氷の上で20分間インキュベートし、光から守ります。106マクロファージ/mLにします。PBS溶液(下記注を参照)を染色し、光から保護されたRTで15分間インキュベートします。μLで洗浄してください。μLで細胞を再懸濁します。4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI、希釈1:1,000)を生死染料として加えます。フローサイトメトリー解析では、主要集団にゲートし、次に単一細胞を、次に生細胞に入れます。生細胞集団では、マクロファージ関連マーカー発現が明らかである(図3A)。注:抗体は、マクロファージを導出するために使用される各細胞株について慎重に滴定する必要があります。結果のセクションに示されている抗体は、材料表にあります。SFCi55由来マクロファージフローサイトメトリーアッセイの希釈因子も含まれています。iPSC由来マクロファージ(iPSC-DM)を収穫し、培地を吸引し、氷冷酵素フリー細胞解離バッファーを添加し、5分間インキュベートして、ピペット処理を繰り返してマクロファージを収集します。iPSC-DMは、イメージング組織培養グレード96ウェルプレート(例えば、セルキャリアウルトラ、パーキンエルマー)の少なくとも2日前に、ステージ3培地の200μLで高スループットイメージングを行う。Zymosan-Aバイオ粒子を調製(「溶液1」)。mLを、より多くのPBSで1:5(“溶液2”)で希釈します。s.の渦溶液4°Cでそれを保ちます。メッキされたiPSC-DMのメディアを取り外し、PBSで洗います。33342を含有するPBS溶液を使用してiPSC-DMを染色する。37°Cで20分間インキュベートします。PBSで細胞を洗います。深い赤血漿膜染色を含有するPBS溶液を用いた汚れは1:1,000希釈した(材料表参照)。37°Cで30分間インキュベートします。PBSで細胞を洗います。4°Cに保たれたビーズ溶液を100μLずつiPSC-DMの各ウェルに加えます。プレートはイメージングの準備が整いました。高含有画像システムを用いてプレートを画像化し、ウェル全体で3つ以上のフィールドを取得し、ウェルの良好な表現を得る。コロンバスソフトウェア(高コンテンツイメージング解析システムソフトウェア)を使用して食作用を定量化します。明確な画像バッチ分析のために、特定のアルゴリズムを開発できます。青い強度を測定し、青信号が核を示すソフトウェアで定義します。赤い強度を測定し、赤信号が細胞質を示していることをソフトウェアで定義します。核と細胞質が一緒に細胞に対応することを定義します。細胞内の緑色の強度を測定し、細胞を貪食と見なすために厳密なカットオフ/しきい値を確立します。細胞毎の食細胞画分と平均食細胞指数を定量化する。ビーズの色の強度はビーズの数に比例するので、貪食活性は、摂取したビーズの数によって測定することができる。アルゴリズム/パイプラインをすべてのフィールド内のすべての画像に適用し、取得したすべてのタイムポイントで、細胞の貪食能力を決定するための堅牢で公平なバッチアプローチを可能にします。注:コロンブスは、細胞のフェノタイピングと機能テストのための細胞セグメンテーション分析を提供する高内容分析ソフトウェアです。Results分化進行、マクロファージ数、形態提示,された結果は、多くの研究8、9、10、269で説明され、10使用されているSFCi55ヒトiPSC8ラインの分化からである。26マクロファージに対するIPSC分化のプロセスは、光学顕微鏡で監視することができた。成熟したマクロファージは形態学的に異なっていた(図2A)。成熟したマクロファージ形態は、遠心分離されたサイトスピン製剤の染色によってさらに検証することができる。IPSC由来マクロファージは大きかったが、小さな楕円形の単一の小さな核と、多くの小胞を含む豊富な細胞質を有していた(図2B)。6±0.54細胞を含む1つの完全な6ウェルプレートの収穫(16〜28日目)です。6±0.94の懸濁液細胞を6ウェルプレート当たりに生成した。80日目以降、EBが枯渇するにつれて、サスペンションセルの数が減少し始めました(図2C)。106前駆体を下回った後、分化プロトコルを停止することをお勧めします。IPSC由来マクロファージ細胞表面マーカー発現フローサイトメトリーは、ヒトマクロファージの表現型を評価するために使用される最も一般的な方法です。細胞表面マーカー発現を評価する格言戦略は、サイズや粒度などの物理的パラメータを使用して細胞の主母集団を格数化し、続いて単一細胞を格紙にしてから生細胞を行う(図3A)。成熟したiPSC由来マクロファージは、系統マーカーCD45およびマクロファージ成熟マーカー25F9を発現し、かつ単球/未熟マクロファージマーカーCD93に対して陰性であるべきである。これは我々の観測と一致している(図3A)。IPSC由来マクロファージは、系統骨髄マーカーCD11b、CD14、CD43、CD64、CD115、CD163、およびCD169についても陽性であった(図3B)。これらは免疫変調マーカーCD86に陽性であり、そのわずかな割合がナイーブ状態でCX3CR1、CCR2、CCR5、およびCCR8を発現したケモカイン受容体を発現した(図3B)。プロットは、私たちの研究室8によって以前に公開されたデータから得られました。iPSC由来マクロファージ食前細胞症と分極化宿主防御および組織恒常性におけるマクロファージの主要な特徴の1つは、病原体、アポトーシス細胞、および破片27を貪食する能力である。食細胞化の割合は、特定のフェノチの状態28と密接に関連している。Zymosan生体粒子(pH感受性色素共役体)を利用した高含有イメージングシステムアプローチ8,8,9,1111を用いた。9培養物に添加すると生体粒子は非蛍光性であったが(図4A)、細胞内酸性pH中で明るい緑色に蛍光を発した(図4B)。ライブイメージングオペレッタ顕微鏡は、ビーズを添加した後5分ごとに、合計175分間の画像化に設定しました。高スループットと偏りのない画像分析パイプラインは、その後、ビーズを貪食した細胞の割合を表す貪食画分と、各細胞が摂取したビーズの数の尺度である貪食指数の観点から活性を定量化するために、コロンブスのプラットフォームで使用されました。マクロファージは、環境の手掛かりに応じて表現型に応答し、変更することができます。iPSC-DMは、環境刺激に反応し変化する能力を評価するために、LPSおよびIFNg、IL4、またはIL10で処理することができます。48時間の治療の後、彼らは表現型を変更し、本明細書において、M(LPS+IFNg)、M(IL4)、およびM(IL10)と称し、それぞれ29。遺伝子発現解析は、マクロファージの偏光状態をテストするのに有用なツールです。LPSおよびIFNg刺激に際して、マクロファージはCD40、VCAM1、VCAM1およびTNFAの遺伝子のmRNA発現をアップレギュレートした(図5A)。発現をアップレギュレートした(図5B)。CD84IL10刺激の際、IPSC-DMはMRC1の発現をアップレギュレートする(図5B)。食性食症の観点から、LPS+IFNgまたはIL4で処理したマクロファージは、ナイーブマクロファージと比較して食細胞の割合が有意に低かった。IL10で処理したiPSC-DMは、貪食細胞および貪食指数の割合の増加を示した(図5C–E)。図1:成熟した機能的マクロファージへのiPSC分化のグラフィック要約バイオレンダーで描かれた図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。図2:マクロファージおよびiPSC-DM数および形態に対するiPSC分化(A)から得られた明視野画像(左から右):IPSCコロニー、胚体(EB)、採取された懸濁液細胞、および成熟したマクロファージ。μm(B)Kwik-diffキットで染色したマクロファージサイトスピンの画像。