(n=6生物学的に独立した実験)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。図3:マクロファージ細胞表面マーカー表現型。(A)成熟したiPSC由来マクロファージの分析のためのギャティング戦略。単一の生細胞をゲートし、次いで細胞表面マーカーCD45、CD93、および25F9の発現について分析した。細胞表面マーカーのゲートは、蛍光マイナス1(FMO)コントロールを使用して描かれた。5生物学的に独立した実験を表す。3);そしてケモカイン受容体(n=3)プロットは、以前にパブリッシュされたデータを使用します8.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。図4:IPSC-DM分極化および貪食アッセイ。iPSC-DM(A)の代表的な画像は、ザイモサンpHrodoグリーンビーズの添加直後とビーズのB添加後175分。赤は細胞の細胞質を表す。(C)貪食マクロファージの割合および(D)ナイーブ状態の経時的な過ぎの貪食性マクロファージ当たりの貪食指数/緑色強度(n=6生物学的に独立した実験)。プロットは平均値を示し、棒はSEMを表し、プロットは以前にパブリッシュされたデータ8を使用します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。生物学的に独立した実験;一方向のANOVAとホルム・シダックの多重比較は、テスト後に行います。偏光基は、ナイーブグループのみと統計的に比較した。プロットは平均値を示し、誤差範囲は標準偏差を表します。転写は検出されません。12生物学的に独立した実験、片道ANOVAおよびホルム・シダックの複数比較後試験後)偏光基は、ナイーブグループのみと統計的に比較した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。Discussionここで説明するiPSC-DMの生成プロトコルは堅牢であり、比較的少数のiPSCから多数の同種細胞を生産することができます。107マクロファージが生産されます。これらのインビトロで生成されたヒトマクロファージは、ヒトの主要マクロファージと形態的に類似しており、主要なマクロファージ細胞表面マーカーを発現し、貪食活性を示す。マクロファージ分化のプロトコルは再現可能であり、他のhiPSCおよびhESC細胞株にも適用できますが、マクロファージ前駆体の最初の収穫の正確なタイミングと生成可能な細胞の絶対数はiPSCラインによって異なります。マクロファージは、遺伝子操作されたiPSCから生成できることが実証されています。iPSC線のAAVS1遺伝子座に挿入し、その後、このiPSC線をZsGreen発現マクロファージ8に分化できることが示された。これらの蛍光マクロファージは、将来的に疾患モデルにおける治療的マクロファージの移動および安定性を追跡するために使用することができる。別の研究では、マクロファージは、タモキシフェン誘発転写因子KLF1を発現するために遺伝的に操作されたiPSCラインから生成された。iPSC由来マクロファージにおけるKLF1の活性化は、エリスロイド島9のマクロファージに匹敵する表現型を有するマクロファージの産生をもたらした。潜在的に、この戦略は、iPSC由来のマクロファージを、皮膚の肝臓またはランゲルハンス細胞のクファー細胞のような他の組織特異的マクロファージ集団に関連する表現型に遺伝的にプログラムするために使用することができる。これは、これらの細胞タイプを定義する主要な転写因子が特定されれば可能です。プロトコルの観点から言えば、iPSCの母集団の開始状態が分化を成功させるために重要であることに注意することは非常に重要です。ヒトのiPSC培養は、いくつかの通路にわたって、典型的に異常な亜集団でオーバーランする可能性があるため、iPSC株やゲノム品質管理を受けた大型バッチマスター株の堅牢なキュレーションが推奨されます。ここで説明するメンテナンスプロトコルは、連続培養で最大2ヶ月間、通常のiPSCを維持することができますが、これは細胞株や研究室によって異なる場合があります。問題が発生した場合は、各分化実験に未分化iPSCのフレッシュバイアルを使用することをお勧めします。未分化iPSCの開始培養は、80%以下のコンフルエントでなければなりません。EBめっき段階では、6つのウェル組織培養プレートのウェルあたり10〜15個のEBのみをメッキする必要があり、これらのEBが井戸全体に均等に広がることは重要です。井戸の中央にあるEBの数が多いり、塊状の脳が発生するマクロファージの数に悪影響を及ぼしました。コーティングされた培養プレートの表面へのEBの接着を妨げないように、培地を補充し、EB培養物から単球様前駆細胞を収穫する際には注意が必要です。採取した造血用懸濁液細胞の数は、収穫のたびに徐々に増加し、40~72日目の分化の間で最適な生産を行う(図2)。生産は68日目以降に徐々に減少し、プレートは2.5ヶ月後に排気する傾向がありますが、正確なタイミングはiPSCラインによって異なる場合があります。我々のプロトコルの1つの制限は、ステージ2の終わりに生成された造血性懸濁液細胞を凍結保存することは不可能であった。WNTの外因性活性化に依存するプロトコルは、凍結保存後の回復率を約40%報告するが、これらのプロトコルは1つの細胞収穫のみを報告するので、生成されるマクロファージの絶対数は低い30である。ここで説明するプロトコルは、脳の形成を介して内因性シグナル伝達を誘導し、隔週に収穫することができ、はるかに高い総マクロファージ収量を生み出す。要約すると、機能性iPSC由来マクロファージの生産に関する詳細なプロトコルを提示する。iPSC由来マクロファージを用いて、健康と疾患のマクロファージ生物学を研究するためのインビトロ実験を設定することは、単球由来マクロファージ(MDM)の実験に対して多くの利点があります。これらの利点は、材料へのアクセスの容易さ(例えば、ドナーが必要とされない)、非常に大量のマクロファージを産生することができ、そして遺伝子組み換えマクロファージを産生することは現実的で比較的簡単である。iPSC由来マクロファージは、組織常駐マクロファージ生物学の研究のためのより良いリソースである可能性があります。disclose.Acknowledgementsフィオナ・ロッシとクレア・クライアーのフローサイトメトリー、エオガン・オドゥイビール、ベルトラン・ヴェルネイの顕微鏡観察に感謝します。この作品は、CONACYT(M.L.-Y.)、ウェルカムトラスト(102610)、イノベート英国(L.M.F)、ウェルカムトラスト博士課程(A.M)、MRC精密医学学生(T.V)によって資金提供されました。Mye-EUNITER(http://www.mye-euniter.eu)によってサポートされました。reserved×-1::1。