味覚項目において苦味及び渋味以外の項目では、人の味覚で試料間の味の違いを識別できることが数値として示された。各味覚項目とその項目から連想される清酒中の成分や官能評価結果との間に相関関係が確認された。味巾や熟度などを判断する指標としても味覚センサーが活用できる可能性が示唆された。群馬の地酒は、各味覚項目で様々な数値を示しており、今回の結果からも味のバリエーションに富んでいることがわかった。(現大阪国税局)鑑定官室長に市販酒調査会に審査員として参加して頂いた。クーロメトリー1)は、電池と同様に酸化還元電位の差を駆動力として、酸化還元反応によって流れた電気量から目的物質の絶対量を測定する方法である。この自己駆動型クーロメトリーとFADグルコース脱水素酵素(FAD-GDH)を用いたグルコース測定法を開発して、日本酒モロミ中のグルコース測定に応用できた。クーロメトリーの測定セルは市販アクリル樹脂製透析セルを加工して作製した。電極にはカーボンフェルトを用い、アノードにはリン酸緩衝液(pH6.0)を含侵させ、カソードには被還元物質となるK3[Fe(CN)6]溶液を含侵させた。試料となるグルコース溶液および酵素反応液(GOD、2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ベンゾキノン(UQ0)、ムタロターゼを含む)をそれぞれ個別にN2ガスで脱酸素したのち,所定量を混合してN2ガスによる脱酸素を行いながら,次に示すGODによる酵素反応を5分間行った。酵素反応終了後の溶液10μLをD-グルコース+UQ0→グルコノ-1,5-ラクトン+UQ0H2自己駆動型クーロメトリーの測定セルのアノードに注入した。クーロメトリー測定は約3分で終わり、得られたグルコース濃度は吸光度法(グルコースCII-テストワコーを使用)により得られた濃度とよく一致した。大吟醸酒のモロミをろ過して、40倍希釈してグルコース測定したところ、吸光度法により得られた濃度とよく一致した。日本酒には本法の測定の妨害となる酸化還元物質は含まれておらず,簡便・迅速・低コストのグルコース測定法として,醸造現場で利用可能と考えられる。センター)【目的】ジアセチルは、ほとんどすべての発酵飲食品の品質を左右する重要な香味成分である。これまで飲料中のジアセチルに関して多くの研究がなされている。「ジアセチル」として測定されているにも関わらず、実際にはその前駆体や同族体も含んでいたりするなど不正確なものが多く、ジアセチルについての正確な知見は乏しい。ジアセチルの分析は、清酒にジクロロメタンを添加し4°Cで溶媒抽出した、後、内部標準を添加しGC-MSにより解析する方法により行った。総米40kgでの醸造試験を実施し、ジアセチルとペンタンジオンの消長を解析した。【結果】ジアセチルおよびペンタンジオンを0.1ppmの濃度で添加した清酒を用いて添加回収試験を実施したところ、回収率はそれぞれ93%、102%と良好な結果が得られた。清酒醸造過程でのジアセチルとペンタンジオンの消長についても定量分析を実施した。清酒もろみでのジアセチル(DA)とペンタンジオン(PD)の量比DA/PDは0.1~1.0の間にあるのに対して、火落ちした清酒ではDA/PD比が0.1未満になることが明らかとなり、火落ちした清酒の判別にDA/PD比が有効であることが示唆された。醸造に不必要な微生物が混入することで4-ビニルグアヤコール(4-VG)などのオフフレーバーが発生し、商品価値の低下を招くことがある。我々は、以前より秋田県内の清酒製造場の麹の微生物検査を定期的に行うことで、麹室を中心とした製造場内の衛生環境の改善を支援していた。これまでは製造場内の微生物叢を調べるために培養法を用いていたが、同法は結果が出るまでに時間がかかることやコロニーの形態から微生物を同定するのは困難であることから、PCRを用いた微生物の検出法について検討することとした。【方法】本県の清酒製造場内の拭き取り検査を実施(約150点)し、寒天培地を用いて培養した。生育したコロニーからダイレクトPCRを行った。プライマーは一般的な16SrDNA検出用(バクテリア)と26SrDNAのD1/D2領域(真菌)検出用を使用した。次に、PCR条件の最適化を行うために、反応系に米麹懸濁液(PCR阻害を想定)を添加/非添加でPCRを行い、ポリメラーゼの評価を行った。米麹を試料として、単離した微生物に特異的なプライマーを設計し、PCRによる検出を試みた。【結果】県内の製造場内の拭き取り検査の結果から、単離した83点の微生物を同定したところ、その多くはBacillus属やミクロコッカス科のStaphylococcus属およびKocuria属の細菌、または野生酵母であり、これまでの研究と同様の結果であった。PCR条件の検討に用いた5つのポリメラーゼでは増幅効率に最大で2.4倍の差が見られた。同定結果を基に16SrDNA配列内で特異的なプライマーを設計し、米麹に生育するStaphylococcus属やBacillus属などの検出を行ったところ、定性的な検出は可能であることが分かった。現在は検出限界の設定など詳細な条件検討を行っている。rouxii等の発酵により生成されている。品質の安定した味噌を製造する目的で,仕込時に培養した耐塩性酵母の添加が行われている一方,蔵つきの耐塩性酵母を利用した味噌製造も行われている。広島県の酵母資源として活用を図ることを目的に,県内で製造された味噌から分離した蔵つきの耐塩性酵母の特性を明らかにした。【方法】4製造所の6種類の味噌から分離した32株の耐塩性酵母を供試した。生育特性として,食塩濃度と生育域,生育温度域及び糖類発酵性及び資化性を調査した。生育pH域(30°C)は,食塩3MでpH3.5~6.5に幅広く生育を示すものと,pH3.5~5.5のみよく生育するものに分かれた。生育温度域(食塩2M,pH5.5)は,15~40°Cで生育するものがほとんどであった。糖類発酵性及び資化性は,ガラクトース,マルトース,スクロース,トレハロースについて,株による違いがみられた。rouxiiの分類グループを判定するプライマーによりPCR増幅され,基準株グループもハイブリッドグループも存在した。ほとんどの株が分類されたグループ由来のMATaかMATαと解析できたが,MATaの前半部分がP-サブゲノム由来,後半部分がT-サブゲノム由来となっている株があった。沖縄県の伝統的酒類である泡盛は日本で最古の蒸留酒である。泡盛の製造工程の中で蒸留は酒質に大きく影響することから、ウイスキーなどの蒸留法を参考に県内12酒造所による共同開発が進められ、2019年に3回蒸留泡盛「尚」が商品化された。常圧蒸留を3回繰り返すという特徴から、従来の常圧あるいは減圧で蒸留した泡盛との成分バランスの違いに興味が持たれる。本研究では、3回蒸留泡盛の化学分析とともに、本法に適した泡盛酵母を用いた醸造を行った。複数銘柄の3回蒸留泡盛とともに、これらの酒造所に対応する常圧蒸留および減圧蒸留で製造した泡盛を試料とした。本法に適した酵母の候補として、育種により開発した泡盛酵母T251)を用い、泡盛の試製は神村酒造の製造スケールにて実施した。3グループに明確に区別され、さらに3回蒸留泡盛は銘柄間の差異が大きかった。alcoholの濃度が低いこと、さらに濃度が高い香気成分は銘柄間でのばらつきが大きいことが判明した。次に、3回蒸留泡盛の特徴を生かした泡盛醸造条件を検討した。acetateを豊富に含む泡盛醸造が可能である。acetateの濃度が高かった。以上の結果から、T25株は3回蒸留泡盛の特徴を引き出せる酵母であることが示された。T25株を用いた3回蒸留泡盛として「尚KAMIMURA」が商品化された。mde-D1は、老香の主成分であるジメチルトリスルフィド(DMTS)の前駆体DMTS-P1の生産性が低下した株で、老香の低減に有効である1)。本株は、親株であるK701と比較し、増殖が遅いなど醸造特性に違いがみられ、もろみ管理等に工夫が必要である2)。本株をより多くの製造場で利用していただくため、R1酒造年度は日本醸造協会より酵母の試験販売を行い、製成酒や製造条件に関する情報を収集した。本発表ではその解析結果について報告する。令和2年1~3月に試験販売を行った。酵母を購入した製造場には、製成酒の提供と製造条件等に関するアンケートへの協力を依頼した。対照仕込みを行った場合、対照酒についても同様に依頼した。製成酒について、DMTS-P1濃度とDMTS生成ポテンシャル(DMTS-pp、70°C1週間貯蔵後のDMTS量)を測定した。アンケートでは、酵母の培養条件や添加量、酒母・もろみの製造条件、製成酒の一般成分等について回答を求めた。酵母を購入した36社のうち30社から、製成酒とアンケートの回答が得られた。製成酒の分析の結果、mde-D1製成酒のDMTS-P1濃度およびDMTS-ppの平均値は、対照酒の1/10程度であった。mde-D1製成酒36点のうち34点はDMTS-ppが検知閾値(0.18μg/L)以下であり、様々な製造条件においてもDMTSの生成が低レベルに抑えられることが示された。発表ではアンケートの解析結果もあわせて報告する。5岡山理大・理)【目的】4-ビニルグアイヤコール(4-VG)は、煙・スパイス様の香りをもつことから、清酒のオフフレーバーの一つとされる。きょうかい酵母はフェルラ酸脱炭酸反応を触媒するPad1p/Fdc1pのFDC1ナンセンス突然変異のため4-VGを生産しないが、野生酵母ではしばしば4-VG生産がみられ、清酒醸造の妨げとなっている。野生酵母における4-VG生産/非生産酵母の分布、4-VG非生産株の4-VG非生産の遺伝的要因の知見はほとんどない。分譲された醪由来酵母と花酵母24株の4-VG生産能を観察したところ、31株が非生産株であり、野生酵母由来は7株のみであった。Pad1p/Fdc1pは桂皮酸の脱炭酸反応も触媒することから、4-VG非生産株の桂皮酸感受性を観察したところ、全ての株が感受性を示した。毒性回避能を欠損していることが考えられた。4-VG非生産株31株のうち3株はK7株同様、Fdc1pにナンセンス変異をもち、これら株は清酒酵母グループに属していた。fdc1Δ株の4-VG生産を相補できない4株が存在し、共にPFDC1に−354G>Tの変異があった。PFDC1-FDC1が正常な4-VG非生産株は、Pad1pに失活を伴う変異はみられなかった。これら株にはpad1Δ株の4-VG生産能を相補できないPPAD1-PAD1をもつ株もあった。以上、桂皮酸にさらされる環境下から単離される野生酵母は4-VG生産能を持つ可能性が高く、また野生株の4-VG非生産の遺伝的要因は多様であることが示された。)【目的】清酒において4-ビニルグアヤコール(4-VG)はオフフレーバーとされ、米に由来するフェルラ酸が脱炭酸されることで生産される。酵母による4-VG生産にはFDC1、PAD1両遺伝子の機能が必要であり、清酒酵母はFDC1に機能欠損変異をホモで有しているため、4-VG非生産となっている。当社の酒蔵の環境中より単離された蔵付き酵母U-01は、小仕込み時に4-VGを生産するものの、味の評価が優れていた。そこで本研究では、U-01の4-VG非生産株を育種することで、香味の優れた清酒を造ることを目的とした。【方法と結果】U-01のゲノムを解析したところ、7号系酵母とは系統が異なることが確認された。U-01はFDC1の機能欠損変異をヘテロで有していたことから、機能欠損型FDC1をホモ化することによる4-VG非生産株の育種を試みた。Heterozygosity;LOH)が起きた株の取得を目指した。結果、FDC1においてLOHを起こした株を複数取得することができた。これらの株においてPRO1に変異があったのは1株のみで、残りの株においてはPRO1の変異は見られなかった。PRO1非変異株がどのようにAZC耐性を獲得したのかは現在解析中である。FDC1の機能欠損変異がホモ化した株で小仕込み試験を実施したところ、4-VG非生産となっており、醸造された清酒は特徴的な甘酸っぱい香りや奥行きのある甘味を有していることを確認した。大型スケールでも、同様に特徴ある清酒を醸造することができた。本研究は非・清酒酵母のオフフレーバーのみを排除することで通常の清酒酵母では出すことの難しい香味を実現したものであり、清酒の多様化に資するものと考えられた。)【目的】きょうかい7号系の清酒酵母は,急性のストレスには感受性であるが,高いアルコール発酵力を示すことが知られている。この現象の逆を利用すると,ストレス耐性はあるがアルコール発酵力の低い実験室酵母からストレス感受性変異株を選抜することで,高発酵力変異株を取得することができる。今回,取得した変異株の変異遺伝子を解析したので報告する。【方法と結果】実験室酵母の一倍体を変異処理して熱ショック感受性株を取得し,それらの清酒小仕込試験を行った。その結果,熱ショック感受性変異株の一部は高いアルコール発酵力を示すことがわかった。高発酵力を示した変異株6株について,遺伝解析を行った結果,5株が劣性であった。劣性の5株について親株と交配し,胞子形成後のセグレガントの形質を調べた。その結果,いずれの株でもストレス感受性とストレス耐性が2:2に分離し,ストレス感受性が1遺伝子に支配されていることがわかった。これらの5株について相補性試験を行った結果,MD10を含む相補群が4株,MD102を含む相補群が1株であった。analysisによる変異点の同定を試みた。変異株を親株と戻し交配し,セグレガントをストレス感受性株とストレス耐性株に分けてプールした。全ゲノム解析により,ストレス感受性株プールには存在するが,ストレス耐性株プールには存在しない変異を検索した結果,MD10についてはRasのGAPをコードするIRA1に変異があることがわかった。MD10にIRA1を含むプラスミドを導入すると,ストレス感受性と高発酵性が相補された。ira1Δ株はストレス感受性で高発酵性であったが,MD10と交配しても,ストレス感受性も高発酵性も相補されなかった。以上の結果から,MD10はIRA1の変異によってストレス感受性かつ高発酵になったことが明らかとなった。)【目的】今日の清酒酵母菌株の主流は、きょうかい6号(K6、以下同様)、K7、K9、K10及びこれらの派生株である。これらは塩基レベルでは相互に極めて近縁だが、各系統内にも頒布年度や保存機関により、塩基レベルの多様性がある。これまで各系統内の染色体の構造多型に関する知見はない。より、染色体の構造多型の実態を調べることとした。異なる約150菌株について、CHEF方式の装置を用いてパルスフィールド電気泳動を行い、核型を観察した。【結果】各系統の核型を大まかに比較したところ、過去に報告のあるとおり、K10系統には、他の系統にはない特異的なバンドが共通して観察された。K6、K7、K9の各系統では、系統を超えて核型の類似性の高い株が存在する一方で、K10も含めた各系統内において、それぞれいくつかの核型の多型が認められ、各系統内に、染色体の構造多型が存在することが示された。醸造協会頒布株では、同名の年度違いの株間でも、醸造特性の傾向が概ね維持されていたこと1)を踏まえると、今回示された系統内での染色体の構造多型は、各系統に特徴的な醸造特性には大きく影響していないと考えられた。これまで核型多型については、菌株の判別への応用が検討されることもあった。今回の結果では、各系統に関し、系統内の一部で見られる特徴的な核型多型を指標として、それを持つ株に限定して系統の推定が可能な場合もあったが、それ以外は系統間の判別が困難なことも多かった。電気泳動核型による系統判別については、他にはない特徴的な核型を有するK10系統の判別以外には、汎用性や精度の面で実用的ではないと考えられた。近年は,京都市産技研独自で,香味に特徴の出る清酒酵母開発にも取り組んでいる。現在までに「京の琴(こと)」「京の華(はな)」「京の咲(さく)」「京の珀(はく)」,そして「京の(こい)」の5種類が「京都酵母」として実用化されている。個々の酵母の特徴は,実験室レベルでの小仕込試験や分析などにより見出されているが,製品レベルでの詳細な分析比較は行っていなかった。そこで本研究では,「京都酵母」を使用した市販清酒製品の分析・解析を行い,個々の酵母の特徴が市販清酒製品にどの程度現れているかを明らかにすることを目的とした。【方法】試料は「京都酵母」を使用した市販製品又は実製造規模で試験製造された清酒を用いた。分析項目は,アルコール度数,日本酒度,酸度,アミノ酸度のような清酒の一般的な分析項目に加え,GCによる香気成分,LC-MSによる有機酸,アミノ酸の組成分析を行った。最後に,得られた分析データを用いて主成分分析を行った。【結果と考察】主成分分析により,同じ清酒酵母を使用した試料のプロットが集約する傾向があり,原料米や仕込規模等が異なる清酒でも,使用した清酒酵母の特徴が表れていることが示唆された。5新潟大学農学部、6新潟県醸造試験場)【目的】清酒製造において、清酒酵母は、原料米と麹菌とともに清酒の品質を決定する大きな要因である。配布されているきょうかい酵母である場合が多く、清酒の安全な醸造や高品質化に大きく貢献している。一方で近年、酒類の多様化に伴い、より個性的でブランド力ある清酒製品が重要になるなか、酒造場の酒造道具や作業場内に存在する「蔵付き酵母」を利用することによって、製造者間における差別化を図る試みがなされている。Amplification(LAMP)法を用いた醸造用酵母の識別法を利用して、清酒製造場より酵母のスクリーニングを行ったところ、既存の清酒酵母とは異なる「蔵付き酵母」を選抜することに成功した。各酒造場の酒母及び醪から、TTC染色法とK7_02212遺伝子およびPPT1遺伝子を標的とするLAMP法をスクリーニング法として利用し、K7グループ系清酒酵母とは異なる酵母を分離した。いった生理学的特徴を解析し、K7グループ以外のきょうかい酵母との差異も調査した。【結果】本LAMP法を利用することにより、いくつかの酒造場から「蔵付き酵母」を分離することが可能であった。一部の酒造場からは、個性的な酒質の清酒が得られる「蔵付き酵母」が単離された1)。cerevisiaeとして同定され、生理学的特徴も、既存の清酒酵母とは異なることが明らかとなった。この分離株を用いた実地醸造試験の結果、香気と酸味に特徴をもった清酒が得られた。)【目的】4-vinylguaiacol(4-VG)等の揮発性フェノール臭物質は、原料由来のフェノール化合物が、微生物によって変換され生じ、ビール、清酒、ワイン等では、一般に異臭とされる。清酒酵母(1)、ビール酵母(2)、ワイン酵母の多くは、4-VG等を産生しないが、Saccharomyces属や、Dekkera/Brettanomyces属の野生酵母が混入すると4-VG等が産生されることがある。S.cerevisiae野生株は、4-VGを産生するが、その産生能には、PAD1とFDC1遺伝子がともに存在することが必須である(1-2)。本研究は、酵母の揮発性フェノール臭の産生機構を解明することで、酒類の品質向上に寄与することを目的としている。BY4741のPAD1遺伝子は、大腸菌のユビキチン合成に関与し、フラビンモノヌクレオチド(FMN)のプレニル化する酵素をコードするubiX遺伝子(3)と相同性がある。Δpad1株に、大腸菌のubiX遺伝子を導入し、4-VG産生能が回復するかを調べた。Δpad1の空ベクター導入株は、4-VGを産生しなかったが、大腸菌のubiX遺伝子を導入した形質転換株では、4-VGが産生された。S.cerevisiaeのPAD1遺伝子には、53アミノ酸からなるミトコンドリア移行配列と想定される配列が存在していた。Δpad1株で発現させたところ、形質転換株では、4-VGが産生された。【考察】S.cerevisiaeの野生酵母では、PAD1遺伝子がコードするタンパク質によって、FMNがプレニル化され、これが補酵素となって、FDC1遺伝子がコードする脱炭酸酵素によって、フェルラ酸等が4-VG等、揮発性フェノール臭物質に変換されると推察された。この脱炭酸反応は、細胞質でおこなわれていると推察された。(群馬産業技術センター)【背景と目的】近年の清酒のニーズは多様化しており、蔵付きの乳酸菌を利用した生酛系酒母造りや、純米酒などの昔ながらの清酒も脚光を浴びている。群馬県では、蔵付きの酵母を利用した清酒造りに取り組む酒造会社や、きょうかい7号(K7)系の優良清酒酵母以前の酵母を使用してみたいという酒造会社もいる。K7系以前に取得された昔の清酒酵母の多くは泡有り酵母しかなく、現在の効率化した酒造りに合わせるためには、清酒酵母の泡無し化が必要となってくる。清酒酵母の高泡形成は、発酵の際に発生する二酸化炭素に吸着する細胞表層タンパク質Awa1pの働きによるものであることが分かっており、すでに泡無し化の手法が開発されている。そこで本研究では、酒類総合研究所や日本醸造協会が分譲可能であり、かつ泡無し株が頒布されていない清酒酵母の網羅的泡無し化を行った。Floatation法による泡無し化を試みた。得られた候補株については、水-ベンゼン混濁による簡易識別法により泡無し候補株を選抜した。総米200gの小仕込み試験により、親株の醸造特性の近い株を選抜した。Floatation法で泡有り株を泡に吸着させることに重要であった。酒類総合研究所から分譲されたK2株は泡無し株と判定されたが、それ以外の16の株泡有り酵母については、泡無し株を取得できた。北垣教授にピルビン酸低生産性K7を用いた泡無し化研究の許可を頂いた。血清のLDLコレステロールの増加は心疾患のリスクを上げることから先進国における深刻な健康問題である。血清LDLコレステロールは肝臓で作られ、その抑制にはスタチン系薬剤の投与が有効であることが示されているが、日常的に摂取できる食品素材も有力な選択肢のひとつであり、肝臓コレステロール低下効果のある食品素材を周知することは公衆衛生及び保険財政にとって重要である。これまでに我々は甘酒や酒粕、味噌、塩こうじ、濁り酒など日本の発酵食品の多くに含まれている麹グリコシルセラミドを肥満マウスに摂食させると糞中の胆汁酸が増加し、肝臓の代謝を活性化し、肝臓のコレステロールを低下させる効果があることを見出している1,2)ことから、その肝臓コレステロールを低下させる効果を他の食品素材と比較することを試みた。こんにゃくに含まれるグルコマンナン、ナマコのグルコシルセラミドなどの肝臓コレステロール低下効果を実験動物を使った研究の文献データから比較した。麹グリコシルセラミドの1wt%の3週間給餌は肝臓コレステロールを21%減少させたのに対し、オメガ3多価不飽和脂肪酸を含むオキアミ油の1.25%wt%の8週間給餌は23%減少させ、大麦食物繊維の5wt%の9日給餌は26%減少させた。本大会では、他の食品素材の結果と実験系も含めて肝臓コレステロール低下効果について考察したい。2]【1目的】烏衣紅曲は、中国の浙江省から福建省の地域で伝統的に黄酒醸造に用いられ、主に黒麹菌、紅麹菌および酵母でつくられる混合培養の散麹である。見た歴史的背景についての考察が報告されているが、紅麹菌や紅麹に由来する生物活性に関する報告はない。本研究では、紅麹菌と泡盛黒麹菌を用いて烏衣紅曲のモデルとして複菌麹を調製し、麹の性質について調べた。インディカ米を18時間水道水に浸漬し、水切り後に121oC、20分間オートクレーブ処理したものを麹原料米として用いた。麹原料米に黒麹菌および紅麹菌をそれぞれ植菌し、30oCで静置培養したものを種麹として用いた。麹原料米に黒麹と紅麹の種麹をそれぞれ任意の量で植菌し、1週間静置培養した。得られた烏衣紅曲検体から抽出液を調製し、糖化力分別定量キットを用いて糖化力を測定した。抗酸化活性は、DPPHラジカル消去活性測定法により測定した。抽出色素の吸収スペクトルと色価は、島津分光光度計(UV-1800)を用いて測定した。紅麹菌由来のシトリニンは、逆相カラムを用いた蛍光HPLC法により測定した。【3結果】複菌麹は、紅麹菌の種類に関係なく、黒麹単独と同程度の糖化力を示した。黒麹の種麹量は、複菌麹の糖化力に影響しないことが示唆された。purpureusで高い活性が観察された。pilosusで高い色価を示し、黒麹の種菌量が少ないことでより高い色価を示した。pilosusで調製した麹はシトリニンフリーであることが示唆された。2(株)セルイノベーター、3佐賀大学農学部)【目的】焼酎製造において、白麹菌は糖質加水分解酵素とクエン酸を高生産する。先行研究において、白麹造りにおける遺伝子発現を解析したところ、仕舞仕事の前後でNAD+依存的ヒストン脱アセチル化酵素をコードするサーチュイン遺伝子の発現が変化していた1)。そこで本研究では、白麹菌の糖質加水分解酵素やクエン酸などの生産におけるサーチュインの役割を明らかにすることを目的とした。【方法】白麹菌においてサーチュインをコードするsirA、sirB、sirC、sirD、sirEの単独破壊株を構築した。sirD破壊株については相補株を構築した。Expression)法によるトランスクリプトーム解析を行った。【結果】白麹菌におけるサーチュイン遺伝子破壊株のうち、sirD破壊株において酸度の低下、α-アミラーゼ活性の低下、および分生子形成数の減少がみられた。次に、トランスクリプトーム解析の結果、sirDの破壊により白麹菌のもつ11488遺伝子のうち、1314が発現上昇し、1590が発現低下したことが示唆された。発現が低下した遺伝子には、クエン酸トランスポーター遺伝子と耐酸性α-アミラーゼ遺伝子が含まれており、酸度とα-アミラーゼ活性が低下した結果と一致した。sirDの破壊による遺伝子発現の変化2)と、先行研究で取得した麹造りにおける遺伝子発現の変化1)を比較した結果、仕舞仕事の前後における遺伝子発現の変化の約3割にsirDが関与する可能性が示唆された。)【目的】ゲノム編集技術は、その効率の良さと簡便さから様々な生物種での利用が広がっている。本研究では、白麹菌におけるCRISPR/Cas9システムによるゲノム編集実験系を構築することを目的とした。【方法】まず、Cas9タンパク質の発現ベクターとして、自己複製配列AMA1、ハイグロマイシン耐性マーカー遺伝子hph、ならびにcas9遺伝子をもつプラスミドpFC3321)を用いた。AMA1、ピリチアミン耐性マーカー遺伝子ptrAをもち、白麹菌由来のU6プロモーターとU6ターミネーターでgRNAを発現するプラスミドpSG12)を構築した。次に、遺伝子ノックアウト効率を評価するためのターゲットとして分生子形成に必要な転写因子をコードするbrlA、硝酸資化に必要な硝酸還元酵素をコードするniaD、α-アミラーゼをコードするamyAを選択し、pSG1に各ターゲット配列を付加した。pFC322と、pSG1に由来する各gRNA発現ベクターを白麹菌にプロトプラスト-PEG法で同時に導入し、ハイグロマイシンとピリチアミンを含有する培地で形質転換体を選択した。取得した形質転換体の表現型の観察、ならびに各gRNAのターゲット配列のシーケンス解析を行った。【結果】一度の形質転換あたり平均約6株を取得した。取得した計32株の表現型を観察した結果、全ての株でbrlA、niaD、あるいはamyAのノックアウト株に特徴的な表現型が見られた。計16株のシーケンス解析を行った結果、全ての株でターゲット配列に塩基の欠損あるいは挿入が生じていることを確認した。以上のことから、白麹菌におけるゲノム編集実験系を構築できた。3酒総研)【目的】泡盛の代表的な香気物質の1つである1-octen-3-olは、泡盛における含有量の高さから、官能特性に影響を与える成分であると考えられているが、その生成機構は未解明である。luchuensisが製麹過程で本化合物を生産すること、その生合成に黒麹菌の脂肪酸オキシゲナーゼAlppoCが必須であることを報告した1)。今回は、3種の脂肪酸オキシゲナーゼAlppoA,AlppoC,AlppoD破壊株を用いた泡盛小仕込み試験を実施し、遺伝子破壊が蒸留液中の1-octen-3-ol含有量に与える影響を評価した。AlppoA,C,D過剰発現株を新たに構築し、遺伝子破壊株とともに麹を調製した。これらの麹における1-octen-3-ol生成量の比較解析から、本化合物の生成機構における各遺伝子の役割を考察した。【方法】AlppoA,C,Dの塩基配列は、黒麹菌ゲノムデータベースに基づいて取得した。AlppoA,C,D破壊株を用いた泡盛小仕込み試験では、得られた蒸留液における1-octen-3-ol含有量をSPME-GC-MSにより定量した。各遺伝子の過剰発現株は、アグロバクテリウム法を用いて構築した。遺伝子破壊株および過剰発現株を用いて調製した米麹における1-octen-3-ol含有量はGC-MSで評価した。【結果】AlppoC破壊株を用いて調製した泡盛蒸留液からは1-octen-3-olが検出されなかった。したがって、泡盛中の1-octen-3-olは黒麹菌のAlppoCによって生合成され、製造工程におけるその他の因子が生成に直接関与しないことが示された。AlppoAおよびAlppoD破壊株を用いて調製した蒸留液は、親株の蒸留液よりも1-octen-3-ol含有量が高く、麹の分析結果も同様の傾向を示した。AlppoAおよびAlppoD過剰発現株で調製した米麹は、親株の米麹よりも1-octen-3-ol含有量が低かった。これらの結果は、AlppoAおよびAlppoDが本化合物の生産を負に制御することを示唆した。AlppoCの過剰発現株で調製した米麹は、親株の米麹よりも1-octen-3-ol含有量が高かったことから、AlppoCの発現と本化合物の生産性に関連性があることが示唆された。2金工大・ゲノム研)精麦時に排出される小麦フスマ(WB)は1割がデンプン、3割がヘミセルロースで構成されている。ミセルラーゼ剤は種類が少ない。これらの市販酵素剤ではキシロース、アラビノースへの可溶化率は10-20%であり、組成の異なる酵素剤の開発が望まれる。我々は小麦フスマをクエン酸溶液でオートクレーブ処理し、デンプン質を酸加水分解する処理方法を開発した。SH34)の酵素抽出液は、アミラーゼ系酵素の生産がほとんどなく、β-キシラナーゼ、β-キシロシダーゼなどを高生産し、従来のへミセルラーゼ剤とは酵素組成が全く異なっていた。脱デンプンにはクエン酸溶液と熱水での処理が必要であり、従来法では小麦フスマの150倍の廃液が出てしまうという課題があった。luchuensis)に対して、実用化を目指した廃液が出ない前処理方法について検討した。従来法では小麦フスマ1gに対してクエン酸溶液を10倍量添加するが、本研究では2.5倍量とし、スプレーボトルで噴霧してスパテルで攪拌した。その後110°Cでオートクレーブ処理し、従来法の熱水洗浄工程を省略して60°Cで一晩乾燥させた。栄養源として酵母エキスと硫酸アンモニウムを添加して焼酎麹菌を30°Cで7日間培養し、菌体重量及びα-アミラーゼ、β-キシラナーゼ、β-キシロシダーゼの活性を従来法と比較した。菌体重量はWB及び従来法のSFWBと同程度であり、α-アミラーゼ活性はWBの25%程度となった。β-キシラナーゼ活性は70%、β-キシロシダーゼは343%となった。本研究によって、110°C、20分、2.5倍量の条件で、多量の廃液が出る熱水処理工程を省略した廃液が出ない脱デンプン処理方法を開発できた。昌弘(株式会社フジワラテクノアート)【目的】製麴条件は造りたい麴の品質により多様に存在し、製麴条件の修正は熟練者により麴の出来に応じて行われる。)により判断され、中でも視覚情報に依るところが大きい。5時点の米麴からそれぞれ100粒を任意に選定し、米麴の透過光画像を得た。)を行うアルゴリズムで機械学習を行い、「麹1粒クラス判定モデル」構築の検討を行った。入力は、32×32pixelの麹1粒画像、pixel値の度数分布、破精の輪郭検出により算出した破精の面積,周長,白黒比等を用い、出力は製麹担当者のクラス分類結果として学習を行った。入力とし、出麹100粒中の4クラスの各比率(破精分布)を出力とした、回帰アルゴリズムによる「破精分布予測モデル」構築の検討を行った。【結果】「麹1粒クラス判定モデル」については、各クラス2000粒、合計8000粒の麹画像を教師データとして学習した結果、正解率90%以上での判定が可能となった。「破精分布予測モデル」については、200パターン以上の製麹データを教師データとして学習した結果、予測精度の高いモデルを構築できた。製麹条件から出麹の破精分布予測が可能となることで、希望する破精分布を得るための最適製麹条件の情報提供が可能となった。)1目的:清酒の呈味性ピログルタミル(pGlu)ペプチドエチルエステルを生成する米麹酵素について検討した。2方法:米麹は黄麴菌RIB128株を用いて清酒タイプの麹を作成した。より調製した後、PD-10カラム処理した。酵素活性は、苦味ペプチド(pGlu)LFGPNVNPWHを基質として(pGlu)LFGP-エチルを生成する活性(Aタイプ酵素活性)及び同じ基質から(pGlu)LFGPNVNPW-エチル又は(pGlu)LFGPNVNPWを生成する活性(Bタイプ酵素活性)を、25mM乳酸Na緩衝液(pH3.0)、12%エチルアルコール存在下で測定した。生成するC末端カルボキシペプチドはHPLCによって、エチルエステル化ペプチドはDラベル内部標準物質を用いて高分解能MSにより測定した。3結果:米麹抽出液を弱陰イオン交換クロマトグラフィーにより分析したところ、ACP活性は複数のピークを示して溶出した。(pGlu)ペプチドエチルエステル生成活性はACP活性区分の一部と重複する比較的高い塩濃度域で溶出した。(pGlu)LFGPNVNPWHの加水分解活性及びエチルエステル生成活性はほぼ同じパタ-ンで溶出した。A,Bの活性は部分的に重複して溶出した。両タイプの活性を指標に麹抽出液から各種クロマトグラフィーによって酵素の精製を行った。途中のDEAE-5PW弱陰イオン交換クロマトグラフィーでA及びBの活性は分離した。最終的に得られた酵素標品のSDS-PAGE分析結果から多量の糖鎖の存在が示唆された。酵素Aは幅広い(pGlu)ペプチドに対して活性を示し、(pGlu)LFGP-エチル生成活性が酵素Bよりも強かった。酵素Bは(pGlu)LFGPNVNPWHに強い活性を示し、加水分解物と(pGlu)LFGPNVNPW-エチルを生成した。oryzae)は、日本の国菌に指定され、発酵産業の根幹となっており、中でも発酵食品は日本の伝統文化を伝える重要な食品となっている。麹菌は、二次代謝産物の生産に関する遺伝子を有しており、様々な二次代謝産物を生産することができる。麹菌の代謝経路の詳細はすべて明らかにされていない。生育培地の成分の違いによる代謝産物の相違について検討することにより、生産する物質を産業および工業的に有効活用できることが期待されている。酒造産業で使用される麹は米を培地として麹菌を生育したものであり、この時に使用される米はお酒の質に合わせて4~7割磨かれている。そのため、大量の米糠が副産物として産出されている。米糠には油脂成分や水溶性成分の栄養成分が含まれている。油脂成分においてはγ-オリザノール、フェルラ酸、トコフェノール、水溶性成分にはビタミンB群、イノシトール、フィチン酸などが含まれている。これらは産業廃棄物として廃棄されている。米糠に含まれている成分は人体および工業的に有用な成分であり、それぞれの成分について幅広い応用の可能性がある。そこで本研究では、米糠に含まれている水溶性有用成分に着目し、米糠を培地として麹菌を培養し、生産された酵素を有効利用することを目的とした。【方法】YPD培地と米糠YPD培地、米糠液を作製した。米糠YPD培地には米糠液の最終濃度を5%とした。それぞれの培地に清酒麹とRIB40を植菌し、18時間振盪培養を行った。その後、SDS-PAGEを用いて、生産されたタンパク質の相違の検討を行った。【結果】SDS-PAGEの結果より、YPD培地と米糠YPD培地、米糠液からそれぞれ異なるバンドが見られた。このことにより、麹菌は培地の異なる栄養成分によって、異なる物質を生産したと考えられる。(大阪ガス株式会社)【目的】蒸米や炊飯米を放置すると、老化と呼ばれる現象が生じ、水分や結晶構造が変化すると同時に、消化性が低下する。酒造りにおいては、醪中での米の溶けやすさを制御するために、その特性を利用し、掛米を老化させることが多い。老化環境が消化性に及ぼす影響については、詳しく知られていない。そこで、本研究では、酒造用原料米の老化環境と消化性の関係性についての評価を試みた。70%のH28年産「五百万石」(福井県産)を用いて蒸米を作成した。その後、以下の異なる3条件で蒸米を老化させた。115°C密閉保管、215°C開放保管、315°C風速約2m/sの風を当てて保管。上記1~3の条件で老化させた米に対し、老化開始から1時間毎に米を一定量採取し、含水率測定、XRD測定、消化性測定(Brix値測定)を実施した。【結果】本試験の結果、1密閉で保管した米は、保管時間に伴った含水率変化は生じず、結晶構造は保管時間に伴い変化し、消化性も保管時間に伴い低下した。一方で、3風を当て保管した米は、保管時間に伴い含水率が大きく低下したものの、結晶構造は変化せず、消化性の変化も見られなかった。1、3の結果の中間的な変化を示した。以上の結果から、酒造用原料米の老化環境が結晶構造の変化に影響を及ぼし、さらには消化性にも影響を及ぼすことが分かった。したがって、現場環境で老化程度および消化性を予測することが重要であると示唆された。現場での老化米の消化性予測を行う上で、老化程度を評価する技術は既にいくつか報告されているが、本研究では、老化米の画像解析によってリアルタイムに消化性を予測する手法を構築し、本手法を用いて予測した消化性は、測定で得た消化性との相関があることを確認した。これまでに、浸漬過程の可視化を通して、酒造用原料米の浸漬時に発生する水浸裂傷や吸水率の経時的な定量評価の手法を開発し1),2)、水浸裂傷が吸水を加速させることを示した。その影響力の評価については定性的なものに留まっていた。そこで本研究では既存の水分拡散モデル内に水浸裂傷の影響を組み込むことで、水浸裂傷が吸水に与える影響のモデル化を試みた。【方法】H29,H30年産「祝(京都)」「山田錦(兵庫)」、「五百万石(京都)」「五百万石(福井)」「雄町(岡山)」「吟吹雪(滋賀)」「おくほまれ(福井)」計2ヶ年各7種類の玄米を精米歩合60%まで精米し、白米水分12%に調湿後、試験に供した。吸水過程の撮影は既報1),2)に従い実施し、水浸裂傷発生のモデル化と予測含水率の算出をおこなった。基本となる水分拡散モデルとしては既報3)のFickの拡散方程式における球体モデル(以下、既存モデル)を用い、水浸裂傷の発生を球体分割による球体半径の経時的な減少に帰することで、水浸裂傷の影響を組み込んだモデル(以下、Crack-ABSモデル)とした。【結果と考察】既存モデルを食用米の浸漬過程に適用した場合、決定係数が0.98となることが報告されているが3)。本試験において酒造好適米に適用した場合、0.64となり、精度が低くなった。対して、Crack-ABSモデルを適用した場合は0.99となり、水浸裂傷の影響を球体分割として組み込むことで酒造好適米の吸水をモデル化できることが明らかとなった。実測値とモデルの曲線形状に着目すると、雄町において、その差が大きいことが分かった。雄町は総水浸裂傷長が全試料中最も長いことから、水浸裂傷の発生個所が吸水部である確率も高く、モデルにおいて水浸裂傷が吸水に与える影響が過大評価されたためであると推察された。株式会社サタケ)【目的】清酒製造において、精米は清酒の風味に大きな影響を与える重要な工程であり精米歩合とともに、白米形状も大きな影響と考えられている。(n=2)、製成酒の醸造酒メタボライト分析法(n=3)などによる分析を行い、特性を解析してきた。精米歩合(40%-70%球形白米)と清酒成分(清酒メタボロームデータ)との関連を解析するために、OPLS回帰分析を行ったところ、非常に精度の高い回帰式を作成することが出来た。このことは精米歩合と清酒成分が密接に関連するとともに、清酒の成分から球形白米の精米歩合が予測できることを示す。そこで、原形・扁平白米の清酒成分から、各精米歩合を予測したところ、実際の精米歩合よりも低く予測され、原形・扁平の40%、50%、60%白米は、球形白米の約20,35,50%と予測された。我々はさらに清酒のメタボローム解析を実施して、各精米歩合および白米形状の清酒への影響について検討を行った。【方法および結果】これまでに行った主成分分析の解析結果から、大きく3つのグループに分けられるように見えたことから、各清酒のメタボロームを用いて、複数の方法で階層型クラスター解析を行った。その結果、いずれの方法でも3つの大きなグループに分かれた。70%原形、60,70%扁平白米の清酒が他の清酒と大きく異なり、さらに、50,60,70%球形白米の清酒群とそれ以外の清酒群に分かれた。胚芽残りクラスター、球形50%以上のクラスター、球形40%・扁平50%・原形60%以下のクラスターに分かれることとなった。これらの結果は、3つのクラスターと玄米の構造との関連を示唆する。これらそれぞれのクラスター間で、清酒成分どのような成分に違いがあるのかについては現在解析中である。梶原一信,橋本悠希,川上晃司(株式会社サタケ)大場健司,荒瀬雄也,山﨑梨沙,大土井律之(食品工業技術センター)【目的】我々はこれまでに,扁平精白米と球形精白米の酒造適性について報告した1)2)。1号」の精米歩合60%,50%の球形精白米,精米歩合60%,50%の原形精白米,精米歩合60%の扁平精白米を使用した。各試料は,(株)サタケ製小ロット醸造精米機(EDB15A)で,砥石にcBNロールあるいはGCロールを使用して精米した。原形精白米の精米歩合50%で砕米率が最も高くなり,扁平精白米の60%で胚芽残存率が最も高くなった。球形精白米の無効精米率は,原形精白米,扁平精白米と比較して高くなった。精米歩合60%の粗タンパク質は,球形精白米(4.7%),原形精白米(4.3%),扁平精白米(3.8%)の順で減少した。球形精白米の精米歩合50%と原形精白米の精米歩合60%の粗タンパク質が同等であり,扁平精白米の精米歩合60%の粗タンパク質は更に少なくなった。脂質および無機成分は,球形精白米,原形精白米に比べて扁平精白米で多くなった。これは,胚芽残存の影響と考えられる。20分および120分吸水性については,球形精白米の方が原形精白米,扁平精白米より高くなり,原形精白米と扁平精白米は同等であった。蒸米吸水性は球形精白米が一番高く,次いで原形精白米,扁平精白米となった。これは,球形精白米に比べて原形精白米,扁平精白米は吸水速度と最大吸水率が小さく,保水力が小さいことを示している。各精米形状で吸水速度が異なる傾向があることから,形状によって吸水時間を調整する必要があると考えられる。(福島県ハイテクプラザ会津若松技術支援センター)【目的】福島県内の酒造場では、県産酒造好適米を用いた特定名称酒の製造量が増加しており、「夢の香」に続く新しい県オリジナル酒造好適米の開発が望まれていた。そこで、福島県農業総合センターと共に栽培特性や醸造特性に優れた品種の育種選抜を進め、令和元年に「福乃香(ふくのか)」が新たに品種登録された。「福乃香」はタンパク質含量が少なく、軽快かつ上品な酒質になりやすい。大きな心白を持ち、溶解性が高く、アルコール収得に優れている。心白発現率が高く、心白も大きいため、高い精米技術が必要である。適切な扁平精米プログラムを設定することにより、精米歩合40%の高精白を達成した。扁平精米試料は精米が進むにつれ均等に厚みが削られていることを確認した。粗タンパク含量については、低精白米において、扁平精米で効果的に減少できることを確認した。カリウム含量は精米形状によらず、精米歩合とともに減少した。「福乃香」は心白が大きいため、初期吸水が早く割れが生じやすい。このことについて、扁平精米のほうがやや吸水が早い傾向があり、精米形状によって吸水速度に影響を及ぼす可能性が示唆された。どちらの精米形状でも浸漬時の水温を調整することによって吸水速度が緩やかになることを確認した。このことから、心白の大きい原料米であっても、適切な原料処理を行うことで浸漬割れを防ぐことができると考えられる。【目的】4-ビニルグアイヤコール(4-VG)は、煙・スパイス様の香りをもつことから、清酒のオフフレーバーの一つとされる。きょうかい酵母はフェルラ酸脱炭酸反応を触媒するPad1p/Fdc1pのFDC1ナンセンス突然変異のため4-VGを生産しないが、野生酵母ではしばしば4-VG生産がみられ、清酒醸造の妨げとなっている。野生酵母における4-VG生産/非生産酵母の分布、4-VG非生産株の4-VG非生産の遺伝的要因の知見はほとんどない。分譲された醪由来酵母と花酵母24株の4-VG生産能を観察したところ、31株が非生産株であり、野生酵母由来は7株のみであった。Pad1p/Fdc1pは桂皮酸の脱炭酸反応も触媒することから、4-VG非生産株の桂皮酸感受性を観察したところ、全ての株が感受性を示した。毒性回避能を欠損していることが考えられた。4-VG非生産株31株のうち3株はK7株同様、Fdc1pにナンセンス変異をもち、これら株は清酒酵母グループに属していた。fdc1Δ株の4-VG生産を相補できない4株が存在し、共にPFDC1に−354G>Tの変異があった。PFDC1-FDC1が正常な4-VG非生産株は、Pad1pに失活を伴う変異はみられなかった。これら株にはpad1Δ株の4-VG生産能を相補できないPPAD1-PAD1をもつ株もあった。以上、桂皮酸にさらされる環境下から単離される野生酵母は4-VG生産能を持つ可能性が高く、また野生株の4-VG非生産の遺伝的要因は多様であることが示された。XタイトルとURLをコピーしました。