この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。(A)表面決定、(i)過大評価された等価値(現在の選択のプレビューは黄色で示されている)、(ii)過小評価された等値、(iii)ポータル静脈および胆管の適切な表面決定のための等値の最適選択。(B)表面決定によって作成された対象領域(ROI)を分割し、(i)ダイアログウィンドウに1つのセグメント(最大のセグメント)のみが残るほどの高さの値を設定し、(ii)黄色のフレームでは小さい(除外された)粒子が示される。(C)データの表面スムージング、(i)平滑化機能が左側のパネル上にあり、(ii)平滑化強度を1(最大2)に設定し、新しい平滑化ROI、(iii)平滑化データを作成する。(iii)灰色で示される門脈、胆道系は緑色で示される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。図4:よく注入された胆管(BD)およびポータル静脈(PV)システム.(A)2つの系に2つの樹脂を注入した15日目(P15)の肝臓の右内側葉(RML)を光学的にクリアした。レンダリング(A)は、緑の白と胆道系のポータル静脈血管構造を描いた。スケールバー1mm(C)2つのシステムに2つの樹脂を注入した成体肝臓のRMLを光学的にクリアした。mm(D)3Dレンダリングは、緑の白と胆道系のポータル静脈構造を描いた。スケールバー1mmパネルA、B、Dは、ハンケオバら9の許可を得て適合している。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。(A)画像は、腹腔の最初の開口部の間に誤ってニックされた肝臓を示しており、樹脂が切り傷(青い矢印頭)を通して漏れている。(B)樹脂硬化によるポータル静脈システムの注入が不十分。青い矢印は空の端子の枝にラベルを付け、赤い括弧は大きな泡をラベル付けします。心筋灌流が悪いため、ポータル静脈システムが不十分に注入されました。青い矢頭は、末端の枝に見える血液をラベルします。樹脂の分離されたボールによって明らかに過剰充填胆道システム。イメージが表示されます。青い点線の輪郭は、拡大領域を表しています。黒い矢印は、マイクロCTスキャン後の光学クリアリング中に損傷を受けた肝臓の一部にラベルを付けます。図の大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。図6:差動樹脂コントラスト(A)開きたばかりの黄色い樹脂は、樹脂注入されたポータル静脈(灰色)と胆管(白)を区別するのに十分なコントラストを生成する。(B)黄色の樹脂の3ヶ月間の貯蔵は、不均一な不透明性をもたらす樹脂の沈殿をもたらす(灰色白い門脈、青い矢印)。黄色樹脂の長期保存(>6ヶ月)は、門脈(灰色)と胆管(灰色)の間のコントラストを減少させる。μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。Discussionいくつかの重要なステップは、サンプル調製からCTデバイスのパラメータまで、ダクトの成功を決定します。最良の結果を得るためには、コントラストがよく、十分に注入され、バブルフリーの樹脂を使用して、3Dデータ、画像、およびムービーを取得するために、自動しきい値による簡単なデジタル処理を可能にする必要があります。トレーニングとこのプロトコルに従うと、注射の90%が成功し、再現可能なデータになります。2つの注入システム間の最もよい対比を達成するために、新鮮な黄色の樹脂を使用することが重要です。黄色の樹脂は非常に強い放射性pacityを有し、青色樹脂は検出不能な放射性pa00を有する。トップの結果は、新しい黄色の樹脂ボトルを開けた後、最初の3ヶ月以内に達成されます。時間が経つと樹脂が沈殿し、長期保存(>6ヶ月)後、黄色と緑色の樹脂はCTスキャンで区別できなくなります。つのシステムの広範で時間のかかる手動トレースとセグメンテーションが必要です。次に、よく伸ばされたチューブは、成人マウスの共通胆管および出生後マウスの共通胆管および門脈に適合するために不可欠である。ポイントは注意して作成する必要があります。共通の胆管が横切って切り開かれる場合、周囲の組織から剥離する可能性が高く、チューブの正常な侵入を防ぎます。このステップは、共通の胆管が引き込まれ、周囲の組織から切り離された場合に「カール」する出生後マウスにとって特に繊細であり、チューブの挿入は非常に困難です。気泡は、CT画像に負のスペースを作成し、時間のかかる手動補正を必要とするので、バブルの形成を避けます.これは樹脂の広がりを容易にするので、注入手順中と後に濡れた綿棒で表面を転がすことによって肝臓を穏やかにマッサージすることが重要です。注入とチューブの除去が完了した後、シルクの縫合結糸は迅速かつ慎重に締め付ける必要がありますので、樹脂は完全に重合する前に肝臓から流れ出ません。マイクロCTイメージングを成功させるには、サンプルをアガロースで適切に固定し、CTデータ内の動きアーティファクトを排除するために熱的に適合させる必要があります。微細な構造を解決するために適切な空間解像度に到達するために最適化する必要があります.注射手順の技術的な変更は、若いマウスでの注入を達成するために行うことができます.現在、若いマウス肝臓の樹脂鋳造は、十分に薄いチューブの入手可能性によって制限されており、PE10は市販のチューブの中で最も小さいものである。谷水らは、ガラス毛細血管11を用いて胚性17日目(E17)共通胆管にカーボンインクを注入することに成功した。したがって、ガラスキャピラリーを介して樹脂を送達できるかどうかの将来のテストは興味深いでしょう。管管は肺9の気道や肺動脈血管系などの他の管状システムを注入するように適応した。二重樹脂注入はまた、他の市販の樹脂と一緒に使用するように変更することができ、またはこのプロトコルは、カーボンインクを注入するために使用することができます。ダクトパイプラインの主な制限要因の1つは、樹脂粘度です。ダクトは直径5μm以上の管状構造の樹脂鋳造にのみ使用できます。このデータセットでは、樹脂は5μm9の最小径のチューブを貫通することができました。このサイズ制限は、細かい管と小さな毛細血管の分析を妨げる。小口径の容器にダクトパイプラインを進めるために、他の市販の樹脂をテストする必要があります、または新しい低粘度の放射不透明剤の開発は、ルーメンの浸透を改善することができます。imaging9を行った。ダクトは、二重分析(高い肝臓自家蛍光のためにiDISCO+にとって困難であった)、3Dイメージング、および定量化(カーボンインク注入では不可能)、および内腔化(ダクトは内部ルーメンアーキテクチャとシステム灌流のデータを提供する)の点で他の2つの方法を上回った。前述のように、ダクトの主な制限は、注入および分析できる最小ルーメンサイズ(5μm限界)であり、カーボンインクインジェクションとiDISCO+の両方が優れたパフォーマンスを発揮したパラメータである。ダクトは、各注入システムの分析を個別に可能にし、また2つのシステム間の建築関係を研究するために二重3D調査を容易にするので、単一システム樹脂鋳造3,5,6よりも優れています。ダクトは、3Dで任意の2つの管状ネットワークを研究するために適用することができます。原理の証明として、ダクトは、肝臓胆道および門脈系および肺動脈脈管および肺の気道を可視化するために使用された。肝内胆管は、門脈静脈に隣接して発達し、ポータル静脈は胆道樹12の成長および分化を調節する構造テンプレートおよびシグナリングセンターを提供する。ハンケオバら9章では、ダクトは、ヒト小児疾患アラジール症候群のマウスモデルで胆道再生を検討した。ダクトは、胆道系が野生型のようなボリューム9を達成するために使用した以前に報告されていない建築メカニズムを明らかにした。アラギル症候群マウスは、2つの異なる戦略を利用した:(1)肝臓のヒラルおよび中央領域において、胆道系は分岐を増加させ、(2)肝臓周辺では、デノボ生成胆管は非常に激しい。これらの2つの要因は、異常なアーキテクチャにもかかわらず、ほぼ正常な胆道系体積をもたらす組み合わせ。ダクトは、2つの門脈間の接続橋を形成する門脈分岐および胆管とは無関係に発生した異常な胆管分岐を検出した9。これらの表現型は、単一の樹脂鋳造では検出不可能であり、2D組織学的セクションでは胆管増殖と誤解される可能性があります。したがって、ダクトは、質的で詳細な定量分析の可能性を持つ全器官またはローブレベルでの2つの管状ネットワークの3Dアーキテクチャを記述するデータを提供する。ダクトは、異なる動物モデルにおける出生後肝発達および肝臓再生分析の新しい基準となり得る。disclose.Acknowledgementsカリ・ユペールとステイシー・ユペールの専門知識と胆管の缶取とその実験室でのホスピタリティに関する支援に感謝します。ナジャ・シュルツとシャーロット・L・マットソンが共通の胆管缶取を手伝ってくれたことに感謝します。(ダニエル・アラジール賞)、スウェーデン心臓肺財団(20170723)、ベテンスカプスローデ(2019-01350)。CR(LM2018110)がサポートするチェコナノラボの研究インフラを認めています。J.K.は、助成金FSI-S-20-6353のサポートのおかげです。reserved×-1::1。