(HUB)概要ここでは、腸管バリア機能、透過性、および輸送を研究するためのヒトオルガノイド由来腸上皮単層の調製について述べる。オルガノイドは外部刺激に対する元の上皮組織応答を表すので、これらのモデルは細胞株の拡張性の利点と初代組織の関連性と複雑さを兼ね備えています。Abstract過去には、腸上皮モデル系は形質転換細胞株および初代組織に限定されていた。これらのモデル系は、前者が元の組織生理学を忠実に表していないため、固有の限界があり、後者の利用可能性は限られている。したがって、それらの適用は基礎的および医薬品開発研究を妨げる。成体幹細胞ベースのオルガノイド(以下、オルガノイドと呼ぶ)は、それらが由来する正常または罹患した上皮組織のミニチュアである。それらは、異なる胃腸(GI)管領域から非常に効率的に確立することができ、長期的な拡張性を有し、インビトロでの治療に対する組織および患者特異的応答をシミュレートすることができる。ここでは、腸管オルガノイド由来上皮単層の確立が、上皮バリアの完全性、透過性および輸送、抗菌タンパク質分泌、ならびに組織学を測定する方法とともに実証されている。腸管オルガノイド由来単層は、増殖する幹およびトランジット増幅細胞、ならびに重要な分化上皮細胞で富化することができる。したがって、それらは、標的細胞およびそれらの作用機序に対する化合物の効果を研究するために調整することができるモデル系を表す。オルガノイド培養は、いったん確立されると、細胞株よりも技術的に要求が厳しいですが、生体内上皮の複雑さと患者間の不均一性を真に表すため、医薬品開発の後期段階での失敗を減らすことができます。Introduction腸上皮は、腸の管腔内容物と下層組織との間の物理的障壁として作用する。この障壁は、タイトジャンクションによって接続された主に吸収性腸細胞の単一の上皮層を含み、隣接する細胞間の強力な細胞間接続を確立する。これらの細胞は、腸の頂端(管腔)側と側底側を分離する分極上皮ライニングを形成し、同時に消化された栄養素および代謝産物の傍細胞輸送を調節する。腸細胞に加えて、ゴブレット、パネス、および腸内分泌細胞などの他の重要な上皮細胞も、それぞれ粘液、抗菌ペプチド、およびホルモンを産生することによって腸の恒常性に寄与する。腸上皮は、ロイシンに富む反復含有Gタンパク質共役型受容体5陽性(LGR5+)幹細胞を腸陰窩の底部で分裂させることによって絶えず補充され、上方に移動して他の細胞型に分化するトランジット増幅(TA)細胞を産生する1。曝露などの遺伝的および環境的要因による腸上皮恒常性の破壊は、腸のバリア機能の破壊につながる。これらの状態は、炎症性腸疾患(IBD)、セリアック病、および薬物誘発性GI毒性を含むいくつかの腸疾患を引き起こす2。vitroプラットフォームシステムを使用して行われます。これらのプラットフォームは、形質転換細胞株または一次組織をモデルとして使用して、膜の頂端側および側底側の両方にアクセスする分極上皮単層を確立するのに適している。vivo上皮を代表するものではない3.さらに、細胞株は単一のドナーに由来するため、患者間の不均一性を表すものではなく、複雑さと生理学的関連性の低下に苦しんでいます。vivo状況をより代表的ですが、それらの限られた可用性、短期的な生存率、および拡張性の欠如により、ハイスループット(HT)研究の媒体としては不適切です。異なる器官から確立されたインビトロ上皮培養物である。それらは、長期的で安定した拡張性ならびに遺伝的および表現型の安定性を有することが証明されており、したがって、外部刺激に対する忠実な応答を有する元の器官の上皮の代表的な生物学的ミニチュアである4,5,6,7,8,9。癌組織のいずれかから効率的に確立され、不均一な患者特異的応答を表す10、11、12、13、14、15、16。本稿では、オルガノイド培養物由来の腸上皮単層を確立する方法を実証する。単層は、小腸ならびに結腸および直腸オルガノイド培養物から首尾よく確立されている。このモデルは、上皮細胞の薬物への輸送と透過性、ならびに上皮に対するそれらの毒物学的効果を研究する機会を作り出す。このモデルにより、免疫細胞および細菌との共培養が腸上皮との相互作用を研究することができる17、18、19。このモデルは、患者固有の方法で治療に対する応答を研究し、上皮バリアに焦点を当てた治療の次の波を探すためのスクリーニング努力を開始するために使用することができる。このようなアプローチは、クリニックに拡張され、パーソナライズされた治療への道を開くことができます。このプロトコールにおける上皮単層はヒト正常腸管オルガノイドから調製されるが、このプロトコルは他のオルガノイドモデルに適用され、最適化され得る。腸オルガノイドは、Wnt、Notch、および上皮成長因子(EGF)経路を調節することによって、腸細胞、パネス、ゴブレット、および腸内分泌細胞などの異なる腸上皮脂肪を有するように富化することができる。ここで、膨張培地中で単層が樹立された後、それらは、先に説明したように、より分化した腸上皮細胞に向かって駆動される20、21、22、23、24、25。スクリーニング目的のために、目的の化合物、その標的細胞、および実験条件の作用様式に応じて、単層を選択した細胞組成物に向かって駆動して、関連する機能的読み出しを有する化合物の効果を測定することができる。バイオセーフティキャビネット内のすべての手順を実行し、細胞培養の操作に関する標準ガイドラインに従ってください。紫外線は、バイオセーフティキャビネットを起動する前に10分間使用されます。使用前および使用後、バイオセーフティキャビネットの表面を70%エタノールに濡らしたティッシュペーパーで洗浄する。Results図1Aは、それらをクライオビアルから解凍した後の腸管オルガノイドの代表的な明視野画像を示す。最適な回収率を確保するためには、オルガノイドを高密度で解凍することが重要です。オルガノイドは、約10μLのECMドーム内の24ウェルまたは6ウェルプレートに播種される(図1B)。ほとんどの正常な腸オルガノイドは嚢胞性形態を有する。解凍プロ?...Discussionこのプロトコールは、腸管オルガノイドの一般的な操作および維持、ならびにこれらのオルガノイドに由来する上皮単層の調製および可能な適用を記載する。正常および以前におよび活発に炎症を起こした腸組織に由来する結腸オルガノイドの異なる領域から首尾よく調製されてきた(未発表データ)。Technology(HUB)への毒物学モデリングのための新しいツールとして、HUBは疾患モデリングおよび毒物学部門に内部資金を供給しています。Bijvelds(消化器科および肝臓科、エラスムスMC、ロッテルダム)の研究室が、膜挿入物に単層を設置するための初期技術サポートを提供してくれたことに感謝します。reserved×-1::1。