改訂:2007/8/10)はじめに我が国では平成14年に全国で32,828人の新規登録結核患者があり,そのうち2,316人が結核で死亡している。結核は,単一病原菌による死亡原因の第一位疾患であり,今も高齢者を中心に発病者が多く,日常診療で最もよく遭遇する感染症の一つである。このため医療従事者は,結核専門病院のみならず一般病院においても結核菌に曝露される機会が多く,一般住民に比べ結核発病率が高い。その中でも検査技師の結核発病率は看護師に次いで高く,検査現場での結核感染防止に関する安全対策は重要である。近年の結核菌検査には,従来の直接塗沫ならびに小川培地を用いた培養検査だけでなく,集菌塗沫や液体培地を用いた培養法あるいは結核菌の遺伝子を検出する核酸増幅法検査などの新しい検査が次々と登場し,既に日常診療に取り入れられている。ところで,一般に結核菌検査室や病理検査室などでの結核感染は,臨床検体を処理する際に生じるエアロゾルに含まれる結核菌を吸入することによって起こる空気感染(飛沫核感染)である。上述の新しい検査は従来の検査に比べ臨床検体に含まれる結核菌がエアロゾル化する操作が多く,検査技師の結核感染の危険性が高い。このため結核菌検査を安全に行うためには,安全キャビネット導入などの施設面での整備だけでなく結核に関する正しい知識を持って感染防止対策を講ずる必要がある。我が国には結核菌検査の安全対策に関する公的指針はない。共同で結核菌検査に関するバイオセ−フティマニュアルを作成した。このマニュアルが検査現場で広く利用され,我が国の検査施設等での結核感染防止に少しでも役立つことを切望する。微生物検査を行う場合に守らなければならない一般的な注意を総論として整理した。これらの多くは「病原細菌に関するバイオセーフティ指針」(日本細菌学会,2002)1)に明記されており,微生物検査を実施する際に遵守すべき基本的な事項である。微生物の中でも特に結核菌は危険度の高い細菌であり,本書に準じ検査を進めるうえで,以下の事項には熟知していなければならない。検査室でのバイオセーフティで問題となるのは,微生物による感染症である。バイオセーフティは職業上の安全を第一とする概念であるが,検査室で扱う病原体は一般社会環境へ伝播しやすいことから,公衆衛生面からも重要な意味をもつ。検査室では,患者検体,細菌の液体培養,固形培地上の集落,細菌の浮遊液などさまざまなものが感染源になるが,原則としていずれの場合にもそこに病原体が存在することがあらかじめ分かっている。病原体は,検査室内で発生したエアロゾルによって容易に人体内に侵入する。結核は自覚症状が現れるまでの期間が長いために,バイオハザード対策の最も困難な病原体として位置付けられている。以下に示すバイオセーフティ指針は,結核菌などの危険度の高い病原体を扱う実験室(検査室)の安全を確保することを目的に定められた。バイオセ−フティについて病原体取り扱い者にとって,バイオセーフティに関する重要事項は,検査室内における作業従事者の感染防止と,病原体を外に出さないことである。病原体によるバイオハザード,特に検査室内感染防止の第一は,病原体取り扱い実技の訓練と教育である。取り扱いに熟練していても,エアロゾル感染,飛沫感染などは特別の配慮と設備なしには防止できない。したがって,病原体のバイオセーフティレベルを認識し,それぞれのレベルに応じた防止対策が必要になる。病原細菌のバイオセ−フティレベル日本細菌学会の指針1)では病原細菌を危険度の低いほうから高いほうへバイオセーフティレベル1〜3の3群に分類し,それぞれの群に適用される取り扱い法を定めている。host)にいわゆる日和見感染症を起こす可能性があるものである。このような細菌種の数は今なお増えつつある。�Aバイオセ−フティレベル2健康な成人に感染症を起こす能力をもち,その危険度が軽度ないし中程度であるものである。エアロゾル感染の危険性は高くないが,特に大量に発生した場合を中心に警戒が必要である。感染は主に事故(針刺しなど)による接種,粘膜や傷のある皮膚との接触,経口摂取によって起こる。�Bバイオセ−フティレベル3感染菌量が小さいため感染性が高く,重篤でしばしば致死的な感染症を起こすものである。エアロゾルが危険であり,人体への侵入はエアロゾルの吸入により経気道的に起こるものが多い。病原体によっては,経口感染,結膜その他の経粘膜感染が重要で,エアロゾル発生による手指などの汚染が原因となることもありうると考えられる。抗酸菌のバイオセ−フティレベル非結核性抗酸菌のほとんどの菌種はバイオセーフティレベル2に分類され,結核菌群に属する5菌種はバイオセーフティレベル3に分類される(表1)。附.ヒトに対する起病性別にみた培養可能な抗酸菌を表2に示した。各バイオセ−フティレベルの病原体の取扱いについて各バイオセーフティレベルの病原体を取り扱うには,以下のような条件のもとで扱うことが決められている。�@検査室では,飲食,食物の保管,喫煙,化粧,コンタクトレンズの脱着・装着,顔面に手を触れる,指で目をこする,あるいは鼻前庭を指先でこする,などのことは絶対に行ってはならない�Aバイオセーフティレベルに応じて,従事者以外の者の検査室への立ち入りを禁止する�B検査室では,必ず専用の予防衣(液体を浸透させない材質のもの,布製は不可)を着用する。これらを着たまま検査室外に出てはならない�C病原体が付着している可能性のある物体,血液その他の検査材料,感染動物等を取り扱う場合には,必ず手袋を着用する。この場合,操作が終わった段階で手袋の表面は汚染されていると見なして対処すること。手袋を付けたままで他の操作に移ると,汚染を拡散させる危険がある。手袋を外す場合は,汚染面に手を触れないように注意する。手袋を外した後は石けんで手を洗うかまたは速乾性消毒薬で手指消毒を行う2)�D検体や菌を扱う場合は安全キャビネットの中で行う。結核菌はバイオセーフティレベル3の病原体であるので,結核菌検査はレベル3の病原体の取り扱いに準じて行うことが原則である。現実にはすべての施設がレベル3をクリアーすることは困難であるので,それぞれの施設において検査内容に応じた取り扱い指針と設備を設け,感染防止対策を適切に実施する必要がある。マスク),顔面スクリーンなどを着用する(図5,図6参照)�F作業計画の立案に当たっては,エアロゾル発生が最も少ない方法を最優先する�G口を使うピペット操作は厳禁である。菌液を吸う際に,ゴムキャップを装着した駒込ピペットやメスピペット,または軟質のプラスチック製チューブ等を用いると,操作中,菌液が飛び出し,付近を汚染させてしまう危険性がある。ピペットで菌液を取り扱う操作では,菌液の吸引・排出を指で微調節できる「電動ピペッター」あるいは「ゴム製の安全ピペッター(通称“ゴム球”)」を用い,作業の安全に心がける(図6参照)�H注射器のピストンを強く押して加圧するときは,針とシリンダーの接合部がロック式になったものを用いる。使用後の注射針の処理は,針刺し事故防止を配慮した安全な方法で行う。他の鋭利な器具の取り扱いにも十分な注意を払う�I液体培養や菌液を取り扱う際には,容器の破損,落下,転倒などの事故に備え,消毒薬を含ませたペーパータオル等を敷いたトレイの中で作業を行う�J汚染された物品は放置せず,いったん検査室内の一定の場所(例:「要滅菌(消毒)」と明示された場所)に置き,その後,廃棄または再使用に先立ち,必ず滅菌または消毒する。このことは,検査室内スタッフの安全確保のために特に重要である。消毒・滅菌のため他の場所へ運搬する必要があれば,丈夫な密閉容器に入れて行う�K作業台の表面は少なくとも1日に1回は消毒するとともに,病原体による汚染があったか,またはその可能性があると思われる場合には,そのつど直ちに消毒する�L各作業の終了時および,検査室を出るときには必ず消毒薬で手指を消毒する�M検査室は整頓し,清潔に保つとともに,不要な物品は置かないように努める�N検査室への昆虫,ネズミの侵入阻止には万全を期し,必要に応じて駆除を行う。ペットなど検査に無関係な動物を検査室に入れてはならない�O容器の破損・転倒などによる病原体の漏洩,病原体の吸入,誤嚥などの事故は必ず責任者に報告し,指示を求める。抗酸菌検査は安全キャビネットを備えた検査室で行わなければならない。安全キャビネットは危険な微生物を封じ込め,キャビネットの外に出さないよう設計されている。正しい使用法を用いないと汚染事故などを起こす危険がある。装置の原理をよく理解し,決められた使用法を守らなければならない。安全キャビネットとよく似た装置にクリ−ンベンチがある。クリ−ンベンチは機械の内部の作業スペ−スは無菌になるよう設定されている。作業スペ−スで発生するエアロゾルなどは術者に向かって外部に漏れてくる。このようにクリ−ンベンチは無菌環境で作業が出来ても,作業者の安全を守る病原体などを機械の内部に封じ込める機能はない。クリ−ンベンチは決して微生物検査に用いてはならない。種類に分類されている。同様の考え方で規格化されている。安全キャビネットは,その基本構造により大きくクラス�T,�U,�Vの三つのタイプに分類される。クラス�Tおよび�Uは作業開口部(物品と作業者の腕を出し入れする)から内部に向かう気流が存在し,内部で発生したエアロゾルが外部(作業者に向かって)漏れることを防ぐ仕組みになっている。この防護機能に関しては,両者の間に大差はない。両者の主な違いは,実験材料を空気中の雑菌による汚染から守る機能の有無にある。このように,クラス�Uのキャビネットは�@作業者の安全保護,�A試料の保護,�B相互汚染防止(作業エリアで試料間の汚染が起きないよう内部を循環する空気を滞りなく速やかに移動させる)の機能を有している。クラス�Vは完全密閉されたグローブボックス型のキャビネットで,高度の危険性をもつ試料の取り扱いに使用される。クラス�Tは作業エリアが外気で汚染されるので,微生物検査には使用できず,クラス�Uが最も広く使用されている。タイプは排気が室内放出型である。タイプでは,いずれも排気はダクト接続により屋外に排気される。タイプが最も普及している。全排気型安全キャビネットを使用することが望ましい(図1)。安全キャビネットの使用で大切なことは,設計で想定された空気の流れを乱さないことである。内部では電気バーナーを使用し,ガスバーナーの使用は禁止する。作業中はファンを止めてはならない。清潔物,汚染物の配置は気流方向を考慮のうえ,決定する。機内を清潔に保つため,消毒用アルコールなどで頻回に清拭する。このとき,ファンは止めてはならない。キャビネット内の蛍光灯を消し,紫外線ランプを点灯させる。分程度経過したら,キャビネット内部の消毒や汚染物を取り出す。(3)エアロゾル安全キャビネットを使うからといって,操作が乱暴になってはならない。エアロゾルの発生が多いと,たとえキャビネット外へのエアロゾルの漏出による呼吸器感染は防ぐことができても,キャビネット内での表面汚染〔特に手指(手袋),その他実験衣,ガラス器具,ピペット等々〕が増え,汚染物がキャビネット外に出たあと経口感染,結膜や鼻粘膜経由の感染につながる。安全キャビネットによる防護にも死角があることを忘れてはならない。結核菌の感染防止対策として最も重要なことは,エアロゾル対策であり,この発生の基本原理は,液面が破れること(泡の破裂もその一つ)である。ミキサーで液面を乱さないように混合すれば,エアロゾルの発生頻度が低いことが証明されている。エアロゾル対策の第一歩は,エアロゾルが発生しやすい状況・操作を知ることであるが,その範囲は驚くほど広い。エアロゾルが発生しない操作のほうが少ないと考えるべきであり,エアロゾルに無頓着な操作は厳に戒められるべきである。感染防止対策は,まず操作そのものをできるだけエアロゾル発生が少なくなるようにし,安全キャビネットを十分活用することである。規格の高性能マスク(フィットテスト;「16」参照),および,�B手袋の着用を義務付ける。基本的な白金耳操作も,重要なエアロゾル発生源となる。白金耳に付けた菌液を寒天平板へ塗抹する際や,菌液などの液体材料を付けたままの白金耳を火炎に挿入することでも,エアロゾルの発生が観察されている。熱した白金耳を直ちに菌液に挿入して冷やすと,大量のエアロゾルが発生する。菌液を別の容器に移したり,菌液と希釈液を吸引と排出の反復で混和する操作でもエアロゾルの発生があり,特にピペットから最後の1滴を噴出することにより泡ができると著しく増加する。使用後のピペットを消毒液を入れた縦型または横置きの容器に捨てる際にも,エアロゾルの発生がある。遠心操作は重要なエアロゾル発生源となりうる。表面が菌液により汚染したローターの使用,遠心中の遠心管内容の漏洩または遠心管が破損した場合は大量のエアロゾルが発生する。菌液をゴムキャップ付きバイアルから注射器で抜き取る,菌液の入った注射器を逆さに持って気泡を追い出すなどの操作は,エアロゾルを大量に発生させる。装置で超音波照射を行うと,大量のエアロゾルが発生する。組織などをホモジナイズする操作では,処理後,ふたを取ると大量のエアロゾルが放出されるが,ふたの構造によっては運転中にも,エアロゾルの漏洩がある。これは最も危険な操作の一つである。乳鉢による摩砕も同様である。乾燥菌体の入ったアンプルを折って開封する操作でも,エアロゾルが発生する。遠心した菌液の上清を他の容器に移し替える,培養液の入った試験管やフラスコの栓を外す,菌液と溶解寒天培地をペトリ皿の中で混和(混釈培養)するなどの操作でもエアロゾルが発生する。�@ピペットから一定量の菌液を排出するとき,吹き出し型をやめ中間目盛ピペットを使用し,先を宙に浮かせず器壁につけるか液中に入れる�A大きなループの白金耳は,液膜がはじけてエアロゾルが発生しやすいので使用しない�B弾性が強すぎる針金で作った白金耳は,寒天培地への塗抹の際エアロゾルを作りやすいので使用しない�Cエアロゾルではないが,結核菌(抗酸菌)のように脂質の含有量の多い菌の菌塊が付いた白金耳を直接火炎に挿入すると,菌塊がはじけて飛散する。満たしたものを実験台に用意しておき,菌が付着した白金耳をその中に差し込んで菌をこすり落としてから火炎に挿入するとよい。一般の菌液についてもこの方法を採用すれば,エアロゾルの発生を防ぐことができる。11)�D白金耳の焼灼に,カバー付きバーナーまたは電気焼灼器(電気バーナー)を用いる�E多数の試料を扱う場合には必要数の滅菌白金耳(またはディスポーザブル製品)を用意することにより,安全かつ作業効率を上げることができる�F注射器でゴムぶた付きバイアルから菌液を吸引したのち,針を引き抜く操作の際にアルコール綿で刺入部を覆う�G菌液を入れた注射器を逆さにして気泡を除く際に,アルコール綿で針先を覆う�H凍結乾燥菌体の入ったアンプルを折って開封するときにも切断部分をアルコール綿で覆う�I遠心操作は,「バイオハザード対策の施された遠心機」を使用する(図2)。「滅菌」とはすべての微生物を完全に殺滅することである。熱または化学薬品に最も抵抗性が強いのは細菌の芽胞であり,滅菌は芽胞も完全に殺菌する方法である。エチレンオキサイドガスやガンマ−線照射などを用いた滅菌法もあるが,日常的には高圧蒸気滅菌が最も頻用されるので十分習得しておく。高圧蒸気滅菌は自動化されており,そのため原理の理解が不十分なまま機械的に操作して思わぬ失敗を招くことがある1)。「滅菌」とはすべての微生物を完全に殺滅することである。熱または消毒薬に最も抵抗性が強いのは細菌の芽胞であり,滅菌は芽胞も完全に殺菌する方法である。エチレンオキサイドガスやガンマー線などを用いた滅菌法もあるが,日常的には高圧蒸気滅菌が最も頻用されるので十分習得しておく。高圧蒸気滅菌は自動化されており,そのため原理の理解が不十分なまま機械的に操作して思わぬ失敗を招くことがある1)。熱容量の大きな物体(例えば大型フラスコに満たした大量の液体培地や卵培地)を缶内に入れると,熱容量の大きな物体の温度はなかなか上がらず,内圧が2気圧になっても容易に121°Cに達しない。しても大量のものを一度に滅菌したいときは,時間を延長する必要がある。分間高圧蒸気滅菌する。空の容器の底には空気が残留するため温度上昇が不十分になりやすく,特に口の小さい容器やふた付き容器(ふたは緩めるのが原則)で著しい。そのため,空容器には少量の水を入れておくのがよい。シリンダー等の大型容器に滅菌物を入れて使用した後,高圧蒸気滅菌器にかける場合には,その容器に十分な量の水(例えば1リットル)を入れることが推奨されている。「消毒」とは感染の危険がほとんどなくなるまで病原微生物を不活化する処置をいう。消毒は滅菌と比較して温和であり,芽胞の不活化はまったくできないか,たとえできても不十分である。熱処理でも100°Cまたはそれ以下の温度であれば,たとえ数時間加熱しても芽胞は死なないため滅菌ではなく,消毒である1)。ふつう消毒は消毒薬により行われる。消毒薬には多くの種類があり,微生物に対する有効範囲が一様でなく,また人体に応用できるものとできないものがある。細菌を消毒薬に対する抵抗性から大まかに分け,強いものから順に並べると,「芽胞を形成している細菌」,「結核菌およびその他の抗酸菌」,「一般細菌」となる1)。消毒薬の殺菌力の強さを表す目安として,アメリカでは「高水準(high)」,「中水準(intermediate)」,「低水準(low)」という分類が使用されている。大まかに言えば,「高水準」は上記のスケールで最上位の芽胞でも時間をかければ不活化可能,「中水準」は芽胞を不活化できないが抗酸菌には有効,「低水準」は無芽胞細菌に有効,ウイルスには無効,という目安である。検査室では例外的なケースを除き,「高水準」に属する薬剤が必要な場合はほとんどなく,実際には「中水準」以下で十分であると考えられる1)。抗酸菌に有効な消毒薬は意外に少なく,選択の幅が狭く限られている。消毒薬の選択に当たっては刺激性が少なく皮膚に使用できるかどうかも重要な要素になる。抗酸菌に有効で皮膚に使用できる消毒薬は,エタノール系,ヨウ素系に限られる。次亜塩素酸ナトリウムなど塩素系の消毒薬は金属に対する腐食性が強く,抗酸菌に対して効果がやや弱い。80%濃度で使用されるが,この濃度範囲では殺菌効果に大差はなく,50%以下の濃度では殺菌作用が急速に低下する。培養した結核菌に対する70%エタノール水溶液の殺菌作用時間は約5分程度と言われている14)。刺激臭があるがイソプロパノールの50%水溶液もエタノールの70%水溶液と同等の消毒効果がある15)。他方,メチルアルコールは殺菌作用が弱く,毒性が強いために常用の消毒薬として使用されることはない。°C,イソプロパノールの沸点82.7°Cで,いずれも引火性の物質なので清拭時の引火に注意する。�Aフェノ−ル系消毒薬フェノール系消毒薬としては石炭酸とクレゾール石けん液があり,作用機序は細菌細胞壁の破壊と細胞質のタンパク変性である。いずれも排水規制のために現在,使用されていない。結核菌に対し殺菌力が強く,結核予防法でも結核菌の消毒薬として認められているので記載しておく。使用する場合は必要最小限度の使用に留めるべきである。a)フェノ−ル(石炭酸:C6H6O)フェノールは消毒薬の中で最も古くから使用され,有機物存在下でも安定した消毒効果が得られるが,特有な臭気と皮膚刺激性,組織毒性があるため皮膚消毒には使用できない。秒〜1分で死滅させる11)。フェノールは強力な殺菌力を有する反面,人体にも有毒なので,実験室で常用する消毒薬としては不適切であり,必要最小限度の使用頻度に留めなくてはならない(排水規制)。b)クレゾ−ル(C7H8O)クレゾールには3種類の異性体があるが,殺菌作用にはほとんど差がない。分,5%水溶液では5分で死滅させる14)。クレゾール石けん液もフェノールと同様に,実験室で常用消毒薬として使用してはならない(排水規制)。本消毒薬は結核菌に対しあまり強くないので,結核菌検査に用いた器具など汚染が激しいと考えられるものでは,さらに高圧蒸気滅菌処理を施してから廃棄するとよい。合成阻害,細胞壁の障害作用もある。CHO〕であるが,ともに特有の臭気があり,目や気道粘膜を刺激する。病院等で「使用後の内視鏡の消毒洗浄処理」に用いられるのは,3〜3.5%グルタールアルデヒドのアルカリ性水溶液の中に1時間以上浸漬する方法である。グルタールアルデヒドのアルカリ性水溶液は約2週間継続して使用可能とされているが,使用直前に緩衝化剤(重炭酸ナトリウム)を添加した後は溶液が不安定となり,消毒薬としての抗微生物活性が経時的に低下する。〜3.5%濃度で使用)。フィルター)交換の場合には,工事の前後に「ホルマリン薫蒸」による室内の消毒が行われる。過マンガン酸カリウム900g」を耐熱性容器に入れ,ホルムアルデヒドガスを発生させる。,(b)「2倍希釈局法ホルマリン水1.8l」をホルムアルデヒドガス発生器に入れて,ホルムアルデヒドガスを発生させる。薫蒸中はガスの漏洩を防ぐため実験室ドア周囲の隙間はガムテープ等で密封する。