記述言語:日本語タイプ2イソペンテニル二リン酸イソメラーゼはFMNとNAD(P)Hを活性に要求する奇妙な異性化酵素である。関する最新の知見について概説した。)超好熱菌は特殊な構造の膜脂質を生産し、それにより構成される安定な細胞膜によって極限環境に適応している。本研究では、我々が過去に超好熱性古細菌における生合成経路を解明した延長型膜脂質、および最近生合成酵素が同定された双頭型膜脂質をツールとして用い、モデル生物である大腸菌の細胞膜の特性改変を目指す。具体的には、生合成前駆体の人工的な供給経路の導入などの代謝工学的な手法を用い、超好熱菌の膜脂質を大腸菌に大量生産させ、細胞膜の主成分とすることで、透過性が低く安定な膜を持つ大腸菌細胞が作製できるか検証する。)申請者らが最近発見した古細菌型メバロン酸経路は、既知経路と比べてエネルギー低消費型の代謝経路であり、同経路の微生物への導入は、様々な有用物質の発酵生産の強化に役立つと期待されている。同経路には酸素が豊富に供給される条件においてが機能が低下するという弱点が存在し、それは同経路に特異的な酵素の酸素感受性に起因すると予想されている。本研究では酸素供給量の違いにより蓄積する中間体を調べることによって同経路の機能低下の原因を究明し、その原因となっている酵素の発現量を増やす、もしくは同酵素に酸素耐性を付与することで、同経路の応用上の弱点の克服を目指す。)イソプレノイドは自然界最大の天然化合物群であり、その中には膨大な数の有用物質が含まれる。これまでに、微生物による有用イソプレノイドの発酵生産を高効率化する目的で、その前駆体供給経路であるメバロン酸経路を使った代謝工学的な試みがなされてきた。微生物に対するそれらの代謝経路のエネルギー負荷は大きく、生産量の向上には限界があった。消費量の少ない「低エネルギー負荷型」メバロン酸経路を大腸菌に導入し、イソプレノイド生産のシャーシ(土台)として広範な目的に利用可能な微生物株の作製を目指すと同時に、同経路を構成する酵素に関する理解を深める。古細菌および未培養真正細菌より単離した、古細菌型メバロン酸経路を構成する新奇酵素であるホスホメバロン酸脱水酵素(PMDh)およびホスホ-trans-アンヒドロメバロン酸脱炭酸酵素(AMPD)の酵素学的な解析を進め、いくつかの新たな知見を得た。一例として、真正細菌由来のAMPDが活性を発揮するには、補酵素であるプレニル化FMN(prFMN)による再構成が必要であるが、一般的な古細菌のAMPDが再構成にマンガンイオンを要求するのに対し、真正細菌由来のAMPDはマンガンイオンでは再構成されず、鉄イオンを要求するという特性が見出された。PMDhに関しては、いずれの生物種に由来する酵素であっても酸素存在下ですぐに失活し、応用目的において有利な酸素耐性の高い同酵素を得るには何らかの工夫が必要であると思われた。我々は、同酵素の活性中心に4Fe-4Sクラスターが存在することをEPR解析によって明らかにしており、その酸素感受性がPMDh失活の原因だと推察される。それらの新奇酵素を含む、古細菌型メバロン酸経路を構成する酵素群を大腸菌に導入し、揮発性テルペン化合物の大量生産系の構築を目指した。大腸菌を嫌気培養した際には、同経路の導入によって明らかにテルペン生産は向上し、ポジティブコントロールに用いた真核生物型メバロン酸経路導入株に匹敵する生産性が観察された。文献値と比較して明らかにテルペン生産量が低かったため、テルペン生合成系の酵素発現を最適化する必要性があると考えられた。hydrolaseを見出し、古細菌型メバロン酸経路の周辺で機能する補酵素の代謝経路とそれに関連する酵素群を同定できたことも成果の1つである。古細菌型メバロン酸経路の導入により、革新的なイソプレノイド生産のシャーシとなりうる微生物を作製するという最終的な目標については、メバロン酸経路の発現強化によって宿主である大腸菌の生育が悪化するといった現象が起き、今後対応すべき点が多く、現状では目標を達成できているとは言えない。その一方で、古細菌型メバロン酸経路中の新奇酵素の特性評価や、同経路周辺の新奇代謝酵素の発見など、酵素学的な研究は順調に進んでおり、代謝工学的な応用に不可欠な多くの知見が蓄積されつつある。ン酸脱水酵素(PMDh)とホスホ-trans-アンヒドロメバロン酸脱炭酸酵素(AMPD)という2つの新奇酵素について、反応機構解析とX線結晶構造解析を進める。PMDhの酸素感受性の原因を明らかにし、今後の同経路の応用に活かしていくために、酸素に耐性を示す同酵素を進化分子工学的な手法により作出することを目指す。酸素耐性PMDhの単離には、カロテノイド色素の生産を指標としたコロニースクリーニング系を用いることを予定している。AMPDの補酵素であるプレニル化フラビンモノヌクレオチド(prFMN)を合成するprFMN合成酵素について、AMPDとのタンパク質間相互作用などの興味深い性質が明らかにされている。そこでAMPDの活性化機構を検証し、同機構におけるprFMN合成酵素の役割を解明する。本研究課題の最終目的である古細菌型メバロン酸経路を利用したテルペン化合物の高効率な微生物生産については、古細菌型メバロン酸経路が酸素感受性であることと、テルペン生合成酵素が同システムのボトルネックになっていることが問題点として予想されている。前者については酸素耐性酵素の探索もしくは作出による改善を目指す。後者については、プロモーターの変更などの手段により問題点を改善し、古細菌型メバロン酸経路によるイソプレノイド生産の効率を正確に評価するとともに、既知の真核生物型メバロン酸経路との比較を行いたい。)プレニル基転移反応は、イソプレノイドという自然界で最大の天然化合物群の生合成に関わる酵素反応であり、この反応の生成物を変化させることでイソプレノイドの構造多様性を拡張することが可能となる。最近我々は通常の酵素が受け入れない化合物を基質とするプレニル基転移酵素を見出している。その基質認識機構を解明し、その知見をもとに他の酵素の厳格な基質認識を変化させることで、非天然イソプレノイドの合成を試みる。各種プレニル基転移酵素を対象として、それらの「緩い」基質特異性の物質生産への応用、およびその特異性の分子機構の解明を目指した研究を実施した。シス型プレニル基転移酵素に関しては、メタン生成古細菌より見出した、基質特異性の緩い同酵素であるMM_0014が、通常の基質であるイソペンテニル二リン酸の4位炭素へのプレニル基転移(C-プレニル化)反応だけでなく、グリセロールなど小分子アルコールの水酸基へのプレニル基転移(O-プレニル化)反応を触媒できることを、X線結晶構造解析や質量分析などにより明らかにした。古細菌膜脂質の生合成に関わるプレニル基転移酵素の緩い基質特異性を利用し、天然には存在しないC30という長い炭素鎖を有する古細菌膜脂質アナログの酵素合成、および大腸菌による生産に成功した。その他、近年我々が見出した古細菌型メバロン酸経路の中間体を、野生型および変異型の各種プレニル基転移酵素の基質とする実験も実施した。期待した結果を得ることはできなかったものの、その研究の過程で、同経路に関わる新奇酵素について、いくつかの新しい発見を行うことができた。ホスホメバロン酸脱水酵素が、真正細菌由来の近縁酵素に関する報告とは異なり、[4Fe-4S]型の鉄硫黄クラスターを活性中心に保持していることをEPR解析により証明した。ホスホトランスアンヒドロメバロン酸脱炭酸酵素がプレニル化フラビンを補酵素とすることを再構成実験により証明した。令和2年度が最終年度であるため、記入しない。pernixの持つ、炭化水素鎖の長いイソプレノイド膜脂質を大腸菌に大量生産させ、その膜の物性を変化させる「細胞膜エンジニアリング」技術の確立を目指して研究を進めた。ある古細菌型メバロン酸経路を見出したため、イソプレノイドの微生物生産に対する同経路の導入の効果を検討した結果、準嫌気条件で宿主を培養した場合にイソプレノイド生産が向上することが示された。本研究で取り扱った古細菌型メバロン酸経路は、既知のメバロン酸経路と比べ、エネルギー低消費型の代謝経路である。そのため、薬品や工業原料などの有用化合物を多く含むイソプレノイドの微生物生産に同経路を利用することで、宿主から生育に必要なエネルギーを大量に奪うことなく物質生産をさせることが可能になるかもしれない。厚く安定な細胞膜を構成することが予想される。したがって、大腸菌などの生体膜の性質を変化させて強い微生物を作る「細胞膜エンジニアリング」を今後確立する上で有用なツールとなりうる。mazeiに由来するシス型プレニル二リン酸合成酵素について、主に基質特異性に関する解析を進めた結果、同酵素が通常の基質を用いたC-プレニル化反応に加えて、短鎖アルコールをプレニル基受容体基質としたO-プレニル化反応をも触媒できることを明らかにした。このような広い反応性を示すシス型プレニル二リン酸合成酵素の報告は無く、それを可能にする基質認識機構に興味が持たれた。そこでX線結晶構造解析を実施し、同酵素の立体構造を明らかにすることに成功した。pernixは炭素数25のプレニル基を疎水性炭素鎖として有するC25古細菌膜脂質を特異的に生産する。我々はすでに、その生合成に関わるプレニル基転移酵素の遺伝子を同一の大腸菌に導入することで、C25古細菌膜脂質を生産させることに成功している。この系の遺伝子の一部を真正細菌由来のプレニル基転移酵素に入れ替えることにより、天然には存在しない、一部C30の炭素鎖を有する古細菌膜脂質の合成に成功した。古細菌の比較ゲノム解析を行うことで、過去に見出された複数種類のメバロン酸経路のいずれとも異なる変形メバロン酸経路に関与する候補遺伝子を見出し、組換えタンパク質を用いてその酵素活性を明らかにし、メバロン酸経路への関与を証明した。新奇な代謝中間体であるホスホ-trans-アンヒドロメバロン酸を経由する同経路は、大部分の古細菌に分布していると予想されたため、古細菌型メバロン酸経路と命名した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。)アーキアの膜脂質の構造は、バクテリアや真核生物といった他生物の膜脂質とは大きく異なっている。その構造の違いにより、アーキア膜脂質で構成された膜はイオンなどの小分子の透過性が低く、その性質が極限環境におけるアーキアの生育を可能にしていると考えられている。そこで我々はアーキア膜脂質をバクテリアである大腸菌に生産させることで、その細胞膜の強化を図っている。大腸菌への導入を実施した。膜の強化に対してより高い効果が期待される、超好熱性アーキア特異的な膜脂質の生合成経路を明らかにし、同脂質の大腸菌における生産系を構築した。University。