screening(クリスパー・スクリーニング)にも利用されています。library(クリスパー・ライブラリー)といいます。libraryには多くの種類があり、どのライブラリーが自分の研究に適しているのか、悩むことも少なくありません。libraryの特徴や選定基準などについて紹介します。libraryと一口に言っても、ターゲット遺伝子やCRISPRの種類、製品フォーマットにより、数多くの製品が存在します。libraryをカテゴリ別に分けたものです。ご覧の通り、多くの製品を取りそろえています。活性化(発現亢進)全ゲノムを対象にしたライブラリーだけでなく、がん・アポトーシス関連遺伝子やキナーゼファミリー関連遺伝子に特化したライブラリーなどもあります。全ゲノムを対象にしたいのか、特定の遺伝子群を調べたいのか、ターゲットの範囲を明確にしましょう。libraryを用いたScreening原理CRISPR-Cas9は、標的とするDNA配列を特異的に認識してDNAに結合するガイドRNA(gRNA)と、ヌクレアーゼであるCas9から構成されます。CRISPR-Cas9に関連する製品を以下のカタログで紹介しております。libraryであり、目的の表現型に関連する遺伝子を包括的に調べる事ができます。libraryには、大きく分けてプール型とアレイ型の2種類があります。プール型は基本的にレンチウイルス粒子フォーマットになります。1本または複数のチューブに多数のレンチウイルス型gRNAが含まれており、レンチウイルス粒子を細胞に感染させgRNAを導入します。セットアップや実験操作が比較的シンプルでコストを抑えることができますが、次世代シーケンサー(NGS)によるデータ解析が必要です。アレイ型は、マルチウェルプレートのウェルごとに1種類のgRNAが含まれており、標的遺伝子と表現型の相関を解析します。ウイルス感染だけでなく、プラスミドDNAや合成RNAの形態でも導入でき、NGS解析も不要です。その一方で、ロボットや特殊な設備が要求されます。screeningの概要については、以下の記事をご覧ください。screeningとは?基礎やワークフロー、ライブラリー選択方法を解説なお、ライブラリー製品によって、gRNAのみ用意されたタイプと、gRNAとCas9が1つのベクターに含まれるAll-in-oneのタイプがあります。gRNAのみの製品を使う場合には、Cas9を同時に細胞導入またはウイルス感染させるか、事前にCas9を安定的に発現する細胞を作製する必要があります。全ゲノムノックアウトライブラリー選択ガイドヒトを対象にした全ゲノムノックアウトライブラリーの製品ラインナップを表1に示します。プール型全ゲノムノックアウトライブラリーSigma全ゲノムライブラリーは1遺伝子あたりのgRNA数が多いのが特徴です。Instituteと提携したGeCKO全ゲノムライブラリーはCas9がセットになったAll-in-oneタイプも用意しており、miRNAをターゲットとしたgRNAも含まれています。これらよりもgRNAの数を抑えつつ、優れた特異性と正確性をもたせたのがBrunelloノックアウトライブラリーとTorontoノックアウトライブラリーV3です。Doenchらの報告をもとにライブラリーを最適化したもので、オンターゲット活性を最大化してオフターゲット活性を最小化していることが特徴です。screeningの経験的データを用いてライブラリーを最適化したもので、スクリーニングの精度・効率の向上を目指したものです。ノックアウトライブラリーは、Sigma全ゲノムライブラリーやGeCKO全ゲノムライブラリーよりもさらにコストを抑えることができ、BFPによる蛍光セレクションが可能という特長もあります。プール型のGeCKO全ゲノムライブラリーについては、ヒトだけでなくマウスを対象にしたライブラリーもあります。All-in-oneタイプとgRNAのみの2種類があるので、Cas9発現細胞をご自身で用意できるかどうかによって製品を選択してください。アレイ型を求める場合には、Sanger全ゲノムライブラリーがあります。ヒトおよびマウスの遺伝子に対して、それぞれ2種類のgRNAがあります。グリセロールストックフォーマットも用意されており、約400枚の96ウェルプレートから構成されます。BFPによる蛍光セレクションや、グリセロールストックからPlasmidを精製し、TransposaseによるgRNA導入も可能です。テクニカルスタッフに相談する※オンライン技術サポートも実施中CRISPRiとCRISPRaライブラリーCRISPR-Cas9はDNA切断によるノックアウトが主な特徴ですが、Cas9を改変して発現抑制や発現亢進も可能になっています。activation、CRISPR活性化)とよばれます。CRISPRiライブラリーCRISPRiでは、Cas9に点変異を導入しヌクレアーゼ活性を欠失させたdCas9と、転写抑制因子であるKRABドメインを融合させたKRAB-dCas9を使用します(図2)。表2は、Sigma-AldrichのCRISPRiライブラリーです。Dolcettoには遺伝子あたり約6個のgRNAが含まれています。Library並びに各Pool製品には遺伝子あたり約10個のgRNAが含まれています(アルゴリズム上トップ5のgRNAのサブプールと、感度増加のための補足的な5個のgRNAのサブプール、および、ネガティブコントロールとしてのノンターゲットgRNAが含まれています)。Dolcettoライブラリーがあります。がん・アポトーシスプール、遺伝子発現プール(転写因子)や膜タンパク質プールなど、特定のパスウェイや領域に特化したサブプールもあります。ターゲットを絞ることでコストを大きく抑えることができます。CRISPRaライブラリーSigma-AldrichのCRISPRaシステムは、dCas9にウイルス由来の転写活性化因子VP64を融合させたdCas9-VP64と、MS2-p65-HSF1活性化ドメインの2つの活性エフェクターを利用します。RNAアプタマーが含まれており、この2つの活性エフェクターと組み合わせることで遺伝子発現を促進します(図3)。表3は、Sigma-AldrichのCRISPRaライブラリーです。CRISPRiライブラリーdCas9-VP64とMS2-P65-HSF1のレンチウイルス粒子が付属するSAMライブラリーと、これらの活性エフェクターが付属しないCalabreseライブラリーがあります。Calabreseライブラリーは、活性エフェクターをご自身で用意しなければなりませんが、その分コストが抑えられています。libraryを使ったScreeningは規模の大きい実験になりますので、最適なライブラリー製品を選ぶことが重要です。Sigma-Aldrichでは様々なライブラリー製品をご用意に加え、技術担当者による実験目的に合わせた製品提案が可能です。オンライン面談を含めた製品のご案内やご相談を承りますので、是非以下のフォームからお問い合わせください。screeningを実行する際には、念入りな情報収集と準備が必要です。Sigma-Aldrich®では、オンライン面談も含めた製品のご案内やご相談を承っています。screeningの詳細やお見積りをご希望の場合、以下よりお問い合わせください。Library製品ご相談フォームオンライン面談でも製品の説明やご相談を個別に承ります。Emailご相談内容をお選びください。アレイ型ご希望の遺伝子セットを教えてください。その他その他の動物種をご記載ください。ご興味のある製品が決定しておりましたらご記入ください。例)製品番号や製品名など評価方法を可能な範囲で詳しくお聞かせください。現在のご状況を教えてください。その他その他のご状況をご記載ください。ご相談内容の詳細をお書きください。※お電話番号を入力いただいたお客様に、弊社担当者より、お電話にてご連絡させていただく場合がございます。姓:名:姓(ローマ字):名(ローマ字):ご所属名(正式名):※部署名・大学の場合は学部、研究室までご入力ください。KGaA(ドイツ・ダルムシュタット)、およびその関連会社が上記の目的およびMerckのプライバシーポリシーに規定されているとおりに、私の個人情報を収集および使用できることを認め、同意します。Ltd.とその関連会社が、ライフサイエンス製品、サービス、およびその他の紹介および提案に関するマーケティング情報を提供するために、私に連絡できることに同意します(電子メール、電話、テキストを含むが、これらに限定されない)。すべての電子メールに記載されている登録解除リンクをクリックすることで、いつでも同意を取り消すことができます。Chromeを推奨しております。送信エラーが出た場合は、お手数ですが、jpwebmaster@merckgroup.com宛に上記申込み事項を記載の上、メールにてお申込みください。送信ボタンが表示されない場合も、同様にメールにてお送りください。screeningとは?基礎やワークフロー、ライブラリー選択方法を解説CRISPR-Cas9(クリスパー・キャスナイン)はゲノム編集ツールの中でも簡便で安価という特長があり、全ゲノム遺伝子ライブラリーによるスクリーニング(CRIS...CRISPR-Cas9の導入方法(プロトコール)と応用例とは?CRISPR-Cas9は世界中の研究室で使われており、この記事の読者の中には「そろそろ自分の研究でもCRISPR-Cas9を使って実験をしたい」と考えている人が...CRISPR-Cas9とは?原理をわかりやすく解説!ゲノム編集ツールの中でも、世界中の研究室で使われているのがCRISPR-Cas9です。酵素阻害剤は酵素による生化学的な反応を阻害するため、研究や医療な...2018年7月18日CRISPR-Cas9とは?原理をわかり...ゲノム編集ツールの中でも、世界中の研究室で使われているのがCRISPR-Cas9です。下記フォームでは、M-hub(エムハブ)に対してのご意見、今後読んでみたい記事等のご要望を受け付けています。メルクの各種キャンペーン、製品サポート、ご注文等に関するお問い合わせは下記リンク先にてお願いします。アルドリッチジャパン合同会社はメルクのグループ会社です。