齋藤博英教授らの研究グループは、幹細胞の分化誘導に有用な実験手法を開発しました。この技術は、抗体を用いて細胞内の様々な分子を検出し、RNA、タンパク質の情報に変換することができるバイオセンサーです。この技術を使えば、特定の分子が存在する細胞でのみゲノム編集を行うなどの細かい細胞の運命コントロールが可能となります。分化が進んだ細胞特異的な分子をターゲットとすれば、幹細胞から分化ステップが進んだ細胞のみに遺伝子改変をすることができます。特定の分子に応答して遺伝子発現をコントロールすることは、細胞の運命や機能を制御するために必要な技術です。この技術によって細胞プログラムの制御が可能となりますが、この方法はこれまで元々細胞が持っている、つまり自然界に備わっているものを使うしか方法がありませんでした。遺伝子発現誘導に関わる分子は限られており、再生医療の発展のためには、タンパク質・ペプチドやRNAなどの分子はウイルス感染や疾患の状態を反映する細胞内の重要な生化学的情報を使う方法が求められていました。細胞制御や応用につなげることのできる自律的な遺伝子制御プラットフォームが求められていたのです。研究グループは求められている技術開発のために抗体に着目しました。感染症に対する防御などの作用でよく知られている抗体は、タンパク質、RNA、低分子を含む多種多様な分子を標的とすることができる非常に強力なタンパク質です。抗体は通常、血中などの細胞外に存在する分子を標的とする目的で利用されますが、抗体の一部分だけを利用した、単鎖可変領域フラグメントのようないくつかの小型抗体は、細胞内分子を標的とするために利用されています。単鎖可変領域フラグメントはさらに重鎖と軽鎖ドメインに分化することができます。研究グループはこの2つのドメインに分かれる特徴を利用してシステムの開発に着手しました。今回発表された研究内容で、重要なポイントを以下に挙げます。抗体を利用して細胞内の分子を検出し、それを起点に遺伝子発現を制御できる技術を開発しました。抗体の変更によってタンパク質・RNA・低分子など多様な分子に応答でき、望みのRNAやタンパク質を作り出せる分子情報変換システムを確立しました。このシステムを利用して特定のペプチドを発現する細胞でのみゲノム編集を行う技術を開発しました。RNAP)に着目しました。RNAPは高い転写活性を示し、追加の因子を必要とせずにDNA鋳型からRNAを合成できます。RNAPは二つの断片に分割することができ、これによって、それぞれの断片に融合したタンパク質間の相互作用によってRNA転写活性を制御することが可能です。簡単にまとめると、抗体を用いて細胞内の標的を特異的に認識して、RNA転写を誘導できる標的依存性RNAポリメラーゼ(TdRNAP)を開発した、という点が今回の研究で最も重要なポイントです。この技術に使っている融合する抗体を変更することにより、標的依存性RNAポリメラーゼはペプチド、タンパク質、RNA、低分子など多種多様な分子に応答し、転写産物を産生することができます。標的依存性RNAポリメラーゼを利用することで、特定の遺伝子産物の検出によって自律的に起動する細胞特異的ゲノム編集が可能となります。標的依存性RNAポリメラーゼは、遺伝子発現の制御に利用できる分子の多様性を拡大し、バイオエンジニアリングや将来の治療応用のための遺伝子工学ツールとして活用できると期待されます。RNAと抗体を組み合わせたものです。これらがどのようにして構築されていったかをここから解説します。標的物質の例として、酵母の転写因子であるGCN4を取り上げました。GCN4は、酵母ゲノムの約10%を調節する遺伝子発現のマスターレギュレーターです。ヒトの細胞内には存在しないタンパク質であるため、標的物質の有無を細胞外から容易に制御できます。RNAポリメラーゼを設計しました。VHドメインとVLドメインをそれぞれスプリットT7RNAPの二つの断片に融合させて、GCN4依存性RNAポリメラーゼ(GCN4-dRNAP)を作りました。GCN4ペプチドと蛍光タンパク質であるEGFPを融合させたタンパク質(EGFP-GCN4)を標的として使い、GCN4依存性RNAポリメラーゼの機能をテストしました。ヒト胎児の腎由来細胞である293FT細胞を使いって、蛍光タンパク質であるiRFP670が働いて発光するようにプラスミドを導入しました。670が発現し、発行することが確認されました。別の抗体を使うことで分子標的が変更できるかどうかを検証しています。RNAポリメラーゼの抗体部分を、GCN4、FLAG、EGFPを認識するAnti-GCN4、Anti-FLAG、Anti-EGFPという抗体に置換したものを作製しました。それぞれの標的物質はAzami-Green、EGFP、EGFP-GCN4、EGFP-3xFLAGであり、これらを細胞内に導入し、置換したものがそれぞれ特異的に反応するかが検証の方法で、全てにおいて標的のみで活性化することが示されました。ゲノム編集技術との組み合わせが行えるかどうかを研究グループは確認しています。RNAポリメラーゼを使うことで、ターゲット分子をもつ細胞だけで特異的にゲノム編集を行うことができると考えられます。この確認のために、EGFPを認識するgRNAを用いて、GCN4依存的にEGFPにゲノム編集が起こり、EGFPの遺伝子がノックアウトされるように設計して検証を行いました。RNAポリメラーゼはEGFP-GCN4を持つ細胞株でより優先的にEGFPノックアウトを誘導することが示されました。これはEGFP-GCN4自体が自身の遺伝子をノックアウトするためのドライバーとして使われていることを証明する結果です。今回の研究では、抗体を用いて細胞内の様々な分子を検出し、望みのRNAやタンパク質を作り出すことができる遺伝子制御システムが確立されたことが証明されました。抗体部分は既存の様々な抗体を利用することができるため、これまでの遺伝子制御システムでは対応できなかった様々な細胞内分子を標的として遺伝子発現をコントロールできます。応用例として、特定のペプチドを発現する標的細胞を検知して、その細胞特異的にゲノム編集できるような新技術が開発できました。この方法はiPS細胞に代表される幹細胞の誘導をコントロールするためには重要な方法になります。今回の研究報告では実験技術の確立が報告されましたが、今後はこの方法を使った幹細胞の分化誘導について多くの論文が発表され、幹細胞研究の効率化につながっていくと期待されています。子宮頸がん向けキラーT細胞をゲノム編集して免疫拒絶を回避2024年9月25日はじめにお読みください。閉じる幹細胞についての最重要情報はこちら!詳細はコチラ幹細胞についての最重要情報はこちら!詳細はコチラ。