問い合わせ大学で学習する生化学や分子生物学などの生命科学の基礎を自宅で学べるまとめサイトです。Transcription-PCR)とは、RNAを鋳型としてDNAを合成(これを逆転写といいます)した後に、特定のプライマーを用いたPCR法によりDNAを増幅させる操作のことをいいます。このRT-PCRはRNAを検出するために広く用いられている手法になります。DNA;相補的DNA)と呼ばれています。ちなみに、このmRNAと相補的な配列をもつcDNAは、遺伝子をコードするDNA領域が選択的スプライシングを受けることで、イントロンが除かれエキソンのみとなったものです。通常のPCRでは、鋳型となるDNA配列上の特定の領域(目的のDNA領域)を増幅させることはできますが、RNAを直接増幅させることはできません。これは、PCPの原理として、DNAを「耐熱性DNAポリメラーゼ」を用いて増幅させているからです。そのため、RNAを増幅させるためには、一旦cDNAの形に変換してからPCR(これをRT-PCRといいます)を行う必要があります。このようにRT-PCRでは、mRNAをcDNAに変換させた後にPCRを行う方法になりますが、RT-PCRを行うことによって、少量しか存在しないようなmRNAを増幅して解析することが可能です。リアルタイムqRT-PCR法を用いることによって、定量的に遺伝子発現の解析を行うことができます。最近では、新型コロナウイルス感染の検査として「PCR検査」がよく使用されていますが、この時にはリアルタイムqRT-PCR法が使用されているかと思います。COVID-19(SARS-CoV-2)は一本鎖RNAウイルスですので、ウイルスがもつRNAをcDNA(RNAから人工的に作成した相補的なDNAのこと)へと逆転写反応によって変換し、その後PCRで微量のDNAを感知できる量まで増幅させます。このときリアルタイムPCRでは、増幅されたDNAの二本鎖には「蛍光色素」をインターカレートさせたりすることができますので、この蛍光を検出することによってウイルスの有無を検査することができます。timeの略ではないので注意しましょう。qRT-PCRのqは「定量的な」という意味です。2.RT-PCRの原理RT-PCRでmRNAをcDNAに変換するためには、まずRNAのみを細胞から抽出する必要があります。RNAからmRNAのみを選択的に逆転写しcDNAとします。このときに、mRNAのみと選択的にアニールするプライマーとしてオリゴdTプライマー(Tが重合したプライマー)が使用されます。その後、目的配列を挟むように設計した一対のプライマーを用いたPCRにより、目的のcDNA配列を増幅させ、電気泳動によって検出することもあります。ガン細胞と正常細胞で特定の遺伝子の遺伝子発現がどのくらい変化しているかを定量的に調べたい場合には、リアルタイムPCRを用いたリアルタイムqRT-PCR法を用いることで解析ができます。※真核生物のmRNAはその3'末端には、ポリA鎖(Aが20~200個重合した構造)が付加されていることから、これとハイブリダイズするオリゴdTプライマーを利用して、totalRNAからmRNAのみを逆転写することができます。※逆転写の過程でオリゴdTプライマーの他に、ランダムプライマーや遺伝子特異的プライマーが用いられることもあります。RT-PCRによるRNAの検出についてはこれで以上です。次は「3)リアルタイムPCRによる定量PCR」について学んでいきましょう。リアルタイムPCRとは、PCRによる増幅産物をリアルタイムでモニタリングすることで、増幅率に基づいて初期のDNAの定量ができる定量PCRのことです。前項では「大腸菌の形質転換について」を学びました。本項では大腸菌を形質転換した後に行われる「プラスミドDNAの抽出」について学んでいきましょう。...生化学(実験手法)1)PCRの原理と概要PCR法は、これまで多大な時間と労力を要した遺伝子クローニングにとって代わる手法となり、RT-PCRやリアルタイムPCR、DNAシークエンシングなどのさまざまな手法として応用されています。...生化学(実験手法)2)マキサム・ギルバート法(従来法)古くから知られているDNAシークエンスには、大きく分けて「マキサム・ギルバート法」と「ジデオキシ法(サンガー法)」の2種類があります。今回は「マキサム・ギルバート法」について解説していきます。...生化学(実験手法)1)ジデオキシ法による塩基配列解析の原理と概要PCRなどによって増幅したDNAは、「DNAシークエンス」と呼ばれる手法により、その塩基配列(A,T,G,Cの並び)を調べることができます。Prism【研究者がもっていると便利なソフト1】2023/1/22プロフィール管理人:AZARASHI「大学で学ぶような生命科学関連の情報を分かりやすくまとめたサイトがあればなぁ...」「専門用語の意味がよく分からない...」といった悩みを解決することを目指して更新中。『わかりやすい』まとめサイト~大学で学習する生化学や分子生物学などの生命科学の基礎を自宅で学べるまとめサイトです。『わかりやすい』まとめサイト~。