タンパク質精製とペプチディス再構成を1つのステップと同じクロマトグラフィーサポートに組み合わせます。その名の指しによると、PeptiQuickは他の再構成方法と比較して急速に進み、洗剤への曝露時間も大幅に短縮します。タンパク質の展開や凝集などの負の洗剤効果は、多くの場合、時間依存的に発生します。したがって、洗剤暴露を最小限に抑えるには、天然タンパク質立体構造14、15を維持することが重要である。これは、タンパク質の相互作用とリガンド結合親和性を報告する方法の精度にとって重要です。このプロトコルを開発しながら、我々は、バイオペプチディスクと呼ばれ、ペプチディスク足場の新しいビオチン化バージョンを提示します。ビオチン官能基は、ストレプトアビジン被覆面への標的膜タンパク質の付着を可能にする。ビオチン標識は足場に限定されるため、標的膜タンパク質上の結合部位は変化しないままである。バイオペプチディスクを用いて、細菌膜受容体FhuAと抗菌ペプチドコリシンM(ColM)の結合動態が16と判定される。この親和性は、センサー先端から反射した白色光干渉パターンに基づいてリアルタイムで相互作用を分析するバイオレイヤー干渉法(BLI)を介して測定されます。このプロトコルを使用することにより、洗剤が相互作用を妨げる可能性があるため、BLI分析中の洗剤の必要性がなくなり、重要な開発が行われる。結合親和性は、この方法で迅速に測定することができ、かつその結果は、ナノディスクおよび等温滴定熱量測定(ITC)16を用いて先に報告されたものと同等である。アッセイにおけるリガンド結合と分析物結合のトラブルシューティングのヒントと共に示および議論されています。日以内に測定できることがわかりました。エクスプレス彼の6-大腸菌株AW740でタグ付きFhuA。M9媒体で37°Cで18時間細胞を成長させる(表1)。al.16を参照してください。遠心分離による細胞の収穫(5,000xg、10分、4°)とトリス塩グリセロール(TSG)緩衝液の50mLで再中断する(表1)。再懸濁した細胞をダウンドし、腎症の直前にフェニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF)を1mMの最終濃度に加える。有毒で腐食性があります。低速遠心分離(5,000xg、10分、4°C)により、未溶解細胞および他の不溶性物質をペレット化する。超遠心を上清(200,000×g、40分、4°)し、粗膜画分を単離する。上清を廃棄し、膜ペレットを最小量のTSG緩衝液に再サスペンドし、ガラスまたは金属ダウンサー装置を用いて同質性を確保する。ブラッドフォードアッセイを行い、再懸濁した粗膜のタンパク質濃度を確認します。可溶化前にTSG緩衝液を用いて粗膜を3mg/mLの最終濃度に希釈する。X-100を最終濃度1%(v/v)に加え、4°Cで細菌内膜を1時間選択的に溶け込ませるように、穏やかなロッキングを行います。g,40分,4°)により不溶性物質(外膜画分)をペレット化する。可溶化膜を含む上清を廃棄し、TSGのペレットを3mg/mLの最終濃度に再スペンドする。ラウリルジメチルアミンオキシド(LDAO)を再懸濁した外膜分画に1%(v/v)濃度に加え、穏やかなロッキングで4°Cで1時間溶入します。g,40分,4°)をペレット化するための最終遠心分離工程を行う。注:得られた上清には、彼のタグ付けされたFhuAを標的とする可溶化外膜タンパク質が含まれています。固定化された金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)洗浄バッファーの2カラム容積を有するプレパックNi-NTAカラム(5mL樹脂容積)を予め平衡化する(表1)。TSGを使用して、可溶化外膜を1%LDAOから0.04%LDAOに希釈します。5mMの最終濃度にイミダゾールを加える。注意:イミダゾールは有毒で腐食性です。可溶化した外膜タンパク質をNi-NTA樹脂にロードし、流れを集めます。樹脂結合を増加させ、二次フロースルーを収集します。注:後のドデシル硫酸ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)分析の基準として、可溶化材料の20μLアリコートを保管してください。洗浄バッファを樹脂床の容積の高さまで排出し、柱のストップコックを閉じます。濃縮10mg/mLバイオペプチディスクペプチド溶液(表1)をカラムに1mL添加します。TSGに50mLの希薄な1mg/mLバイオペプチディスクペプチド溶液を加え、ガラス棒で樹脂をかき混ぜてTSGでビーズを再サスペンドします。mg/mLバイオペプチディスク溶液を排出することができます。付属のペプチディスク粒子を洗浄します。TSG中に600mMイミダゾールを含むIMAC溶出緩衝液(表1)の15mLでペプチド粒子を溶出する。μLを加え、浸出したニッケルイオンをケレートします。始動材料の10μLアリコートを、ペプチクイック再構成から12%SDS変性ゲルおよびエレクトロフェールに10mの定電流で30分間積み込む。クマシーブルー染料でゲルを染色し、ゲルを汚し、スキャナーで視覚化します。kDaカットオフ遠心濃縮器を使用して濃縮する。mL以下に集中しています(SEC器械の注入ループ容積)。