Bioinformatics概要ウイルス感染におけるRNA修飾の役割は、検討され始めたばかりで、新しいウイルス宿主相互作用メカニズムを強調する可能性がある。RNA修飾を調査するパイプラインを提供する。Abstract生物学的プロセスにおけるRNA修飾の役割は、ここ数年で研究の増加の焦点であり、今日ではエピトランスクリプトロミクスとして知られています。N6-メチルデノシン(m6A)および5-メチルシトシン(m5C)RNA修飾はmRNA分子に記載されており、細胞プロセスを調節する役割を有し得る。エピトランスクリプトミクスは、ウイルス感染を含む任意の化学物質または生物学的薬剤への暴露によって改変または変調することもできるので、トランスクリプト分析に加えて考慮されなければならない新しい調節層である。ここでは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に感染している細胞のm6Aとm5Cマークの関節細胞およびウイルスエピトランストランスクリプトの風景を同時に分析できるワークフローを提示する。HIV感染細胞と非感染細胞からのmRNA単離および断片化に際して、RNA免疫沈降法であるMeRIP-Seqを用いて、m6Aマークを含むRNA断片とバイサルファイト変換ベースの技術であるBS-Seqを濃縮し、一塩基分解能でm5Cマークを同定しました。メチル化特異的なキャプチャの際、RNAライブラリはハイスループットシーケンシング用に用意されています。基礎的発現プロファイルとは無関係に微分メチル化(DM)転写物を同定する専用のバイオインフォマティクスパイプラインも開発しました。全体として、この方法論は複数のエピトランストランスクリプトマークを同時に探索することを可能にし、ウイルス感染または他の細胞摂動時にDM転写物のアトラスを提供する。このアプローチは、ウイルス複製を促進または制限する細胞因子などの新しいプレーヤーと細胞応答の新しいメカニズムを識別する新しい機会を提供します。IntroductionRNA分子が改変できることは長い間知られており、150以上の転写後修飾がこれまでに1に記載されている。これらは、主にメチル基である化学基を、RNA分子のピリミジンおよびプリン環の実質的に任意の位置に添加する2を含む。このような転写後修飾は、伝達RNA(tRNA)およびリボソームRNA(rRNA)において高度に富化することが既に示されており、最近ではmRNA分子にも説明されている。次世代シーケンシング(NGS)などの新技術の台頭と、明確な化学修飾を認識する特定の抗体の産生は、トランスクリプトーム全体のレベルでの特定の化学修飾の場所と頻度の調査を初めて可能にしました。これらの進歩はRNA修飾のよりよい理解とmRNA分子3,4上のいくつかの修飾のマッピングにつながっている。エピジェネティクスは、トランスクリプトーム調節におけるDNAの役割とヒストン修飾を調査する一方で、同様の方法でエピトランストランスクリプト法はRNA修飾とその役割に焦点を当てています。エピトランスクリプト法修飾の調査は、様々な細胞プロセス(RNAスプライシング、エクスポート、安定性および翻訳)を調整する新しい調節機構を強調する新しい機会を提供する。したがって、最近の研究では、細胞およびウイルスの両方のRNA6におけるウイルス感染時に多くのエピトランストランスプトミック修飾が明らかになったことは大きな驚きではなかった。ウイルスの両方が含まれます。その中でも、HIVは先駆的な例と考えることができます。全体として、ウイルス感染の文脈におけるRNAメチル化の発見は、ウイルス発現または複製の未記述的なメカニズムの調査を可能にし、したがってそれらを制御するための新しいツールおよび標的を提供するかもしれない7。HIVエピトランスクリプノミクスの分野では、ウイルス転写物の改変が広く検討されており、この改変の存在がウイルス複製に有益であった8,9,10,11,12,13であることが示されている。現在までに様々な技術を用いて、トランスクリプトームワイドレベルでエピトランスクリプソメマークを検出することができる。m6A同定に最も使用される技術は、MeRIP-SeqやmiCLIPなどの免疫沈殿技術に依存しています。MeRIP-Seqは、メチル化残基を含む断片を捕捉するためにRNA断片化に依存していますが、miCLIPはRNA抗体UV架橋時のα-m6A抗体特異的シグネチャ突然変異の生成に基づいており、より正確なマッピングを可能にします。RIP)に類似した抗体ベースの技術、バイサルファイト変換、AZA-IPまたはmiCLIPによって達成できます。miCLIPの両方がRNAメチル化を経ながらRNAを標的とする餌として特異的なメチルトランスファー酵素を使用します。Aza-IPでは、標的細胞が5-アザシチジンにさらされ、その結果、シチジンアナログ5-アザシチジン部位が新生RNAにランダムに導入される。miCLIPでは、NSun2メチルトランスファー酵素が遺伝子組み換えされ、C271A突然変異14,15を収容する。本研究では、HIVをモデルとして、感染細胞におけるm6Aとm5C修飾の二重特性化に焦点を当てます。方法論的最適化では、メチル化RNA免疫沈降(MeRIP)とRNAバイサルファイト変換(BS)を組み合わせたワークフローを開発し、細胞およびウイルスの両方のコンテキストで、トランストランスクリプトーム全体のレベルでm6Aとm5Cエピトランスクリプトマークを同時に探査することを可能にしました。このワークフローは、細胞RNA抽出物と、ウイルス粒子から単離されたRNA上で実装することができます。メチル化RNA免疫沈降(MeRIP)16アプローチにより、転写体全体のレベルでm6Aの調査が十分に確立されており、m6A特異的抗体の配列が、現在までに市販されています。この方法は、m6A特異的抗体を用いたm6A含有RNA片の選択的捕捉に含まれる。この技術の2つの大きな欠点は、(i)RNA断片のサイズに大きく依存し、メチル化残基を含む近似位置および領域を提供する限られた分解能であり、(ii)分析を行うために必要な大量の材料を提供する。以下の最適化されたプロトコルでは、フラグメントサイズを約150ntに標準化し、出発物質の量を、現在推奨される出発物質量であるポリ-A選択RNAの10μgから、ポリA選択RNAのわずか1μgに減らしました。RNA断片の回収効率を最大化しました。このRIPベースアッセイの主な制限は、正確な修飾されたAヌクレオチドの同定を可能にしない最適ではない分解能のままである。m5Cマークの解析は、m5C特異的抗体を用いたRIPベースの方法とRNAバイサルファイト変換の2つの異なるアプローチを使用して現在行うことができます。RIPはメチル化残基の同定に関する解像度が限られているため、一塩基分解能を提供できる亜硫酸水素変換を用いた。バイサルファイト(BS)へのRNA曝露は、シトシン脱アミノ化をもたらし、それによってシトシン残基をウラシルに変換する。したがって、RNAバイサルファイト変換反応の間、すべての非メチル化シトシンは脱アミン化され、ウラシルに変換され、シトシンの位置5にメチル基が存在すると保護効果を有し、BS誘導脱アミノ化を防止し、シトシン残基を保存する。BSベースのアプローチは、単一塩基分解能でm5C修飾ヌクレオチドの検出と、各転写物のメチル化頻度の評価を可能にし、m5C修飾ダイナミクス18に関する洞察を提供します。この技術の主な制限は、メチル化残基の偽陽性率に依存する。確かに、BS変換は、アクセス可能なC残基を有する一本鎖RNAに有効である。緊密なRNA二次構造の存在は、N5C位置をマスクし、BS変換を妨げ、U残基に変換されない非メチル化C残基、したがって偽陽性をもたらす可能性があります。この問題を回避し、偽陽性率を最小限に抑えるために、3ラウンドの変性と亜硫酸水素変換サイクル19を適用しました。サンプルに2つのコントロールを導入して、バイサルファイト変換効率の推定を可能にしました:ERCCシーケンシングコントロール(非メチル化標準化および市販シーケンス)20とポリA枯渇RNAをスパイクインして、一方でバイサルファイト変換率を評価し、RT-PCRによって既知でよく保存されたメチル化部位の存在を確認します。28SリボソームRNAに対して他方の21.ウイルス学の分野では、これら2つのエピトランスクリプト法と次世代シーケンシングと正確なバイオインフォマティクス分析を組み合させることで、m6Aおよびm5Cダイナミクスの詳細な研究が可能になります(すなわち、ウイルス感染時に起こり得るRNA改変一時的な変化は、臨床使用に対する新しい治療関連の標的の配列を明らかにすることができる)。注:細胞の種類とRNA含有量によって、細胞の開始数は異なる場合があります。μgの間で得られる十分な細胞を持っている。SupT1細胞はフェノール系試薬を用いて抽出すると約500μgの総RNAを得る必要があり、テストされた個々の条件に必要です。実験計画に従って必要な数の細胞を準備し、テストされた条件の数(感染、タイムポイント、治療)に従って。細胞が必要であり、半分は非感染状態、半分は感染状態である。106)を収集し、上清を捨てる。細胞ペレットに5mLのフェノール系試薬を加え、数回上下にピペットで混合します。完全なリシスを可能にするために室温で5分間インキュベートする。Lysed細胞は、-80°Cで保存することも、直接処理することもできます。クロロホルムを1mL加え、反転して混ぜます。室温で3分間インキュベートします。水相(上相)をピペットアウトし、新しいチューブに移します。45°でチューブを釣り、慎重に溶液をピペットアウトすることによって水相を移し終えます。1mL)に近いはずです。位相ロックチューブまたはフェーズメーカーチューブを使用すると、このプロセスを容易にすることができます。-80°Cで1時間インキュベートし、RNA沈殿を可能にします。遠心分離機は12,000xgで10分間、4°Cで沈殿したRNAをペレット化した。上清を捨て、75%分子生物学グレードエタノールの1mLでRNAペレットを再懸濁します。7,500xgと4°Cで5分間遠心分離機を使用し、上清を捨てます。ペレットを15分間エアドライします。ペレットを20μLのRNaseフリー水で再懸濁し、新しいチューブに移します。μLボリュームでプールします。分光光度計でRNA全体を定量化し、フラグメントアナライザでRNAの品質を評価します。カラムベースのウイルスRNA抽出キットによるRNA抽出注:フェノールベースの試薬を用いたウイルス粒子からのRNA抽出は、低品質のウイルスRNAおよび低品質のライブラリーで生じます。カラムベースのRNA抽出が好まれるべきである。RNAの溶出および回収にキャリアRNAを用いたRNA抽出キットは、この手順には適しておらず、避けるべきです。RNAはポリ-アデニル化されているため、さらなるmRNA分離を伴う直接RNA抽出は、MeRIP-SeqおよびBS-Seqパイプラインに入るのに十分です。mLは、ワークフロー全体を実行するのに十分なRNAを提供する必要があります。μL添加してバッファーを調製します。mLを加えることによってウイルス洗浄緩衝液を再構成する。細胞RNA汚染を最小限に抑えるために、ウイルス含有上清および遠心分離機をペレット細胞の破片に収集する。1mLのウイルス上清を15mLチューブに移す。mLを加え、渦によって混合する。μLのサンプルをカラムに移し、コレクションチューブに挿入します。gで2分間遠心分離機。フロースルーを破棄します。サンプル全体が処理されるまで上記の3つの手順を繰り返し、すべてのRNAをシリカベースマトリックスカラムに取り込みます。ウイルス洗浄バッファーをカラムに追加します。gで1分間の遠心分離機。フロースルーを破棄します。ウイルス洗浄バッファーをカラムに追加します。gで1分間の遠心分離機。フロースルーを破棄します。チューブに列を配置します。gで1分間、残りの洗浄バッファー汚染物質をさらに廃棄する。mLチューブにカラムを移します。μLのDNase/RNaseフリー水をカラムマトリックスの中心に直接加え、遠心分離機を30秒で再度追加します。分光光度計でRNA全体を定量化し、フラグメントアナライザでRNAの品質を評価します。注:RNA抽出は、取得したRNAの品質が高い場合、RNAの完全性/品質番号が9>であれば、任意の方法で行うことができます。全RNAは、さらに処理されるまで-80°Cで保存することができます。注:細胞抽出物にメチル化リボソームRNAが存在するため、rRNAの枯渇によってポリARNAを分離するか、ポリA陽性選択によって優先的にポリARNAを分離することが強く推奨されます。このステップは任意であり、より高い解像度でシーケンシング結果を得るために、細胞RNAサンプルに対してのみ実行されるべきである。非ポリアデニル化ウイルスRNAのメチル化を分析する場合、ポリA選択ではなくrRNA枯渇を好むか、最終的には全RNAに対する分析を行います。磁性ビーズストックバイアルを>30sのボルテックスで再中断します。処理するRNAサンプルの合計量に応じて、マグネットビーズを使用してチューブの数を準備します。μgのサンプルを収容できます。チューブを磁石の上に1分間置き、上清を捨てます。マグネットからチューブを取り外します。追加し、ボルテックスで再中断します。マグネットにチューブを1分間置き、上清を捨てます。マグネットからチューブを取り外します。μLの結合バッファーに再懸濁します。注:RNAの濃度が低い場合は、ボリュームを変更せずに以下の手順に従ってください。μLのRNAサンプルを分配することにより、複数のチューブ内のRNA全体を分配します。各RNAサンプルに100μLの結合バッファーを加えます。RNA全体を65°Cに加熱し、2分間加熱して二次構造を破壊します。次のステップに進む準備ができるまで、すぐに氷の上に置きます。注:インキュベーション時間は、処理するサンプルの数によって異なる場合がありますが、RNAの分解を避けるために1時間を超えないようにしてください。各RNAチューブ(ステップ3.2から)に、洗浄された磁気ビーズを100μL加えます(ステップ3.1から)。上下にピペットを入れ、室温で15分間回転するホイールにバインドできるように徹底的に混ぜます。すべてのチューブを開き、磁石の上に1分間置き、上清をすべて慎重に取り除きます。ポリA最終回収を改善するために、新しいチューブ内の上澄み物を回収し、RNAキャプチャの第2ラウンド(ステップ3.3.14)のために脇に置きます。EDTA)を加えます。慎重に4〜5回ピペットで混ぜます。マグネットにチューブを1分間置き、上清を捨てます。