第6回の講義では、呼吸と光合成の代謝て気相と作用と、研究室内の変異による順化応答変異株の研究例について解説しました。以下に寄せられたレポートとそれに対するコメントを載せておきます。Q:維持呼吸速度が温度上昇に伴い上昇しているのに対し、構成呼吸速度は温度に影響されないことが講義中で示されていた。構成呼吸が温度上昇で変化しないのは、植物体生存のために細胞の維持が優先されているためであると考えられる。呼吸速度は維持呼吸と構成呼吸の和で示されていたが、シアン耐性回路による影響はどちらに含まれているのか疑問に思った。シアン耐性回路がATPを産生しない呼吸経路であり、ATPの余剰が軽減できる点をふまえると、温度上昇によって代謝が活発になるとシアン耐性回路の呼吸割合が大きくなると考えられる。温度上昇で呼吸速度が変わらない構成呼吸に対し、維持呼吸速度は温度と共に呼吸速度の上昇がみられるため、維持呼吸速度の上昇はシアン耐性回路の割合増加による影響を受けているのではないかと考えた。シアン耐性回路を阻害した状態で同様に維持呼吸速度を計測できれば、温度が上昇しても維持呼吸速度の変動が少ない図が得られるのではないか。A:言おうとしていることはわかりますが、内容がやや行ったり来たりしているので、日本語をもう少し整理するとぐっと読みやすくなると思います。Q:講義内では適者生存について同じ光条件下でグルコースの添加の有無で、シアノバクテリアがWS型かWL型になるかを調べることで再現している研究が紹介された。この点について、グルコース付加の条件を継代ごとに変えることで細胞はどちらの型による場合が多いのかを疑問を持った。実験ではグルコースを付加して培養を続けることでWS型が、付加しないとWLが大きな割合を占めるように適者生存が再現された。これはシアノバクテリアがその環境に適応する過程を代を重ねるなかで観察している。これを適者生存によって型がどちらか一方に寄らない段階でグルコースの条件を変えることで、シアノバクテリアにおける適応が同じ条件下で代を重ねることで起こる現象であることを確認する。この実験でシアノバクテリアにおいてWL型とWS型の適者生存が起こる際のグルコース濃度について、濃度をいくつかに分けて実験することで、適応が起こる条件が淘汰される型では生存が難しいような厳しい条件によって引き起こされることを示す実験を考え、こうした小進化が通常では起こらず、従来の細胞では生存に困難が生じる場合のみ発生することを実験的に確かめる。A:これも最初の問題設定であるはずの「グルコース付加の条件を継代ごとに変えることで細胞はどちらの型による場合が多いのかを疑問を持った。」の部分の日本語がありまりよくないので、わかりにくいですね。一度書いた後に、日本語をちょっと読み直すだけでも、格段に人に読みやすい文章にできるはずです。最後の方の「小進化が通常では起こらず」の「通常」というのはあいまいな単語なので、きちんと定義する必要があると思います。6803のΔpmgA株が光混合栄養条件下で死滅する理由が気になったため、考察する。ΔpmgA株の性質を調べてみると、他に、強光下での培養で生育阻害を受ける、野生株と比べて強光下での光化学系IIの量子収率が高い(強光であまり低下しない)、野生株と比べて強光下で光化学系Iの量が多い(強光であまり減少しない)という性質があった。強光下では、野生株は光合成活性を低下させる応答を行うことで阻害が防がれるとする考えがあった。以上のことから、ΔpmgA株の阻害は、光化学系IIでの電子伝達の抑制を起こせないことに起因するものであると予想する。光合成生物において致死的な影響を与えるものとして、活性酸素は主要なものの一つである。光合成の電子伝達系では、主に光化学系Iで酸素が電子を受け取ることによって活性酸素が生成される。よって、電子伝達系の電子伝達体が還元されている割合が高いことが、活性酸素の生成頻度を高めることが予想される。電子伝達系がより還元されるのは、光化学系IIからプラストキノンへの電子伝達速度が高い場合が挙げられる。よって、光化学系IIでの電子伝達速度が高まる強光下では、活性酸素発生のリスクが高くなるため、光化学系IIの量子収率を低下させる仕組みが働くことでそのリスクが低減されるのだと考えられる。電子伝達系を還元する要素として、シアノバクテリアの場合は呼吸鎖からのプラストキノンへの電子流入が挙げられる。そこで、光混合栄養条件の場合を考えると、こちらの条件では呼吸基質となるグルコースが供給されるため、呼吸の速度が高くなり、プラストキノンプールが還元されると考えられる。このとき、野生株では光化学系IIの電子伝達を抑制することによってプラストキノンプールの過還元を軽減し、Δpmg株ではこの軽減の仕組みが働かないのだろうと考えられる。このように、ΔpmgA株では強光と光混合栄養条件の両方で、活性酸素の発生を抑制できないことによる阻害を受けるものと考えられる。それから、ΔpmgA株では強光条件下で光化学系I量があまり減少しないことに関しては、変異株においては強光下で系II抑制による電子伝達系の過還元の抑制ができないため、それを補うように光化学系Iの量を増加させることで電子伝達系を酸化させている、という説明が一応成り立つものと考える。https://www.nodai.ac.jp/teacher/symposium/pdf/2009/2009sonoike.pdfA:これは、還元力過剰仮説ですね。阻害が軽減するはずなのですが、実際に実験してみると、むしろ阻害が増大していました。すると、どのような仮説が考えられるでしょうか?Q:昨年東京大学の発表した論文において、老化細胞の純培養法を確立し、その老化細胞のコロニーに対してレンチウイルスshRNAライブラリーを添加することで老化因子としてGLS1が発見された1)。この研究では老化細胞のコロニーにshRNAライブラリーを添加した際に形成したコロニーに対して遺伝子群の探索を行い、GLS1阻害が老化細胞を選択的に除去することが分かった。一方でこの実験系はネガティブスクリーニングであり、この研究チームは成功していたがかなり困難な実験であると考えられる。ポジティブスクリーニングかつガン抑制に関わるタンパク質の効率的な探索は他にないだろうか?個人的に考えた実験系としては、ガン細胞を静止期に誘導できるタンパク質をスクリーニングする実験系ではあるが、既知の静止期関連タンパク質を安定発現できる細胞株をまばらに播種し、shRNAライブラリーを添加することで静止期から脱して形成したコロニーに対して遺伝子群の探索を行えばポジティブスクリーニングとして成り立つと考える。一方でこの実験系は静止期に安定的に誘導できる細胞株をどのように培養し、アイソレーションも可能なのかという疑問は残る。Doxycycline誘導型プラスミドを用いれば細胞株の培養は可能だろうが、やはりアイソレーションまでは厳しいと考えられる。改善させることを証明、https://www.ims.u-tokyo.ac.jp/imsut/jp/about/press/page_00065.htmlA:これは、講義のどの話にかかわるレポートなのでしょうか?話題自体は、老化細胞のスクリーニングでもよいのですが、講義で紹介したスクリーニングと対比させて議論するなど、講義に対するレポートというスタンスは保ってください。Q:シアノバクテリアは自身のゲノムを複数持っているため、EMSなどで人為的に変異を入れようとしても全てのゲノムに変異が入らないことがある。致死な変異が全てのゲノムに入らないのは理解できるが、ナンセンスな変異が全てのゲノムに入るのは何故だろうか。8つのマルチコピーがあるとしたら、最初に変異が入ったゲノムDNAが多数派になっていく確率はかなり低いのではないか。考えられる可能性としては、1つは相同組み換えの際、変異が入ったDNAを鋳型としやすくする機構が存在する可能性、もう1つは、入ったナンセンス変異は全て相同組み換えの際に鋳型とされやすい配列であった可能性である。変異に関してそのDNA配列の柔軟性や結合力について調べてみたい。A:これは、シアノバクテリアでの遺伝子破壊の手法の話でしょうか。あるとすれば、相同組換えを行なう際に、抗生物質耐性カセットを導入することと、そのカセットの数と耐性の間に正の相関があることが鍵になります。Q:今回の講義を視聴して、実験室内進化を利用すれば任意の周期の体内時計を備えたシアノバクテリアの株を得ることができるのではないかと考えた。