画像をクリックすると拡大表示されます。†ジャガイモからメラニン形成に重要な働きをする酵素であるチロシナーゼを分離し、分離した酵素をいくつかの条件で反応させる。この実験を通して、生体化学反応の触媒である酵素の特性を学ぶ。酵素の分離にあたり、ゲル濾過クロマトグラフィーを体験し、その原理を理解する。生物体は、様々な化学反応が複雑に組み合わさって生命を維持している。生体というマイルドな環境にも関わらず、それらの反応の効率が高いのは、「酵素」とよばれる生体触媒が関与しているからである。酵素は、特定の物質の特定の化学反応のみに働くという「基質特異性」を有している(図1)。図1.酵素反応モデルそのため、反応の数だけ、酵素が存在するといわれている。様々な物質が混在している生体内で、化学反応が秩序正しく進行するには、酵素の「基質特異性」が重要な役割を担っている。酵素の本体はタンパク質であり、その基本構造は、アミノ酸が直線的に並んだものであるが、酵素が基質に働くためには、鍵と鍵穴のように、その立体的な構造が基質の構造とうまく合わなければならない。タンパク質の立体構造は、pHや温度により変化するため、それぞれの酵素反応には、最適なpHや温度(至適pH、至適温度)が存在する。チロシナーゼは、銅イオンと結合して活性をもつ酸化酵素の一種で、動物の皮膚や昆虫の体液、植物の細胞内に存在し、チロシンやドーパを基質として、ドーパキノンを生成する。ドーパキノンは、自動的に酸化され、赤褐色のドーパクロムとなり、さらに複雑な反応経路を経てメラニンになる(図2)。ジャガイモやリンゴを切ってしばらく置いておくと空気に触れた切り口が黒くなるのは、植物に含まれるこの酵素の働きにより、メラニンが形成されるためである。†(目的1)ジャガイモの抽出液からゲル濾過カラムを用いてチロシナーゼを調製する。課題1:分画の比色分析(Bセット、Cセット)の結果を表にまとめる(表1)。課題2:表1より、チロシナーゼを含む分画(チロシナーゼ分画)を同定する。その分画にあると推定したか理由をまとめる。(目的2)表2の反応液において、酵素(チロシナーゼ)の性質を調べる。課題3:酵素の定性試験(Dセット)の結果を表にまとめる(表3)。課題4:Dセットの実験結果からどのようなことが言えるか。課題5:粗抽出液および酵素液(チロシナーゼ分画)は、それぞれ実験終了時にどのようになっているか、違いを観察し、その理由をまとめる。†ジャガイモ:1片/2人(班)小型のじゃがいもでは1/2個、大型では1/4個程度。pH7.35〜7.65PBSタブレット(タカラバイオ株式会社)10錠を蒸留水に溶かし、1lにメスアップする。NaOHに溶かし、PBSを加える。HClを慎重に加えて、pHを7.5〜8.0くらいに調整する。使用日に溶液1lに対して、ドーパを極少量(耳かき半分適度)加え攪拌する。μl/2人アスコルビン酸ナトリウムを使用。mlを加えてシャーレに濾過する。ジャガイモの成分ができるだけ溶出するように、ガーゼを濾液中で何度か揺する。最後に、ガーゼを持ち上げ、最後の一滴まで絞り出す(図3中)(注2)。1分間放置してデンプンを沈殿させる。シャーレを静かに傾けながら、2mlの駒込ピペットを用いて、上清(粗抽出液)を試験管に移す(図3右)(注3)。ジャガイモの処理スタンドに固定したゲル濾過用カラムの下にビーカーを置いて、カラムの上下のふたを開ける(図4)(注4)。カラムの上部に入っていた緩衝液の水面がフィルターのところにきたら、すぐに下側のふたをキッチリと閉める(図4右)。カラムの準備8本のマイクロチューブ(Aセット)のフタに番号をつけ、ふたを開けたままラックに並べ、1のチューブがカラムの真下に来るようにセットする(図5)。μlとり、カラムの上部に静かに加える(図5)(注5)。カラムの下側のふたを開けて、溶出液をマイクロチューブに回収を開始する(図5)。粗抽出液が全てゲル内に移動したらすぐに、2mlの駒込ピペットを用いて、緩衝液約2mlをカラムの上部に入れる(図5)。カラム上部の緩衝液が半分くらいまで減ってきたら緩衝液を上端まで足すという操作を繰り返す。ml(チューブ上部の線のところ)までたまったら素早く試験管立てを移動して、2のチューブに溶出液を入れる。この操作を8回繰り返す(図5)。mlの緩衝液を通し、カラムを洗浄する。最後は緩衝液が満たされた状態でカラム下側のふたを閉める。カラムの上部に緩衝液を満たし、上側のふたをする(図3)。チューブのふたを閉めて5回くらい上下を逆さにしてよく混ぜる(図5)(注6)。(図6)1〜8の番号をつけたチューブをBとCの2セット用意する。