問い合わせ大学で学習する生化学や分子生物学などの生命科学の基礎を自宅で学べるまとめサイトです。「核酸の抽出」とは、細胞や組織などからDNAやRNAを取り出してくる操作のことを言います。ここでは、核酸を抽出する際によく用いられる手法である「フェノール・クロロホルム抽出」や「エタノール沈殿」の原理について学んでいきましょう。DNAやRNAの抽出DNAやRNAを抽出することは、「PCR→電気泳動」といった基本的な操作の前段階としても必要ですし、例えば、PCR検査のように「細胞や組織内に存在するあるRNAを増幅させたい」といった場合などには、RNAのみを細胞や組織から取り出してくる(これを「抽出」と言います)という操作が必要になります。以下では、基本的な核酸(DNAやRNA)の抽出法についてご説明したいと思います。基本的な流れを覚えていきましょう。1細胞や組織を壊すまず初めに細胞や組織を壊さなければ、DNAやRNAを含む内容物は取り出せません。「EDTA(エチレンジアミン四酢酸)」を含む細胞溶解バッファーを使用します。これらの試薬を加えているかは、答えられるようにしておく必要があります。以下にこれらの試薬を用いる理由について簡単に解説します。・Tris(pH8.0)・・・Trisはバッファー(緩衝液)として用います。DNAはpH8.0で安定ですが、RNAはpH8.0で不安定(RNAのアルカリ分解)ですので、DNA抽出の際はよく用いられます。・SDS・・・SDSは強力な界面活性剤なので、タンパク質変性作用があります。・NaCl・・・NaClは塩(えん)です。「DNAとRNAの構造」で説明していますように、DNAはリン酸基を持つことから負(マイナス)の電荷をもちます。NaClなどの塩は溶液中ではNa+とCl-に電離します。この時、正(プラス)の電荷をもつNa+はDNAの二本鎖の間に入り込んでDNAを安定化させます。・EDTA・・・EDTAは2価の金属イオンをキレートする作用があります。キレートとは、簡単に言うと金属イオンに直接結合(配位結合)して、金属イオンの活性を封じ込めることを言います。DNAは細胞内に存在するDNase(DNA分解酵素)という酵素によって分解されてしまいますが、DNaseが働くためにはMg2+などが必要になります。そのため、細胞を破砕したときに、DNAがDNaseによって分解されることを防ぐためにEDTAを加えます。K(プロテイナーゼK)」を上記の細胞溶解バッファーに加えることもあります。プロテイナーゼKは、SDSなどの変性剤の存在下でも変性しないという性質をもつことからDNA抽出の際によく使用されます。2フェノール・クロロホルム抽出フェノール・クロロホルム抽出では、フェノールとクロロホルムを1:1の割合で混合した溶液を加えます。フェノールはタンパク質の変性作用をもつとともに、タンパク質を不溶化させる性質をもちます。簡単にいうと、フェノールを加えることで除タンパクすることができます。フェノールを加えると、DNAを溶けている水層と、脂質などが溶けている水には溶けにくいフェノール層に分離することができます。その中間層にタンパク質が集まってきますので、細胞溶解液からタンパク質・脂質を一気に除去することができます。このとき水層とフェノール層の分離をよくするのに、有機溶媒であるクロロホルムを加えています。クロロホルムは水にはほとんど溶けない性質がありますので、フェノールを水層に混入するのを防ぐことができます。実際の操作としては、フェノール・クロロホルム液を細胞溶解液に加えて、よく撹拌した後に遠心分離することによって、上記のように水層とフェノール・クロロホルム層に分離することができます。3クロロホルム抽出フェノール・クロロホルム抽出の原理を理解することができれば、この操作の意味もわかってきます。フェノールはタンパク質を除くのにとても便利なのですが、水層にフェノールが混入してしまっていると、タンパク質変性作用がありますので、後の酵素反応などに影響が出てきます。そこで、クロロホルム抽出を行うことによって、完全にフェノールを除去する必要があります。実際の操作としては、フェノール・クロロホルム抽出によって得られた水層を新しい1.5mLチューブなどに移し、そこにクロロホルムを加えます。その後、よく撹拌した後に遠心分離することによって、水層とクロロホルム層に分離することができます。4エタノール沈殿エタノール沈殿とは、簡単に言うと水に溶けているDNAなどの核酸を沈殿させる方法です。エタノール沈殿では、「エタノールは水に溶けるが、核酸を溶解しない」という性質を利用しています。イメージとしては、エタノールが水と混ざることによって、水に溶けていたDNAがエタノールのない部分に逃れていきますが、水とエタノールの混合液しかないために行き場を失い、不溶化し沈殿してくるといった感じです。この時、DNAはリン酸基をもち負電荷(マイナス)を帯びていますので、マイナスの電荷同士が反発し合ってなかなか沈殿してきません。そこで、DNAをうまく凝集させるためには、一価の陽イオンを含む「酢酸ナトリウム」などを加えることが多いです。実際の操作としては、クロロホルム抽出によって得られた水層を新しい1.5mLチューブなどに移し、そこに酢酸ナトリウムを加え、2~2.5倍量の100%エタノールを加えます。その後、よく撹拌した後に、低温条件下で遠心分離することによって、DNAを凝集させ沈殿として分離することができます。6洗浄(Wash)エタノール沈殿によって得られたDNAの沈殿物(ペレットと言います)には、塩やエタノールが混入しています。そのため、これらのペレットを70-80%エタノールで洗浄(Wash)します。実際の操作としては、エタノール沈殿した後の上清を捨て、70-80%エタノールを加えます。その後、よくペレットを剥がした後に、遠心分離します。遠心後の上清を捨て、乾燥させます(風乾によって沈殿からWash液を除く)。その後、TE(Tris-EDTA)バッファーなどに溶解させることで、DNA抽出の完了になります。dropなどでDNA濃度を測定し、目的濃度のDNAに希釈した後で各種解析に用います。RNA抽出DNA抽出とRNA抽出の基本的な流れは同じですが、いくつか注意点がありますので、以下で確認していきましょう。『RNAは分解されやすい』RNAの取り扱いにおいて最も注意しなければいけないことは、RNAが分解されないようにするということです。RNAはRNase(RNA分解酵素)によって簡単に分解されてしまいますが、このRNaseは私たちの汗や唾などに含まれています。一方で、このRNaseの酵素活性はフェノールなどの変性剤によっては完全に失活させることはできません。そのため、例えば実験台や実験器具にRNaseがコンタミ(コンタミネーションのこと)していると、RNAは急速に分解されてしまいます。そこで、RNA抽出の際には、より強力なタンパク質変性剤である「グアニジンイソチオシアネート」という試薬を用います。実際には、DNA抽出の際に用いたフェノール(これもタンパク質の変性剤です)にグアニジンイソチオシアネートを入れたものでRNA抽出を行います。※RNA抽出のときには手袋を着用し、ベラベラ喋らずに(唾を飛ばさないように)実験を行いましょう。細胞や組織からのDNAやRNAの抽出についてはこれで以上です。次は「2)大腸菌の形質転換について」について学んでいきましょう。ここでは「大腸菌の形質転換」について学んでいきます。前項では「大腸菌の形質転換について」を学びました。本項では大腸菌を形質転換した後に行われる「プラスミドDNAの抽出」について学んでいきましょう。ここでは「大腸菌の形質転換」について学んでいきます。...生化学(実験手法)2)マキサム・ギルバート法(従来法)古くから知られているDNAシークエンスには、大きく分けて「マキサム・ギルバート法」と「ジデオキシ法(サンガー法)」の2種類があります。今回は「マキサム・ギルバート法」について解説していきます。Prism【研究者がもっていると便利なソフト1】2023/1/22プロフィール管理人:AZARASHI「大学で学ぶような生命科学関連の情報を分かりやすくまとめたサイトがあればなぁ...」「専門用語の意味がよく分からない...」といった悩みを解決することを目指して更新中。『わかりやすい』まとめサイト~大学で学習する生化学や分子生物学などの生命科学の基礎を自宅で学べるまとめサイトです。『わかりやすい』まとめサイト~。