分解能スポットサイズ走査レンズチュートリアルFeedbackこのページでは、顕微鏡対物レンズの機能、仕様、そして光学系内の動作に関連するチュートリアルがご覧いただけます。下の目次のリンクをクリックするか、上のタブをクリックしてください。対物レンズのチュートリアル倍率&視野(FOV))分解能スポットサイズ走査レンズのチュートリアル対物レンズ、走査レンズ、チューブレンズの製品ラインナップはこちらからご覧いただけます。注:上の図は典型的な対物レンズの刻印ですが、こちらはあくまで例としてご参照ください。刻印されている仕様の書式や内容は、対物レンズごとに、もしくはメーカごとに異なります。当社では、様々な研究ニーズに合わせていくつかのタイプの対物レンズをご用意しています。ここでは、それぞれのタイプの対物レンズの特長と利点を説明します。vivo観察用対物レンズここでは対物レンズの先端とカバーガラスの間に存在する媒質について触れます。ドライタイプの対物レンズは、対物レンズと試料の間には空気を満たしていることを前提に設計されています。油浸対物レンズの場合、対物レンズと試料のカバーガラスの間にはMOIL-30のような液浸油を満たす必要があります。油浸はNAを1.0より大きくするために必要とされます。Dipping)は試料と直接接触する設計となっています。vivo観察用対物レンズが媒質のない状態で使用された場合、像の品質は非常に低くなることにご注意ください。プランアクロマートおよびプランアポクロマート対物レンズ「プラン」とは対物レンズの視野にわたって平坦な像を作り出すための収差補正が行われたことを意味しています。「アクロマート」はレンズ設計において色収差の補正がなされていることを意味しています。こちらの対物レンズでは2つの波長に対する色収差補正と、1つの波長に対する球面補正がなされています。プランアクロマート対物レンズは緑の光に対して最も優れた像を作り出します。アポクロマート対物レンズは3~5の波長に対する色収差補正と、2~4の波長に対する球面収差補正がなされています。白色光を使用したカラー顕微鏡写真撮影の場合、プランアクロマート対物レンズは十分な像を作り出しますが、より補正がなされているプランアポクロマート対物レンズやプランフルオール対物レンズ(後述)には及びません。プランフルオール(プランフルオリート)対物レンズプランフルオール対物レンズは、プランセミアポクロマート対物レンズや、プラン蛍光対物レンズ、プランフルオリート対物レンズとも呼ばれ、視野にわたって平坦な像を作り出します。プランフルオール対物レンズは、2~4波長において色収差、3~4波長において球面収差を補正します。プランアクロマート対物レンズよりも多くの波長において収差を補正した上、設計波長の間の波長範囲でも収差が少なくなっています。これらの対物レンズはカラー顕微鏡写真撮影の用途にも適しています。スーパーアポクロマート対物レンズ当社のスーパーアポクロマート対物レンズは可視域全体で軸上色収差が補正されています。これらの対物レンズでは、広い視野全体にわたり、ビネットの無い回折限界の軸上色性能が得られます。開口数(NA)が高いため、ワイドフィールド観察・撮像や光量の低い環境での使用に適しています。倍率(Magnification)対物レンズの倍率はレンズチューブの焦点距離(L)を対物レンズの焦点距離(F)で割った値です。Fシステムの総合倍率は、対物レンズの倍率に接眼レンズまたはカメラチューブの倍率を乗じます。顕微鏡用対物レンズ筐体に示されている仕様の倍率は、対物レンズを対応するチューブレンズの焦点距離でお使いになる限り正確です。開口数(NA)開口数は、対物レンズの最大受光角を表す無次元量です。一般的には下記の式で表します。sinθaθaは対物レンズの最大受光角度の半分(半角)、niは媒質の屈折率です。媒質は通常空気ですが、水や油、ほかの物質の場合もあります。Length)対物レンズ上部(取付けネジの底)からカバーガラス(カバーガラスを使用しない場合は、試料)までの距離です。同焦点距離は製造会社によって、また同じ会社の製品でも異なることがあります。mmの特大対物レンズを製造しているメーカもあります。同焦点距離が異なる対物レンズを使用する必要がある場合には、同焦点距離エクステンダもご用意しています。Distance)対物レンズの先端からカバーガラスの近い方の面までの距離で、対物レンズの設計により異なります。対物レンズに刻印されているカバーガラスの厚さの仕様値によりカバーガラスを使用すべきかが分かります。nmでの画質におけるカバーガラスの効果を示しています。FN)視野数は、視野(mm単位)に対物レンズの倍率を乗じた数に相当します。mmの厚みで設計されていますが、製造工程でのバラツキにより異なる場合があります。いくつかの対物レンズに付いている補正リング(カラー)は、内部の光学素子の位置を調整することにより厚さの違うカバーガラスに使用されます。mmの標準のカバーガラスとのみ使用できる設計の対物レンズもあります)。その場合、対物レンズには補正リングは付いていません。nmの光における球面収差の大きさと使用するカバーガラスの厚さの関係を示しています。0.40までの対物レンズではカバーガラスによる球面収差は回折限界を超えることはありません。カメラで画像を表示する場合、システム倍率は対物レンズの倍率とカメラチューブの倍率の積です。三眼鏡筒で画像を表示する時のシステム倍率は、対物レンズの倍率と接眼レンズの倍率の積です。mmのチューブレンズを使用しておりません。倍率システムの倍率はシステム内の各光学素子の倍率の積で求めます。倍率のある光学素子には右図の通り、対物レンズ、カメラチューブ、そして三眼鏡筒の接眼レンズが含まれます。各製品仕様に記載されている倍率は通常、すべて同じメーカの光学素子を使用した時のみ有効であることにご留意ください。同じメーカの光学素子を使用していない場合、システムの倍率は下記の通り、まず対物レンズの有効倍率を求めたあと算出する必要があります。Calculator(赤いボタンをクリック)をダウンロードしてご使用ください。こちらの計算用エクセルファイルはマクロを使用したスプレッドシートになっています。計算を行う際はマクロを有効にする必要があります。マクロを有効にするには、ファイルを開いて、上部にある黄色いメッセージバー上の「編集を有効にする」ボタンをクリックしてください。試料をカメラでイメージングする場合、イメージは対物レンズとカメラチューブによって拡大されます。三眼鏡筒を通して試料をイメージングする場合、イメージは対物レンズの倍率と三眼鏡筒内の接眼レンズによって拡大されます。右図のように接眼レンズでの像はカメラチューブを通りません。倍率は根源的な値ではなく、特定のチューブレンズの焦点距離を推定して計算し、導き出す値です。右の表のように各顕微鏡メーカはチューブレンズに様々な焦点距離を設定しています。そのため異なるメーカの光学素子を組み合わせる場合、システムの倍率を算出するには対物レンズの有効倍率を計算する必要があります。対物レンズの有効倍率は式1で求められます。Magnificationを算出するために対物レンズのメーカが使用したチューブレンズの焦点距離です。焦点距離は右表に記載されています。Leica、Mitutoyo、Nikonならびに当社ではチューブレンズの焦点距離は同じです。これらのメーカの光学素子を組み合わせた場合、倍率の変換は必要ありません。対物レンズの有効倍率が算出されたら、上記のようにシステムの倍率が計算できます。例3:三眼鏡筒の倍率(異なるメーカを使用)三眼鏡筒を通して試料をイメージングする場合、イメージは対物レンズの倍率と三眼鏡筒内の接眼レンズによって拡大されます。この例では倍率が20倍のOlympus製対物レンズと接眼レンズの倍率が10倍のNikon製三眼鏡筒を使用します。式1と右の表によりNikon製顕微鏡内のOlympus製対物レンズの有効倍率を下記の通り計算しました。試料をカメラでイメージングする場合、試料領域の寸法はカメラセンサの寸法とシステム倍率を使用して下の式2で求められます。2)カメラセンサの寸法はメーカが提供しています。システム倍率は対物レンズの倍率とカメラチューブの倍率の積です(例1をご参照ください)。必要に応じ、対物レンズの倍率を例3のように調整します。倍率が高くなればなるほど分解能も向上しますが、視野は狭くなります。倍率と視野の関係性については右の図でご覧いただけます。このカメラを例1のNikon製対物レンズと三眼鏡筒に使用した場合、システム倍率は15倍となります。イメージングの領域は下記の通りになります。下のマウス腎臓の画像はすべて同じ対物レンズとカメラを使用して取得しました。カメラチューブのみ違う製品を使用しています。左から右の画像にいくにつれカメラチューブの倍率が下がっていますが、視野が広くなる分、細部も小さくなり見にくくなることが分かります。WFA4102)分解能のチュートリアル多くのイメージングにおいて、対物レンズの分解能は重要なパラメータです。このチュートリアルでは、対物レンズの分解能を定義するために使用されるさまざまな約束事について説明します。当社のサイトに掲載しているすべてのイメージング用対物レンズには、レイリー分解能の理論値を示しています。ここに示すそれ以外の基準に基づく記述方法は、情報提供の目的で提示しています。対物レンズの分解能は、物体の近接した構造を識別する性能を表します。これは多くの場合、2つの点光源で構成される物体を想定し、これらの2つの点光源を分解できる最小間隔を求めることによって理論的に定量化します。点光源をイメージングしてみると、単体の明るい点となることはなく、回折の影響を受けて幅の広い強度プロファイルとして現れます。このプロファイルはエアリーディスクとして知られ、強度の高い中央のピークと、それを囲む強度の低いリングから構成されます。そのため、2つの互いに近接する点光源から生成されるイメージは、2つの重なり合うエアリーディスクプロファイルから構成されることになります。したがって、対物レンズの分解能は2つのプロファイルを一意的に識別できる最小間隔によって決めることができます。どのような状態であれば2つのプロファイルが分解されたとするのかという点について、基本的な基準はありません。実際に使用されている基準は幾つかあります。顕微鏡イメージングの分野で最も一般的に使用されている基準としては、レイリーの基準とアッベの基準の2つがあります。その他の基準としては、天文学の分野でより一般的に用いられているスパローの基準があります。レイリーの基準レイリーの基準では、一方の強度プロファイルの最初の極小値の位置が、もう一方の強度プロファイルの最大値の位置と一致したときに、2つの重なり合うエアリーディスクプロファイルが分解されたとします[1]。エアリーディスクの最初の強度の極小値は、中心の最大値から半径1.22λf/Dの位置に生じることを示すことができます。ここで、λは光の波長、fは対物レンズの焦点距離、Dは入射瞳の直径です。0.5*D/f)を用いて、レイリー分解能は次の式で表されます。0.61λ/NAレイリー分解能に等しい距離だけ離れた2つのエアリーディスクの理想的なイメージを左下に示します。光源はインコヒーレント光源であると仮定しています。この図の2つの最大値を通る水平な線に沿って、その強度分布をグラフ化すると右側の図が得られます。この強度プロファイルの図における垂直の点線により、一方のエアリーディスクの最大値の位置と、もう一方のエアリーディスクの最初の極小値の位置が一致していることが分かります。2つの最大値の間には極小値があり、それにより2つの白いピークの間には灰色の領域が現れています。Enlarge左:2つの点光源がレイリー分解能によって分離されたとき、それらは分解されたとみなします。2つの白いピークの間に灰色の領域がはっきりと見えます。上:垂直の点線により、一方の強度プロファイルの最大値の位置が、もう一方の強度プロファイルの最初の極小値の位置と一致していることが分かります。当社では、ウェブサイトに掲載しているすべてのイメージング用対物レンズについて、そのレイリー分解能の理論値を個別の製品説明ページでご提示しています。アッベの基準アッベの理論では、画像形成を回折の二重プロセスとして表現します[2]。そのフレームワークでは、2つの構造が距離dだけ離れているとき、それらを分解するには少なくとも0次と1次の両方の回折光が対物レンズの開口部を通過する必要があるとします。λ/n*sin(α)で与えられます。ここで、αは対物レンズの半開口角、係数nはイメージング媒体の屈折率です。この結果は、実際の限界に対して2倍の過大評価をしています。理由は、0次光とともに対物レンズを通過しなければならない1次光は少なくとも1つあればよいわけですが、ここでは両方の1次光を通過させているためです。n*sin(α))を使用することで、有名なアッベの分解能限界が得られます。0.5λ/NA下の画像は、アッベの分解能限界で分離された2つのエアリーディスクを表しています。レイリー限界と比較して、原点における強度の減少を識別するのは大分困難になります。右側の強度分布図を見ると、中心の強度の減少はわずか2%です。最大値と中央の極小値の間のコントラストは観察可能ではありますが、レイリー限界と比較するとはるかに弱くなっています。上:このグラフでは2つの最大値の間に小さな強度の減少が見られます。スパローの基準2つの点光源の間の距離がレイリーまたはアッベの分解能基準に対応する場合、重ね合わせられた強度プロファイルにおける2つの最大値の間の原点に極小値が見えます。いった意味では、これらの評価基準では2つの点光源を分解することができています。点光源間の距離がアッベの分解能限界を超えてさらに小さくなると、2つの独立した最大値は1つの中央の最大値に一体化され、2つの光源からの寄与を個々に分解することができなくなります。スパローの基準では、中央の極小値が中央の最大値に変化したときに分解能限界に達したとします。スパローの分解能限界では、重ね合わせられた強度プロファイルの中心は平坦になります。これは、位置に関する微分係数が原点でゼロになることを意味します。原点でのこの1次微分係数は、重ね合わせられた強度プロファイルの極小値または最大値であるため、常にゼロです(厳密に言えば、これは2つの光源の強度が等しい場合にのみ当てはまります)。従って、原点の強度が極小値から最大値に変化するときにスパローの分解能限界に到達したことになるため、このときに2次微分係数の符号が正から負に変化する必要があります。このようにスパローの基準は2次微分係数に課される条件となり、2次微分係数がゼロのときに分解能限界に到達することになります[3]。この条件を2つのエアリーディスクが重ね合わせられた強度プロファイルに適用すると、スパロー分解能が次のように得られます。0.47λ/NA左下の画像は、スパローの分解能限界の距離に置かれた2つのエアリーディスクのイメージを示しています。上記のように2つのピークの間では強度が一定であり、原点での強度のくぼみはありません。右側のグラフでは、原点付近で強度が一定であることを確認できます。レイリーやアッベの限界とは異なり、原点で強度は減少しません。上:スパローの分解能限界では、重ね合わせられた強度分布は原点付近で一定になります。ここではスケールが1に規格化されています。ガウシアンビームの強度プロファイルはゼロに漸近する形状であるため、スポットサイズの定義として半値全幅(FWHM)または1/e2幅が慣習として用いられています。このチュートリアルでは後者の定義を使用しています。スポットサイズのチュートリアルレンズや対物レンズによって集光されたレーザービームのスポットサイズは、多くの用途において重要なパラメータです。このチュートリアルでは、初期のビーム径と入射瞳径の比(トランケーション比)が与える集光スポットサイズへの影響と、集光スポットサイズをこの比の関数として表した計算式について説明します。集光素子を透過するパワーもトランケーション比に依存するため、スポットサイズとパワー透過率の最適なバランスはその用途に依存します。当社の集光対物レンズについては、入射するガウシアンビームのビーム径(1/e2)と入射瞳径が等しいときの集光スポットサイズの推定値を提示しています。1.83λ/(2*NA)によって求められます。それぞれ対物レンズのf値と開口数で、このときに透過する光パワーは入射ビームの86%です。ガウシアンビームプロファイルレーザービームは一般に横方向の強度プロファイルを有し、それは下記のガウス関数で近似できます。ここで、wはビームの半幅、すなわちビームウェスト半径です。0.14I0に減少した地点までの半径(r)として定義されています。レーザービームのスポットサイズはビームウェスト半径の2倍で定義され、このスポットサイズの円内にはビームの全強度の86%が含まれます。レーザービームを対物レンズで集光したとき、得られるスポットサイズ(s)は、光の波長(λ)、対物レンズに入射するビームの直径(S)、対物レンズの焦点距離(f)および対物レンズの入射瞳径(D)に依存します。S/D)が導入されています。f値は対物レンズによって決まる値ですが、トランケーション比は入射ビーム径の大きさを変えることで調整が可能です。集光スポットサイズは、波長、トランケーション比、およびf値を用いて次の式で表されます。ここでK(T)は、スポットサイズ係数と呼ばれ、トランケーション比(ビーム径と入射瞳径の比)の関数です[1]。集光の強度プロファイルを計算し、さらに個別のTの値に対する集光スポットサイズを求め、そのような数値計算によって得られたKの値を、下の図2に黒い四角でプロットしています。0.5における計算値に対する多項式フィッティングを示しています。青い網掛け領域は、ガウシアンビームの理論により集光スポットサイズを正確に推定できることを示しています。それ以上の領域ではトランケーション(ケラレ)の影響は無視できず、実際のスポットサイズは大きくなります。∞では、係数は灰色の実線で示すエアリーディスクによる値の1.6449に漸近します。S/Dの関数として示しています。青い網掛け領域は、トランケーションによるスポットサイズへの影響が無視できる領域を示しています。0)では、Kの値はよく知られている理論値に漸近します。小さなT、すなわち入射するガウシアンビームのビーム径よりも入射瞳が非常に大きい場合には、Kは1.27/Tに従います。1.27λf/Sが得られます。1.27/Tが得られます。0.5以下、すなわち入射瞳径Dが入射ビーム径Sの2倍以上の場合には、この式により集光スポットサイズを正確に予測することができます。0.5では、数値計算の結果と青い点線の偏差が示すように、この式でのKの値は過小評価となります。エアリーディスクプロファイルのスポットサイズは、一般に最初に強度がゼロになる半径によって定義されます。半径をλNの単位で表すと、その値は1.22λNとなり、そのスポットサイズは2.44λNになります。同じプロファイルの1/e2半径は0.82245λNとなり、そのスポットサイズは1.6449λNになります。Tが大きくなると、開口に当たるビーム強度はより均一になります。その結果として、集光スポットの強度プロファイルは、ガウシアンプロファイルからエアリーディスクプロファイルに移行します。大きいTの極限では、このことがKの値に反映され、では一定値1.6449に漸近します。スポットサイズに対応し、良く知られている最初の強度極小値に対応する2.44λNではありません。[3]Tの中間の値は多くの用途で当てはまる値ですが、そこでのKの正確な理論値は得られません。その代わりとして、数値計算結果に対して2つの項で多項式フィッティングした式(上図の赤い線)があります。各項の係数は下の表に示します。(この多項式フィッティングでは1/Tを独立変数として使用しました)。Kの推定に使用できます。上の結果は、Tの中間領域でTを増加させると、より小さなスポットサイズが得られることを示しています。すると入射開口を通過する光パワーを減少させることになり、それではスポットサイズを小さくする価値が無いかもしれません。直径Dの入射瞳を通過するパワーをTの関数として表したグラフが図3です。1、すなわちガウシアンビームのスポットサイズと入射瞳径が同じであるときに、透過するパワーは入射パワーの86%です。9%小さくなりますが、透過するパワーは86%から40%に減少します。スポットサイズとパワー透過率の最適なバランスは用途に依存します。1における集光スポットサイズの推定値を提示しています。1.83λ/(2*NA)で与えられます(ここで、NおよびNAは、それぞれ対物レンズのf値および開口数です)。(2002)走査レンズは共焦点レーザ走査型顕微鏡、光コヒーレンストモグラフィ(OCT)、多光子イメージングシステムほか様々なレーザーイメージングシステムに使用されています。これらの用途では、レンズの後方開口部(入射瞳)から入射したレーザ光が角度走査されます。これにより、レンズの視野内の結像面に形成されたスポットが移動します。テレセントリックレンズ以外のレンズを使用して像面の焦点を走査すると、顕著な収差が引き起こされ、生成画像の画質は著しく損なわれます。テレセントリック走査レンズは、各走査位置において均一なスポットサイズを生成するので、高画質な試料像が得られます。一般的に、レーザ走査顕微鏡システムは走査レンズとチューブレンズを対で使用し、無限遠補正の光学システムを構築します。多くのOCTシステムは、チューブレンズ無しで走査レンズを使用する設計です。CLS-SL、SL50-CLS2、SL50-2P2そしてSL50-3Pは、当社の共焦点レーザ型走査顕微鏡ならびに多光子顕微鏡システム向け、そしてLSMシリーズのレンズはOCTイメージングシステム向けに最適化されています。走査システムにおけるチューブレンズの有無については後述しています。mmのテレセントリックチューブレンズを使用した場合のレンズ間の距離を示しています。一般的なレーザ走査顕微鏡に組み込んだ走査レンズ右の図ではレーザ走査顕微鏡における走査レンズとチューブレンズ間の適切な距離を示しています。図の左側の走査面に位置する走査ミラーは、レーザービームを走査レンズに誘導します。走査レンズへの入射角度により、走査レンズとチューブレンズITL200の間に位置する中間の像面の焦点位置が決まります。チューブレンズは光を収集し、コリメートする位置にあります(無限焦点)。コリメート光は対物レンズを通り、試料面で焦点を結びます。試料面で散乱または放射された光は対物レンズにより集光され、ディテクタに誘導されます。左下の画像では走査レンズCLS-SLをチューブレンズとともに使用しています。画像をクリックするとCLS-SLとチューブレンズITL200を使用した場合の正確なレンズ間の距離がご覧いただけます。この光学システム設計の特長は、走査レンズとチューブレンズを組み合わせることによってコリメート光が生成されることです。チューブレンズの光が無限遠で集光されるため、チューブレンズに対する対物レンズの位置を移動させても、試料面での画質には影響がありません。これにより光学システムを高い柔軟性で設計することが可能となります。チューブレンズを使用しない場合、走査レンズは対物レンズと同様に機能し、中間の像面は試料面となります。画質を維持したまま走査レンズに対して像面の位置を大きく動かすことは非常に困難です。右下では、走査距離とチューブレンズと対物レンズの間の距離の関係性について図で示しています。実際のシステムはこの完全なアライメントから若干逸脱しています。多くの市販の顕微鏡では、チューブレンズと対物レンズの間の距離(d2)は、焦点距離(f2)と等しくはありません。よって距離の調整が必要になる場合があります。右下の図では走査距離とチューブレンズと対物レンズの間の距離がそれぞれδ1ならびにδ2と少しずつ移動していることを示しています。-δd2*(f1/f2)2です。走査角度を考慮して使用すると画質が最大限に向上できます)。一般的に入射ビーム径が大きくなると焦点サイズは小さくなります。ビネット効果や収差の増大によりビーム径が大きくなるにつれ、走査角度の範囲は狭くなります。ビーム径が入射瞳寸法より小さい場合スポットサイズは仕様値よりも大きくなり、逆に径が寸法より大きい場合はビームが蹴られてしまいます。ガルバノミラーが1つしかないイメージングシステムでは、走査レンズの入射瞳の中心は、ガルバノミラーの回転軸と一致していなければなりません。ガルバノミラーを1つだけ使用する場合、走査距離はレンズの取付け面からミラーの回転軸までの測定距離となります。これは左下の図で示されています。イメージジングシステム内にガルバノミラーが2つある場合は(1個はX方向の走査用、もう1個がY方向走査用)、右下の図のように入射瞳が2つのガルバノミラーの間に位置する必要があります。この場合、走査距離は、レンズの取付け面からレンズ(d1)に近い方のミラーの回転軸に、このミラーの回転軸から入射瞳までの距離(d2)を加えた値になります。ここで重要なのは2個のガルバノミラーの間の距離が最小であることです。入射瞳とビームステアリングのピボットポイントが一致していない場合、イメージ品質は劣化します。この現象の主な原因は、試料上をスキャンするビーム光の光路長のバラツキです。下図はイメージングシステムにおいて、ガルバノミラーが1個の場合と2個の場合を示しています。ガルバノミラーを1つだけ使用した場合、入射瞳はミラーの回転軸の位置にきます。ガルバノミラーを2つ使用した場合、入射瞳はミラーとミラーの間に位置します。