Reaction:以下RT-PCR)は、DNAを増幅するPCR技術をRNAにまで発展させたものです。transcriptase)」というRNA依存性DNAポリメラーゼを用いて、RNAから相補的DNA(以下cDNA)を合成し、さらに耐熱性DNAポリメラーゼによってcDNAを検出可能なレベルにまで増幅する技術です。この方法により、少量のRNAやわずかなmRNAなどの検出や解析が可能になりました。この記事では、プライマーや酵素の選択基準、テンプレートを準備する際の注意点など、RT-PCRを行うときに気をつけるべき5つのポイントについて解説します。1ステップと2ステップのどちらで行うか?RT-PCR反応は2つのプロセスから成ります。最初のプロセスでRNAの逆転写を行い、次のプロセスでcDNAを増幅します(図1)。2つのプロセスをどのように行うかによって、RT-PCRには2つの方法があります。逆転写に続いて、増幅をそのまま同じチューブで行うのが「1ステップRT-PCR」です。これに対して「2ステップRT-PCR」では、逆転写と増幅を別々のチューブで分けて行います。どちらの方法にも特長があり、実験の性質によってどちらの方法を選ぶか検討する必要があります。p127)1ステップRT-PCRは、チューブを開閉して操作する場面が減るため、短時間で行うことができ、コンタミネーションのリスクも低いといえます。2ステップRT-PCRは逆転写と増幅それぞれを最適な条件で行うことができるため、正確な増幅が効率的に行えます。同一の逆転写サンプルから複数のPCRを行うこともできます。多くの操作が必要となるため、時間がかかる場合があります。最適な逆転写酵素を選択するRT-PCRの成功要因の一つは、最適な逆転写酵素を選ぶことです。市販されているそれぞれの逆転写酵素の特性をよく理解して、目的に合った酵素を使用してください。逆転写酵素を選ぶときに検討すべきポイントは以下の通りです。逆転写可能な配列の長さ酵素によって逆転写できる配列の長さは異なります。kbまでの長い配列を逆転写できるものがあります。酵素によって活性の至適温度は異なるため、反応の温度はあらかじめ検討しておく必要があります。ターゲットのGC含量が特に多い場合や、RNAの二次構造を防いだり、プライマーの非特異結合を減らしたりするためには、高温で反応させると、より正確な逆転写が行われると期待できます。感度が高いと、より低濃度のテンプレートから逆転写が可能です。酵素ごとに異なるため、特に発現レベルが低いRNAをターゲットとする場合には感度に注意して酵素を選ぶ必要があります。特異性ターゲットとする配列のみを正確に逆転写する能力です。増幅しにくい配列では特異性の高い酵素の選択や反応条件を設定することが重要です。H活性を持つものがあります。HはRNA-cDNA複合体のRNAを分解し、転写後のPCRでの増幅感度を高めることができます。H活性が逆転写反応と競合して、完全長のcDNAが転写される前にテンプレートRNAを失う可能性があります。H活性を持たない酵素を試してみるのもよいでしょう。ライフサイエンス研究を目的としたRT-PCR用に、さまざまな逆転写酵素が市販されています(図2)。kbまでの長さの配列の増幅に対応しており、1ステップRT-PCRを行うことができます。kbのターゲットRNAを増幅することができる、2ステップRT-PCR用の酵素です。※収量とは、任意のPCRサイクル数で多くのPCR産物を増幅する能力のことです。目的に合った逆転写用プライマーを選ぶ逆転写で必要なプライマーは実験の目的や方法(1ステップか、2ステップか)によって異なります。逆転写で使用されるプライマーは以下の4種類に分けることができます(図3)。下記に挙げた特徴を考慮して、実験の目的や種類によって最適なプライマーを選択してください。1つのプライマーで結果が得られない場合は、他の種類のプライマーの検討をお勧めします。オリゴ(dT)nプライマー(図3A)真核生物がターゲットの場合、3’末端にあるポリAテールに結合させて、完全長のcDNAを合成する目的で使用します。アンカーオリゴ(dT)nプライマー(図3B)5'側にあるポリAテールの開始点に結合させて、ポリAテール内部でのプライミングを避けることができます。完全長のcDNAを合成する目的で使用します。配列特異的(遺伝子特異的)プライマー(図3C)通常のDNA増幅を目的としたPCRと同様に、特定の配列部分を増幅したい場合に用います。1ステップRT-PCRを行う場合は、このタイプを使います。ランダムヘキサマー(図3D)多種類のランダムな6塩基の配列です。特定の1種類の配列ではなく、含まれる多種類のRNAを均等に増幅、検出する場合などに使います。テンプレートRNAに対するプライマーの比率を調節することで、cDNAの平均的な長さを調節できます。p131)※配列特異的なプライマーの設計について特定の配列部分の増幅を目的とした実験では、プライマーを工夫することにより、得られたPCR産物がcDNA由来のものか、またはゲノムDNA由来のコンタミネーションかを区別することができます。プライマーの設計には、以下の2つの方法があります(図4)。RNA配列上で、複数のエクソンをまたぐようなプライマーを設計します。この場合、エクソンの間にイントロンが存在するゲノム由来のDNAは増幅されません(図4パネル1)。1つのイントロンの両隣のエクソンに、片方ずつがアニールするようにプライマーを設計します。ゲノムDNA由来のPCR産物は、cDNA由来の産物よりもサイズが大きくなるため、区別が容易になります(図4パネル2)。テンプレートRNAのクオリティを上げるRNAテンプレートのクオリティはRT-PCRの結果に大きく関わります。できる限り純度の高いRNAテンプレートを使用するようにします。ターゲットがmRNAの場合には、トータルRNAではなく精製したmRNAを用いることにより、増幅の可能性が高くなります。RNAテンプレ―トを調製する際は、RNaseがコンタミネーションしないよう細心の注意を払いましょう。mRNAの抽出過程で用いるエタノールやフェノール、SDSなどの反応を阻害する化学物質がテンプレート溶液に残らないように、完全に除去することも大切です。テンプレートRNAの調製ついての詳細は2ステップRT-PCRを行う前に検討すべきポイントをご覧ください。RNAの分解が進んでいる可能性があります。多くのRNaseを不活化することができるRNase阻害剤を反応液にあらかじめ添加してください。RNaseの重度なコンタミネーションがあると考えられる場合には、より高濃度のRNase阻害剤を使います。Inhibitor(製品番号:3335399001/3335402001)を使用する場合、通常に用いられる量(表2)の16倍の濃度を使用しても、反応には影響しません。p134)以上、RT-PCRを行う際に注意すべきポイントを5つに分けてご紹介しました。PCR実験は、テンプレートの特性や増幅したい配列の長さ、実験の特性により大きく条件が異なります。RT-PCRを行う際の条件検討の参考にしていただければ幸いです。PCR技術のすべてこのカタログでは、PCRの歴史やさまざまなPCRの原理、さらにはトラブルシューティングなど、PCRに関連する便利な情報を掲載しております。酵素阻害剤は酵素による生化学的な反応を阻害するため、研究や医療な...2018年7月18日CRISPR-Cas9とは?原理をわかり...ゲノム編集ツールの中でも、世界中の研究室で使われているのがCRISPR-Cas9です。下記フォームでは、M-hub(エムハブ)に対してのご意見、今後読んでみたい記事等のご要望を受け付けています。メルクの各種キャンペーン、製品サポート、ご注文等に関するお問い合わせは下記リンク先にてお願いします。アルドリッチジャパン合同会社はメルクのグループ会社です。