́-三リン酸)合成酵素に含まれる、回転する生物分子モーター「F1-ATPase(*1)」は、ATPを加水分解する際のエネルギーで駆動され、反時計方向に回転します。ATPの加水分解反応と回転角度の関係は、長年理解が曖昧なままでした。F1-ATPaseのもつ3つの触媒部位のうち1つを、ATPとの反応が極端に遅い変異型に置換することで、ATP結合からATPの開裂までの回転角度が200oであることを明らかにしました。結核菌ATP合成酵素は近年薬剤ターゲットとしても着目されており、回転駆動の仕組みを知ることは、結核の治療薬開発にもつながると期待されます。回転時の化学・力学的エネルギー変換効率はほぼ100%であることが知られています。(現所属・浜松ホトニクス株式会社、研究時の所属・学習院大学)らの研究グループは、F型ATP合成酵素に含まれる回転分子モーター「F1-ATPase」の回転機構の解明を目指し、F1-ATPaseのもつ3つの触媒部位のうちの1つを、ATPとの反応が極端に遅い変異型に置換することで、ATPを結合してからこれを分解するまでの間に、F1-ATPaseの中心軸が200o回転することを明らかにしました。F型ATP合成酵素は、生体内でエネルギー通貨として用いられるATPを合成する酵素で、ほとんどすべての生物が共通して利用している重要な蛋白質です。この酵素の大きな特徴として、タンパク質分子が回転することが挙げられます。F1-ATPaseはその回転分子モーターであり、回転方向に依存した可逆的な触媒活性を示すことが知られています。通常、F1-ATPaseはATPを加水分解した際のエネルギーで駆動され、反時計回りに回転しますが、強制的に時計回りに回転させることでADP(アデノシン二リン酸)とリン酸からATPを合成します。本研究では、このような特異な性質をもつF1-ATPaseの回転機構を明らかにするべく、ATPの加水分解による反時計回りの回転について研究を行いました。F1-ATPaseのもつ3つの触媒部位のうちの1つを、ATPとの反応(結合および分解)が極端に遅い変異型に置換した、ハイブリッド型酵素を作製し、光学顕微鏡を用いて1分子レベルでその回転を観察することで、ATPを結合してからこれを酵素上で加水分解する(ATPが開裂する)までの間に、F1-ATPaseの中心軸が200o回転することを明らかにしました。この生物のもつ世界最小の回転分子モーターの回転機構を解明し、生物のもつ高効率のエネルギー変換の仕組みを理解することで、薬剤開発やナノテクノロジーに応用できると期待されます。Journal」にオンライン掲載され、印刷体は2023年2月7日に122巻3号に掲載されました。F1-ATPaseのもつ3つの触媒部位のうちの1つを、ATPとの反応(結合および分解)が極端に遅い変異型β(E190D/F414E/F420E)に置換したハイブリッド型酵素を作製(上)。光学顕微鏡を用いた1分子レベルの観察から、ATPを結合してからこれを酵素上で加水分解する(ATPの開裂が起こる)までの間に、F1-ATPaseの中心軸が200o回転することが明らかになった(下)。【研究の背景】F1-ATPaseは主に3種類のタンパク質サブユニットから構成され、αサブユニットとβサブユニットがそれぞれ3つずつ交互に並んだリングに、1つのγサブユニットが突き刺さる構造をしています。このγサブユニットが、モーターの中心軸として一方向に回転します。ATPとの結合部位(触媒部位)は、それぞれ3つのβサブユニット中に存在しています。これまでの研究から、回転の際にF1-ATPaseは、80oとそれに続く40oの回転ステップから構成された「ステップ状回転」を示し、いくつかの停止期を挟んで回転することがわかっていました。F1-ATPaseによるATP加水分解反応は、(1)ATPの結合、(2)高エネルギーリン酸結合の加水分解(酵素上でのATP開裂の過程)、(3)生成物(ADPとリン酸)の解離、という3つの反応素過程に分けられるため、回転の停止期はそれぞれ素過程に対応したものと推定されてきました。ATP結合前の停止(ATP結合待ちの停止)時の角度を0oとしたとき、高エネルギーリン酸結合の加水分解が何度(o)で起こるかについては、蓄積されたこれまでの研究結果から200oであるとの推定がなされてきました。確証はまだ得られておらず、長年未解明のままでした。そこで、本研究グループは、各反応素過程と各回転ステップの相関を明らかにするべく研究を行いました。PS3)のF1-ATPaseを用いました。従来の実験では、野生型に比して各停止期の時間が長い、βサブユニットのE190D変異体が用いられてきましたが、E190D変異体の0oにおける停止(ATP結合待ちの停止)には、温度依存的なものが含まれることがわかり、実験結果の解釈を複雑にしていました。そこで本研究では、その問題点を解消するべく、ATPとの結合速度が極端に遅いF414E/F420E(以降「FEFE」と表記)変異を、E190D変異体にさらに導入しました。これにより、「ATP結合待ちの停止」と「酵素上でのATP開裂待ちの停止」の時間がどちらも長くなった変異型βサブユニットを作製しました。野生型F1-ATPaseの3つのβサブユニットのうち、1つをこの変異型βサブユニットで置換したハイブリッド型酵素「1×β(E190D/FEFE)」、2つを置換したハイブリッド型酵素「2×β(E190D/FEFE)」、そして3つとも置換したノンハイブリッド型酵素「3×β(E190D/FEFE)」を作製しました。これら各変異型酵素をガラス面に固定し、さらに中心軸であるγサブユニットに金属ビーズを取り付けることで、各反応素過程を待つ間の回転停止を、光学顕微鏡を用いて観察しました。すると、まず3×β(E190D/FEFE)では、1回転あたり6回の停止(0o、80o、120o、200o、240o、320o)が観察されました。これらの停止は、80oと40oの回転が交互に繰り返されてできたものであり、3組の短い停止と長い停止に分けられました。μMまではATP濃度に依存せずほぼ一定の長さを示したことから、「酵素上でのATP開裂待ちの停止」と考えられました。80o回転の前に見られる短い停止は、ATP濃度に明らかに依存していたことから、「ATP結合待ちの停止」と考えられました。次に、2×β(E190D/FEFE)では、4回(0o、120o、200o、320o)の停止が見られました。これは、それぞれの変異型βサブユニットが200o離れた停止期をもち、それぞれが120oずれて配置されていることに一致しました。長い停止と短い停止の傾向は、3×β(E190D/FEFE)と類似しており、短い停止の長さはATP濃度に依存していました。最後に、1×β(E190D/FEFE)では、2回(0o、200o)の停止が見られました。0.03秒となり、ATP濃度が増加するほど停止時間が短くなる濃度依存性を示しました。0.1秒とそれほど変化がありませんでした。これにより、0oにおける停止は「ATP結合待ちの停止」であり、200oにおける停止が「酵素上でのATP開裂待ちの停止」であることがわかりました。ATPを結合してから200o反時計回りに回転したとき、ATPの開裂が起こることが、これにより明確に示されました。結核菌ATP合成酵素は近年結核の薬剤ターゲットとしても着目されており、回転駆動の仕組みを知ることは、薬剤の開発にもつながると期待されます。この分子の高効率のエネルギー変換の仕組みを理解すれば、マイクロマシンや分子ロボットの開発などナノテクノロジーに応用できる可能性があります。(さきがけ)(JPMJPR12L8)の助成を受けて実施したものです。ATPaseATPのもつ3つのリン酸基から1つを加水分解により切り出し、ADPとリン酸を生じさせる酵素群のこと。Analyticsを利用しています。Analyticsは、クッキーを利用して利用者の情報を収集します。