調製した試薬をウェルに加える。μLの6x試薬を追加します。μLの6x試薬を追加します。マイクロプレートボルテックスミキサーで短時間混合した後、37°Cのインキュベーターでプレートを30分間インキュベートします。目的の測定エンドポイント(すなわち、処理後6時間または24時間、ステップ1.2.3)で、蛍光を読み取ることができる機器(380-400nmEx/505nmEm)で蛍光を96または384ウェルフォーマットで測定します。μLのLgBiTタンパク質を添加して、2x溶解検出試薬を調製します。ピペッティングエラー(ウェル数+10%など)を考慮して、アッセイするウェル数に対して十分な2倍の検出試薬を準備します。調製した溶解検出試薬をウェルに加える。μLの2x溶解検出試薬を追加します。μLの2x溶解検出試薬を追加します。プレートをマイクロプレートボルテックスミキサーで10〜20分間混合します。96ウェルまたは384ウェルプレートの発光を読み取ることができるルミネッセンスメーターでルミネセンスを測定します。分解と細胞生存率の定量化測定された時点でのDMSOコントロールからの相対光単位(RLU)を平均します。この値をターゲットのベースラインタンパク質レベルとして使用して、この同じ時点でテストされた他のすべての処理をこの値に正規化することにより、フラクショナル分解を計算します。0.5と計算されます(式1)。フラクショナルRLUからの劣化率を決定します。特定の時点でのフラクショナルRLUまたは%分解をプロットして、化合物の活性をランク付けします。オプションで、すべての処理の値をDMSOコントロールと比較することにより、細胞生存率アッセイ測定のための相対蛍光ユニット(RFU)データを分析します。DMSO対照と比較していずれかの処理でRFUの有意な低下が観察された場合、分解データを細胞生存率アッセイデータにさらに正規化して、細胞生存率の損失に対するタンパク質レベルの変化を決定することができます。注:キネティックスクリーニングおよび分解を行う能力には、細胞内でのLgBiTタンパク質の共発現が必要であり、これは以前に説明されています18、19、63。CRISPR挿入を行うことによって達成できます。接着細胞株のプレーティング。吸引によって細胞フラスコから培地を取り除き、DPBSで細胞を洗浄し、0.05%トリプシン-EDTAで細胞を解離し、細胞をフラスコ底部から解離させます。浮遊細胞株については、セクション2.2に進んでください。使用してトリプシンを中和し、混合して細胞を回収して再懸濁し、細胞懸濁液を円錐管に移します。5分間スピンダウンします。細胞培養培地を廃棄し、等量の新鮮な細胞培養培地に再懸濁します。実験条件および対照条件ごとに最低限の三重ウェルでアッセイプレートに細胞をプレート化します。μL(20,000細胞)を分注します。μL(8,000細胞)を分注します。一晩、または成長に最適な条件でインキュベートします。105細胞/mLに調整します。細胞をアッセイプレートにプレート化し、実験条件および対照条件ごとに最低3ウェルにします。μL(20,000細胞)を分注します。注:シグナル対バックグラウンド(S:B)発光が低い懸濁細胞株の場合、例えば、クローンではなくCRISPRプールを使用する場合、播種する細胞数を96ウェルフォーマットで最大100,000細胞/ウェル、384ウェルフォーマットで40,000細胞/ウェルに増やすことで発光を増加させることができます。CRISPR細胞を用いた速度論的分解アッセイ2.2.のめっき工程で含まれていたエンデュラジンを既に含有している懸濁細胞については、直接工程2.3.3に進みます。接着細胞株のために、ナノグロエンデュラジン溶液を調製する。96ウェルフォーマットの場合、ストック試薬を1:100に希釈して、10Sを添加したCO2非依存性培地にエンデュラジンの1x溶液を調製します。384ウェルフォーマットの場合、ストック試薬を1:50に希釈して、10Sを添加したCO2非依存性培地にエンデュラジンの2x溶液を調製します。エンデュラジン溶液を接着細胞の各ウェルに加える。μLの1xエンデュラジン溶液を加えます。μLの細胞に加えます。独立培地の50:50混合物で行われるため、培地を吸引しないでください。インキュベーター内で2.5時間インキュベートして、発光を平衡化させます。有効性が不明な化合物の場合、最高点での最終濃度1〜10μMが出発点として推奨されます。0〜48時間の間、37°Cに事前平衡化されたルミノメーターで発光の速度論的測定値を収集します。測定の時間増分は実験ごとにカスタマイズできますが、推奨される初期実験は、24時間または希望の時間で5〜15分ごとに発光測定することです。オプションの細胞生存率同ウェルマルチプレックス分析注:このアッセイは、市販のCellTiter-Glo(CTG)キットを使用して実行されます(材料の表を参照)。CTG試薬を室温に平衡化します。rpmのプレートシェーカー(96ウェルプレート)またはマイクロプレートボルテックスミキサー(384ウェルプレート)で5分間混合します。プレートを室温で30分間インキュベートして、細胞溶解とHiBiTシグナルの消光を可能にします。ルミノメーターで全発光を測定するには、メーカーの推奨に従ってください。速度論的劣化プロファイルの定量化収集されたキネティックルミネッセンス測定値を使用して、各PROTAC濃度の生のRLUを、各時点での反復平均DMSO条件に正規化して、時間の経過に伴う遊離フリマジン濃度の変化を説明します。式1を使用して分数RLUを計算します。劣化曲線から、式2を使用した単一成分指数減衰モデルを、各曲線の初期劣化部分まで、データがプラトーに達する点まで適合させます。注:劣化が観察される前に短い遅れがある可能性があるため、最初のいくつかのデータポイントを適合から除外すると便利な場合があります。式2から、分解速度定数を表すパラメータƛと、残っているタンパク質の最小量を表すプラトーを決定します。分解タンパク質の最大分画量であるDmaxを計算し、1-プラトーとして計算されます。PROTACの各濃度についてDmaxをプロットし、時間に依存しない分解効力曲線を決定した。値を決定し、化合物の有効性を分析します。特定の時点でDC50を決定するには、選択した時間における各濃度の計算された劣化率をプロットします。