使用してトリムされた読み取りを逆補完します。実行して読み取り品質を確認します。GRh38ヒトゲノムとHIV[統合線形pNL4-3Env-GFP]参照をFASTA形式でマージします。使用してインデックスを作成します。使用すると、出力ファイルに書き込まれるマルチマップ読み取りを有効にします。HIVゲノムは5’LTRおよび3’LTRに相同634bp配列を有する:SAMtoolsを用いて5’LTRから対応する3’LTR領域へのマルチマッピング読み取り結果を再整列させる。ツールを使用して、メチル化呼び出しを実行します。サイズ係数は、次のステップでパラメータとして使用されます。時間の微分メチル化分析を行います。Resultsこのワークフローは、HIV感染のコンテキストでm6Aおよびm5Cメチル化の役割を調査するのに有用であることが証明されています。T細胞線モデル(SupT1)を使用しました。1条件あたり5,000万個の細胞でワークフローを開始し、RNA品質番号10の平均500μgのRNAを得た(図1A-B)。ポリA選択時に、1つの条件(全RNAの約2%を表す)のmRNAの10〜12μgの間で取り出しました(図1B)。この時点で、MeRIP-Seqパイプラインには5μgのポリA選択RNA、BS-Seqパイプラインには1μgを使用しました。RNAはポリアデニル化されているため、それ以上のアクションは必要なく、MeRIP-SeqおよびBS-Seq手順を直接適用することができます。図1:下流用途のRNA調製物。同時MeRIP-SeqおよびBS-SeqパイプラインのためのRNAの準備および分布を描写するワークフロー。塗りつぶされた六角形の形状は、m6A(緑色)やm5C(ピンク)などのRNA修飾タイプを表します。実験を行うために必要なRNA材料の量が示されている。RNAの総抽出(上部パネル)およびポリA選択(下部パネル)で期待されるRNA分布プロファイル(サイズと量)を示す代表的な結果。サンプルは、特定のMeRIP-SeqおよびBS-Seq手順に入る前にRNAの品質を評価するために、標準感度キットを用いてフラグメント分析装置にロードしました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。MeRIP-Seqパイプラインは、RNA分子に沿ったm6A修飾の調査を可能にするRNA免疫沈降ベースの技術です。このために、RNAはまず断片化され、m6A特異的抗体と結合して免疫沈降および捕獲のために磁気ビーズと結合される。MeRIP濃縮RNA断片と手つかずの(入力)分数を配列決定し、m6A修飾RNA領域を同定し、m6A-メチル化された転写物を同定する(図2A)。この技術の分解能は、RNA断片化の効率に依存します。実際、短い断片はm6A残基のより精密な局在化を可能にする。ここで、細胞ポリA選択RNAおよびウイルスRNAは、20μL最終容積で15分の間にRNA断片化バッファーを有するイオンベースの断片化を行い、100〜150ntのRNA断片を得た。μgのmRNAから、90%の回収率に対応した4.5μgの断片化したRNAを回収しました(図2B)。ngの断片化した精製RNAを入力制御として使用し、直接ライブラリ調製およびシーケンシングを行った。残りのRNA(約4.4μg)は、抗体特異的抗体または抗IgG抗体に抗IgG抗体を制御するように結合したビーズを有する断片化されたRNAのインキュベーションから始まるMeRIP-Seqパイプラインに従って処理された。μgの断片化されたRNAのm6A特異的RIP(MeRIP)は、ライブラリー調製およびシーケンシングを行ったm6A濃縮材料の約15ngを取り出すことができます(図2B)。反IgG制御を用いたRIPは、予想通り、さらなる分析を可能にするのに十分なRNAを得られなかった(図2B)。nt部分に断片化し、シーケンシング(100ng、入力制御)を直接行うか、またはシーケンシング前に陰性対照として抗m6A特異的抗体または抗IgG抗体を有するRNA免疫沈降(2.5μg、RIP)に使用した。B)断片化時の期待されるRNA分布プロファイル(サイズおよび量)およびRIP(下部パネル、MeRIP:左、IgG制御:右)を示す代表的な結果。サンプルは、ライブラリー調製およびシーケンシングにさらなる処理を行う前に、RNAの品質と濃度を評価するためにフラグメント分析装置にロードした。断片化したRNA分析は、免疫沈降RNAが高感度キットを使用しながら、RNA標準感度キットを用いて行った。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。RNA修飾を探索し、m5C-メチル化転写物の同定につながります。バイサルファイト変換時には、非メチル化シトシンはウラシルに変換され、メチル化されたシトシンは変わりません(図3A)。高温および低pH)の過酷な条件により、変換されたmRNAは高度に分解される(図3B)が、これはライブラリの調製およびシーケンシングに干渉しない。バイサルファイト変換は、一本鎖RNAでのみ効率的であり、二次的な二本鎖RNA構造によって妨げられる可能性があります。C-U変換の効率を評価するために、2つのコントロールを導入しました。rRNA23の位置C4447における高度にメチル化されたシトシンの前述の存在を利用した。メチル化部位を取り囲む200bp断片のRT-PCR増幅およびシーケンシングの際に、すべてのシトシンがウラシルに正常に変換され、それによって、変化しなかった4447位のシトシンを除くDNA配列中にチミジンとして現れるのを観察することができた。この混合物は、既知の非メチル化およびポリアデニル化RNA配列のプールで構成され、様々な二次構造および長さを有する。ライブラリの調製とシーケンスの際に、変換速度を計算するためにこれらのERCC配列に焦点を当て、これはすべてのERCC配列および各サンプルの合計C残基の中で変換されたCの数を数えることによって実行することができる。我々は、99.5%の変換率を得て、バイサルファイト変換反応の効率と成功を確認した(図3D)。ワークフローの概略表現。ポリA選択の際、サンプルはバイサルファイトにさらされ、非メチル化C残基に対してCからUへの変換(脱アミノ化による)が生じます。影響を受けず、変化しないままである。標準感度キットを用いてフラグメントアナライザで解析した際のバイサルファイト変換RNA分布プロファイル(サイズと量)の代表的な結果。rRNAの位置4447で100%メチル化Cを取り囲む領域のRT-PCRアンプリコンの代表的なシーケンシング結果を示す電解液球図(青色で強調表示)。よるアンプリコン配列のT残基として同定された。HIV感染細胞および非感染細胞におけるERCCスパイクイン配列の分析によるC-U変換率の評価平均換算率は99.5%です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。M6A濃縮サンプル、バイサルファイト変換サンプルおよび入力制御は、ライブラリ調製、シーケンシングおよびバイオインフォマティクス分析のためにさらに処理される(図4)。実験計画と生物学的問題に従って、複数のバイオインフォマティクス解析を適用することができる。ここでの原理証明として、HIV感染時に誘導される微分メチル化転写物の同定に焦点を当てた1つの潜在的な応用(すなわち、微分メチル化分析)の代表的な結果を示す。結果、感染状態に応じてZNF469転写物がm6A-メチル化されたのが分化され、実際にこの転写産物は非感染細胞ではメチル化されなかったが、HIV感染時にメチル化されたピークがいくつか示された(図5A)。m5Cに対する同様の微分メチル化分析は、PHLPP1転写物に複数のメチル化残基が含まれていることを明らかにした。この文脈では、両方の分析は、HIV感染が細胞エピトランストランスクリプトームに影響を与ことを示唆している。図4:m6Aおよびm5Cデータの解析のためのバイオインフォマティクスワークフローの概略表現。図5:感染時の微分メチル化転写物の例。HIV感染(緑色)および非感染(灰色)細胞におけるZNF459転写産物のm6Aメチル化を示す代表的な結果。ピーク強度(入力式減算時)は、y軸上およびX軸に沿った染色体内の位置に表示されます。微分メチル化分析は、ZFN469転写産物がHIV感染時に過メチル化されることを明らかにする。B)HIV感染(上レーン)および非感染(下車線)細胞におけるm5Cメチル化遺伝子の代表的な結果。各バーの高さは、ヌクレオチドあたりの読み取りの数を表し、カバレッジ評価を可能にします。各C残基は赤色で表され、メチル化Cの割合は青色で表される。正確なメチル化率(%)は、各C残基より上に報告される。矢印は、IGVビューアを用いて可視化された統計的に有意な微分メチル化C.サンプルを強調した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。Discussionウイルス感染におけるRNA修飾の役割は、まだほとんど知られていない。ウイルス感染の文脈におけるエピトランストランスクリプト修飾の役割をよりよく理解することは、新しい抗ウイルス治療標的の探求に寄与する可能性がある。この研究では、感染細胞のm6Aおよびm5Cエピトランスクリプションの調査を可能にする完全なワークフローを提供する。生物学的な問題に応じて、ポリA選択RNAを出発物質として使用することをお勧めします。パイプラインは全RNAと併用できますが、rRNAと小さなRNAは高度に修飾されており、重要な数のメチル化残基が含まれていることを覚えておいてください。データの質と量が減少する可能性があります。研究の焦点が非ポリアデニル化RNAである場合、RNA抽出ステップは、小さなRNA(カラムベースのRNA抽出の場合)を廃棄することを避け、パイプラインに入るためのポリボソーム枯渇技術ではなく特権リボソーム枯渇技術に適応する必要があります。高品質のRNA、正しい断片化、適切なm6A濃縮およびBS変換されたRNA品質をライブラリ調製に確実に行うために、フラグメントアナライザまたはバイオアナライザを使用することを強くお勧めします。この装置は常に使用できるとは限りません。別の方法として、RNAの品質、mRNAおよび断片化されたRNAのサイズはまたアガロースゲルの視覚化によって評価することができる。ライブラリーの調製は、RNA量の以前の評価なしで行うことができる。抗体ベースのMeRIP-Seq16技術を用いて、m6Aエピトランスクリプトの風景を探索しました。この技術はRNA免疫沈降に基づいており、成功しています。一部の手順では、慎重な最適化が必要であり、重要な場合があります。m6Aメチル化は、主にコンセンサス配列RRA*CH内で起こることが説明されているが、このモチーフはmRNA分子に沿って非常に頻繁に起こるものであり、メチル化部位の正確な同定を可能にしない。したがって、RIPベースの分解能を向上させるためには、再現性と一貫性のあるRNA断片化を達成し、小さなRNA断片を生成することが重要です。このプロトコルでは、実験環境で再現可能で一貫性のある結果を提供する最適化された手順をお勧めします。この断片化の手順では、特定のサンプル機能に応じて、さらに最適化が必要になる場合があります。近年、m6A直接シーケンシングを可能にする新しい技術が説明された。RNA修飾24に遭遇した応答としてユニークなRTシグネチャを示す特異的な逆転写酵素変異体の使用に基づいています。この技術は、慎重な最適化の際に、MeRIP-Seqに直面する大きな制限を回避する可能性があります(初期材料の量を減らすと、より高い解像度を可能にします)。m5C修飾を探索するために、修飾されたC残基をヌクレオチド分解能で検出するためにバイサルファイト変換技術を使用することにしました。RNA二次構造の存在による偽陽性率を低減するために、ERCCスパイクインコントロールの使用により、変性/亜硫酸水素変換の3サイクルを行い、バイサルファイト変換速度のパフォーマンスをさらに制御しました。この技術に関連する制限の1つは、亜硫酸水素変換が非常に過酷であり、変性/亜硫酸水素塩変換の3サイクルがRNAを分解し、したがって分解能を低下させる可能性があることです。この設定では、データセットの品質を向上させるために、わずかに低い解像度に落ち着くことを選択しました。特定の治療への暴露の文脈におけるエピトランストランスクリプトの風景とその変化を調査するために利用できる信頼性の高い健全なワークフローを提供することができました。disclose.Acknowledgementsこの研究は、スイス国立科学財団(助成金31003A_166412と314730_188877)によって支援されました。reserved×-1::1。