パルボウイルス科ディペンドウイルス属に属する非エンベロープウイルスです。AAVはヒトへの病原性が知られておらず、カプシド構造タンパク質により、種々の組織/細胞への感染指向性が異なることが知られています。AAVベクターは、AAVの特徴を活かしたウイルスベクターです。vivoにおいても分裂/非分裂細胞へ遺伝子導入が可能です。導入された遺伝子は感染細胞のゲノムに組込まれる可能性は極めて低く、非分裂細胞においては長期間の遺伝子発現が可能です。血清型(セロタイプ)について知りたい。AAVの血清型(セロタイプ)は、カプシド構造タンパク質の種類によって分類されています。その違いにより、種々の組織/細胞への感染指向性が異なることが知られています。アデノ随伴ウイルスベクター調製システムを発売しています。血清型2(AAV2)は古くから広く研究されてきた血清型の1つであり、宿主域が大変広いことが知られています。血液型1(AAV1)、血清型5(AAV5)、血清型6(AAV6)、血清型8(AAV8)は、より高い組織指向性を持った血清型です。遺伝子導入効率が高いと言われています。詳細な情報は、こちらをご参照ください。AAVベクターを使用する際の遺伝子組換え生物の拡散防止措置レベルが知りたい。レベルの施設で取り扱いが可能です。挿入断片によっては拡散防止措置を上げる必要があります。実験安全委員会の指示に従い、安全には十分ご注意ください。AAVベクターを使用した遺伝子導入を実施している例(文献)が知りたい。参考文献」にまとめていますのでご参照ください。Systemについて知りたい。Systemではヘルパーウイルスを使用せずに、目的遺伝子を含むAAVベクターゲノムがパッケージングされたアデノ随伴ウイルスベクター(AAVベクター)を調製できます。kb程度のフラグメントが挿入可能です。kb程度までのフラグメントが挿入可能です。それ以上の長さのフラグメントを挿入されますと、ウイルスベクターの力価の低下や中空粒子の増加、またはウイルスベクター自体が産生されない原因となります。Systemを用いる場合は、HEK293細胞、HEK293T細胞をご使用ください。HEK293もしくはHEK293T細胞にはいくつかの系統が知られています。11268)の使用でAAVベクター産生が安定して行えることを確認していますので、これらの細胞の使用をお勧めします。弊社の検討において、一般的に使用されている細胞株ではAAVベクターの産生量が少ない場合が多いことを確認しています。培養細胞に感染させたが感染が確認できない。高タイターのAAVベクターが得られていない可能性が考えられます。高タイターのAAVベクターが得られない原因としては下記が考えられます。HEK293やHEK293T細胞にはいくつかの系統が知られています。弊社の検討では、一般的に使用されている細胞株ではAAVベクターの産生量が非常に少ない場合が多いことを確認しています。11268)を使用することでAAVベクター産生が安定して行えることを確認しており、AAVベクター産生にはこれらの細胞の使用をお勧めします。トランスフェクション効率が低い可能性が考えられます。高タイターのAAVベクターを取得するために、高いトランスフェクション効率が不可欠となります。ユーザーマニュアル記載のトランスフェクション法でお試しください。LacZ、ZsGreen1を発現するAAVベクタープラスミドをそれぞれ販売しております。一般的に動物実験に必要なAAVベクター量が知りたい。/マウス程度のAAVベクター量となります。ここで挙げた投与量は、あくまで参考値です。文献等でご確認いただき、投与量を決定してください。VectorにはAAV2ベクター産生能を指標にスクリーニングしてきたmiRNAの一種であるhas-miR342が含まれます。Vector使用時と比較して約2倍のタイター向上効果が確認されております。293T細胞へのトランスフェクションの段階からスケールアップをしていただければ対応可能です。Plasmidシリーズの使用をお勧めします。原理的には、全てのセロタイプに適用可能です。Finch脳への遺伝子導入、AAVベクターを用いたマウス大脳皮質(視覚野)への遺伝子導入)をご参照ください。Serotypes)はT225フラスコ1枚までの細胞からAAV粒子の精製が可能です。1キットは精製4回分の容量です。各工程にいくつかのポイントがございます。詳細については、取扱説明書のVI.実験操作に記載の注意書きをご参照ください。本キットは、セロタイプ2専用です。6675)をご使用ください。超遠心法は一般的な精製方法ですが、熟練した技術が必要であり、精製工程に2~3日間以上を要します。(AAV2)の使用により、約4時間でAAV2粒子産生細胞からAAV2粒子を精製することができるため、どなたでも短時間で簡便にご利用いただけます。本キットを使用した場合の収量についてはこちらをご参照ください。1本につきT225フラスコ10枚までの細胞からAAV2粒子の精製が可能です。(T225フラスコ5枚分の精製を推奨します。明確な基準はありませんが、SDS-PAGEに供した際にAAVベクター由来の3本のバンド(VP1、VP2、VP3)が主要バンドとして確認できるまで精製を行えば、動物への投与は可能であると思われます。(AAV2)を用いて精製されたAAV2粒子は動物への投与が可能です。実際に精製したAAV2-ZsGreenをマウス脳線条体へ投与し、遺伝子導入できていることを確認しています。カラムの樹脂部分に空気が含まれる場合、流速が遅くなることがあります。使用前にご確認いただき、空気が含まれている場合はピペッティングで空気除去後、樹脂を沈めてご使用ください。不純物の多いサンプルを添加した場合にも流速が遅くなる場合があります。μmのフィルターでろ過することで解決することがあります。本キットはAAV2のITR領域にプライマーを設計していますので、AAV2のITRを使用したAAVベクターであれば、セロタイプを問わずに測定することが可能です。従来、AAVベクターゲノムを定量する際には挿入配列上に増幅領域を設定していました。そのため、AAVベクターごとにプライマーを設計する必要がありました。Ver.2は、AAV2由来のITRをターゲットとしてベクターゲノムを定量するキットであり、ウイルス粒子内に封入されているベクターゲノムのITR領域がAAV2由来であれば、血清型に関わらず本製品を使用することができます。以下の例を参照してください。copies/mlになります。セロタイプを問わずに使用可能です。セロタイプによっては凍結融解法と比較して抽出効率が低くなる場合があります。Solutionを用いて抽出した方が明らかに少ないことを確認しています。Bを添加した際にピンク色に変色することがありますが、性能には問題ありません。ウイルスの血清型により比率は異なります。血清型1(AAV1)や血清型6(AAV6)は、培養細胞よりも培養上清に多く存在していたという結果データがあります(参考文献1)。以下の文献をご覧いただき、参考にしてください。(AAV2)がございます。こちらの参考文献をご覧いただき、参考にしてください。ウイルス発現用ベクタープラスミドの構築から組換えAAVウイルスの作製までを承っております。オプションサービスとして力価測定やAAVベクターの精製も承ります。詳しくはこちらのウェブサイトをご覧ください。製品ラインナップのある、血清型1、2、5、6、8は製造可能です。血清型9等の場合、お客様自身でプラスミドを手配していただくことで対応可能です。AAVベクター作製量は目的遺伝子と血清型の組み合わせにより変動するため、収量保証はいたしかねます。タイターも事前予想が難しい面もございますが、精製作業終了後のAAVベクタータイターを確認いただき、オプションとして希釈あるいは濃縮を実施可能です。可能ですがオプションになります。vector)の作製からもオプションとして承っております。HEK293T、HEK293を用意しています。目的によってはマスターセルバンク(MCB)のご利用も可能です。別途お客様自身で手配していただくことで対応可能な細胞もございます(製造検討から実施します)。6233)を使用して算出しています。ウイルス粒子からウイルスゲノムを粗抽出し、ITR領域を対象としたqPCRによって、ウイルスゲノムのタイターを定量化しています。オプションとして、他のタイター測定方法(TCID50など)もご提供しています。お見積りの際にお問い合わせください。オプション例となりますので、その他に希望の項目があれば別途お問い合わせください。