Corporation概要このプロトコルは、標的タンパク質に融合した抗体フリーの内因性タンパク質検出タグを発現させるためにCRISPR/Cas9を使用して操作された生細胞におけるタンパク質分解動態の定量的発光検出について説明しています。50、およびDmax50を計算および取得するための詳細な手順が含まれています。Abstract分子接着剤やタンパク質分解を標的とするキメラを含む標的タンパク質分解化合物は、低分子創薬におけるエキサイティングな新しい治療法です。このクラスの化合物は、ユビキチン-プロテアソーム経路(UPP)を介して標的タンパク質をユビキチン化し、最終的に分解するために必要な標的タンパク質とE3リガーゼ機構タンパク質を近接させることにより、タンパク質分解を誘導します。ハイスループット方式での標的タンパク質分解のプロファイリングは、分解を達成するために必要な細胞経路の複雑さを考えると、依然として非常に困難です。ここでは、LgBiTタンパク質に高い親和性で補完する11アミノ酸HiBiTタグを持つ標的タンパク質のCRISPR/Cas9内在性タグ付けを使用して発光タンパク質を製造するプロトコルとスクリーニング戦略を提示します。内因性タグを有するこれらのCRISPR標的細胞株は、発光プレートベースのリーダーを使用して発光シグナルをモニタリングすることにより、リアルタイムのキネティックライブセルモードまたはエンドポイント溶解モードのいずれかで化合物誘発分解を測定するために使用できます。ここでは、さまざまなフォーマットで推奨されるスクリーニングプロトコルの概要を説明し、レート、Dmax、DC50、Dmax50の主要な分解パラメータの計算、および細胞生存率アッセイによるマルチプレックスについても説明します。これらのアプローチは、関連する細胞バックグラウンドにおける標的タンパク質の内因性発現と調節を維持しながら、初期段階の化合物の迅速な発見とトリアージを可能にし、リード治療化合物の効率的な最適化を可能にします。Introduction標的タンパク質分解は、低分子創薬で最も急速に成長している分野の1つとして浮上しており、癌治療のための免疫調節分子グルー化合物(IMiDなど)の治療の成功、およびキメラ化合物を標的とするタンパク質分解の有望な早期臨床試験データによって大きく支えられています1,2,3,4,5,6,7,8、9,10,11,12。標的タンパク質分解化合物は、E3リガーゼ機械タンパク質1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12を有する標的タンパク質を近接させることによって機能する。.歴史的に、低分子創薬スクリーニングプログラムは、活性を評価し、化合物をランク付けするために、初期の生化学的アッセイに依存してきました。これは、究極の活性であるプロテアソームを介した分解が細胞イベントのカスケードに依存する標的タンパク質分解者にとって重大な課題を提示しています1、2、4、5、6、11、12、13、14、15、16、17、18.ターゲット分解を成功させるために必要なタンパク質複合体の複数の経路と複雑さにより、初期化合物の早期スクリーニングとトリアージのための細胞アッセイアプローチが必要です。現在、細胞環境の状況でハイスループット方式で標的タンパク質の分解を監視する技術の利用可能性は著しく不足しています14。ここでは、分解剤化合物10,11,18,19で処理した後の発光測定を介して標的タンパク質の損失を監視するために、CRISPR/Cas9内因的にタグ付けされたHiBiT標的細胞株18,19,20を使用したリアルタイムの動的生細胞またはエンドポイント溶解分解活性評価のプロトコルを提示します。治療標的の分解を成功させ、創薬可能なプロテオームを拡大するために、原形質膜、リソソーム、ミトコンドリア膜、細胞質、および核に局在するものを含む、広範囲のタンパク質を破壊対象とすることができる多数のアプローチおよびタイプの分解剤が登場している21–57。広く研究されている化合物の2つの主要なクラスは、分子接着剤とタンパク質を標的とするシメラ2、4、5、6、7、12、26です。分子接着剤は一価であるため、通常はサイズが小さく、E3リガーゼ成分2,12,26に結合すると、標的タンパク質との新規タンパク質:タンパク質相互作用界面を促進します。それらは、最も一般的にはセレブロン(CRBN)E3リガーゼ成分2,12,26,55,56,57に結合する分解剤である。58,59,60やDDB145へのCDK/Cyclinリクルートメントなどの他のE3リガーゼ機構を利用したエキサイティングな新しい例は、このクラスの化合物の拡大の可能性を示しています。対照的に、PROTACはより大きく、二価分子であり、標的結合リガンド(ほとんどの場合阻害剤)で構成され、化学リンカーを介してE3リガーゼハンドル1,3,4,5,7,13に架橋されます。そのため、これらの化合物は、E3リガーゼと標的タンパク質1,3,4,5,7,13の両方に直接結合することができる。多数のタンパク質がこれらの二価分子を介して分解されることが示されており、最も使用されているE3リガーゼハンドルは、CRBNまたはフォンヒッペルリンダウ(VHL)のいずれかをリクルートします1,3,4,5,7,13。タンパク質分解設計を標的とするキメラにおけるE3リガーゼリガーゼリクルートメントに利用可能なハンドルの数は急速に増加しており、このクラスの化合物の能力を拡大し、多様な標的クラスを分解し、細胞または組織タイプの特異性を高める可能性があります24,48,61,62.標的タンパク質と結合するための最小限の要件と組み合わせることで、たとえわずかな親和性であっても、分解化合物は創薬可能なプロテオームの拡大に有望です。タンパク質喪失の細胞動態、および治療後の潜在的なタンパク質回収を特徴付けることは、分解化合物の機能と有効性を理解するために重要です。ウェスタンブロット抗体アッセイまたは質量分析を使用して、関連する細胞系における内因性タンパク質レベルの変化を研究することは可能ですが、これらのアプローチは、ハイスループットスクリーニングフォーマットに適応することが困難であり、定量能力が限られているか、または多くの時点で速度論的変化を測定する能力があります14。これらの課題に対処するために、我々は、11アミノ酸タグHiBiTのCRISPR/Cas9を介したゲノム挿入を利用する、内因性タンパク質レベルの変化をモニタリングするためのプレートベースの細胞発光システムを開発しました18,19,20。このペプチドは、その結合パートナーであるLgBiTに高い親和性で相補し、その基質の存在下で明るい発光を生成し18,19,20,63、それによってこれらのタグ付き内因性タンパク質を細胞またはライセートで発光させる18,19,20,63.ルミノメーター機器で測定された相対光単位(RRU)は、タグ付けされた標的タンパク質レベル18、19、20、63に正比例します。安定化ルシフェラーゼ基質の開発により、24〜48時間の時間枠にわたるリアルタイムの速度論的タンパク質レベル測定が可能になる18,53,64。(Dmax)、および化合物処理後の回収率の定量分析を含む、任意の所与の化合物濃度における任意の所与の標的に対する完全な分解プロファイルの決定が可能になる18,53。分解化合物の大規模なライブラリをスクリーニングする場合は、エンドポイント分析をさまざまな薬物濃度と指定された時間で384ウェル形式で簡単に実行することもできます。この原稿で提示されたプロトコルは、すべてのタイプの分解物に適用可能な、標的タンパク質分解化合物の細胞スクリーニング戦略を表しています。CRISPR細胞株を使用することは、タンパク質分解に限定されず、化合物の影響または耐性メカニズムを研究するために治療後に調節され得る内因性標的タンパク質レベルをモニタリングするための一般的なツールである20、65、66。これらの発光ベースの検出方法の前提条件は、内因性にタグ付けされたHiBiT標的細胞株であるCRISPRであり、内因性の標的発現とネイティブプロモーター制御を維持しながら、高感度の発光検出を可能にするため重要です18,19,20。ゲノムタグの挿入にCRISRP/Cas9を利用することにおいて、特にスケーラビリティ20および高感度の検出において、CRISPRプールまたはヘテロ接合性またはホモ接合性の対立遺伝子挿入を有するクローンを含む様々なフォーマットで、重要な進歩が見られた18,19,20。内因性タグ付けの代わりに細胞内でHiBiTまたは他のレポーター融合の外因性発現を使用することは可能ですが、タンパク質過剰発現を有する系を用いるには細心の注意を払う必要があります14,18。これらは、標的分解後に活性化される潜在的な転写フィードバックループを含む、真の化合物効力およびタンパク質回収ダイナミクス14,18を理解する上でのアーティファクトにつながる可能性があります。効力の低い初期段階の化合物は見逃され、スクリーニングで偽陰性として現れる可能性があります。タンパク質の損失は化合物誘発性の毒性および細胞死に起因する可能性があるため、ここに記載されているプロトコルには、強く推奨されていますが、分解プロトコルと組み合わせたオプションの細胞生存率発光または蛍光アッセイが含まれています。プロトコルには、溶解エンドポイントと生細胞動態スクリーニングの2つの主要なセクションがあります。これらの各セクションには、エンドポイントまたはキネティック形式でのマルチプレックス細胞生存率測定のオプションが含まれています。タグ付けされた内因性タンパク質の変化をモニタリングするには、細胞内のLgBiTによる補完が必要です。したがって、キネティックスクリーニングセクションは、一過性または安定な発現を介して達成することができ、生細胞発光測定を実行するために不可欠な、これを導入するための重要なプロトコルを参照します。ここで紹介するすべてのアプローチにより、化合物の迅速なランク順序付けと活性評価が可能になり、初期段階の化合物スクリーニング作業と鉛分解体のより迅速な同定が可能になります。CRISPR細胞株と組み合わせた分解化合物の研究用に設計されています。CRISPR挿入の生成のためのプロトコルは、いくつかの最近の刊行物18、19、20に概説されている。105/mLに調整します。実験条件および対照条件ごとに最低3ウェルのプレートに細胞を分注します。μL(20,000細胞)を96ウェルの白いプレートに分注します。μL(8,000細胞)を384ウェルのホワイトプレートに分注します。化合物の調製と添加100%DMSO中で最終濃度の1,000倍で段階希釈したPROTACまたはデグレーダーテストコンパウンドプレートを準備します。次に、細胞培養培地で最終濃度の10倍に希釈します。等量のDMSOを培地に添加し、無化合物DMSOコントロールとして使用する。μLの細胞に加えます。μLの10xコンパウンドおよびコントロール溶液を追加します。インキュベーター内で所望の時間またはそれらの成長に最適な条件でインキュベートする。注:これはエンドポイントアッセイであるため、複数の時点のテストでは、上記のステップ1.1.2で説明したように、各時点ごとに個別の分解プレートを準備する必要があります。化合物媒介分解を検出するためのインキュベーション時間は非常に変動し、化合物濃度にも依存する可能性があります。オプションの細胞生存率測定なしでエンドポイント発光検出を測定する場合は、以下のステップ1.3に直接進んでください。細胞生存率測定でマルチプレックスを行う場合は、以下の次のセクション1.4に進んでください。μLのLgBiTタンパク質を添加して、2倍の溶解検出試薬を調製します。10%)を考慮した追加の容量を含む、アッセイするウェル数に対して十分な2倍の検出試薬を準備します。調製した溶解検出試薬を細胞に加える。μLの2x溶解検出試薬を追加します。μLの2x溶解検出試薬を追加します。プレートをマイクロプレートボルテックスミキサーで350rpmで10〜20分間混合します。96または384ウェルプレートの発光を読み取ることができるルミネッセンスメーターでルミネセンスを測定します。オプションの細胞生存率マルチプレックス注:この手順は、市販のCell力価-蛍光(CTF)キットを使用して実行されます(材料の表を参照)。