Edinburgh概要このプロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞からのマクロファージの堅牢な生成とその後の特性評価のための方法を記述する。機能アッセイは、これらのiPSC由来マクロファージの表現型および機能を評価するために使用される。Abstractマクロファージは、ほとんどの脊椎動物組織に存在し、異なる機能を有する広く分散および不均一な細胞集団を含む。ヒトマクロファージ機能に関わる分子プロセスの一部を研究することは可能であったが、ヒトのマクロファージに遺伝子工学的手法を適用することは困難であることが判明した。これは、マクロファージ生物学に関与する複雑な遺伝的経路を尋問し、特定の疾患状態のモデルを生成する能力を著しく妨げている。したがって、遺伝子操作技術の膨大な武器庫に適した人間のマクロファージの既製の供給源は、したがって、この分野で貴重なツールを提供します。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)からマクロファージを生成できる最適化されたプロトコルをvitroで提供します。これらのiPSC由来マクロファージ(iPSC-DM)は、CD45、25F9、CD163、CD169を含むヒトマクロファージ細胞表面マーカーを発現し、当社の生細胞イメージング機能アッセイは、それらが堅牢な貪食活性を示していることを示している。培養されたiPSC-DMは、LPSおよびIFNg、IL4、またはIL10を添加することによって遺伝子発現および貪食活性の変化を示す異なるマクロファージ状態に活性化することができる。このように、このシステムは、特定のヒト疾患をモデル化する遺伝的変化を運ぶヒトマクロファージを生成するプラットフォームを提供し、これらの疾患を治療するための薬物スクリーニングまたは細胞治療のための細胞の供給源を提供する。Introduction胚性幹細胞(ESC)と誘導多能性幹細胞(iPSC)は、3つの生殖層系統すべての細胞を生成するために分化することができる自己更新細胞源を表します。ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALENS、CRISPR-Cas9などのヒト多能性幹細胞(PSC)の遺伝子操作を可能にする技術は、医学研究11、2、3、42,3,4に革命を起こしている。ヒトPSCの遺伝子操作は、目的の第一細胞がインビトロの拡大および/または維持することが困難な場合、またはマクロファージ55、6、7、8、96,の場合のような遺伝的操作が困難な場合に特に魅力的な戦略である。7,8,9ヒトのiPSCは体細胞から派生できるため、ESCに関連する倫理的な制限を回避し、個別化医療を提供するための戦略を提供します。これには、患者固有の疾患モデリング、薬物検査、および免疫拒絶反応および感染のリスクを低減した自己細胞療法686、8、10、1110,11が含まれる。胚体の生成;2)懸濁液中の造血細胞の出現;3)末端マクロファージ成熟。胚体(EBs)と呼ばれる三次元凝集体の形成は、iPSCの分化を開始する。骨形態形成タンパク質(BMP4)、幹細胞因子(SCF)、および血管内皮成長因子(VEGF)が追加され、メソダームの指定を駆動し、新たな造血細胞77、8、9、11、128,9,11,12を支持する。EB内の分化細胞は、WntやActivinなどの内因性シグナル伝達経路の活性化も開始します。いくつかの分化プロトコルは、EB形成の段階を通過しません。これらの場合、組換えヒトアクティビンAおよび/またはカイロンなどのWntおよびActivinシグナル伝達調節因子は、単層フォーマット13、14、15,14,15で分化iPSCに添加される。形成を使用するプロトコルに焦点を当てます。分化の第2ステップでは、EBは付着面にメッキされます。これらの結合された細胞は、造血および骨髄性前駆腫を含む懸濁細胞の出現を促進するサイトカインにさらされる。増殖16、17、17ならびに骨髄前16駆体増殖および分化18を支持する可能性が高い。マクロファージコロニー刺激因子(CSF1)は、ミエロイド細胞の産生及びマクロファージ19,20,20への分化を支持する。分化の第3段階の間、これらの懸濁細胞は、末端マクロファージ成熟を支持するためにCSF1の存在下で培養される。ヒトiPSCをインビトロでマクロファージに分化すると、開発中のマクロファージ生産の初期の波を模倣しています。組織居住マクロファージは、胚発生時に確立され、成体単球とは異なる発達系統を有する。いくつかの研究では、iPSC-DMは血液由来単球よりも胎児肝臓由来マクロファージに匹敵する遺伝子シグネチャを有することが示されており、iPSC-DMは組織居住マクロファージに似ていることを示唆している。iPSC-DMは、組織の再モデリングおよび血管新生に関与するタンパク質の分泌をコードする高レベルの遺伝子を発現し、炎症性サイトカイン分泌および抗原提示活動21,22,22をコードする低レベルの遺伝子を発現する。iPSC-DMは、組織居住マクロファージ23,24,24と同様の転写因子要件を有する。転写因子RUNX1、SPI1(PU.1)、およびMYBに欠損しているノックアウトiPSC細胞株を用いて、BuchrieserらはiPSC-DMの生成がSPI1およびRUNX1依存性であるが、MYB独立性であることを示した。これは、それらが、発達23の間に造形の第一波の間に生成される黄身嚢由来マクロファージに転写的に類似していることを示している。したがって、iPSC-DMは、ミクログリア14、25および25クファー細胞11などの組織居住マクロファージを研究するためのより適切な細胞モデルを表し、組織11修復療法に使用される可能性のあるより望ましい細胞源であることを広く受け入れられている。マウスESCからインビトロで産生されるマクロファージが、生体内11におけるCCl4誘発性肝傷害モデルにおいて線維化を改善するのに有効であったことが示されている。これらのESC由来マクロファージは、マウスでリポソームクロドロント11を用いてマクロファージを枯渇させたクッパー細胞区画を再抽出する際の骨髄由来マクロファージよりも効率的であった。ここでは、ヒトiPSCのメンテナンス、凍結、解凍、およびこれらのiPSCを機能的マクロファージに分化するための、血清およびフィーダーフリープロトコルについて説明します。このプロトコルは、ヴァン・ヴィルゲンブルクらで記述したものと非常によく似ています。ROCK阻害剤は、EB形成段階では使用されません。酵素的アプローチではなく機械的アプローチを用いて、iPSCコロニーから均一なEBを生成する。EB収穫とめっきの方法が異なる。5)サスペンション細胞は週2回、週単位ではなく、収穫される。6)収穫された懸濁液細胞は、7日間ではなく9日間のマクロファージ成熟のためにCSF1の下で培養される。iPSC由来マクロファージ表現型および機能の特性評価に用いるプロトコルについて、遺伝子発現解析(qRT-PCR)、細胞表面マーカー発現(フローサイトメトリー)、機能アッセイを用いて、貪食と分極を評価する。Protocol注:このプロトコルで使用されるすべての試薬と装置は、材料表にリストされています。培地は細胞培養のために37°Cにする必要があります。分化プロトコルで使用される培地および試薬は滅菌性でなければならない。その他の試薬を準備します。2メルカプトエタノールで補うことで、hESC-血清フリー培地(hESC-SFM;材料表を参照)を準備します。(bFGF)ストック溶液(10μg/mL)を調製。株式溶液を200μLのアリコートとしてクライオチューブに配布します。ストックソリューションは、1年まで-20°Cで保存することができます。一度解凍すると、ストックbFGFは7日間4°Cで保存することができます。ローキナーゼ阻害剤(ROCK阻害剤)-Y27632ストック溶液(1mg/mL)を滅菌水に溶解して調製します。μLアリコートとして配布します。ストックソリューションは、1年まで-20°Cで保存することができます。一度解凍すると、7日間4°Cで保管することができます。ダルベックコのリン酸緩衝塩分カルシウムとマグネシウムで。希釈した幹細胞の基質溶液を培養プレートに置き、表面積あたりの最終体積が78μL/cm2になるようにします。μLの溶液を加えます。コーティングされたプレートを37°Cおよび5%CO2の加湿雰囲気で1時間インキュベート2する。hESC-SFM培地に移します。遠心分離細胞は100xggで3分間。hESC-SFMで再中断する。コーティングウェルに細胞を移す。培養細胞は24時間用である。bFGFを補ったhESC-SFMにメディアを変更しますが、ROCK阻害剤なし。細胞を維持するには、細胞が80%の合流度に達するまで、毎日培地を変更します。未分化iPSCは、通常、80%の合流に達するまでに3〜4日かかります。細胞が80%の合流度に達したら、通過細胞。mLで使用済み培地を置き換えます。培養容器を片手に持ち、使い捨てのセルパッセジングツール(材料表を参照)をプレートを横切って一方向(すなわち、左から右)に転がします。ローラーのすべてのブレードがプレートに触れている必要があります。転がりながら均一な圧力を維持する。全体の井戸が覆われるまで、同じ方向に転がりを繰り返します。培養容器を90°回転させ、ステップ1.12.2および1.12.3の説明に従って繰り返し転がします。使用後にパスツールを破棄します。滅菌ピペットを使用して、切断されたコロニーを取り除くために井戸内の媒体を使用する。ROCK阻害剤を補充したhESC-SFMで交換してください。細胞通過ツールでコロニーを切断し、遠心分離管に外れたコロニーを配置します。遠心分離細胞は100xggで3分間。mLで細胞を再中断する(資料表を参照)。細胞を-80°Cで24~48時間保存します。冷凍庫または液体窒素タンクに移します。注:マクロファージ分化プロトコルの概略的な要約を図1に示します。(前のセクションを参照)。ゼラチンを滅菌水に溶解して、ブタゼラチンの0.1%w/v溶液を調製します。ゼラチン溶液は、最大2年間4°Cで保存することができます。PBS溶液に溶解して、ヒトBMP4ストック溶液(25μg/mL)を調製します。μLアリコートとして配布します。ストックソリューションは、1年まで-20°Cで保存することができます。一度解凍すると、ストックBMP4は5日間4°Cで保存することができます。PBS溶液に溶解させることにより、ヒトVEGFストック溶液(100μg/mL)を調製します。株式溶液を10μLのアリコートとしてクライオチューブに配布します。ストックソリューションは、1年まで-20°Cで保存することができます。一度解凍すると、ストックVEGFは7日間4°Cで保存することができます。PBS溶液に溶解して、ヒトSCFストック溶液(100μg/mL)を調製します。株式溶液をクライオチューブで5μLアリコートとして配布します。ストックソリューションは、1年まで-20°Cで保存することができます。一度解凍すると、ストックSCFは10日間4°Cで保存することができます。PBS溶液に溶解させることで、ヒトIL3ストック溶液(10μg/mL)を調製します。μLアリコートとして配布します。ストックソリューションは-20°Cから2年まで保存できます。一度解凍すると、ストックSCFは15日間4°Cで保存することができます。PBS溶液に溶解して、ヒトのCSF1ストック溶液(10μg/mL)を調製します。mLのアリコートとしてクライオチューブに配布します。ストックソリューションは-20°Cから2年まで保存できます。一度解凍すると、ストックSCFは15日間4°Cで保存することができます。PBS溶液に溶解して準備します。U/mL)のストック溶液にリポ多糖(LPS)を調製します。μLのアリコートとして分配します。-80°Cで2年まで保管してください。一度解凍すると、在庫は7日間4°Cで保存することができます。SCFを補う)を超低い取り付け6ウェルプレートの2つの井戸に加えます。mLで6ウェルプレートに交換します。細胞通過ツールを使用してコロニーをカットし、切られたコロニーをピペットで超低添付ファイル6ウェルプレートの2つの井戸に移す(材料表を参照)。SCFの最終濃度にします。4日目には、ゼラチンを0.1%w/vで6ウェル組織培養プレートの4ウェルをコーティングし、少なくとも10分間インキュベートします。mL遠心管に集め、重力によって管の底に落ち着くようにします。慎重にメディアを吸引します。ステージ2媒体2.5mLを含むゼラチンコーティングウェルに10~15個のEB(15個以下)を送ります。