特任准教授らの研究グループは、多くの生物種で利用可能なDNA染色蛍光色素(Kakshine、カクンシャイン)を開発しました。DNAは生物の体の設計図と言われ、子孫に受け継がれる遺伝情報の本体です。DNAを蛍光検出する試薬は電気泳動、PCRなど日常的な分子生物学的技術として使用されるほか、細胞周期における染色体動態や細胞小器官の複製などの、ライブイメージング解析においても欠かせない技術になっています。DNA染色蛍光色素に求められる性質として、1「高いDNA選択性があること」、2「光毒性の少ない可視光を利用できること」、3「適用できる生物種が広いこと」などが挙られます。これまでこれらの性質すべてを満たす色素はありませんでした。様々な研究への応用や先端顕微鏡技術の普及への貢献が期待できます。Communications」に掲載されました。支援のもと行われました。【ポイント】Kakshine(カクシャイン)は従来のDNA染色蛍光色素よりも高いDNA選択性をもつことを示した。nm)の幅広い波長で使用できるKakshine(カクシャイン)シリーズの合成に成功した。Kakshine(カクシャイン)は、複数種の動物培養細胞や植物細胞の核内のDNA(核-DNA)、ミトコンドリアDNA(mt-DNA)、葉緑体DNA(chl-DNA)を生きたまま染色できることを示した。核-DNA、mt-DNA、chl-DNAは濃度により染め分けが可能であることを示した。よる深部イメージング、STED顕微鏡注2)による超解像イメージングに適用可能であることを示した。acid)は、生物の遺伝情報の担い手であり、高感度にDNAを検出するDNA蛍光検出試薬は、生命科学研究を支える必須な分子ツールになっています。用いたDNAの動態解析が注目されています。DNA染色に使われてきた従来の蛍光色素には、高いDNA選択性を有するものの光毒性を生じる紫外線を必要とする分子や、可視光で検出可能なもののDNA選択性に乏しい分子などに頼らざるを得ないという課題がありました。研究グループは、これらの課題を一挙に解決する分子を開発するため、従来のDNAを染色する分子の構造を見直しました。その過程で博士後期の大学院生(当時)であった宇野何岸研究員は、DNAを染色する分子としては報告されていなかったピリドシアニン注3)骨格に着目し、改良を重ねました。DNAを染色できる様々な誘導体の合成に成功しました(図1)。研究グループは、これらのピリドシアニン骨格をもつ対称性シアニン色素誘導体による蛍光色素を、核を輝かせる色素としてKakshine(カクシャイン)と名付けました。nm)に吸収をもつ様々な化合物を得た。これらすべての化合物が二本鎖DNAと結合し蛍光を増大させることを示した。1)は、二本鎖DNAのアデニン(A)とチミン(T)の配列領域に特異的に結合して大きく蛍光を増大する性質があり、汎用的に使用されるDNA染色色素として知られるHoechstやPico-Greenよりも、高いDNA選択性をもつことを明らかにしました(図2)。細胞内には多くのRNAが存在するため、RNAに対して大きなDNA選択性をもつことはDNA染色色素の性質としてとても重要な要素であるため、本色素の有用性を示しています。(PC1)はAT配列をもつヘアピンオリゴのみ濃度依存的に蛍光が増大することがわかった。DNA蛍光検出試薬のDNA滴下時の蛍光増大率をRNA滴下時の蛍光増大率で割ったDNA/RNA選択性を示す。次に研究グループは、Kakshine(カクシャイン)が複数種類の動物培養細胞だけでなく、植物の葉、根の細胞の核-DNAを生きたまま染色できることを示しました(図3)。用いることによって最も深部にある細胞にまでKakshine(カクシャイン)が浸透し、核の染色に成功していることを示しました。Kakshine(カクシャイン)を用いた核-DNAのライブイメージングKakshine(カクシャイン)(PC1)は、ヒト、マウス、ラットの培養細胞の他、植物細胞にも浸透し、核を染色することを示した。シロイヌナズナの根の細胞を二光子励起顕微鏡で撮影したものです。組織深部の細胞まで核が染色されていることがわかった。続いて研究グループは、Kakshine(カクシャイン)の濃度により核-DNAとオルガネラDNAを染め分け可能であることを示しました。pM)ではミトコンドリアDNA(mt-DNA)を特異的に染色できることを示しました(図4a)。4)により核-DNAとmt-DNAを区別して可視化することにも成功しました(図4b)。植物細胞においては、核-DNA、mt-DNAに加えて、葉緑体DNA(chl-DNA)の染色も可能であり、蛍光寿命イメージングにより植物細胞に存在する3種類のすべてのDNAを1つの色素で分離し、可視化することに成功しました(図4c)。nM)では、両方のDNAを染色した。核内DNAとmt-DNAの両方が染色される濃度では、蛍光寿命顕微鏡を用いることにより蛍光波長や蛍光輝度の違いでは分離できない2種のDNAを分離できることを示した。chl-DNA)を1つの色素で分離して可視化することに成功した。研究グループは、光の回折限界注5)を超える解像度を持つ超解像STEDイメージングが適用可能なKakshine(カクシャイン)誘導体を見出すことに成功しました。Kakshine(カクシャイン)とSTED顕微鏡を組み合わせた結果、通常の共焦点顕微鏡では分離できない細かな核-DNA構造や、ミトコンドリア核様体注6)構造を明瞭に可視化できることがわかりました(図5)。nmであることを示しました。ミトコンドリア核様体の超解像STEDライブイメージングは、従来のDNA染色色素では達成できておらず、Kakshine(カクシャイン)の有用性を強く示すものです。Kakshine(カクシャイン)を用いた超解像STEDライブイメージングKakshine(PC3)を用いて超解像STED顕微鏡にて撮影することにより、通常の共焦点顕微鏡像では分離できない核内DNAの微細構造やミトコンドリア核様体構造の可視化に成功した。Iの短所を補い長所を兼ね備えた蛍光色素と言えます。DNAの検出に紫外線を必要としない高いDNA選択性を有する色素です。複数種類の動物細胞や植物の根、葉の組織にも浸透し生きたまま細胞内のDNAを染色できるため、多くの生物での利用が期待されます。用いた深部イメージングや、STED顕微鏡を用いた超解像イメージングにも適合し、蛍光寿命顕微鏡を用いれば1つの色素で核-DNA、mt-DNA、chl-DNAを区別することも可能です。おいて、DNAを扱う研究は、ライブイメージング以外にも電気泳動、定量PCR、フローサイトメーターなど広範囲に行われています。1つの蛍光分子が2つの光子を同時吸収して励起されて発する蛍光を検出する。通常の蛍光観察で使用する波長の約2倍程度長い近赤外領域の波長を使用するため、生体深部イメージングに用いられている。depletion)を利用した超解像顕微鏡法の1つ。Radiation)の光増幅にも応用されている。注3)ピリドシアニン:共役二重結合で結ばれたメチン鎖の両末端に窒素を含む複素環をもつシアニン化合物の一つ。メチン鎖の長さによって吸収波長および蛍光波長が異なることが知られている。注4)蛍光寿命顕微鏡:蛍光分子が光により励起されてから、蛍光を発してもとの状態に戻るまでの平均時間を検出されるまでの時間を計測しマッピングする方法。蛍光波長の強度による解析の欠点を補うイメージング手法として注目されている。注5)光の回折限界:光は波としての性質をもち、回折現象が見られる。顕微鏡などの光学系において光の回折現象が原因となる分解能の理論的な限界を「回折限界」と言う。