アガロースゲル電気泳動で、制限酵素処理が正常に行われたことを確認する。<注意点>制限酵素は温度変化に影響を受けやすいため、一時的な保管は氷上に置くのではなく、マイナス20°Cのクールボックスに入れましょう。制限酵素が入っているチューブを持つときは、チューブの底を持つことは避け、できるだけ素早く取り扱いましょう。前述したように、制限酵素で処理したプラスミドベクターの末端の形状が平滑末端の場合、または結合性のある突出末端の場合には、ベクター同士で結合するセルフライゲーションを予防するためにベクターの脱リン酸化が必要な場合があります。プラスミドベクターの脱リン酸化のプロトコール以下にプラスミドベクターの脱リン酸化のプロトコールを紹介します。CIP)が最も一般的ですが、熱不活性化がやや困難です。処理の時間やバッファーは、酵素によって異なりますので、試薬の説明やラボのマニュアルを参照してください。μLに加えてよく混ぜる。μgになる液量を入れる。分間インキュベートする。μLになる量)入れる。μLの順で入れて、ピペッティングでよく混ぜる。分間インキュベートする。ジチオトレイトール脱リン酸化したプラスミドとDNAフラグメントのライゲーションを行うには、DNAフラグメントに5’リン酸基が必要です。一般的なオリゴ/プライマーやPCR産物は、5’端がリン酸化されていないため、T4ポリヌクレオチドキナーゼによるリン酸基の付加、または制限酵素処理によるリン酸基の露出が必要になりますが、リン酸基の付加よりも制限酵素処理を選択する方が一般的です。平滑末端のプラスミドDNAは脱リン酸化などの処理が必要になります。以下のような場合、挿入するDNAフラグメントを平滑末端にして簡易的にクローニングを行う場合があります。DNAライブラリー作成ダメージを受けてせん断されたDNAをベクターに入れる場合DNAの平滑末端クローニング次に、DNAの平滑末端クローニング(ブラントエンドクローニング)の方法を紹介します。■DNAの平滑末端クローニング(ブラントエンドクローニング)平滑末端クローニングを行うときはベクターと挿入するDNAフラグメントの両方とも平滑末端になっている必要があります。bean(リョクトウ)ヌクレアーゼが使用されます。μMになるようにdNTPを添加する。分間インキュベートする。μMになるようにdNTPを添加する。分間インキュベートする。μg/μLの濃度でDNAを懸濁する。分間インキュベートする。beanヌクレアーゼの熱処理による不活性化は行わない。DNA精製用スピンカラムまたはフェノール/クロロホルム沈殿とエタノール沈殿によって酵素を除去する。DNAポリメラーゼは5’オーバーハングを埋め3’オーバーハングを除去する作用があります。DNAポリメラーゼが推奨されます。beanヌクレアーゼは5’と3’オーバーハングの両方を除去します。以上、クローニングを行うための最初のステップとなるDNAフラグメントとプラスミドベクターの末端処理について、基本的なフローを紹介しました。クローニングを成功させるためには知識と経験が必要ですが、まずは大まかな流れをつかむことから始めてみてはいかがでしょうか。DNAリガーゼを使ってDNA断片同士をつなぐ反応をライゲーションと呼びます。酵素阻害剤は酵素による生化学的な反応を阻害するため、研究や医療な...2018年7月18日CRISPR-Cas9とは?原理をわかり...ゲノム編集ツールの中でも、世界中の研究室で使われているのがCRISPR-Cas9です。下記フォームでは、M-hub(エムハブ)に対してのご意見、今後読んでみたい記事等のご要望を受け付けています。メルクの各種キャンペーン、製品サポート、ご注文等に関するお問い合わせは下記リンク先にてお願いします。アルドリッチジャパン合同会社はメルクのグループ会社です。