ビーズを完全に再中断するために数回穏やかにピペットで混ぜます。°Cでロッカーに連続的な揺れで1時間すべてのチューブをインキュベートします。RIP反応を遠心分離して、キャップとチューブの側面から液滴をスピンダウンします。チューブを磁気セパレータに1分間置きます。mLマイクロ遠心分離チューブに移します。それは、バックグラウンドノイズを増加させるので、ビーズを吸引しないように注意してください。μL添加し、4°Cで1hインキュベートし、磁気分離後に溶出液を回収することにより、溶出工程(7.3.3~7.3.6)を繰り返します。同じサンプルからすべての溶出液を組み合わせます(溶出量は200μLでなければなりません)。溶出したRNAとフロースルー(オプション、ステップ7.2.5から)をエタノール沈殿またはカラムベースの選択方法(すなわち、RNAクリーンおよびコンセントレータ)によって精製する。高感度検出キットを使用して、フラグメントアナライザを使用して、RNA量とフロースルーおよび溶出したサンプルの品質を評価します。RNAの品質が満足のいく場合は、ライブラリ調製およびハイスループットシーケンシング(ステップ9)に進みます。量は非常に少なく、定量化を確実にするためには高感度検出キットが必要です。バイオアナライザーが利用できない場合は、ライブラリの準備に盲目的に進むことができます。ngに添加することを推奨します。この制御は、バイサルファイト変換の効率を評価するのに役立ちます。ngのmRNAに対するポリA枯渇RNAの500pg)。rRNAを含む必要があります。注:総RNAは、ポリA枯渇RNAの代わりに正のコントロールとして使用することもできます。EZ)でバイサルファイト変換を行います。mL)を12mLのRNA洗浄バッファー濃縮物に加えます。バイサルフィット変換注:バイサルファイト変換は、下記の製造者の手順に従って市販のRNAバイサルファイト変換キットで行った。ngの間)を加えます。pg(ステップ8.1.2)。μLのボリュームを完成させます。サンプルを上下にピペットで混ぜます。チューブのキャップまたは側面に液滴がないことを確認するために、短時間回転します。°Cで45分間の変換。合計3サイクルの変性と変換ステップを繰り返します。4°Cで無期限に保持します。注:変性と亜硫酸水素変換の3サイクルは、サンプルの完全な亜硫酸水素変換を保証します。°Cで保存することも、直接処理することもできます。列内の逆行を続行します。結合バッファーをカラムに追加します。μL)をRNA結合バッファーを含むカラムにロードし、上下にピペットを入れて混ぜます。キャップを閉じ、列を数回反転してすぐに混ぜます。フロースルーを破棄します。カラムに200μLのRNAウォッシュバッファーを加え、遠心分離機を30秒のフルスピードで追加します。カラムに200μLのRNAデスルフォネーションバッファーを加え、室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、遠心分離機は30sの全速速度で。フロースルーを破棄します。フルスピードで追加します。μLのRNA洗浄バッファーで洗浄ステップを繰り返します。フロースルーを破棄します。空にしたコレクションチューブの柱を全速速度で2分間遠心分離します。カラムをRNaseフリーチューブに移します。DNase/RNaseフリー水≥10μLをカラムマトリックスに直接加え、室温で1分間インキュベートします。sのための全速力で遠心分離機。μLのボリュームで溶出します。溶出したRNAは、すぐに使用するか、または-20°Cで最大3ヶ月間保存することができます。長期保存の場合は、-80°Cに保ちます。μLを取り出し、ライブラリの調製およびハイスループットシーケンシングに進みます(ステップ9)。μLを取ります(ステップ8.3)。この手順により、シーケンス処理に進む前にバイサルフィット変換が成功したことを確認します。28SリボソームRNAは、RNAメチル化分析のための陽性対照として使用され、位置4447におけるC残基(GenBank加盟#NR_003287)が100%メチル化されていると説明されている。大容量cDNA逆転写キットを使用して、逆転写(RT)反応ミックスを準備します。氷の上にキットコンポーネントを解凍し、次のように氷の上にRTマスターミックスを準備します。μLの最終体積が含まれている必要があります。次のRTプログラムとサーマルサイクラーにチューブを入れて:10分間25°C。