Country:Japan【目的】近年miRNAがエクソソームを介して細胞機能を制御することが注目されており,子宮内膜で発現するmiRNAが胚の伸長や着床過程で重要な役割を担うことが示唆している。ウシ子宮内膜で発現するmiRNAの種類や発現量などの全体像は明らかにされていない。そこで本研究では,ウシ子宮内膜で発現するmiRNAの着床過程における機能解析を最終目的とし,卵胞期,黄体期および着床期のウシ子宮内膜組織に含まれるmiRNAを網羅的に解析した。sequence解析によってそれぞれのステージ間のmiRNA発現を網羅的に解析した。silico解析により着床過程の制御機構に関与すると考えられるmiRNAの探索および特定を行った。その結果をもとに,miRNAのターゲット遺伝子およびその遺伝子が関与するウシ子宮内膜の制御機能の探索を行った。【結果】各ステージ間における既知miRNAおよび新規miRNAの数は卵胞期で297個および77個,黄体期では317個および81個,着床期では293個および435個確認された。GO機能エンリッチメント解析の結果,それぞれのステージで発現が上昇したmiRNAのターゲット遺伝子の多くは細胞構成成分,中でも細胞質,細胞膜,膜貫通型タンパク質の機能に関与するものであった。そのヒストグラム解析ではコラーゲン含有細胞外マトリックスに関与する遺伝子が最も高い値を示した。黄体期と着床期で変化倍率が1.5倍以上かつ片方のステージで1000リードを越えるmiRNAは合計35個確認された。その内、黄体期で発現が上昇したmiRNAは既知が14個、着床期で上昇したものは既知が19個、新規が2個であった。これらのmiRNAは胚性因子によって制御されている可能性が示唆された。Country:Japan【目的】ウシ胚は着床前に細長く伸長するとともに妊娠認識物質であるIFNtを産生する。胚伸長期は妊娠の律速段階であり、子宮内膜因子の制御下で促進されることが報告されている。エクソソーム(Exo)がこの過程においてどのような作用を及ぼすかは明らかにされていない。本研究では、子宮内に存在するExoが胚伸長およびIFNtの産生に与える影響を明らかにすることを目的とし、ウシ胚由来の培養栄養膜細胞(BT細胞)を用いてその影響を解析した。【方法】Exoは黄体期(L)および妊娠8日目(P8)のウシ子宮灌流液からアフィニティー法によって単離した。BT細胞は5%FBS添加DMEM/F12培地を基礎培地とし、コラーゲンコート処理ディッシュで培養した。Exoの細胞への取り込みを確認するため、膜染色色素を用いてExoを蛍光標識し、培地へ添加4h後にヘキスト染色を行い、蛍光顕微鏡下で観察した。Exo添加によるBT細胞の形態的変化について観察した。観察した結果、蛍光標識されたExoが栄養膜細胞に取り込まれていることが確認された。Exo無添加区では小胞が消失していたのに対し、Exo添加区では小胞構造が維持されていた。qPCRの結果、Exo無添加区、L-Exo添加区と比較して、P8-Exo添加区においてPCNA,CCND1およびIFNt遺伝子の発現量が有意高い値を示した(P<0.05)。以上の結果から、子宮内に存在するExoの特性は時期特異的に変化し、妊娠初期のExoは胚細胞の遺伝子発現を変化させることが明らかとなった。これらの結果は、妊娠初期の子宮内Exoが着床の成立を促進する可能性を示唆するものである。Country:Japan【目的】ウシを含む反芻動物の胚は伸長過程において栄養膜細胞より妊娠認識物質であるインターフェロンタウ(IFNt)を産生する。その具体的な制御因子は未だ明らかにされていない。反芻動物の妊娠成立におけるIFNtの重要性を考えると,その制御機構の解明は受胎率の向上において大きな意義を有する。本研究では,ウシ胚盤胞期胚由来の栄養膜細胞(BT細胞)を用い,そのIFNt発現に対する子宮内膜産生因子の影響を調べた。【方法】BT細胞の培養には5%ウシ胎子血清含有DMEM/F12を基礎培地として用いた。2(CCL2)の影響を解析した。それぞれの因子の受容体遺伝子の発現をRT-PCRによって,IFNtの遺伝子発現をqPCRによって解析した。blottingによってIFNtタンパク質の発現を解析した。【結果】RT-PCRの結果,BT細胞においてそれぞれの因子の受容体遺伝子が検出された。qPCRの結果,100ng/mlの濃度でそれぞれの因子を添加したBT細胞におけるIFNt遺伝子の発現は,それぞれ1ng/mlの濃度で添加したBT細胞よりも高くなっていた。blottingの結果,BT細胞におけるIFNtタンパク質の発現は,無添加区よりも高かった。本研究の結果,子宮内膜で産生されるBTC,HB-EGF,IGF1およびCCL2を高い濃度でBT細胞に添加するとIFNtの発現が促進されることが示された。(SERPINA14、GRP,FOXA2)の発現を解析した。Country:Japan【目的】妊娠初期のウシ子宮内膜の組織改変は着床や胎盤形成に必須な過程である。Metallopoteinase)が中心的に機能する事が報告されている。我々は、着床期の組織改変が伸長期胚から分泌されるインターフェロンタウ(IFNτ)の制御下にある可能性を報告している。既報では、I型IFNがウシ子宮内膜組織中に貯蓄されているMMPの放出を誘導することを報告した。MMPがグリコサミノグリカン鎖(GAG鎖)に結合して貯蓄されていると想定してGAG分解酵素の発現を解析し、スルファターゼであるN-アセチルガラクトサミン-6-スルファターゼ(GALNS)遺伝子の発現が着床期で上昇することを示した。これらの結果は、GALNSを介してIFNτがMMPの放出を制御している事を示唆するものである。本研究ではGALNSのタンパクレベルでの発現動態を明らかにすることを目的とした。【方法】黄体期および着床期のウシ子宮内膜におけるGALNSの局在を免疫組織化学的に検索し、ウェスタンブロット法により発現量を解析した。単層培養のウシ子宮内膜上皮細胞(BEE)と間質細胞(BES)を、IFNαで処理し、GALNSの発現量に対する影響を調べた。結果、黄体期および着床期でGALNSの発現が認められ、BEEとBESにGALNSが局在していた。タンパクの発現は黄体期と比較して着床期において有意に高い値を示した(P<0.05)。培養細胞を用いた解析結果から、BEEでは無添加区とIFNα添加区の間に発現量の変化は認められなかったが、BESではIFNα添加区でGALNSの発現が有意に上昇した(P<0.05)。このことから、BESにおいてGALNSはI型IFNにより発現が促進され、着床期に発現が上昇することがタンパクレベルで明らかとなった。Country:Japan【背景と目的】反芻動物の伸長期胚の成長と生存には腺上皮産生因子が不可欠である事が示唆されているが、その具体的な機能や発現制御機構は未解明である。一方で、子宮腺機能を生体外で再現できる培養系は未だ確立されていない。そこで本研究では、腺上皮様構造を再構築できるマトリゲル内培養を用いてウシ子宮内膜上皮(BEE)の培養系を確立し、子宮腺産生因子の解析を行った。【方法】培養4日目のマトリゲル内培養下のBEEを用いて以下の実験を行った。(SERPINA14、GRPおよびFOXA2)の遺伝子発現を解析した。(10-6M)、IFNα(100IU/ml)およびP4+IFNα処理を行い、SERPINA14の遺伝子発現を解析した。3子宮内膜の機能発現には間質細胞とBEEの相互作用が重要であると報告されていることから、単層間質細胞の上に1と同様のBEEのマトリゲル内培養を行い、P4、IFNα及びP4+IFNα処理後にSERPINA14の遺伝子発現を解析した。【結果】1単層培養BEEと比較し、マトリゲル内培養下BEEにおいてSERPINA14及びGRPの遺伝子発現が有意に高い値を示した(P<0.05)。2全ての処理区において、マトリゲル三次元培養下BEEのSERPINA14遺伝子の発現に変化は認められなかった。3BEEと間質細胞の共培養では、無処理区と比較してP4+IFNα処理区においてSERPINA14遺伝子の発現が有意に上昇した(P<0.05)。以上の結果より、マトリゲル内培養下のBEEは腺上皮特異的因子の発現が高く、間質細胞との共培養により生体での生理作用を反映し得るモデルであることが示された。よって、BEEのマトリゲル内共培養は子宮腺の生体外モデルとして有用であることが示唆された。iriomotensis)も絶滅危惧種に指定されている。これらの種の保護・繁殖の取り組みは重要であるが、飼育下繁殖は難航しているのが現状である。そこで新たな人工繁殖の方法として体細胞クローン技術が期待されるが、絶滅危惧種においてはドナー細胞採取が非侵襲的に行われる必要がある。musculus)の作出が報告されている。センターにてイエネコの去勢・避妊手術の際に尿および糞を採取した。生細胞数はトリパンブルー染色により計測した。尿サンプルは運搬時の温度を4°Cまたは37°Cに設定し、運搬後の生存率を調べた。UDCは採取した尿を遠心分離して回収した。FDCについては、糞の凍結切片を作製してHE染色を行い、まず糞中に細胞が含まれている事を確認した。糞をPBS/PVA中で静かに攪拌した後、遠心分離を行い上清を除去した。沈殿からDNAを抽出し、イエネコDNAの特異的配列に対するプライマーを用いてPCRを行った。ネコ尿中に移行上皮細胞と扁平上皮細胞が確認でき、生細胞数の尿中平均濃度は移行上皮細胞が約337.8cells/ml、扁平上皮細胞が約6252.1cells/mlであった。輸送の温度条件は4°Cにおける生存率が43.2%であったのに対し、37°Cでは66.1%であり、37°Cの輸送における生存率が有意に高かった(p<0.05)。HE染色の結果、糞表面に細胞が存在することが確認された。糞由来のDNAにおけるPCRによってイエネコ特異的な配列が検出されたことから、本採取法で糞からFDCを採取出来る事が示唆された。トリパンブルー染色によって、遠心後の沈殿からFDCの生細胞が存在することが確認され、糞1gあたりから採取できる生細胞数は平均約329.4個であった。これらの結果から、ネコの尿および糞から生細胞を採取できることが示された。今後は密度勾配遠心分離による生細胞の分離法を検討する。実際にイエネコ卵子を用いて体細胞核移植を行い、これらの細胞がクローン作製のドナー細胞として使用できる可能性を検証する。Country:Japan【【目的】我々は第122・123回日本畜産学会において、P4がウシ子宮内膜間質細胞のIGF-1遺伝子発現を促進し、さらにIGF-1がβカテニン(CTNNB)の発現を増加させる事を報告した。IGF-1の上皮細胞に対する効果は未だ不明な点が多く残されている。発現に対する効果を調べた。【方法】IGF-1は100ng/mlの濃度で添加した。細胞増殖活性は培養3日後の細胞数を測定し対照区と比較した。CTNNBの発現とその上流因子であるGSK3βのリン酸化状態をウエスタンブロッティングにて調べた。黄体期で特異的に発現する遺伝子であるALDOA、TXN、SLC2A1およびBCL2の発現に対する効果をRT-qPCRによって調べた。【結果】BEEの増殖活性はIGF-1添加により有意に増加した。CTNNBの発現が有意に増加するとともに、GSK3βのリン酸化も促進された。SLC2A1およびBCL2の発現を促進した。発現を制御している可能性を示唆するものである。Country:Japan【目的】反芻動物の妊娠成立にはIFNtが妊娠認識物質として大きな役割を担っていることが報告されている。一方で、IFNtとは異なる他の胚性分泌因子が遺伝子機能を制御する可能性が示唆されている。本研究では、ウシ伸長期胚が産生する因子の同定とその受容体および下流因子の遺伝子発現制御について解析を行った。RNA-Seq解析の結果から、IFNt以外の胚性分泌因子としてマクロファージ遊走阻止因子(MIF)に着目した。MIF受容体の遺伝子発現と、その発現に対するI型IFNの効果を解析した。次に、MIFの下流因子として推定された遺伝子(ARG1、CCL2、IL7、IL23A)の発現に対するIFNおよびMIFの効果を解析した。(BEE)、単核球(PBMC)および多形核白血球(PMN)における発現が認められた。BEEおよびPMNにおいてIFNによりMIF受容体の遺伝子発現が上昇し(P<0.05)、下流因子のCCL2はIFN+MIFにより遺伝子発現が上昇した(P<0.05)。本研究において新たな胚性分泌因子としてMIFを特定した。MIF単独では遺伝子発現に対する効果が認められなかったことから、IFNtとの共作用により着床期に重要な機能を持つことが示唆された。Country:Japanイエネコ卵子は実験動物や家畜の卵子に比べて基礎的な生理学的特性に関する情報が非常に少ない。ネコ卵巣のドナーは年齢や生育環境が様々であり、卵巣ドナーとなるネコを選択することは難しい。そこで本研究では、ネコ卵子についての基礎的な情報を得る事を目的に、様々な要因が卵子の成熟培養に及ぼす影響、およびその後の単為発生の条件検討を行った。避妊手術の際に得られた卵巣を4°Cまたは35°Cで保存し実験室まで輸送した。達した卵子に電気刺激による単為発生処理を行い、電圧の強さと刺激回数が分割率に及ぼす影響について検証した。