トップページ生物学DNA末端の処理方法(クローニングの基礎と実験のコツ)DNA末端の処理方法(クローニングの基礎と実験のコツ)生物学DNA末端処理クローニングコツ2018年3月14日クローニングとその基本的なフローライフサイエンスでは、特定の遺伝子を単離して増やす操作をクローニングと呼びます。この記事では、目的の遺伝子を挿入したベクターを大腸菌に導入するために必要な一連の実験の操作とコツを解説します。クローニングの大まかな流れを見てみましょう。目的のDNAフラグメントとプラスミドベクターをそれぞれ連結しやすい形に処理する。リン酸化DNAフラグメントとプラスミドを連結する。これをライゲーションという。大腸菌などのプラスミドを取りこめる状態の細胞(コンピテントセル)にプラスミドを導入する。これを形質転換という。コンピテントセルのコロニーから目的の遺伝子が取りこまれたセルだけを選ぶ。これをスクリーニングという。この記事では1のDNA末端の処理について説明します。DNAフラグメントの制限酵素処理DNAフラグメントの制限酵素処理は、以下で説明するプラスミドベクターの制限酵素処理と同様に行います。このとき、使用するプラスミドベクターのクローニングサイトに合わせて、切り出しに使用する制限酵素を選びます。プラスミドベクターの制限酵素処理DNAフラグメントとプラスミドベクターのライゲーションを行うためには、環状のプラスミドベクターを制限酵素で処理して線状にする必要があります。このとき、制限酵素で処理したプラスミドベクターの末端の形状が平滑末端の場合、または結合性のある突出末端の場合には、プラスミドベクター同士で結合するセルフライゲーションが起きてしまうため、その予防のためにプラスミドベクターの脱リン酸化が必要です。8.5)またはヌクレアーゼフリーの水の溶液に溶解している場合の例です。※BSAをヌクレアーゼフリーの水に溶解して調製する。※制限酵素は使用するプラスミドと目的に応じて選びます。クローニングの方法によって制限酵素を1種類にすることもあります。mLエッペンドルフチューブにTE(または水)、プラスミドDNA、制限酵素用バッファー、BSAの順で上記の量を入れて混合する。最後に制限酵素を加え、穏やかに混合する。反応液を適切な温度でインキュベートする。このときの温度は、一般的には37°C。例外的にSwaIは25°C。