地球上の生物に普遍的なシステムであり、生体内の1日周期のリズムを支配する。サイクルにより、多様な生理機能がリズミカルな制御を受けている。現代社会において、シフトワークや社会的な時差ぼけなどによる概日リズムの乱れが深刻化しており、睡眠障害だけでなく、がんや代謝性疾患などのさまざまな疾患につながることが報告されている。概日時計に関連する疾患の分子メカニズム解明や治療に向け、時計タンパク質を標的とする低分子化合物は有用なツールとなる。本稿では、これまでに同定されたユニークな時計調節化合物と、創薬の可能性について解説する。)申請者は概日リズムの周期を変化させる新規化合物を発見して鍵となる制御機構を明らかにしてきた。本研究では標的タンパク質が未同定の時計調節化合物を用いることで時計タンパク質のPERを標的とするfirst-in-classの化合物の発見を目指す。PERは睡眠リズム障害などにも関与していることから、PERの機能制御を可能にすることで概日時計システムの理解と創薬への応用に新たな可能性を切り拓きたい。)概日リズムを制御するCRYタンパク質は睡眠リズム障害など様々な現代病に関与し、有力な創薬ターゲットとして期待される。シミュレーション・分子デザインの融合から、概日時計ネットワークにおいて多彩な機能をもつCRYの天然変性領域の構造多型性を解明し、各構造に特有の機能を選択的に制御する機能改変を生成的デザインによって実現する。)睡眠・覚醒などの日内リズムを支配する概日時計の攪乱は、睡眠障害や代謝疾患などの現代病に関連する。私たちは概日時計の機能を調節する化合物を世界に先駆けて発見してきた。治療法開発にアプローチする。)睡眠・覚醒など様々な生理機能の日内リズムを支配する概日時計について、私たちが世界に先駆けて発見した独自の時計調節化合物を用い、新たな時計タンパク質の発見や概日リズムの自在な制御を可能にする新技術を開発する。これらの革新的な技術を用いて、分子メカニズム解析から組織・個体における機能制御を統合的に行い、従来の分子遺伝学研究を超えて概日時計システムの作動原理を徹底解剖する。)申請者は概日リズムの周期を変化させる新規化合物を発見して鍵となる制御機構を明らかにしてきた。多細胞から成る概日時計システムの理解に向けて解明すべき重要課題が、細胞間の相互作用である。本研究では時計調節化合物のケージド誘導体を用い、狙ったタイミングに狙った細胞で概日時計を定量的に操作する新技術を生み出す。これを概日リズムの1細胞イメージングに応用し、細胞間相互作用の時空間的な解析に挑戦する。概日時計は分子から個体の各階層を時間・空間的に統合して多様な生理現象の日内リズムを生み出す。申請者はケミカルバイオロジーの手法を応用し、概日リズムの周期を変化させる新規化合物を発見して鍵となる制御機構を明らかにしてきた。多細胞から成る概日時計システムの理解に向けた次のステップとして解明すべき重要課題が、細胞間の相互作用である。これまでに時計調節化合物longdaysinをもとにケージド誘導体を開発し、時間的な精密制御を実現した。本研究ではこのようなケージド時計調節化合物を用い、狙ったタイミングに狙った細胞で概日時計を定量的に操作する新技術を生み出す。これを概日リズムの1細胞イメージングに応用し、細胞間相互作用の時空間的な解析に挑戦する。本年度は1細胞レベルの概日リズムを測定する顕微鏡システムにおいて、ケージド化合物の活性化に必要な紫色光の照射条件の検討を進めた。光源を変更し、さらにUVをカットするフィルターを用いても、長期的な測定においては光照射による細胞毒性が見られたため、照射時間や強度の検討を行っている。並行して、光によってトランス体とシス体に構造変化するアゾベンゼンを光スイッチとしてlongdaysinに導入し、標的タンパク質であるCKIの活性をUV光と白色光を用いて可逆的に制御することに成功した。テトラフルオロアゾベンゼンを用いることで可視光(緑色光と紫色光)による調節を可能にし、細胞集団において概日リズムの周期を可逆的に変化させることに成功した。光スイッチを導入したlongdaysinを開発し、概日リズム周期の可逆的な制御に成功した。ケージド化合物および光スイッチ化合物を用いて条件検討を進め、概日リズムの局所的な操作を可能にすることにより、細胞間相互作用を解析する。)哺乳類の概日時計を構成するCRYタンパク質には、CRY1とCRY2というよく似たホモログが存在する。これらの機能的な差異の解析は、概日時計がどのように正確に発振するのか、いかに生理機能を調節するのか、という根本的な疑問に対するよいモデル系となる。本研究では、CRY1とCRY2のそれぞれに選択的な新規化合物を見出し、その作用機序を解析することでCRY1とCRY2の特異性を生み出すメカニズムを明らかにした。CRY1とCRY2は配列が非常によく似ているため、選択的な化合物のデザインは困難であった。本研究では、配列がほぼ同一である化合物結合ポケットに対して選択性を生み出すユニークな化合物を見出し、それらの作用機構を解明した。概日時計が乱れるリズム障害は現代社会における深刻な問題となっており、本研究による制御機構の理解と特異的な調節ツールの開発は、CRYを利用した疾患治療法の開発に向けた重要な足がかりとなるであろう。細胞内には約24時間周期で遺伝子発現のリズムが刻まれており,その制御にはヘムやCOといった生体内小分子が関与していると考えられているが,その詳細は明らかではない。本研究では従来の遺伝子工学的手法では制御が困難なヘムおよびCOに対して,これらの動態をコントロールすることのできるケミカルツール群を開発して活用することにより,ヘムとCOがクロストークする概日リズム制御機構の一端を明らかにすることを目的とする。本研究では細胞内概日リズム制御におけるヘムと一酸化炭素のクロストーク性を解明することを目的としており,2021年度にはそれを可能とする化合物群の合成と,細胞内一酸化炭素を計測するための独自のアッセイを確立して報告した。細胞内一酸化炭素を捕捉するためのケミカルツールhemoCDを用いたアッセイを確立した。動物体内の細胞には微量の内因性一酸化炭素(CO)が常時存在するが,それを簡便かつ正確に計測する方法はこれまでに報告されていなかった。我々は細胞内や動物組織内に含まれるCOをhemoCDを使って簡便かつ正確に計測することを試み成功した。この定量方法により,デキサメタゾンで同期化した細胞内に含まれるCOの産生には概日リズムが存在することが明らかとなった。動物を用いて組織内に含まれるCOの定量方法を確立した。この手法は,内在性COのシグナル伝達物質としての機能解明に役立つだけでなく,過剰のCOを吸入した体内における毒性メカニズム解明にも役立てることができ,論文公表後にプレスリリースにより広く周知した。その結果種々の共同研究および知財としての権利化を遂行することとなった。moleculeの開発,ヘムオキシゲナーゼによって分解されてもCOを発生しないメソメチルヘム誘導体の合成にも成功しており,次年度からの研究に貢献するケミカルツールが種々揃っている段階である。当初計画したとおりにケミカルツールの合成を進めており,それぞれを成果として報告できている。一方でCOVID-19の影響により研究分担者との往来を控える傾向にあったために,研究分担者との連携による概日リズム現象のキャラクタリゼーションには着手できていない状況である。2022年度には感染状況に配慮しつつ我々の研究室で合成したケミカルツールを用いて概日リズム関連の有効な共同研究を遂行する予定である。新規膜透過性CORM,およびメソメチルヘムなどのケミカルツールの添加がもたらす細胞内概日リズムへの影響を研究分担者である廣田氏の協力のもとに観測することである。上記の3つのケミカルツールを使用することにより,細胞内COおよびヘム濃度を自在に調節することが可能であり,これらの濃度変化が転写因子CLOCKおよびNPAS2の転写活性に与える影響についてダイレクトに可視化する。今年度が最終年度であることから,当研究計画の最終目標であった概日リズムの自在制御についても挑戦する。ヘムやCOの濃度を変えることにより,概日リズムのフェーズを人為的にシフトさせることができるかどうかの可能性を探る。ひとつの目標として,昨年度までに我々の研究室で合成したケミカルツールあるいは確立したアッセイについて,論文として公表する。それぞれの成果について新規性のあるものについてはすでに特許出願により権利化しており,これらをさらに成果として社会に還元するためにも公知の事実として公表するとともに関連企業との共同研究の展開にも注力することが最終年度における到達目標である。)概日リズムの振幅は肥満や老化によって減少し、生理機能の調節における重要性が知られているものの、分子レベルの理解が遅れている。本研究は概日リズムの振幅の制御機構にケミカルバイオロジーの手法を用いてアプローチすることを試みた。化合物スクリーニングからリズム振幅を増加させる新規化合物を発見し、作用機序を解析した。研究を進めることにより、振幅制御の理解が深まると期待できる。本研究により、振幅を増加させる新規化合物を発見した。このようなユニークな化合物が起点となり、将来的には概日リズム疾患の治療への応用に繋がる可能性が期待される。ケージドlongdaysinを開発して光を用いて概日リズム周期を誘導的かつ精密に調節することを世界で初めて実現し、chronophotopharmacologyという新領域を切り拓いた。)概日時計は分子から個体の各階層を時間・空間的に統合して生理現象の日内リズムを生み出す。本研究では概日時計の周期制御に中心的な役割を果たすPERとCRYの安定性および複合体形成に焦点を当て、これらのプロセスを狙った機能調節化合物を探索し、CRY1に選択的に作用する全く新しい化合物を発見した。並行してSUMO化修飾に注目した解析を行い、CRYのSUMO化を見出した。独自のツールを用いて概日時計の発振機構の解明と自在な機能操作を可能にしていく。)本研究では、時計タンパク質CRYの安定性を変化させる新規の化合物を同定し、それをプローブとしてCRYの機能調節機構を解明することを目指す。そのために本年度は化合物スクリーニング系のセットアップを行った。タイミング、処理時間などを検討し、384ウェルプレートを用いたアッセイ条件を最適化した。化合物処理によるCRY1-LUCの蓄積量の変化を用いたエンドポイントアッセイとすることで、半減期を測定するよりも手順を簡略化し、ハイスループット化への目途をつけた。コントロールとしてLUCを安定発現する細胞を用い、化合物がルシフェラーゼに与える影響を評価することで、CRYに対する作用を明らかにする。用いる微量分注機をセットアップしているところである。機器の準備が整い次第、化合物ライブラリーセンターが所有する化合物のうち1万種類をスクリーニングし、CRYの発現量を増加あるいは減少させる化合物がどの程度の頻度で出現するかを見積もる予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。)交付申請書に記載した研究実施計画に沿って研究を行い、下記の成果を得た。TIEG1蛋白質の部分配列を有する抗原蛋白質を作製し、ウサギに免疫した。得られた抗血清をアフィニティー精製し、抗TIEG1抗体とした。この抗体を用いてウエスタンブロット解析した結果、TIEG1は主に核内に存在する約65kDaの蛋白質で、rat-1細胞における発現量はグルコース刺激によって急速に上昇することが判明した。mRNAのピークから約1時間遅れていたものの、mRNAと蛋白質の発現プロファイルが互いに似ていたことから、TIEG1蛋白質の合成・分解は比較的速いと考えられた。生体内においてもTIEG1が時計入力因子として働く可能性を検証するため、マウスを2日間絶食させた後に餌を2時間与え、摂食が肝臓におけるTIEG1蛋白質量に与える効果を解析した。その結果、餌を与えた場合は絶食を続けた場合と比べ、TIEG1蛋白質量が有意に上昇することがわかった。Per1およびBmal1遺伝子の発現量は摂食によって低下したことから、TIEG1は生体内においてもPer1・Bmal1遺伝子の抑制因子として時計入力に関与すると考えられた。以上の解析と並行して、時計蛋白質E4BP4およびCRY2のリン酸化動態を解析した。ニワトリE4BP4のSer182およびマウスCRY2のSer557のリン酸化は、各蛋白質のプロテアソームを介した分解を導く。詳細を見る担当区分:研究分担者(1)ニワトリ松果体G11の光活性化が概日時計の位相シフトを導くことを見出した。ピノプシン遺伝子の光依存的転写調節に必須の光応答エレメントを同定した。(2)網膜桿体のG蛋白質のファルネシル化が、光情報伝達だけでなく明順応に重要な役割を果たす事を示した。ゼブラフィッシュ網膜の錐体の光受容体キナーゼGRK7-1は桿体GRK1Aの数十倍も高い活性を示した。(3)ニワトリ松果体やカエル網膜のMAPK活性が夜にピークを持つ概日リズムを示した。マウス視交叉上核では、MAPKの活性化の時刻と光刺激に対する応答パターンが背内側部と中心部において互いに異なる事を示した。時計システムにおいてMAPKによってリン酸化されるBMAL1、CRY1およびCRY2のリン酸化部位とリン酸化に伴う活性変化を同定した。SCOPがK-Rasを介してMAPKを制御することを見出した。ニワトリ松果体においてp38キナーゼ/MAPKAPK2経路が昼に時計発振系に入力して位相前進を導く可能性を示した。(4)ニワトリ松果体では明期の延長によりE4BP4の発現レベルが高く維持され、Per2の転写抑制を介して位相後退を引き起した。E4BP4はCKIεによってリン酸化され、プロテアソームを介して分解された。(5)末梢時計モデルとしてrat-1細胞をグルコース刺激すると概日リズムがリセットされることを見出し、その際、時計遺伝子の発現を調節する分子の候補としてTieg1とVdup1遺伝子を同定した。TIEG1はグルコース投与によって発現量が急上昇し、Bmal1プロモーターに直接作用して転写を抑制した。(6)ゼブラフィッシュ松果体の光受容分子エクソロドプシンの松果体特異的な遺伝子発現を担う新規配列PIPEを同定した。University。