Medicine概要この方法論は、基質剛性、タンパク質組成および細胞形態などの細胞外マトリックスの手掛かりがシュワン細胞(SC)表現型を調節するメカニズムを示すことを目的とする。Abstract外傷性末梢神経系(PNS)の傷害は現在、完全な機能的回復を取り戻すための適切な治療法を欠いている。シュワン細胞(SC)は、PNSの主要なグリア細胞として、損傷後の再生細胞表現型に脱分化することによってPNS再生を促進する上で重要な役割を果たす。SCの分化状態は、再生に必要な期間を通じて維持することが困難であり、周囲の細胞外マトリックス(ECM)の変化の影響を受けます。したがって、SCと異なるECMの間の複雑な相互作用を決定して、SCの再生電位の手掛かりを提供することが不可欠である。これに対処するために、異なるECMタンパク質を調整可能なポリジメチルシロキサン(PDMS)基質に吸着させ、剛性およびタンパク質組成を変調できるプラットフォームを提供する戦略が作成されました。SCをチューナブル基材に播種し、SC表現型のダイナミクスを表す重要な細胞機能を測定した。SCタンパク質発現と細胞形態との相互作用を例示するために、個別のマイクロコンタクト印刷細胞パターンに加えてSCの異なる播種密度が利用され、免疫蛍光染色およびウェスタンブロットによって特徴付けられていた。結果は、より小さな広がり領域を有し、細胞伸びの範囲が高い細胞がSC再生表現性マーカーのより高いレベルを促進することを示した。この方法論は、SCのECMと細胞機能の重要な関係を解明し始めるだけでなく、末梢神経修復における生体材料の将来の最適化のためのガイドラインを提供する。Introduction末梢神経系(PNS)傷害は、患者の生活の質を損ない、社会経済的要因11,22を通じて重大な影響を及ぼす医療における主要な臨床的課題であり続ける。シュワン細胞(SC)は、PNSの主要なグリア細胞として、PNS再生を誘導し、短いギャップ傷害における機能的回復を助けるために必要な分子および物理的手がかりを提供する。分解する顕著な能力によるものである。修復SCは、いくつかの点で特徴的な細胞表現型である。傷害後、SCは細胞周期に再入することによって増殖速度を増加させ、再活性化を容易にするためにいくつかの転写因子の発現を開始する。NTRなどのこれらの要因は、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)などのSCマーカーを下方制御する一,方でアップレギュレートされる。SCは形態を変化させ、細長くなり、互いに整列して傷害部位6を横切ってブンナーバンドを形成する。これは、軸索が正しい遠位ターゲット7まで拡張するための物理的なガイダンスメカニズムを提供します。SCが短いギャップ傷害で神経再生を促進する能力を有しているにもかかわらず、機能的回復の結果は重度の傷害において依然として悪いままである。これは、細胞外マトリックス(ECM)誘導の喪失、ならびにSCが長期間にわたって回生表現型を維持できないことに起因する8。神経の再生および回復プロセスは、損傷後の基底層層の状態と密接に結びついている。基底層ラミナは、指導を容易にし、損傷後に無傷のままである場合に軸索およびSCにECMバウンドキューを提供する神経の周りのECMの層である9。ECMの状態とセルに行列結合キューを提供する能力は非常に重要であり、以前は,10、11、12、13、14のさまざまな異なるコンテキストで探求されてきました。10,11,12,1314例えば、ECMの剛性が増殖や分化,11、15、16,15などの細胞機能を導くことができることが示されている。16ECMの組成はまた、明確な細胞応答を導き、細胞内シグナル伝達経路17、18,18を介した移動および分化などの細胞行動を調節することができる。細胞形態は、広域および細胞伸長を含む、機能を調節する上で大きな役割を果たし、ECM結合キュー19、20,20によって支配することができる。多くの以前の研究は、定義された系統に分化する幹細胞に焦点を当ててきましたが、SCは健康な神経内の恒常性の成人SCから、神経損傷55、2121に続くECMを再モデリングしながらタンパク質および成長因子を分泌することができる修復SCに表現型を変更する同様の能力を有する。したがって、神経再生のためにこの能力を最終的に活用するための洞察のために、先天的なSC再生能力とECMバウンドキューとの関係の根底にあるメカニズムを特定することが特に重要です。これに対処するために、我々は、機械的剛性およびリガンドタイプが生理学的に関連する範囲で容易に調整できる細胞培養基質を生成するための詳細な方法論を開発した。kPa22,,23,,24.これは、最近の研究では、発達中にウサギ坐骨神経のヤング率が50kPaを超えることができ、それによってPNS内の神経の剛性の範囲が以前に調べられたよりも広いことを示唆しているので、目の前の仕事に有益である。異なるタンパク質は、SC挙動上の力学とリガンドの組み合わせ調節を分析するためにPDMS基質に吸着することが可能です。これにより、PNS再生プロセスに存在する複数の微小環境手掛かりの調査と、基板25の剛性のみに焦点を当てた作業に対する高度なタンナビリティの比較を可能にする。これらの操作細胞培養基質は、免疫物質化学、ウェスタンブロット、定量ポリメラーゼ連鎖反応(q-PCR)などの多くの定量分析方法と互換性がある。この工学的細胞培養プラットフォームは、各ECM結合信号の個々のタンナビリティの高いレベルに起因する機械経路の解析に非常に適しています。マイクロコンタクト印刷を含む細胞マイクロパターニングの一般的な方法は、他のECM結合キュー24に関連して細胞形状を解析する制御された細胞接着を可能にする基質上で達成することができる。これは、細胞集団の伸びを促進する線パターン化基質が、神経再生中にビュンナーバンド内の細長く再生的なSCを模倣し、研究するためのツールを提供するため、非常に重要です。細胞形態は複数の細胞機能の強力な調節因子であり、制御されない場合には交和実験結果を導入する可能性がある26,27。回生表現型を制御するメカニズムに、重要な注意が提供されています。これは、PNS神経再生の補助のための神経誘導導管として適用することができる生体材料の設計に関する洞察を提供するために不可欠です。これらの詳細なプロトコルは、最終的には、ECMバインドキューによって規制されるSCおよび他の細胞タイプの機能のメカニズムを解読する潜在的なツールとして適用することができる。PDMSベースエラストマーと硬化剤を、10:1~60:1の比率でピペットチップを使用して、気泡が混合物内に均質に分散するまで激しく混合します。気泡が消散するまで真空乾燥を使用して気泡を除去します。ResultsSC表現型上の基質剛性とタンパク質組成との相互作用を分析・定量化するために、調整可能なPDMS細胞培養基質を開発した(図1A)。異なる塩基におけるポリマーの圧縮試験:硬化剤比は、基材のヤング率(E)を定量するために利用された(図1B)。得られたモジュラス値の範囲は、生理学的に関連する基質条件を表す。基質の調製後、SCを培養し、チューナ?...DiscussionSCは、その表現型の変換と神経損傷後の再生可能性のために神経再生を促進することができます。ECMキューがこの再生能力をどのように調節するのかはほとんど不明であり、神経再生を促進することを目的とした生体材料の開発だけでなく、神経再生に関与するメカニズムの理解を妨げる可能性がある。disclose.Acknowledgements著者らは、シンシナティ大学からの資金援助を感謝して認めている。ロン・フレニケンの支援に感謝する。reserved×-1::1。