ml)で15分間刺激し、十分に洗浄し、さらに4時間インキュベートしNETsを作成、PBMCは抗CD3抗体でコーティングプレート上でr-IL-2(10ng/ml)を含む培養液にて7-14日間培養し、活性化T細胞を得た。ml)で前処理するとキャンセルされた。migrationをタイムラプス動画で観察すると、PMA刺激好中球の上清の添加で劇的に抑制された。活性化T細胞の遊走はLPS活性化好中球によって有意に阻害されたが、NETsを除去するとその抑制は部分的に解除された。2.ウエスタンブロッティングにてCXCL-11はLPS刺激好中球に由来するNETsと共存させると8kDのCXCL11に対応するbandは消失したが、PMSFまたはNEIを添加するとbandは残存した。vivoでのNETsの効果を検討するために、C57/BL6マウスに同種胃癌細胞YTN16を腹腔内投与し腹膜播種を形成させる実験系を作成し、抗PD-1抗体に投与が有効であることを確認した。NETsを共投与すると腹膜播種の形成が促進されることを確認した。vitroでの解析をほぼ完遂し、「NETsあるいは活性化好中球がTリンパ球の遊走に対して抑制的な作用を持つ」という仮説の正当性を示唆するデータが得られた。PMAとLPSで刺激した好中球由来のNETsでは、T細胞の運動能に対する影響が若干異なっている事実がわかり、好中球はいくつかのメカニズムを介してT細胞の浸潤に影響を与えていることが判明した。vitroの実験を追加することにする。同種の胃癌細胞による腹膜播種の動物モデルにてPD-1抗体の作用を確認することができ、今年度以降の免疫チェックポイント阻害薬の奏効にNETsがどんな影響を与えるかを検討できる基盤となる実験系が確立できた。vitroの実験で、PMA刺激好中球は活性酸素(ROS)を介してT細胞の運動を抑制するが、LPS刺激好中球ではNETs依存的にケモカインを分解することで遊走を抑制することが示唆されたため、この機序についてより詳細に検討を加える。(200microg/mouse)を3日毎に投与し、その治療効果をNETs非存在下の治療効果と比較検討する。(50mg/Kg)をそれぞれ腹腔内、皮下に連日投与し、抗PD-1抗体の奏効性の変化を検討する。Gr-1に対するモノクロナル抗体を用いて染色し、NETsの存在が腫瘍の免疫学的がん微小環境に与える影響を明らかにする。vitroの実験のほとんどは前年度の研究資金で実施することができた。vivoの実験を繰り返し、各種モノクロナル抗体を用いた免疫染色実験にて信頼性の高いデータを得ることに努めたい。