サンプルは、Formvarでコーティングされた炭素安定化銅グリッドに吸着されました。陰性染色し、18,000倍の倍率と80kVの加速電圧で電子顕微鏡で調べました。明確な糸状構造と適切なサイズを持つ均質な微小管の存在は、天然のコンフォメーションで微小管を形成する能力を示しました(図6)。図1:チューブリンの分離と精製の概略図。括弧内の数字はプロトコルステップを示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。kDa)の安定した増加に伴う不純物の減少が見られます。各行の上の数字は、プロトコルのステップ番号に対応しています。(B)リン酸化セルロース樹脂上のタンパク質クロマトグラフィー後に得られた画分のSDS-PAGE分析(1ラインあたり4μL)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。図3:タンパク質濃度。希釈シリーズと比較しました。(A)BCAアッセイを使用した場合、DTT(ソリッドシンボル)を含むサンプルのバックグラウンドに大きな変化が見られました。(B)この効果は、ブラッドフォードアッセイで濃度を測定したときには検出されませんでした。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。図4:Tubulin自己組織化アッセイ。°Cでインキュベートした保存チューブリンが、広範囲の濃度で温度依存的に重合する能力が確認されました。(P-ペレット、S-上清;チューブリンのそれぞれの濃度は各ラインペアの上に示され、ロードされた各サンプルの量は10μgであった)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。図5:チューブリン共沈降アッセイ。MAP2c支援チューブリン集合体のSDS-PAGE解析により、貯蔵チューブリンが微小管関連タンパク質との相互作用によって濃度依存的に重合する能力が確認されました。MAP2cのモル濃度は、各線の上に示されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。TEM顕微鏡写真は、チューブリンが(A)MAP2cタンパク質で装飾された均質なチューブリンフィラメントからなる適切な直径(B)の微小管に集合することを示しました。nm(B)に対応します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。Discussionニューロンの樹状突起と軸索は微小管が豊富(最大40%)であるため、あらゆるソースからの神経組織はチューブリン分離のための優れた材料です23。脳組織は、十分な量で比較的容易に得ることができる。主な欠点は、不特定のレベルの翻訳後修飾であり、これはその後の実験に影響を与える可能性がある24,25。それ以外の場合、唯一の懸念は、特に暖かい条件で出発物質が急速に劣化することです。輸送前の熱放散を強化するために、いくつかのトランスファーバッファー交換を採用し、できるだけ早く開始される処理のための迅速な輸送を行いました。新鮮な組織は、加熱が防止される条件で解剖され、GTPとグリセロールを含む緩衝液で均質化され、チューブリン26がさらに安定化されます。提示されたプロトコルでは、粗溶解物の清澄化ステップ(ステップ3.2.7)が導入されています。最初の重合前に遠心分離を長時間行うことは、チューブリンが不可逆的な修飾やプロテアーゼに対して感受性があるため、一般的には推奨されません。本実験では、高Gフォースでの短いスピンが破片を減らし、チューブリンの品質に大きな影響を与えることなく、処理されたホモジネートの相対体積を増加させることを実証しました。正確なタンパク質濃度の決定は、主にチューブリン結合タンパク質または阻害剤との相互作用を研究する場合、さらなる実験に不可欠です。調査中、タンパク質濃度アッセイの結果に大きな違いが見られました。主な理由は、高濃度のDTT、GTP、およびATPの存在がアッセイに干渉することでした。BCAアッセイは、保存バッファー中のDTTの量が多いため、上限にシフトし、アッセイ容量が減少しました。タンパク質とATPまたはGTPの吸光度最大値が類似しているため、280nmの吸光度を用いたタンパク質濃度測定に不整合が生じていました。UV検出器からの読み取りでも顕著でした。信頼性が高く、安定した結果が得られたアッセイは、緩衝化合物の影響が観察されなかったBradfordタンパク質アッセイでした。それにもかかわらず、タンパク質標準希釈シリーズを保存バッファーに調製することが不可欠です。精製されたチューブリンが適切な配列を作り出す能力は、その後の実験の前提条件です。チューブリンは、その性質上、グリセロールGTPが豊富な環境でも非常に分解しやすく、その結果、均質なフィラメントを形成する能力が低下します。精製プロセスを追跡し、保存されたチューブリンが重合して安定した通常のフィラメントになる能力を実験的に検証することが重要です。vitroで導入されています。32であるを挙げることができます。このプロトコールで使用されるチューブリンの重合アッセイと共沈は、簡単に実行できます。チューブの底に発生するペレットまたはSDS-PAGEを使用して迅速に評価できます。高度な方法を含めて、品質管理のために微小管繊維の存在を確認する必要があります。reserved×-1::1。