単為発生処理では、200V×1回および50V×3回の条件で電気刺激を行う事で約70%の分割率が得られた。以上の結果はネコ卵子の基本的な生理的特性を明らかにするものであり、ネコクローン胚の効率的な作製に寄与するものである。Country:Japan【目的】伸長期胚の成長と生存には腺上皮細胞が産生する子宮セルピン(SERPINA14)の発現が重要である事が示唆されている。その発現制御機構や具体的な機能は未だ不明な点が多く残されている。本研究では、腺上皮様構造を再構築できるマトリゲル内培養を用いてウシ子宮内膜上皮(BEE)の培養系を確立し、SERPINA14の発現制御機構の解明を目的とする。【方法】ウシ子宮内膜のRNASeq解析よりSERPINA14の発現は着床期において有意に高い値を示した。この結果から、SERPINA14の発現はプロジェステロン(P4)およびインターフェロン・タウ(IFNτ)の制御下にあることが想定された。time-qPCRにて解析した。マトリゲル内培養の全ての実験区においてBEEは楕円形の腺様構造を形成した。SERPINA14遺伝子の発現はP4処理(P=0.91)およびIFNα処理(P=0.53)において対照区と比較し有意な差は認められなかった。子宮内膜の機能発現には間質細胞とBEEの相互作用が重要であると報告されていることから、BEEは間質細胞との共培養を行う必要が示唆された。Country:Japan【目的】βカテニン(CTNNB)は細胞間接着と遺伝子の転写活性に関与する細胞内タンパク質であり、子宮機能において重要な役割を担うと考えられている。ウシ子宮内膜における時期特異的な局在、およびその機能を制御する上流因子については未だ明らかでない。間質細胞で制御因子が産生されると想定し、培養ウシ子宮内膜間質細胞におけるCTNNBの上流因子候補(IGF1、WNT2、FZD1およびLRP6)の遺伝子発現をRT-qPCRにより解析した。リコンビナントIGF1をウシ子宮内膜上皮細胞に添加し、CTNNBのタンパク質量と細胞内局在をウェスタンブロッティングと免疫染色を用いてそれぞれ解析した。【結果】CTNNBは卵胞期では細胞膜および細胞質に局在していたが、黄体期と着床期では核内にも局在していた。この結果から、黄体期および着床期においてCTNNBが転写活性に関与する可能性が示唆された。上流因子の遺伝子発現解析では、P4添加によりIGF1遺伝子の発現のみが有意に上昇した(P<0.05)。リコンビナントIGF1を用いた解析結果も併せて報告する。Country:Japan【目的】着床や胎盤形成の際に生ずる子宮内膜の組織改変には、様々なプロテアーゼが関与している。カテプシン(CTS)はECMや細胞内のタンパクの分解に機能し、げっ歯類やヒツジにおいて着床前の子宮内膜で発現していることが報告されているが、その詳細は未だ明らかでない。A、B、G、KおよびLの遺伝子発現をRT-qPCRによって調べた。Country:Japan子宮内膜上皮細胞はその局在から腔上皮と腺上皮(GE)に分別され、それぞれが子宮機能に重要な役割を持つ。GEは妊娠および胚発生に重要な子宮乳を分泌することが報告されている。A2(FOXA2)がGE特異的に発現し、子宮腺の形成・機能に必要な因子であると考えられている。我々はウシFOXA2について、GE特異的に発現すること、また発情周期・着床期における発現動態を報告した。ウシFOXA2の上皮細胞における機能は不明である。その局在から腔上皮と腺上皮(GE)に分けることができ、それぞれが子宮機能に重要な役割を担っていることが報告されている。GEは妊娠の確立と維持を担う子宮分泌物の主要な産生組織であり、ウシでは胚の伸長と着床において重要な役割を果たすと考えられている。着床におけるGEの機能解析は、着床メカニズムの解析に必要であると考えられる。そこで本研究では、ウシ子宮内膜上皮細胞(BEE)のゲル内三次元培養を行い、GEの生体外モデルの確立を試みた。Country:Japan【目的】β-catenin(CTNNB1)はカドヘリンと複合体を形成して細胞接着に関与するとともに、核内へ移行して転写制御に関わることで、子宮機能に重要な役割を担うと考えられている。ウシ子宮内膜におけるCTNNB1の発現動態およびその制御については未だ明らかでない。mRNA発現を促進することを報告した。関与する増殖因子のひとつであり、子宮においてもいくつかのFGFの発現が報告されている。FGF受容体(FGFR)は4種類から構成され、子宮内膜上皮-間質の細胞間相互作用に関与していると考えられている。子宮におけるFGFの機能を解明する上でFGFRの解析が必須となるが、これまでにその発現に関する報告は少ない。そこで本研究では、子宮におけるFGFシグナル系列の解明を目的にFGFRの発現動態の解析を行った。それぞれにおけるFGFRの発現をRT-PCRにて解析した。次に子宮内膜で発現が確認されたFGFRについての解析を行った。qPCRにて解析を行った。間質細胞ではFGFR4の発現は認められなかった。これらの結果から子宮内膜の細胞間相互作用にはFGFR1,2,3が重要であり、FGFR4は筋層や血管内皮などで発現していることが示唆された。mRNAの発現は発情前期において有意に高い値を示し、その後の発情後期および初期妊娠期では発現が低下した。mRNAは着床前である妊娠3.5日に一過性の上昇を示し、以降は妊娠の進行とともに発現が減少した。mRNAは性周期および妊娠初期における発現の差は認められなかった。以上の結果からラット子宮では全てのFGFR遺伝子が発現しており、FGFR1およびR2のmRNAは性周期および初期妊娠期にその発現が変動することが明らかとなった。これらの結果は、子宮においてFGFRが時期特異的に発現して機能を有することを示唆するものである。Country:Japan胚の発生や着床は胚と子宮内膜の相互作用によって制御された子宮内膜環境が重要である。これまでに様々な動物種において胚性分泌因子が着床における子宮受容能獲得に機能している可能性が示唆されているが、その具体的な因子は未だ明らかにされていない。そこで本研究では、着床期の子宮内膜環境を制御する胚性分泌因子の探索を目的とし、妊娠18日目のウシ伸長期胚が分泌するサイトカインおよび成長因子の検索を行った。【方法】妊娠18日目のウシ伸長期胚を無血清培地で24時間培養し、回収した上清中のタンパク質をLC-MS/MSにより同定した。これら遺伝子の伸長期胚と子宮内膜組織における発現をRT-PCRにより解析した。【結果】LC-MS/MSによりウシ伸長期胚の培養上清から1091個のタンパク質が同定された。HDGF)が特定された。IFN-tau-c1)が特定された。これら因子の遺伝子発現をRT-PCRにより解析した結果、IFNTは従来の報告と同様に胚でのみ発現していたが、他の因子全てが胚と子宮内膜組織の両方で発現していることが示された。これらの結果から、今回同定された因子が着床期の胚または子宮内膜において機能を有する可能性が示唆された。Country:Japanウシ伸長期胚が産生する因子としてIFNTが母体の妊娠認識や着床過程に不可欠であることが報告されているが、他の因子の解析はほとんど行われていない。本研究では、着床期の子宮内膜機能を制御する因子の探索を目的として、伸長期胚が産生する因子の同定とその受容体の解析を行った。タンパク質をLC-MS/MSにより同定した。これらのタンパク質の中からサイトカインおよび成長因子に着目し、胚と子宮内膜における遺伝子発現をRT-PCRにより解析した。次に、ウシ子宮内膜のRNA-Seq解析結果からIPA解析により着床期子宮内膜で発現が上昇する遺伝子の上流因子の解析を行った。HDGF)が特定された。これらの因子は、IFNT以外の全ての因子の遺伝子が子宮内膜でも発現していた。加えてMIF(マクロファージ遊走阻止因子)が制御していると想定される遺伝子の発現が着床期子宮内膜で上昇した(P<0.05)。MIFの受容体であるCD74の遺伝子は胚では発現しておらず、着床期子宮内膜で発現が上昇した(P<0.05)。制御している可能性が示唆された。おけるウシ子宮内膜上皮細胞(BEE)の機能はプロジェステロン(P4)により制御されていると考えられている。一方で、BEEにおけるP4受容体の発現はP4自身によって抑制されており、P4によるBEE機能の制御機構は未だ不明な点が残されている。本研究では、P4がウシ子宮内膜間質細胞(BES)を介してBEEの機能を制御していると想定し、P4によるBEE機能制御機構の解明を目的にBESにおけるP4誘導性因子の探索を行った。【方法】ウシ子宮内膜RNA-seq解析の結果から黄体期で発現が上昇している因子に着目し、GO解析により細胞間コミュニケーションを担う可能性のあるサイトカインおよび成長因子を探索した。これらの因子について、培養BEEおよびBESにおける発現をRT-PCRにより解析した。PGF)が同定された。BEEとBESの両方でそれぞれ遺伝子が発現していた。遺伝子発現に対するP4の影響についても併せて報告する。Country:Japan【目的】着床期ウシ子宮内膜における組織改変にはMMPsが関与することが示唆されている。我々は第117回大会にて、MMPsが子宮内膜組織中に蓄積され、I型IFNによって組織からの放出が促進される事を報告したが、その制御機構の詳細は未だ不明である。MMPsは組織中のグリコサミノグリカン(GAG)に結合して蓄積されることが報告されている。分解酵素の探索を行った。ヘテロスフェロイドにおける遺伝子発現をRT-qPCRにて解析した。GAG分解酵素であるヘパリチナーゼを用い、MMPの放出に対するGAG分解酵素の影響を解析した。【結果】RNA-Seq解析によりスルファターゼであるGALNSが着床期で有意に上昇し、IFNαによりヘテロスフェロイドと間質細胞において遺伝子発現が促進された。ヘテロスフェロイドのMMP放出に対するヘパリチナーゼの影響では、IFNα添加時と同様に培養上清中にMMPsが放出された。これらの結果から、組織中のGAGに蓄積されたMMPsはI型IFNにより発現が誘導されるGALNSによって放出され活性化し、着床期ウシ子宮内膜における組織改変を引き起こすことが示唆された。Country:Japan【目的】着床期ウシ子宮内膜における組織改変にMMPsが関与していることが示唆されているが、その制御機構については未だ解明されていない。本研究では、MMPsの制御メカニズムに対するI型インターフェロン(IFN)の影響を調べるため、三次元培養塊であるウシ子宮内膜ヘテロスフェロイドを用いた解析を行った。スフェロイドをゼラチンザイモグラフィーにて解析し、MMP2およびMMP9の発現を無添加の対照区とそれぞれ比較した。数種類のプロテアーゼ阻害剤を用いて、MMPs放出に関与する因子をスクリーニングした。【結果】IFNτを含有すると考えられる伸長期胚の上清添加によりMMP発現が増加した。IFNα添加により同様の結果が得られたことから、I型IFNが着床期におけるMMPの制御を行っていることが示唆された。セリンプロテアーゼ阻害剤により、これらMMPsの発現が抑制された。これらの結果から、着床期ウシ子宮内膜における組織改変にMMP2およびMMP9が関与し、I型IFNがセリンプロテアーゼを介して子宮内膜組織内部のMMPs動態を制御していることが示唆された。Country:Japan【目的】ウシ子宮内膜上皮細胞(BEE)はエストロジェン(E2)の直接的な影響下にあることが知られているが、プロジェステロン(P4)濃度が高い黄体期や妊娠期においても子宮機能に重要な役割を持っている。(BES)で産生された分泌性因子によって間接的に制御されることが考えられる。おいて、P4がBESにおけるFGF9の発現を誘導することを報告した。そこで本研究では、BEEに対するFGF9の影響を明らかにするために、その遺伝子発現について解析を行った。【方法】血中P4濃度が低い卵胞期と、高い黄体期および着床期のウシ子宮小丘からmRNAを抽出し、定量RT-PCR法を用いて各時期におけるFGF9下流候補因子の遺伝子発現を比較した。FGF9を添加し、候補因子の遺伝子発現を同様に解析した。【結果】卵胞期と比較し、黄体期および着床期ではFGF9下流候補因子であるTIMP2、ITGB5およびLGMNの遺伝子発現が有意に高かった(P<0.05)。培養系におけるBEEに対するFGF9の影響についての解析結果も併せて報告する。Indonesia2013.11G30推進事務局G30推進事務局が主催した米国サンフランシスコ及びバークレーでの日本留学説明会に参加し、セッション参加やブース対応等を行った。