異なるソフトウェアでの後続処理のために、オペレータの好みに基づいて、両方の管状システムの結果のROIをさまざまな形式でエクスポートします。ボリューム・グラフィックス・ソフトウェアで処理し、最終的な視覚化をイメージまたはビデオの形式でエクスポートします。Results何をすべきか正常な二重樹脂注入は、両方の肝胆管と門脈脈管が十分に充填されている場合に達成されます。品質管理ステップとして、1つのローブ(例えば、左横葉)をクリアすると、注入に成功し、続いて目的のローブのイメージングが可能になります。光学的にクリアされたローブはmicroCTを使用して後でスキャンすることができます。したがって、肝臓全体を光学的にクリアすることが可能です。注入されたマウス肝臓では、肝臓周辺と樹脂が側枝に見えるまで、門脈血管系を樹脂で満たすべきであり(図4)、このアーキテクチャはマイクロCTスキャンおよびセグメント化されたデータで忠実に再現される。注入された肝内胆管は、周辺にほぼ及ぶ主要な門脈枝の隣に見えるようにする必要があり、樹脂は主要な側枝に見える必要があります。制御ローブが品質管理ステップを通過した場合、対象となるローブ(光学的にクリアされたものを含む)はmicroCTでスキャンすることができます。P15マウス(図4A、B)および成人マウス(図4C,D)について、よく注入された肝臓からのセグメント化されたデータの結果が示されている。やらないことインタクト肝臓組織は、注射を成功させるための前提条件です。誤って肝臓組織をニックしないように腹腔と横隔膜を切断するときに余分な注意を払ってください。この処置の間に肝臓に物理的な損傷がある場合、樹脂は、ポータル静脈注射中に漏れ出す可能性が非常に高い(図5A)。肝臓が物理的に損傷を受けている場合、血管系の良好な注射を達成することはできません。一般的な間違いの1つは、視覚化や分析のための課題につながる可能性のある樹脂で肝臓を不足しています。システム不足の原因の1つは、注射が完了する前に針やチューブの先端で樹脂が早期に硬化することである(図5B、青い矢印、ブラケットは大きな泡を示す)。1つの動物に1つの注入セットを使用し、硬化剤を樹脂に添加した後に速く働くことをお勧めします。注入中に樹脂が硬化した場合(これは半分充填されたシステムで観察され、ここでは半分充填されたポータル静脈血管構造で例示される)チューブを取り除き、チューブの先端を切断し(常に斜めに斜めにして斜めの先端を作成する)、プランジャーを押します。樹脂が再び滴下し始めた場合は、慎重にチューブを挿入し直し、縫合糸で固定します。樹脂が針に固まった場合は、チューブを完全に交換し、樹脂(気泡を避ける)で満たし、チューブを慎重に再挿入し、縫合糸で固定します。組織がより脆弱であるため、特に若い出生後マウス<P30では、チューブを交換することは困難です。門脈脈の貧弱な樹脂充填の別の原因は、心筋灌流が不十分である可能性がある(図5C、青い矢印は末端枝に見える血液を示す)。これは、血管の先端が樹脂の代わりに血液で満たされたときに観察することができる。これを避けるために、注射前に門脈(肝臓外)に血液が含まれていないことを確認してください。肝臓の不充満の第3の原因は、チューブが肝臓に深く挿入されすぎて、葉の1つに向かって枝に入る場合である。これを防ぐために、肝臓への入り口から最低0.5cmでチューブを挿入します。逆に、一方または両方のシステムが樹脂で過剰充填される(図5D)。注射を通して肝臓を視覚的に監視する必要があります。.樹脂を使用した胆道系の鋳造は、樹脂充填ダクトが肝臓表面にかすかに見えるだけなので、ポータルの静脈の樹脂鋳造よりも難しく、システムがほぼ満杯になり、いつ停止するのかどうかを評価することは困難です。小さな黄色の樹脂の点が肝臓表面に現れると(図2Ci、青い矢印)、これは胆道系が完全に充填され、樹脂がダクトから漏れ始めていることを示す。マイナー樹脂漏れは、microCTデータセグメンテーション中に手動で修正することができます(図5D、右パネル)。射出圧力が高すぎると、血管やダクトが破裂し(図5E)、不可逆的に損傷を与える容器またはダクトアーキテクチャが発生する可能性があります。肝臓はマイクロCTスキャンや分析には適していません.樹脂の過剰充填を避けるには、各マウスモデルでの射出に使用される適切な容積と圧力を最適化します。有毒な食事、遺伝子組み換え、または胆道系や静脈系に影響を与える肝臓損傷、または肝臓の硬直に挑戦されたマウスを扱う場合、注入圧力および量は体積として調整する必要があり、圧力は野生型マウスと異なる場合があります。このプロトコルは、2つのシステムの手動注入を記述しますが、注入圧力を標準化するためにポンプに注射器を接続することが可能です。気泡は、管状ネットワークのまばらな充填につながるもう一つの非常に一般的な注入アーティファクトです(図5F-H、青い矢印)。気泡の形成を避けるために、注射器とチューブに気泡が含まれていないこと、樹脂で完全に充填されていること、そして注入前に樹脂がチューブの先端から滴り落ちることを確認してください。microCTデータ上でマイナスの領域として表示される小さな気泡は、処理後のステップで手動で修正できますが、これは面倒です。新鮮なのは最高です新鮮な黄色の樹脂を使用することは重要な要因であり、2つの樹脂のコントラストとmicroCTデータセグメンテーションに大きな影響を与えます。開けたばかりの樹脂を使用する場合(図6A)黄色の樹脂注入胆管(明るい白色)と緑色の樹脂注入門脈(明るい灰色)との対比が明確に異なる。新鮮な樹脂を注入した肝臓は、自動化されたグローバル閾値を使用して簡単に処理されます。長期保存すると樹脂が沈殿し、コントラストが薄くなります。3ヶ月の貯蔵後、コントラストは、まだ胆道(図6B)とポータル静脈を区別するのに十分であり得るが、沈殿は、充填された門脈(図6B、青い矢印の向き)で不均一な不透明度として見える2つの樹脂の混合に影響を与える。異種のコントラストは、自動しきい値に悪影響を及ぼし、手動による修正が必要となり、処理時間が長くなります。樹脂が6ヶ月以上古い場合、コントラストだけでは、黄色注入された胆管と緑注入された門脈を区別できない点まで劣化している(図6C)。この場合、胆管と門脈は、直径とヒラ領域内の位置に基づいて手動でセグメント化され、マイクロCTデータ全体にわたって手動で従う必要があります。この手順は非常に時間がかかり、最善の回避です。(A)注射セット#1は、30Gの針とPE10の長さから30cmのチューブを含む。射出セット#2は、長さ約30cmの23G針とPE50チューブで構成されています。チューブの先端を伸ばして斜め切り、斜めの先端を作成します。AとBの定規はセンチメートル定規で、大きな増分は1cm、中間増分は5mm、マイナーインクリメントは1mmです。(A)マウス静脈循環循環系と心臓を示す図表は、灌流前に切り取るべき右心房と、循環系から血液を洗い流すために針を挿入する必要がある左心室を示す。下の大静脈は、血管圧を緩和するために腎臓の下で切断されるべきである。胆管樹脂注入フローチャート。肝臓ヒラル領域からオディの括約筋(黒矢印)までの共通胆管(黄色の点線)を、クリアされた共通胆管の下に縫合糸を有する画像。共通の胆管のまわりの緩いオーバーハンド結び目のための適した位置。(iv)黄色の点線と黒い矢印はオディの括約筋にラベルを付け、切開の斜めの角度と斜めの角度切開後の開口部がどのように現れるかを示す。挿入時にPE10チューブベベル開口部(上向き)の向きを示す回路図。黄色樹脂の注射の外観;樹脂は、ゆるやかに結ばれた結び目を簡単に渡す必要があります。CBD、一般的な胆管。ポータル静脈樹脂注入フローチャート。緑色の点線は、ハイラー領域からのポータル静脈を示します。青い矢印は、過剰充填された胆道システムにラベルを付けます。(ii)ポータル静脈のまわりの緩いオーバーハンド結び目のための適した場所。挿入時にベベル開口部(上方)を示す回路図。緑色樹脂と黄色樹脂の注射時の肝臓の外観;肝臓周辺の樹脂で満たされた血管に注意してください。