Institute概要このプロトコールは、小規模の装置に最適化されたブタの脳からのチューブリンの高収率単離技術について説明しています。チューブリン重合活性を測定する手順によって補完されます。Abstract神経細胞の樹状突起と軸索には微小管が豊富に含まれているため、あらゆる供給源からの神経組織はチューブリンの分離に最適な材料です。ここでは、複数の供給源からの神経組織にわずかな変更を加えて使用できるチューブリンを抽出する手順を紹介します。提示されたプロトコルでは、粗溶解物の新しい清澄化ステップが導入されており、これにより、最初の重合ステップが発生する前に不溶性破片の初期量が大幅に減少しました。この追加のステップにより、同じ器具を使用しながら追加の組織を処理できるため、処理されたホモジネートの相対体積が増加しました。活性アッセイおよび透過型電子顕微鏡によって確認されたように、精製チューブリンの品質に大きな影響を与えません。記載されている手順には、組織の収集、輸送、組織の均質化、チューブリンの分離サイクル、FPLCを使用したイオン交換クロマトグラフィーによる最終研磨、その後の活性測定アッセイなど、すべての重要なステップが含まれています。精製チューブリンの均一性は97%以上であり、エレクトロスプレーイオン化とMALDI-TOFを用いたMS/MS分析で確認されました。nm)である微小管は、さまざまな重要な細胞プロセスに関与しています。分泌に関与しています1。微小管の細胞機能は、微小管関連タンパク質(MAP)や他のタンパク質との直接的または間接的な相互作用、またはチューブリンコード2で定義された複雑な翻訳後修飾によって影響を受ける可能性があります。短い微小管が形成され、その後のチューブリン繊維の成長は、両端が可逆的に伸びることによって達成され、平行なプロトフィラメント2に配置されたチューブリンヘテロ二量体からなる円柱を形成する。動的不安定性とは、組み立てられた微小管がしばしばそのサブユニットと平衡状態にないが、定常状態を維持しながら、成長と収縮の長期にわたる相転移を経験する可能性があるという事実を指す1,2。チューブリン繊維の動的不安定性は、主に、高純度グリセロール、DMSO、GTP/ATP、Mg2+、またはその他の化学物質(タキソールやポリカチオンなど)3の環境下で、高温重合と低温解重合のサイクルを使用する多くのチューブリン分離および精製手順で利用されています。ほとんどの分離手順4は、タンパク質クロマトグラフィー5,6,7,8,9によって行われ、これにより、ヌクレオシドジホスホキナーゼおよびATPase活性5を持つチューブリン関連タンパク質の分離が保証されます。同様の結果は、高塩緩衝液10を利用することによっても得ることができる。神経11、12、13、14および非神経15組織、魚類16(淡水および海洋の両方)、酵母、または異なる生産株11、12、13、14で過剰発現した組換え変異体17、および他の供給源9、18を含む複数の供給源を分画に用い、浄化。提示されたプロトコルは、沈殿とタンパク質クロマトグラフィーを利用して、ブタの脳からチューブリンを高均質に単離します(図1)。主な利点は、日常的な分子生物学実験用の設備の整った研究室で利用可能な装置で比較的高い収率を達成できることです。材料表に記載されています。すべての溶液は、FPLCグレードの薬品を使用して調製し、使用前に0.22μmフィルターでろ過しました。メガネなどの個人用保護具が使用されました。すべての器具は清潔で、洗剤の痕跡はありませんでした。手続き中は、適切な動物飼育ガイドライン(施設によって承認されたもの)が守られました。脳組織を含むすべての生物学的材料は、原材料として屠殺場から購入されました。プロトコルのどのステップでも生きた動物は使用されていません。乾燥ホスホセルロース樹脂15gに50%エタノール700mLを加え、ビーカーにスプーンでやさしく混ぜます。mL)の適切なクロマトグラフィーカラムに注ぎます。フリット付きのピストンでコラムを閉じます。空のヘッドスペースの少なくとも10%を残してください。注:他の容器を使用することもできますが、FPLCカラムを蠕動ポンプと組み合わせることで、樹脂の活性化と樹脂の損失に必要な時間を大幅に短縮できます。ロッカーシェーカーで60rpmで30分間インキュベートします。minに設定したペリスタルティックポンプを使用して、過剰な50%エタノールを除去します。樹脂を乾かさないでください。トップピストンを取り外し、50%エタノールを300mL加えます。余分なエタノールを取り除きます。残りのエタノールを取り除きます。カラムに300mLの超純水を加え、ピストンでカラムを閉じ、樹脂が再懸濁するまで傾けます。蠕動ポンプを使用して余分な液体を取り除きます。mL加えてカラムを閉じ、樹脂を穏やかに傾けて再懸濁します。ロッカーシェーカーで60rpmで30分間インキュベートします。蠕動ポンプを使用して余分な液体を取り除きます。mL加え、レジンを再懸濁し、余分な液体を取り除きます。残ったHClを取り除き、超純水300mLをカラムに加え、ピストンでカラムを閉じ、レジンが再懸濁するまで傾けます。蠕動ポンプを使用して余分な液体を取り除きます。MgCl2)をカラムに注ぎ、樹脂を傾けて再懸濁します。NaOHでpHを6.1に調整し、穏やかに撹拌して2時間インキュベートします。6.4)を加え、4°Cで一晩インキュベートします。余分な液体をデカントし、96%エタノールを最終濃度20%に加え、使用するまで4°Cで保存します。mLの活性樹脂を、閉じた底プラグでクリーンなクロマトグラフィーカラムに注ぎます。樹脂が沈殿するのを待ちます。沈殿した樹脂の量は約5mLです。mm)を、軽い壊れたマトリックスの破片が堆積する可能性のある場所から取り除きます。下部のプラグを取り外し、保存液を一滴ずつ自由に排出します。樹脂を乾かさないでください。カラムを閉じてFPLCシステムに接続します。分間、同じ条件で逆流でカラムを洗浄します。活性ホスホセルロースを充填したカラムを4°Cで数日間保存します。注:チューブリンは分解されやすいため、迅速に進行することが重要です。すべての溶液、機器、および機器は、事前に準備、冷却、または必要に応じて加熱する必要があります。この手順は、推奨温度の変化に敏感です。脳組織は、精製中に生成される生物学的廃棄物の量を考慮して、解剖後できるだけ早く処理する必要があります。超遠心キュベットを使用したローターに最適化されました。処理された組織の量は、利用可能な超遠心分離機に応じて増減することができます。EGTA)を完全に浸すまで注ぎます。氷の上に5分間放置し、熱放散を容易にするためにトランスポートバッファーを新しいものに変更します。氷上で迅速に輸送し、さらなる処理を行います。組織の均質化注:組織の均質化は、冷蔵室の氷上で行われます。すべての機器は、自然重合を防ぐために事前に冷却する必要があります。チューブリンの主な供給源は灰白質であり、残りは次の手順で除去されます。Lプラスチックビーカーに注ぎ、容器を含む重量W1(g)を決定します。ATPとGTPは使用直前に追加されます。きな白質の塊、髄膜、血管を指で取り除きます。ハサミやピンセットも使用できます。不要な組織で縞模様になったブタの脳を、100mLの冷抽出バッファーを入れたビーカーに入れます。すべての組織が処理されるまで続行します。処理された脳組織でビーカーを計量し、W2(g)重量を決定します。抽出緩衝液の重量=W2〜W1という式に従って抽出緩衝液を添加する(例えば、400gの組織に対して、300gの抽出緩衝液を添加する)。抽出バッファーで脳組織を予冷したキッチンブレンダーに移し、4〜8回の短い3秒パルスで処理します。rpm)で1分間処理します。懸濁液を氷の上に3〜5分間置き、時々スプーンで混ぜます。5回、または完全に均質化されるまで繰り返します。gで10分間遠心します。上清はそのままにして、ペレットを捨てます。mLの清澄抽出物が収集されるまで繰り返します。上清を収集し、ボリュームS1を決定します。注:ローターが1つしかない場合は、次の遠心分離ステップ(37°C)のために温水浴で加熱します。mMの最終濃度に添加します。懸濁液を超遠心チューブに注ぎます(上清の量がチューブの量を超え、残りは廃棄されます)。チューブを上清と共に水浴中で37°Cで45分間インキュベートします。gで90分間回転させます。上清(S2)の量を測定してMEMバッファーの量を決定し、ステップ3.3.4でペレットに追加してから、上清を廃棄します。ペレットは重合チューブリンが入っている場所に保管してください。MEMバッファーを調製します。MEMバッファーを加えます。MEMバッファーにペレットを再懸濁し、懸濁液をメスシリンダーに移し、総容量を決定します。懸濁液をDounceガラスホモジナイザーに移し、氷上で約10分ごとに溶液を45分間均質化します。ピストンは壊れやすいため、慎重に操作する必要があります。その間、ローターを氷を入れた水で冷やします。(S3)を測定します。mMの最終濃度まで加えます。上清を超遠心チューブに注ぎ、37°Cで45分間インキュベートします。注:その間に、ウォーターバスでローターを37°Cにウォームアップします。37°Cで60分間遠心分離します。上清の量を決定します(S4)。これはオプションの停止ポイントです。チューブリン入りペレットは、液体窒素で衝撃凍結し、-80°Cで保存できます。ATP)を調製し、ペレットの入ったチューブに均等に分け、スプーンでペレットを再懸濁し、溶液をDounceガラスホモジナイザーに移します。氷上で10分ごとに45分間均質化します。その間、ローターを氷を入れた水で冷やします。gで60分間遠心します。mLのDMSOを添加します。懸濁液を超遠心チューブに注ぎ、37°Cで20分間インキュベートして重合します。注:その間、ウォーターバスでローターを30°Cにウォームアップします。30°Cで60分間遠心分離します。上清(S6)の量を決定し、ペレットを保持します。ATP)に溶解します。Dounceガラスホモジナイザーを使用して、可溶化を促進します。ペレットが完全に溶解するまで(乳白色の粒子が見えなくなるまで)、PEMバッファーを添加し続けます。イオン交換クロマトグラフィー精製注:逆イオン交換クロマトグラフィーは、ミクロチューブリン関連タンパク質の除去に使用されます。チューブリンは所定のpHでカラム内を自由に流れ、汚染タンパク質はホスホセルロース樹脂上に保持されます。すべてのステップは、4°Cに近い温度または氷上で行われます。FPLC精製前に、ろ過または遠心分離によってチューブリン抽出物を清澄化しないでください。ATP)で平衡化します。平衡化のために少なくとも10カラム容量を使用してください。mL/分)を超えてはなりません。mL/分)カラムにロードし、レジンを流れる未結合タンパク質を回収します。チューブリンを含む画分を液体窒素で凍結し、すぐに液体窒素で容器に移します。チューブリンは、これらの条件下で数年間保存することができます。チューブリンを-80°Cで保存すると、安定性は数か月にわたって急速に低下します。Results分離および精製ステップでは、SDS-PAGE電気泳動用のサンプルを採取し、その後、Coomassie-blue染色を使用して分析しました(図2)。β-メルカプトエタノール)と混合し、95°Cで15分間インキュベートし、各サンプル4μLを12.5%アクリルアミドSDSゲルにロードし、還元および変性条件で1ゲルあたり30mAの定電流で分離しました。その結果、相対チューブリン濃度の漸進的な増加と、汚染タンパク質の減少が確認されました。最初の遠心分離(ステップ3.2.7)では、このステップを省略した場合(図2A、B)と比較して、清澄化されたライセート中のチューブリンの有意な損失はありませんでした。(図3)の3つの独立した方法を使用して決定しました。記載された手順を用いたチューブリンの全収率は、250gの神経組織から精製されたチューブリン123mgであった。測定時には、保存バッファー中の高DTT濃度がBCAアッセイに大きな影響を与えることを考慮する必要があります。A595増加し、BCAアッセイの容量が大幅に減少します(図3A)。DTTの悪影響は、純水で10倍希釈した後でも検出できます(データは示していません)。Bradfordアッセイは、デンシトメトリー分析で確認されたように、保存バッファー(図3B)の影響を受けていないようでした。Republic)のエレクトロスプレーイオン化とMALDI-TOFを使用。どちらの分析でも、いくつかのアイソフォームにブタのチューブリンαとβが存在することが確認されました。分析のためのサンプル調製中に導入されました。つのペプチド分解能(0.0069%)で同定されました。その後の実験では、急速凍結後の重合能力の保存と液体窒素中での保存を確認しました。アリコートを液体窒素から取り出し、氷上でゆっくりと解凍しました。mg/mL)を調製しました。1つの希釈シリーズを37°Cで60分間インキュベートし、もう1つの希釈シリーズを氷上で60分間インキュベートしました。対応する温度(4°Cまたは37°C)で60分間遠心分離しました。上清30μLを除去し、SDS-PAGEに使用した。残った上清はピペットで丁寧に取り除き、廃棄しました。μMのPEMバッファーを加えて短時間洗浄した後、ピペットを使用して直ちに除去しました。μLの1倍濃縮SDSローディングバッファーに再懸濁して、ペレットと上清の相対濃度が保持されるようにしました。ローディングバッファーを各上清に加えました。Stainingを使用して分析しました(図4)。SDS-PAGEにロードされる各サンプルの量は、開始濃度に応じて調整されているため、濃度による降水量の差がより明確になります。PEM緩衝液中でのチューブリンの自己組織化試験により、温度依存的にチューブリン繊維を形成する能力が確認されました。MAP2c駆動チューブリン20,21アセンブリアッセイを実施し、チューブリンが他のタンパク質と相互作用する能力を検証した22。μMの範囲に調製しました。GTPで希釈することにより、氷上で調製しました。g、37°Cで60分間遠心分離しました。μLのPEMバッファーで2回行いました。この実験では、MAP2cを含まないサンプルのみがペレットを形成しなかったため、調製したチューブリンがMAP2cによる重合を受ける能力が確認されました(図5)。