Medicine概要このプロトコルは、エアスプレーノズルのサイズ、シース液の圧力、サンプルフロー圧力、電圧、ゲイン、およびトリガーしきい値パラメータを最適化することにより、小さな細胞外小胞の迅速かつサイズ固有の分離方法を提供します。Abstract小さな細胞外小胞(sEV)は、すべての細胞タイプから放出され、タンパク質、DNA、およびRNAを運びます。シグナル伝達分子は、細胞の生理学的および病理学的状態の指標として役立つ。sEVの分離には標準的な方法がないため、下流のバイオマーカーの同定や薬物介入研究ができません。sEVの分離と精製のための詳細なプロトコルを提供します。このために、50μmのノズルと80psiのシース液圧を選択して、良好な選別速度と安定したサイドストリームを得ました。(FSC)トリガスレッショルドをさらに最適化することで、sEV信号をバックグラウンドノイズから分離することができます。これらの最適化は、FSC対側方散乱(SSC)のみを使用してsEVの代表的な母集団を取得できるようにする重要なソート設定のパネルを提供します。フローサイトメトリーベースの単離法は、ハイスループット分析を可能にするだけでなく、バイオマーカー発現に基づくsEVの同期分類またはプロテオーム解析を可能にし、多くのダウンストリーム研究アプリケーションを開きます。Introduction細胞はさまざまなサイズの細胞外小胞(EV)を放出し、細胞間コミュニケーションに重要なシグナル伝達分子と膜封入体をもたらします1。異なるサイズのEVも異なる生物学的役割を果たし、50〜200nmのsEVはRNA、DNA、およびタンパク質を正しい細胞外位置に正確に分配することができます。正常な生理学的プロセスの調節だけでなく、腫瘍の進行や転移などのいくつかの疾患の根底にある病状を含む、それらの分泌メカニズムを決定するのに役立ちます2,3。sEVの効果的な分離と分析は、バイオマーカーを特定し、将来の薬物介入を設計するために重要です。sEVの臨床応用に関する継続的な研究により、sEVの分離方法はより高い要件を提唱しています。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、ポリマー沈殿、および免疫親和性捕捉が最も一般的なsEV分離方法です6。nmの広いサイズ分布で低純度になり、長期遠心分離後のsEVに重大な機械的損傷が生じます7,8,9。通常ポリエチレングリコール(PEG)を使用するポリマー沈殿は、細胞外タンパク質凝集体の沈殿とポリマー汚染を伴うその後の機能分析では許容できない純度に悩まされています10,11。免疫親和性捕捉ベースの方法は、様々な特異性を有する高コストの抗体を必要とし、また、処理量および収率が低いという問題を有する12,13,14。粒子径は、単離されたsEVの純度を評価するための主要な指標の1つです。sEVの純度は達成不可能な目標のままですが、SECはかなりの量の媒体成分を除去し、SEC法によって抽出されたsEV粒子は主に50〜200nmの範囲にあります15。既存の技術には、時間がかかる、純度が低い、収率が低い、再現性が低い、サンプルのスループットが低い、sEVの潜在的な損傷など、いくつかの欠点があり、臨床利用と両立しません16。したがって、多様な生体液に適用可能な迅速で安価でサイズ指定のsEV分離方法は、いくつかの研究および臨床状況で不可欠なニーズです。フローサイトメトリーでは、単一粒子がハイスループット、マルチパラメトリック方式で分析され、サブセットが選別されます17。EVの不均一性のために、単一粒子フローサイトメトリー測定が理想的であり、これは細胞分析のパラダイムに従ってEVを調査するために使用されており、光散乱および蛍光標識を使用して生理学関連の特徴およびタンパク質成分を特定するために使用されている18,19,20。それにもかかわらず、従来のフローサイトメトリーは、sEVのサイズが小さく、表面バイオマーカーの存在量が少ないという課題があります。フローサイトメトリーの感度は、前方散乱(FSC)、側方散乱(SSC)、または蛍光閾値トリガーパラメータ19の使用に関係なく、バックグラウンドノイズとsEVを区別するように検出パラメータを最適化することで改善できます。本プロトコルでは、蛍光ビーズを標準として高分解能フローサイトメトリーのソート設定を最適化しました。適切なノズルサイズ、シース液圧力、しきい値トリガーパラメータ、および散乱光強度を制御する電圧を選択することにより、複雑な混合物からsEVの特定のサブセットを分離することができました。10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)の培養培地を調製する。細胞/mLの密度で培養します。培養物を5%CO2と共に37°Cでインキュベートする。顕微鏡観察下で細胞密度が75%〜80%に達したときに細胞を継代培養する。この方法では、標準サイズのポリスチレンミクロスフェアを粒度分布の参照標準として使用しました。特定の機器パラメータ条件下では、対数形式を使用して、粒子信号はFSC対SSCプロットのバックグラウンドノイズと明確に区別できました。R4、R5、およ...Discussionこのプロトコルは、NTAによって検証されたフローセルソーターを使用して、指定された粒子サイズ50〜200nmのsEVを分離および精製するための最適化された方法を概説しています。この方法は、大型EV22に包まれた無関係な生体分子からの干渉を回避し、均一な粒径と高純度のsEVを得るというボトルネックの問題を解決した。プロジェクト(SJS201712、SYB202130)の支援を受けました。reserved×-1::1。