Systemは、GAL4ツーハイブリッドに基づき、未知のタンパク質-タンパク質間相互作用を検出、同定できる極めて優れたシステムである。A(AbA)(1)に対する耐性遺伝子(AUR1-C)をレポーターとして採用し、より簡単で厳密なスクリーニングが可能になった。Goldシステムで相互作用が見られる場合、酵母はAUR1-Cレポーター遺伝子の発現によりAbA耐性を獲得し、AbA添加培地でも生育する。本システムでは、3種類のGAL4応答性プロモーターで制御される4種類のレポーターを利用してスクリーニングを行うことで、偽陽性クローンの出現を低減させ、より確実な陽性クローン取得を可能にする。Two-Hybridシステムは、タンパク質間相互作用を酵母を用いて簡便に検出、同定できる非常に優れた解析手法である。GAL4タンパク質が、DNA結合ドメイン(DNA-BD)と転写活性化ドメイン(AD)の2つのモジュールからなり、それぞれに分割しても、分割された2つのドメインがプロモーター上でごく近傍に位置する場合、強い転写活性能を示すことに基づいている(2、3)。Matchmakerシステムでは、既知の“bait(おとり)”遺伝子、および、未知の“prey(獲物)”遺伝子を、それぞれDNA-BD、および、ADとの融合遺伝子となるようにベクター構築して酵母を形質転換する。baitタンパク質とpreyタンパク質の2つのタンパク質間で相互作用が見られる場合のみ、GAL4タンパク質の機能が回復し、酵母ゲノム中にコードされたレポーター遺伝子の転写が活性化される(図1)。Goldシステムでは、相互作用するbaitとpreyを発現する酵母クローンは、4つのレポーター遺伝子により検出、同定される(図2)。ライブラリーを用いるスクリーニングでは、レポーター遺伝子を発現する候補酵母クローンが選択培地上に生育するため、プラスミドを回収し、さらなる解析やシーケンスに用いることができる。DNA-BDと融合して発現)と相互作用し、レポーター遺伝子の転写を活性化する。Goldシステムの相互作用検出の厳密性は、本システムで用いる新しいY2HGold酵母株が、3種類のGAL4応答性プロモーター(MEL1、GAL1、GAL2)から転写される4種類のレポーター遺伝子AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1を保持していることに基づいている(図2、表1)。4つめのレポーター遺伝子として新しく採用されたAUR1-C遺伝子の発現は、感度の高い抗真菌抗生物質AbAに対する耐性を酵母に付与するため、従来の栄養要求性レポーター遺伝子のみによるクリーニングで生じていた多数の偽陽性クローンの出現を大幅に低減させることができる。これらのレポーター遺伝子はY2HGold酵母株のゲノム上にコードされており、4種類のレポーター遺伝子を活用することで、ある種のpreyタンパク質が一つのレポーター遺伝子上流のプロモーター領域に非特異的に結合し、偽陽性クローンを生じる可能性を強力に排除する。Goldシステムでは、まず2種類のレポーター遺伝子(AUR1-C、MEL1)による一次スクリーニングを行い、続いて4種類のレポーター遺伝子(AUR1-C、MEL1、HIS3、ADE2)により厳密な選択を行う2段階スクリーニングを推奨している(図4:実験例1)。Goldシステムの4種類のレポーター遺伝子preyタンパク質とbaitタンパク質が相互作用すると、Y2HGold酵母株のゲノム中にコードされた3種類のGAL4応答性プロモーター(MEL1、GAL1、GAL2)制御下にある4種類のレポーター遺伝子の転写が活性化される。AbA耐性と2種類の栄養要求性レポーターによる培地上での生育の可否によって選択を行い、さらにα-galactosidaseレポーターによりX-α-Gal存在下でのコロニーの青色選択が行える。Plateライブラリーが利用できる。Plateライブラリーとbaitタンパク質を発現するY2HGold株を共に培養し接合させるだけで、簡単にライブラリーから相互作用タンパク質をスクリーニングできる。Systemを用いて、ご自身のサンプルからY187酵母株にオリジナルのライブラリーを構築することも可能である。Two-Hybridスクリーニングをお試しください。Plateライブラリー(Y187酵母株に導入済み)を、baitタンパク質を発現するY2HGold株と共に培養して接合させることで、簡便にライブラリーから相互作用タンパク質をスクリーニングできる。Libraryを用いてOct4結合タンパク質のスクリーニングを行った。ng/ml+X-α-Gal)(パネルB)に植え継ぎした。その結果、32コロニーのうち25コロニーが4種類のレポーター遺伝子すべてが活性化されている陽性コロニーであることが確かめられた。ng/ml濃度のAbAを含む培地上で、ライブライースクリーニングを行うことを推奨しています。【実験例2】3種類のbait/preyペアを用いたAbA耐性の比較3種類のbait/prey融合タンパク質ペアをそれぞれ発現するY2HGold酵母株を用いて、各濃度のAbAを含むDDO(SD/-Trp/-Leu)寒天培地上でのコロニー形成能を調べた。各酵母のコロニー形成能はbait/prey融合タンパク質ペア間の相互作用の強度を反映することが分かる。本ページの製品はすべて研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。して使用しないでください。ための改変、商用製品の製造に使用することは禁止されています。タカラバイオ製品に関連するライセンス・パテントについては、ライセンスマークをクリックして内容をご確認ください。他メーカーの製品に関するライセンス・パテントについては、各メーカーのウェブサイトまたはメーカー発行のカタログ等でご確認ください。ウェブサイトに掲載している会社名および商品名などは、各社の商号、または登録済みもしくは未登録の商標であり、これらは各所有者に帰属します。