80°Cで2分間インキュベートします。チューブをマグネットに置き、ポリARNAを含む上清を新しいRNaseフリーチューブに素早く移します。チューブを氷の上に置きます。溶出ステップ(ステップ3.3.8~3.3.10)を繰り返して歩留まりを増やします。慎重に4〜5回ピペットで混ぜます。磁石の上に1分間置き、洗浄バッファーを捨てます。今のところ、RNA溶出物を別々のチューブに入れておいてください。相当する上清を新しいチューブに残します。手順の最後に、エタノール沈殿またはカラムベースの選択方法(すなわち、RNAクリーンおよび濃縮器)によってRNAを精製し、濃縮する。このサンプルは、ポリAが枯渇したRNAサンプルに対応し、バイサルファイト変換の制御として使用できます(ステップ8.2.2)。μLアリコートを保持して、フラグメントアナライザでRNAの品質をさらに評価します。RNAは必要になるまで-80°Cで保存することができます。細胞ポリARNA(mRNA)とウイルスRNAサンプルを2つのアリコートに分割し、それぞれのエピトランストランスクリプト分析パイプライン専用にします。BS-Seq用の細胞mRNAまたは500ngのウイルスRNAの1μg(ステップ8および9に進む)。サンプル用に使用されます。ntの範囲のフラグメントを取得するために慎重に最適化する必要がある非常に重要なステップです。PCRチューブに分割します。注:迅速に作業してください。再現性のある結果を得るために、一度に8つ以上のサンプルで作業しないでください。ボリュームをスケールアップしても、再現性と均一な断片化は保証されません。サーモサイクラーを70°Cで温めます。各PCRチューブの縁に2μLの断片化試薬を加えます。チューブを閉じてスピンダウンします(試薬が8本のチューブに対して同時にRNAと接触するようにします)。予熱サーモサイクラーで70°Cでサンプルを15分間インキュベートします。インキュベーションが終わるとすぐに、各チューブに2μLのStop溶液を素早く加えます。スピンダウンし、次のステップに進む準備ができるまで氷の上に座らせてください。注:インキュベーション時間は、処理するサンプルの数によって異なる場合がありますが、RNAの分解を避けるために1時間を超えないようにしてください。チューブを一緒にプールし、RNAクリーンおよびコンセントレータキット(ステップ6)またはカスタマイズされたカラムベースキットでRNA精製に進み、バッファーを取り除き、水中のきれいな断片化したRNAを回収します。注:このステップは、エタノール沈殿またはカラムベースのRNA精製および濃縮方法(すなわち、RNAクリーンおよび濃縮器)の任意の種類で行うことができます。精製したRNAをDNase/RNaseフリー水の総体積50~75μLで溶出または再中断します。ラウンドの溶出を強くお勧めします。分光光度計で精製した断片化したmRNAを定量化し、フラグメント分析装置でRNAの品質を評価します。μg)はMeRIPに使用できます(ステップ7.2に進みます)。注:各免疫沈降(IP)に、特定の抗m6A抗体(試験条件)を使用するか、または抗IgG抗体(陰性対照)を使用して、フラグメント化mRNAの最小値が必要です。IPバッファーを調製します。注:少なくとも2つの反応が必要です(1つのテストと1つのIgGコントロール)。チューブを氷の上に置きます。mLマイクロ遠心分離管にラベルを付けます。抗m6A抗体のnチューブ(試験)。通常マウスIgGのためのnチューブ(陰性制御)。反転とボルテックスにより磁気ビーズ(マグナChIPプロテインA/Gなど)を再懸濁します。ビーズの塊は表示されません。磁気ビーズをマイクロ遠心チューブに移します。IPバッファ(ステップ7.1.1から)を10倍追加します。ビーズを数回上下に軽くピペットして混ぜ、完全な再懸濁液を取り付けます。チューブを磁気分離器に1分間置きます。上清を取り出して捨て、磁気ビーズを吸引しないようにします。マグネットからチューブを取り外します。洗浄手順を繰り返します(ステップ7.1.6~7.1.9)。μLでビーズを再中断します。μg/μL)を加える。回転ホイールに室温で30分間インキュベートし、抗体を磁気ビーズと共役にします。チューブを磁気分離器に1分間置きます。