:SIMPLEX法による新規蛋白質の創製。type:Competitive申請者らが独自に開発したビーズディスプレイ法等を用いてセルラーゼの高機能化を目指す。がん細胞増殖にも関わるなど、多面的な機能を有することが知られている。抗体の標的分子は可変領域の配列で決まっているのであるが、その配列と標的であるエピトープを網羅的に解析する手法は存在せず、それらの関係性は不明のままである。本研究では、エマルジョン中での極微細反応場や無細胞タンパク質合成系、さらには次世代シーケンスやバイオインフォマティクスを駆使することで、抗体配列とエピトープを迅速安価に解析する新たな方法論を開発する。標的分子に結合するモノクローナル抗体を網羅的に取得することと、取得抗体のエピトープを決定することは、免疫系を理解し、それらを医療だけでなく様々に産業利用していくためには大変重要な技術課題である。ともに一つの抗体に対して作業を行う場合でも数ヶ月単位の時間が要する作業であり、相当のコストがかかる。したがって生体内に存在する10の16から18乗にものぼるレパートリーのうち、ある特定の抗原に対するほんの少しもの抗体とそのエピトープを「網羅的」に解析することは全く不可能であった。本研究では、抗体配列とそのエピトープ、網羅的に解析することを可能にする技術課題に取り組んでいる。本年度は、第一段階として1)リボソームディスプレイを用いたウサギおよびヒトFab抗体のライブラリー構築技術の開発とモデルスクリーニングの実施2)リボソームディスプレイ、次世代シーケンス、とバイオインフォマティクスによるエピトープ推定技術の開発に取り組んだ。1)については、ヒト・ウサギの抗体を網羅的にリボソーム上に提示できるプライマー設計とそのモデルスクリーニングを行った。腸内細菌を抗原としてそれに結合できるヒト抗体配列を、リボソームディスプレイにより濃縮した。2)については、ランダムペプチドライブラリーをリボソーム上に提示し、モデルとした抗タグ抗体に結合するペプチド配列を濃縮し、次世代シーケンス解析と独自に作成したPythonプログラムを用い、標的分子中からエピトープを推定する手法を開発した。各B細胞が元来有しているL鎖とH鎖のDNAを結合させる条件を検討する。その後結合したL鎖H鎖からなる抗体を提示するリボソームディスプレイを行い、抗原(ウイルスやがん細胞))に結合する配列を濃縮する。2)大腸菌にクローニング、抗体を発現させELISAなどにより抗原に結合する抗体とそのDNAを、数百個単位で取得する。その後抗原結合能を有する数百の抗体配列とそのエピトープをランダムペプチドを提示するリボソームディスプレイやcDNAディスプレイを用いて、各抗体に結合するペプチドのDNA配列濃縮、抗体DNA配列とペプチドDNA配列を結合して、次世代シーケンサー(NGS)解析により解析するシステムを開発する。膨大なNGSデータより、抗体配列とそのエピトープ配列のデータベースを作成する。ハイスループットなシステムを構築するため、大腸菌にクローニングする代わりに、エマルジョン技術を駆使した解析技術を開発する。初年度は、上記の1)の項目のうち、リボソームディスプレイに関する基盤技術を確立した。2)のエピトープマッピングに関しての主要技術・解析プログラムを開発しており、おおよそ順調に推移していると判断した。1)リボソームディスプレイ法により抗原に対する抗体セレクションのプロセスを確立する。2)無細胞タンパク質合成系により合成したFab抗体に対してリボソームディスプレイによりエピトープマッピングを行う際の条件検討3)上記のFab抗体を多サンプル(96種類程度)同時解析行うための、条件検討を行う。エマルジョン中での抗体L鎖H鎖mRNA結合反応の条件を検討する。detailsAuthorship:Coinvestigator(s)本研究計画は大きく1転移性脳腫瘍内のTLSおよびTABの検出2新鮮腫瘍組織からのTABのソーティングと抗体情報の抽出3CARの構築と抗腫瘍効果の検証の3つの段階に分かれる。大量の転移性脳腫瘍検体を用いての検索を必要とするため深層学習アルゴリズムを用いたハイスループット画像解析手法を用いてTLSの検出を行い、かつ抗体抽出に最適なTABの選定のための抗体コンビネーションを選定する。続いてEcobody法を用いた新鮮腫瘍組織からのTABの抽出と抗体情報の取得を行う。vitro、動物脳腫瘍モデルを用いた新規CARレパートリーの有効性を検証する消化器癌の転移性脳腫瘍パラフィン埋包検体を15例収集し、これらを用いてHE染色および各種免疫染色を行った。がん免疫の活性化に関与し、良好な予後や免疫チェックポイント阻害薬の有効性を予測するとして近年注目されている三次リンパ構造は、他の臓器では多くの報告があるが、転移性脳腫瘍に関しては皆無である。この度、HE染色を用いて転移性脳腫瘍組織の観察を行い、腫瘍辺縁や腫瘍辺縁の脳血管腔にこの三次リンパ構造を推定させるリンパ球の集簇を発見した。CD4、CD8、CD20、BCL6などによる免疫染色を進め、三次リンパ構造に特徴的なCD20陽性細胞、すなわちB細胞が腫瘍辺縁や腫瘍辺縁の脳血管周囲に集簇していることが観察された。成熟した三次リンパ構造のマーカーとして使用されるBCL6を発現しているB細胞は認められず、転移性脳腫瘍における三次リンパ構造は未熟な形態として存在していることが明らかになった。腫瘍組織内に存在するB細胞は主に三次リンパ構造内に存在するという既知の知見より、腫瘍細胞内のB細胞を含む免疫細胞のすべてを画像解析ソフトを用いてカウントし、これらの結果を臨床データと照らし合わせ、統計解析を行った。生存期間および転移性脳腫瘍術後からの生存期間が有意に長いことが分かった。良好な予後に関連することが分かった。3年にわたる新型コロナの蔓延により当院においても臨床業務に支障が生じた。病理部門が所属する臨床検査科においては多くのスタッフとその家族が新型コロナに感染し就業困難となった。患者の治療に関連する業務の遂行が最優先され、研究に関する業務は後回しになる。結果、当研究に必要な病理組織検体スライドの作成が大幅に遅れることとなった。転移性脳腫瘍における三次リンパ構造の存在に関する報告はいまだなく、その存在をより強固に証明するため転移性脳腫瘍における追加の免疫染色を行い詳細な構造解析を進める。転移性脳腫瘍に存在するB細胞が良好な予後に関連することが確認されたため、今後は手術摘出で得られた生検体を用いてB細胞を抽出していく。腫瘍内に存在するB細胞においても高度に腫瘍免疫活性を認めるものから、免疫活性に乏しいものまであるため、腫瘍免疫活性の高いB細胞の抽出のためのマーカーを決定していく。有望なB細胞の抽出が完了すればこのB細胞の抗体情報を用いてCARの構築を行っていく。detailsAuthorship:Coinvestigator(s)生命機能の発現・制御機構を解明する上で、染色体の動的な構造変化を考慮することは非常に重要である。oryzaeのゲノム構造情報ならびに全遺伝子発現情報を包括的に取得し、その経時的動態をデータベース化する。oryzaeの創生技術を確立する。これらのアプローチを通して、生命機能の発現・制御のメカニズムの包括的理解のための汎用的な技術基盤の構築を目指す。oryzaeの固体培養における遺伝子発現動態の包括的理解とその技術基盤構築を目的として研究期間1年目に以下のアプローチを実施した。oryzaeより抽出したRNAを用いることで一定時間ごとの遺伝子発現動態をトレースできるかどうかの予備検討を実施した。oryzae野生株を寒天プレート上で培養し、植菌後3日後から7日後まで1日おきに菌体を回収した。oryzae全遺伝子の発現データを取得した。取得した発現動態をもとにクラスタリングを実施し、類似発現パターンを示す遺伝子群をグループ化した。各クラスター中の遺伝子の機能を精査したところ、一つのクラスターでは過半数がリボソームタンパク質で構成されていた。この結果は、サンプリングからRNA-Seq、クラスタリングに至る一連の作業工程の適切さを示すものであった。2022年4月にこれまで所属していた研究期間とは別の機関へ異動したため、研究実施環境の再構築に想定以上の時間を要したことが主な要因として挙げられる。oryzaeのゲノム動態の解析など、当初1年目に予定していた実施内容を十分行うことができなかった。異動後の研究遂行環境は整いつつあり、今後の進展が期待できる。2022年度に得られた研究成果をもとに、下記のアプローチを実施する。oryzae菌体を一定時間ごとにサンプリングし、RNA-Seqにより各条件ごとの全遺伝子の発現量の時系列データを取得し、データベース化する。oryzae菌体を一定時間ごとにサンプリングし、架橋処理を施したゲノムを回収し、各条件ごとのクロマチン構造の時系列データを取得し、データベース化する。oryzaeより抽出したRNAやゲノムを用いて同様の手法により全遺伝子の発現量とクロマチン構造の時系列データを取得し、データベース化する。oryzaeの創生技術を確立する。University。