University概要これは、野生で捕獲されたコウモリのゲノム、トランスクリプトーミクス、およびプロテオミクス分析のための最適な組織調製のためのプロトコルです。これは、コウモリの捕獲および解剖、組織保存、およびコウモリ組織の細胞培養のためのプロトコルを含む。Abstractハイスループットシーケンシング技術が進歩するにつれて、高品質の組織の取得と保存のための標準化された方法は、非モデル生物へのこれらの方法の拡張を可能にします。コウモリからの組織収集を最適化する一連のプロトコルは、一連のハイスループットシーケンシングアプローチのために開発されました。ここでは、コウモリの捕獲のためのプロトコル、各コウモリに対して収集する必要な人口統計、および組織収集中のコウモリへのストレスを最小限に抑えるために最適化された方法を示します。RNA、および(iii)プロテオミクスレベル分析用のタンパク質を得るための組織を収集および処理する方法を概説する。最後に、ウィングクリップから生存可能な一次細胞培養物を作成することによって致命的なサンプリングを回避する方法も概説する。これらの方法の中心的な動機は、各コウモリの潜在的な分子および形態学的データの量を最大化し、組織を保存する最適な方法を提案し、将来的に新しい方法が開発されるにつれてその価値を維持することです。この標準化は、染色体レベルのエラーのない種のゲノムを世界中で配列するイニシアチブが出現し、複数の科学当事者が異なる分類のシーケンシングを先導しているので、特に重要になっています。ここに概説されるプロトコルは、Bat1Kの理想的な組織収集および組織保存方法を定義し、コウモリのあらゆる種のゲノムを配列するコンソーシアムである。Introductionハイスループットシーケンシング(HTS)方式は、効率が急速に向上し、コストが削減され、これらのアプローチを数百または数千のサンプルに拡張できるようになりました。これらの技術の応用によって得られた洞察は、生物医学から進化と生態学に至る複数の科学分野に大きな影響を及ぼします1,2,3.しかし、多くのHTSアプリケーションは、生きている源からの高品質の核酸に批判的に依存しています。この制限は、長読み分子4に基づく第3世代シーケンシングの開発に伴い、ますます問題となる可能性が高い。そのため、研究室外の野生生物から新鮮な組織サンプルを採取するためのベストプラクティスの確立に注力する必要があり、材料の有用性を最大化し、必要な個体数を減らす必要があります。Bat1Kは、染色体レベルのアセンブリ5にコウモリのすべての種のゲノムを配列するための継続的なイニシアチブを持つ科学者の国際的なコンソーシアムです。5、6を理解するための影響を持つ例外的な適応を有する。多くのコウモリはまた、人間の搾取7のために脅かされたり、絶滅の危機に瀕しているか、病原体8、9、およびゲノムレベルのシーケンシングがこれらの種の保全のために非常に重要であるために急速に減少しています。Bat1Kは現在、すべてのコウモリ種のゲノムを配列することを目指していますが、高品質のゲノムシーケンシングのための組織サンプルの収集の標準化は、組織生物学者のコミュニティ全体で重要な課題のままです。ゲノムデータに加えて、コウモリの適応の多様性を機能的に理解するには、組織特異的な転写物およびタンパク質分析が必要であり、多くの場合、別個の収集プロトコルが必要です。すべての分類グループと同様に、最適な組織の収集と保存は-omics分析のための最高品質のデータを得るために不可欠ですが、技術が急速に変化するため、ベストプラクティスの伝達は困難であることが多く、独立して取り組む複数の研究チーム。オミクス研究は、多くのコウモリ種がまれまたは脅かされていることを考えると、特に緊急です。げっ歯類やシュルーなどの他の小型哺乳類とは異なり、コウモリは長生きしており、優れたDNA修復メカニズム10と遅い繁殖11に起因し、ほとんどの種は1年に1つまたは(少数の場合)2人の若者を出産する。これらの理由から、コウモリの集団は妨害から回復するのが遅く、野生から多くの個体を集めることは望ましくも実現可能でもありません。言い換えれば、プロトコルを最適化して単一の試料のデータ量を取得し、不必要にサンプリング作業を複製する必要性を減らす必要があります。ここでは、このプロトコルは、ゲノムおよびトランスクリプトームシーケンシングおよびタンパク質分析のためのコウモリ組織の収集およびサンプリングのための標準化された方法に特に焦点を当てています。その最優先事項は、コウモリ組織が収集の許可プロセス、組織の輸出、動物へのストレスの最小化、および長期保存条件に至るまで、倫理的かつ責任を持って収集されることを保証することです。収集した異なる材料の有用性を将来的に防除することを目的として、精巧な解剖が開発されました。この原稿は、集団への影響を最小限に抑え、科学的価値を最大化することを目的とした人道的な方法でコウモリを収集するためのステップバイステップガイドを提供します。このプロトコルの焦点はコウモリでの使用のために特に、ステップの多くは、他の脊椎動物のタキサ、特に哺乳類に関連しています。貯蔵のための温度および保存剤の選択を含む組織集のためのプロシージャは計画された下流の分析の性質によって決定される。可能であれば、特定の分析が計画されていない場合でも、その将来の有用性を最大化するために、組織を様々な方法で収集することを強くお勧めします。一般に、組織は、核酸(DNAおよびRNA)、またはタンパク質のいずれかのその後の分析のために収集され、保存されます。これらの各用途について、液体窒素(LN2)で直接フラッシュ凍結することにより、組織を最適に保存することができる。即時浸漬は、常に現場で可能であるとは限りません。技術の進歩に伴い、周囲温度でDNAやRNAを保存する特殊なバイアルなどのリソースが容易に利用できるようになってきています。このプロトコルでは、このような材料のすべてを検証していませんが、他の研究者は、我々がここで提示するものに対して、新しい材料の性能を比較的分析することを奨励します。私たちは、LN2にアクセスできない状況で、例えば、アマゾンの小さな平面を介してサイトアクセスのためにLN2輸送が不可能な場合に、異なるアプリケーションのための組織を理想的に保存する方法を提供しています。生細胞を増殖・増殖させることができる組織を採取する方法を提供しています。採取されたすべての採取された組織について、貯蔵培地は、標準または高分子量(HMW)DNA抽出に使用できるかどうかを決定します。HMWは、長い読み取りシーケンシングに必要であり、現在染色体レベルのゲノムアセンブリ、または「プラチナ標準」ゲノムを生成するために必要とされます。呼ばれる)、またはRNAlater(以下「RNA安定化溶液」)保存サンプル(フラッシュ凍結サンプルは最適なままであるが)から抽出することができる).標準的な実験方法(例えば、シリカゲル膜スピンカラム、フェノールクロロホルム)によって単離されたDNAは、依然として〜20キロ塩基(kb)までのDNA断片を得ることができる。したがって、十分な収率がある場合、この形態の単一インサートサイズライブラリー調製物に使用してもよいし、挿入サイズがしばしば〜500塩基対(bp)であり、〜100bpの短い配列読み取りが生成される12。このDNAは、全長染色体データが必要ない「再配列」プロジェクトや研究に特に有用です。kb)はより困難であり、収穫後にLN2で急速に凍結され、抽出されるまで最大-80°Cで維持された組織を使用してのみ確実に得ることができます。低分子量または断片化されたDNAは、多くの場合、PCRによる遺伝子増幅および短読シーケンシング13を含む標的アプローチに対して十分である。保全17,18.低分子量および断片化されたDNAの標的配列再捕捉に成功したはまた、コウモリ19を含む多数の脊椎動物群のために実証されている。21.ただし、品質は、サンプルが格納されているメディアの種類22に大きく依存します。カ綿棒と生検パンチの系統的および定量的比較の後、翼生検パンチは一貫して高いレベルのDNAを生み出し、コレクション22の間にコウモリにストレスが少なかったことが示された。これらの比較はまた、翼のパンチが指標シリカ(すなわち、水分が観察されたときに色を変化するシリカゲルビーズで作られた乾燥剤の一種)で保存されたときに最良の結果が得られたことを示した。エタノールまたはDMSO22;しかし、組織安定化溶液を含む他の貯蔵媒体は検査されなかった。翼パンチは、Kacprzykら23および以下に説明するように培養中の線維芽細胞を増殖させるためにも使用することができる(セクション6参照)。これらの方法では、翼またはウロパタギウムを穏やかに拡張し、サンプルを得るために、クリーンな生検パンチ(通常は直径3mm)を使用する必要があります。このアプローチは、ほとんどの場合24で数週間以内に治癒する傷跡で、永続的な損傷を引き起こさないようです。kb)はより困難であり、現在、収穫後にLN2で急速に凍結され、抽出されるまで最大-80°Cで維持された組織のみを使用して確実に得られる。kb)は、長読みDNAシーケンシング、したがってデノボゲノムアセンブリに不可欠です。DNAを単離するために使用できますが、得られる分子サイズは、多くの場合、第3世代シーケンシング技術(例えば、パシフィックバイオサイエンス(PacBio)などの企業が立ち上げたもの)の要件を満たしていません。オックスフォードナノポア技術、および10倍ゲノミクス、またはバイオナノゲノミクスまたはダヴテールゲノミクスによって提供される組み立て方法を介して」。kb)の新たな需要があります。新鮮なサンプルはすべて適していますが、これらは貯蔵バッファーまたは凍結保護剤なしでLN2で直ちに凍結フラッシュする必要があります。ペーパーの範囲を超えていますが、他の場所で25で入手できます。RNA用組織RNAはDNAよりも安定性の低い一本鎖分子です。RNAには多くの形態がありますが、-omics分析はmRNA(メッセンジャーRNA)と小さなRNA(例えば、マイクロRNA)に焦点を当てる傾向があります。転写後、mRNAは、イントロンを含んでおらず、遺伝子/ゲノムのコード部分を表す成熟した転写物を形成するためにスプライスされる。コード遺伝子はゲノムサイズのごく一部(1%~2%)を占めており、mRNAを標的化することで、遺伝子の配列データを得る費用対効果の高い手段となります。マイクロRNAは、mRNAをタンパク質に変換するプロセスを調節するRNAのクラスであり、したがって重要な調節エフェクタです。RNA転写物は、転写物の一部として、個別に、または-omics分析26、27、28、29、30のために、より一般的に配列することができます。所定のサンプルに存在するすべてのRNA転写物の合計です。シーケンシングは、いくつかの方法(すなわち、短読RNA-seqまたは長読み全体アイソフォームSeqを介して)に従って行うことができ、RNAの豊富さとアイソフォームの使用法の両方の分析を可能にする。mRNA転写物の量と多様性は細胞や組織によって異なるため、RNAシーケンシングにより、サンプル間での遺伝子発現および調節を研究および比較することが可能になります。これらの方法はますます生物学的に有益になりつつあるので、小さなRNAおよびアイソフォームシーケンシング全体のシーケンシングに対する関心が高まっています。RNAの異なるクラスを配列する組織サンプルの調製は、この原稿に提示されるのと同じ方法で行うことができ、その後の抽出方法のみが31、32と異なる。DNAとは対照的に、RNAは化学的に不安定であり、RNAベースのウイルスに対する防御戦略として組織リサテスに普遍的に存在するRNase酵素によって標的とされています。これらの理由から、細胞および組織におけるRNA画分は、サンプリングおよび/または安楽死の点の直後に分解し始める。したがって、RNAを保存するには、その劣化を防ぐためのステップが必要です。これは典型的には、組織に自然に存在するRNasesを不活性化するRNA安定化溶液などの安定化剤で4°Cで新たに採取した組織を保存し、続いて長期保存のために凍結することを含む。好ましい代替として、組織はLN2でフラッシュ凍結され得る。前述したように、LN2を現場に輸送し、組織の解凍を防ぐためにレベルを維持することは、ロジスティックに困難な場合があります。ついて議論されたものと同様の方法で細胞や組織の間で変化します。タンパク質は平均的にRNAよりも安定しています。プロテオミクスを用いたタンパク質同定は、通常、全体ではなく、タンパク質配列の一部に一致するが、組織間の発現に関する情報を提供し、存在する病原体を特徴付けることができる。多くのタンパク質配列が哺乳類全体で保存されているので、プロテオミクスのコウモリサンプルは、保存されたヒトタンパク質で容易に汚染され、採取中に無菌プロトコル(例えば、手袋、鉗子)を必要とする。LN2のフラッシュ凍結はタンパク質の分解を防ぐ最良の方法ですが、ドライアイス、-20°C冷凍庫、さらには氷を使用する場合は、他の手段がない場合に適しています。温度が上昇するにつれて、差動タンパク質の分解のリスクも上昇します。組織安定化液などの安定化剤は、組織のタンパク質分率を室温で保存するのに有効であり、フラッシュ凍結が生存できない場合の短期保存(最大1週間)に適しています。所定の組織の酵素プロファイルは、その中のタンパク質の保存に直接影響を与える。筋肉などの酵素活性の低い組織は、家庭用冷凍庫の高温でもタンパク質プロファイルを保持することができます。対照的に、肝臓組織は酵素的に反応性であり、そのタンパク質は調製中に分解する確率が高い。ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)サンプルからヒトプロテオミクスプロファイルを得るためのプロトコルの増加は、組織のパラホルムアルデヒド固定が、採取時に凍結する際に低コストのタンパク質保存の約束を保持することを示唆している。実現可能な33,34.保存時間および状態に大きく依存するが、タンパク質はホルマリン固定、エタノール保存コウモリ標本35から免疫組織化学によって同定されている。このアプローチはプロテオミックレベルのサンプリングにスケーラブルではありませんが、フラッシュ凍結が利用できず、他の安定化剤が高価すぎる場合にホルマリン固定コウモリ組織がタンパク質プロファイルを生成する可能性を強調しています。細胞培養組織サンプリング組織とフラッシュ凍結は、使用する材料の有限量を提供し、材料が使用されると、それはもはや利用できません。細胞培養は、将来の研究のためにすぐに使用または保存することができる生細胞を提供する。培養はまた、組織サンプルが小さいときに収量を増加させるために細胞の膨張を促進する。非致死的サンプリングが不可欠であり、したがって保全に広い意味を持つ希少種の実験など、組織採取が限られている場合に特に有用である。記載されているのは、翼膜組織の非致死的サンプリングを介して細胞培養が可能であるが、培養は複数の組織タイプ36、37で可能であるプロトコルである。ここで提供されるプロトコルは、付着細胞を選択します。使用されるソース組織と成長培養媒体の組み合わせは、このプロトコルを選択し、線維芽細胞を増殖するのに適していますが、必要に応じて、代替プロトコルを使用して他の細胞タイプを選択することができます。Bat1Kプロジェクトの文脈では、希少種や絶滅危惧種の場合、翼膜の非致死的サンプリングと培養によるサンプルの膨張が、5を採用する複数の技術に必要なDNAの量を生成するために不可欠であると予測されています5.バットキャプチャコウモリを扱うすべての人々は、コウモリの有能な研究者によって訓練され、一連の露出前注射で狂犬病に対して予防接種を受けるべきです。噛まれた場合は、さらなる一連の露出後注射が必要です。コウモリを捕獲する標準的な方法には、ミストネット(図1)とハープトラップ(図2)があります。ミストネットは、コウモリの苦痛を最小限に抑えるために最も注意を必要とするので、最も一般的に使用され、中程度の活動を持つ領域に最適です。小さなコウモリは特に脆弱であり、すぐにする傾向がない場合はストレスで死ぬことがあります。頻繁なネット検査は、コウモリの損傷や死亡率だけでなく、ミストネットへの損傷を最小限に抑えます。適切な組織採取は組織を新鮮にする必要があり、コウモリのミストネットに対する不適切な注意は、研究者がサンプルを適切に処理する前に不必要な死亡率または早期死亡につながる可能性があるため、この詳細は重要です。いくつかのコウモリは最小限の苦痛でハープトラップで休むことができるので、このアプローチは、洞窟や大きなねぐらのような高いコウモリの活動を持つ領域に最適です。形態学的および人口統計的情報を収集するための適切なコウモリのキャプチャとデータ処理の詳細な手順は、補足的な方法で利用可能です。Protocolここに記載されているすべての方法は、ストーニーブルック大学の機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています(プロトコル#2013-2034)。イゾルラン麻酔薬または別の利用可能な麻酔薬で綿のボールを湿らせます。綿のボールを再密封可能な気密性のビニール袋に入れます。ResultsDna標準的な低分子量(LMW)分析のために、DNAは3つの新熱帯コウモリ種から抽出された。(脳、肝臓、腸)の小片(<0.5cm)をRNA安定化溶液に入れ、フラッシュ凍結し、-80°Cで保存した。抽出は、RNase処理43?...Discussionこの原稿で議論されるプロトコルは、コウモリの様々なハイスループット分子解析のための最良のサンプリングプラクティスを説明する。すべての成功した-omics研究は、高品質の組織を必要としますが、コウモリ組織だけでなく、他の非モデル生物は、多くの場合、制御された実験室の設定と同じ基準に設定することができないフィールド条件で発生します。disclose.Acknowledgementsセントロ・デ・エコロディア・イ・バイオディバーシダード・セビオ、エリカ・パリザ、ミルスカ・サンチェス、ホルヘ・カレラ、エドガー・レンギフォ・バスケス、ハロルド・ポロカレロ・ザリア、ホルヘ・ルイス・レヴォー、ジェイミー・ペチェコ・カスティージョ、カルロス・テロ、ファニー・コルネホ、ファニー・ファニー・ファニ・ファニ・ファニェ可能なペルーでの収集。グルポ・ジャラグアとヨランダ・レオンのメンバー全員に対し、ドミニカ共和国での組織採取を可能にし、ベルナル・ロドリゲス・ヘルナンデス、ベルナル・マタリタ、コスタリカのラ・セルバ生物研究ステーションの皆さんに感謝します。サンプリングが可能です。我々は、細胞培養生成のためのフィロストムス変色コウモリからの翼パンチのアクセスとサンプルコレクションのためのエラ・ラッテンカンプ&ルッツ・ヴィーグレベに感謝します。フィロストムス変色コウモリは、ミュンヘンのルートヴィヒ・マクシミリアン大学の生物学II科の繁殖コロニーに由来する。コウモリを維持し、繁殖するための承認は、ミュンヘン地区獣医局によって発行されました。1442142によって資金提供されました。1838273によって資金提供されました。1812035によって資金提供されました。SCVとPDは、マックス・プランク・リサーチ・グループ賞とヒューマン・フロンティア・サイエンス・プログラム(HFSP)研究助成金(RGP0058/2016)によって資金提供されました。SJR、JHTP、およびKTJDは、SJRに授与された欧州研究評議会(ERC開始助成金310482[EVOGENO])によって資金提供され、ECTは欧州研究評議会の助成金(ERC-2012-StG311000)によって資金提供されました。reserved×-1::1。