セルラーインターフェース用の有機電変調電変調トランジスタ(OCMFET)ベースのデバイスの製造プロトコルを紹介する。電気的および代謝的活動のモニタリングを可能にします。Abstract現代の電気生理学は、ますます高度化するツールと材料の並行開発によって常に促進されてきました。この分野での発見は、過去50年間の印象的な成果を最終的に決定した前後のプロセスで技術の進歩を推進してきました。存在など、いくつかの制限を依然として有しています。これらの課題を部分的に克服するために、有機バイオエレクトロニクスと呼ばれる新しい科学分野が発展し、低コスト、より便利な材料、革新的な製造技術などの利点をもたらしました。細胞培養との間に便利にインターフェースするために、過去10年間にいくつかの興味深い新しい有機デバイスが提案されています。本論文では、有機電変調された電界効果トランジスタ(OCMFET)に基づく細胞インターフェース用デバイスの製造プロトコルを紹介する。マイクロOCMFETアレイ(MOA)と呼ばれるこれらのデバイスは、有機エレクトロニクスの利点とOCMFETの独特の特徴を組み合わせて、体心筋細胞およびニューロンの電気的および代謝活動を体質で監視することができる透明で柔軟で参照のないツールを準備し、電気細胞モデルのマルチパラメトリック評価を可能にします。基礎研究アプリケーションにおいて有効かつ強力なアプローチを表しています。このような研究のために通常使用されるツールは、主にマイクロ電極アレイ(MEA)1,2,3,4,5に基づいており、ますます効率的で強力な電界効果デバイス(FET)6,7,7,8,9,10,11,12.これらの2つのデバイスファミリーは、ニューロンと心筋細胞の電気活動のリアルタイムモニタリングと刺激を可能にし、通常は堅牢性、使いやすさ、信頼性によって特徴付けられる。これらの特徴はMEAおよびFEDを電気生理学的適用のための金本位にし、標準的な細胞培養物、オルガノピックの脳スライスおよび三次元オルガノイド13、14、15、16とのインターフェイスに現在使用されている。MEAやFEDは、その幅広い使用と印象的な特徴にもかかわらず、高コスト、材料の剛性、および通常はかさばる参照電極の存在など、いくつかの制限を提示し、測定液環境に配置する必要があり、デバイスの適切な動作に必要です。細胞インターフェースの代替ソリューションを探求するために、有機材料と革新的な製造技術に基づく電子機器の研究に過去10年間で多くの努力が投資されてきました。前述の制限に対処するために研究されたいくつかの有機デバイスの中で、OCMFETと呼ばれる特異な有機トランジスタが最近MEAおよびFEDs18に代わる有効な代替手段として提案されている。有機エレクトロニクス技術が提供する標準機能に加えて、OCMFETは外部参照電極を必要とせずに超高電荷感度(二重ゲート構造による)を提供します。この有機センサは、トランジスタ領域19,20から分離されたセンシング領域の特定の機能化に応じて、異なる検体/物理的パラメータを検出する顕著な能力を有する。これらの機能はすべて、細胞培養内のさまざまなパラメータを取得するために便利に利用できます。神経/心臓の電気的活性を検出できることに加えて、細胞代謝活性に起因するわずかな局所pH変動を確実にモニタリングする単純な物理的機能化21を用いてOCMFETの超高pH感受性を利用することもできる。インビトロ細胞バイオセンシングにおいて、細胞代謝活性のモニタリングは、培養の状態の強力な指標であり、薬物投与および電気刺激などの様々な刺激に対する細胞応答を評価するために使用することができる22,23。神経用途の特定の場合には、特に薬理学および毒物学24において、電気的および代謝活動の両方をモニタリングすることは大きな関心事である。OCMFETの利点を提供しながら、現代の体外電気生理学の要件に便利に対処することを意図して、マイクロOCMFETアレイ(MOA)と呼ばれるデバイスが最近導入されました。マルチパラメトリック分析を可能にします。2つのMOAチャネルは、その感度を最大化するためにより大きなセンシング領域を有し、培養培地のpH変動などの関心のある特定のパラメータを監視するために選択的に機能化することができる。構造内の他のOCMFETは、細胞外の電気活動センサーとして機能する。図1は、16チャンネルMOAの構造を示しています。この機能は、外部参照電極の存在と組み合わせることで、MOAをインビトロアプリケーションにとって非常に興味深いツールにします。この研究は、ニューロンおよび心筋細胞の電気および代謝活動のインビトロ検出のための多感性MOAの段階的な製造プロトコルを提示する。図2は、主な製造手順、使用する材料、およびデバイス構造を示しています。Protocol動物のケアと使用に関するすべての適用対象の国際、国家、および/または制度的ガイドラインに従った。プロジェクトのための動物の数を減らし、彼らの苦しみを最小限に抑えるために、すべての努力がなされました。mMの濃度でNaOHペレットを脱イオン水に希釈して、開発液を調製します。注:これは発熱反応です。プラスチック容器を使用する場合は、すべてのペレットが完全に溶解するまで、容器を攪拌し続けます。脱イオン水(濃縮48%HFの1部、49部脱イオン水)にフッ化水素酸(HF)を希釈してチタンエッチング液を調製します。注意:フッ化水素酸は皮膚に容易に浸透し、深部組織層に深刻な損傷を引き起こす可能性があります。HFの急速な中和は、数日続き、重度の傷害またはさらには死亡をもたらす可能性のある組織破壊を防ぐために必要である。HFに関連するリスクは、酸との接触の濃度および期間に依存する。顔の盾を使用して、ヒュームフードの下でのみ使用してください。ダブルグローブも強くお勧めします。ヨウ素、ヨウ化カリウム、および脱イオン水を混合して金エッチング液を調製(溶液250gの場合、200mLの脱イオン水、20gのKI、I2の5gを使用する)。室温で溶液を1時間撹拌し、使用前に一晩休ませます。6,13-ビス(トリイソプロピルシリレチルニル)ペンタセン(TIPSペンタセン)をアニソール(重量1%)に溶解し、80°Cのホットプレートで2時間軽く攪拌して半導体溶液を調製します。注:このソリューションを攪拌し続けます。アンバーガラスバイアルを使用し、低照度条件で保管してください。ベクトルグラフィックスソフトウェアで、希望のフォトリソグラフィマスクセットを準備します。ためのビアおよび感知区域の開口のためのマスク;自己整列プロセスのマスク。ソース、ドレインとコントロールゲートトップコンタクトのパターニングのためのマスク。pHチャネルのプラズマ活性化のためのマスク。メモ:必要な解像度と特定のフォトリソグラフィックの設定に応じて、異なる種類のマスクを使用することができます。μm)の場合、シンプルなプラスチック製のフレキシブルマスクは、地元のコピーショップで購入されています。注:最終的なデバイスよりもわずかに大きな基板から始めて、損傷を与えることなく標準のラボピンセットで操作できる十分な幅の広いマージンを持っています。深い溝や傷の存在を除外するために光学顕微鏡で基板を検査します。大きな欠陥が最終的なデバイスの故障につながる可能性があるため、傷の少ない基板を慎重に選択してください。PET基質をアセトン、イソプロピルアルコール、脱イオン水(この順序)でリンスし、窒素の流れを用いて乾燥させます。きれいなプラスチックペトリ皿/容器に基材を保管してください。プラズマ酸素(100Wで30s)で基板を事前に洗浄し、熱エバポレータの真空チャンバー内の基板ホルダーに置きます。トルより低い真空レベルに達するまでポンプで送ります。シャッターを開け、パワーを60%に上げ(またはるつぼが明るい白色になるまで)、60s待ちます。シャッターを閉め、電源を下げろ。蒸発器から基板を取り外します。アセトン、イソプロピルアルコール、脱イオン水を使用してそれらをきれいにしてください。窒素の流れを使用してそれらを乾燥させます。チタン表面を僅かに酸化する第2酸素プラズマ処理(200Wで60s)を行う。ヒュームフードの内側に置かれたスピンコーターに一度に1つの基板を置きます。ホットプレート(70°Cで5分間)に基板を置いてフォトレジストをソフトベークする。光の露出を避けるために、アルミホイル包装ペトリ皿/プラスチック容器の中に基板を保管してください。注:基板の変形を防ぐため、推奨されるベーク温度(50sの場合は100°C)を避けてください。長い時間のために低い温度で焼くことは良い結果を保障する。デバイスをブロモグラフに配置し、プラスチック製のフォトリソグラフィマスクを目的のFGレイアウトで基板上に配置します。上から紫外線(UV)光を1分間照射し、マスクを慎重に取り外し、マスクを被傷を避けるため、マスクを基板上に横移動しないように注意してください。現像液を充填したガラス容器に5s用の基板を突き落とす(ステップ1.1)。脱イオン水で素早くすすいで、窒素の下で乾燥させます。光学顕微鏡を使用して、基板内の未発達/未発達のスポットを探します。開発中の場合には、開発ソリューションで基板の浸漬を繰り返します。露出したチタンをチタンエッチング液に15sの液中に沈め(ステップ1.2)し、脱イオン水ですすいで、窒素を用いて乾燥させる。基板を光学的に検査し、アセトンを用いてフォトレジストを取り外す。イソプロピルアルコールと脱イオン水で基板をリンスし、窒素で乾燥させます。塗布室壁に2mLの接着促進剤(シラン-3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート)を実験室ワイプで分配して、パリレンコーターの堆積チャンバーを準備します。パリレンコーターに300mgのパリレンCダイマー(最終厚さ150nmに相当)を置きます。堆積後、アセトン、イソプロピルアルコール、脱イオン水で基材を洗浄し、窒素で乾燥させます。ステップ4.1および4.2の同じパラメータを使用して、基板上にフォトレジストを堆積させる。図2のFGの背面接触と呼ばれる)の上に配置して、精密な位置合わせを改善します。上から1分間紫外線に当て、マスクを慎重に取り外し、マスクを被傷を避けるために、マスクの基板上の横移動を最小限に抑えるように注意してください。背面接触として示されています)は、トランジスタの特性評価中の接触に必要です。FGへの電気的アクセスを有することは、機能化の異なるタイプ(例えば、電着)のために非常に有用であり得る。前述したようにフォトレジストを開発します。パターン化されたフォトレジスト(ここではマスクとして機能する)を用いて基板を酸素プラズマ(200Wで180s)に露出し、感知領域からパリレンCを除去する。Wの等方性プラズマクリーナーにおけるパリレンCのエッチング速度は約90nm/分です。センシング領域をさらに洗浄するために、わずかなオーバーエッチングが行われます。フォトレジストは、プロセス中にエッチングされます。μm)は、パリレンCのそれよりもはるかに高い。基板を超音波浴の中にアセトンを充填したガラス容器に入れ、10sでフォトレジストを完全に除去します。基質をアセトン、イソプロピルアルコール、水でリンスし、窒素で乾燥させます。注:単にアセトンで基板をすすくう代わりに超音波処理を使用することは、感知領域の表面にパリレンC断片の望ましくない折りたたみや再堆積を防ぐために重要です。ステップ4.1および4.2の同じパラメータを使用して、基板上にフォトレジストを堆積させる。デバイスをブロモグラフに配置し、トランジスタの領域を完全に覆うシンプルな黒い長方形のプラスチック製のフォトリソグラフィマスクを基板に配置します。上面と底面の両方から1分間UV光に当て、マスクを慎重に取り外し、マスクを被傷を避けるために、基材上のマスクの横移動を最小限に抑えるように注意してください。注:両面露光では、FGは底面露出に対してフォトリソグラフィックマスクとして機能し、トップマスクの存在はトランジスタのチャンネルに存在するフォトレジストのみが露出していない状態に保たれている。前述したようにフォトレジストを開発します。s)で基板を洗浄します。トルに達するまでポンプで送ります。シャッターを切り、パワーを40%に上げ(または、るつぼが明るい白色に輝くまで)、60s待ってからシャッターを閉めて、電源を下げます。基板を超音波浴内のアセトン容器に入れ、10sの超音波浴でフォトレジストを持ち上げ、トランジスタのチャネルから金を取り除きます。基質をアセトン、イソプロピルアルコール、水でリンスし、窒素で乾燥させます。ステップ4.1および4.2の同じパラメータを使用して、基板上にフォトレジストを堆積させる。デバイスをブロモグラフに配置し、プラスチック製のフォトリソグラフィマスクを基板に配置し、所望のソース、ドレイン、および制御ゲートレイアウトを使用します。上から1分間紫外線に当て、マスクを慎重に取り外し、マスクを被傷を避けるために、マスクの基板上の横移動を最小限に抑えるように注意してください。説明したようにフォトレジストを開発する。露出した金を金エッチング液に10sに浸してエッチングし(ステップ1.3)、脱イオン水ですすいで、窒素を使用して乾燥させます。基板を光学的に検査し、アセトンを用いてフォトレジストを取り外す。イソプロピルアルコールと脱イオン水ですすい、窒素で乾燥させます。ステップ4.1および4.2の同じパラメータを使用して、基板上にフォトレジストを堆積させる。デバイスをブロモグラフに配置し、OCMFETのpH感知領域に対応する開口部を持つプラスチック製のフォトリソグラフィマスクを基板に配置します。上から1分間紫外線に当て、マスクを慎重に取り外し、マスクを被傷を避けるために、マスクの基板上の横移動を最小限に抑えるように注意してください。説明したようにフォトレジストを開発する。ステップ5.1に記載の同じパラメータを使用して、500nmのパリレンC(パリレンCダイマーの1gに相当する)を基板に付着させる。この堆積にはシランは必要ありません。ポリイミド絶縁テープを慎重に取り外します。s)に露出し、OCMFETのpHセンシング領域でパリレンCを活性化します。注:ポリイミド絶縁テープは、パリレンCの堆積を制限するためにここに必要です。実際、フォトレジストを使用した簡単なリフトオフは、パリレンCで得られるコンフォーマルコーティングのほとんどピンホールフリーの性質のために肯定的な結果を与えません。基板を超音波浴内のアセトン容器に入れ、フォトレジストを完全に除去します。基質をアセトンとイソプロピルアルコール(水なし)でリンスし、窒素で乾燥させます。基板を50°Cのホットプレートに置きます。半導体溶液(ステップ1.4)の液滴(1μL)を各チャンネル領域に投げ、基板全体を蓋で覆い、化学フードの下で30分間乾燥させます。内径15mm、厚さ1mm、高さ7mmのアクリロニトリルブタジエンスチレンリングを3Dプリンタで印刷して、培養チャンバーを準備します。ポリジメチルシロキサン(硬化剤の比率:重量15%)を使用して、基板の中央部に培養チャンバーを接着します。手動またはレーザーカッターを使用して、PETからデバイスを切り取ります。ソースメーター18,19,20,21を使用して各トランジスタを特性化します(材料表を参照)。比、およびサブしきい値勾配)を推定する必要があります。ResultsMOAの可能性は、電気活動記録と代謝活動のモニタリングの両方のためにここで検証されています。[DIV])18で測定された原発性ラット心筋細胞における)による徹底的な特徴付けに基づいていた。上端のインセットは、MOAの表面に付着したコンフルエントラット心筋細胞培養の例を示す。彼らの健康を強調するために、細胞は記録セッションの後に肉体タンパク質、トロポミオシンについて免疫染色されている。下端のインセットは、OCMFETで測定された単一の心筋細胞信号を示す。装置は、図3Bに示すように、自発的な電気的活動および異なる化学物質の投与に誘発される活動を検出することができた。この検証は、このアプローチを電気細胞インターフェースに使用することの実現可能性を実証するために非常に重要でした。配列構成のため、MOAは心臓信号の伝搬速度の再構築を可能にし、従って細胞ネットワークの研究のためのシステムの適合性を示す(図3C)。DIV)18でテストされ、信号振幅と記録の信頼性という点で興味深い結果が得られました。図3Dに示すように、OCMFETは、驚くべき安定性を持つニューロン電位を増幅し、最大3.2の信号対雑音比(SNRS)を示す(標準MEAs25で得られたSNRと同じ範囲で)。記録設定は、トランジスタバイアス用のカスタムマルチチャンネルエレクトロニクスと信号の読み出しとコンディショニングで構成されていました。kHzバンドパスフィルタからなる第1段階があります。