CDKタンパク質のレベルを異なる時点で測定し、DMSO対照に対するフラクショナルRLUを決定しました(図1A)。各CDKタンパク質は、化合物処理および様々な時点に応答して異なる程度の分解を示した(図1A)。図1Bの各時点についてプロットしました。これは、2時間または4時間の早い時点でさえ、CDKファミリーのメンバーの一部が高レベルの分解を示し、時間の経過とともに上昇傾向にあることを示しています(図1B)。速度論的分解分析を実証するために、BETファミリーメンバータンパク質のそれぞれ;BRD2、BRD3、およびBRD4は、LgBiTタンパク質18を安定に発現するHEK293細胞のN末端にHiBiTで内在的にタグ付けされました。次に、これらを3つの異なる濃度の汎BETプロタックで処理しました。セレブロンベースのdBET650(図2A)およびVHLベースのARV-77141(図2B)。PROTACで以前に観察されており、分解プロセスと競合する転写フィードバック応答に起因する可能性が高い18。エンドポイント分析と速度論的分析の両方は、完全な複合用量反応治療で行うことができます。プロファイルです2,26,55,57;レナリドマイド(図3A)、イベルドマイド(CC-220)(図3B)、サリドマイド(図3C)、およびポマリドマイド(図3D)。これらの分解剤は、化合物間および濃度系列全体で分解応答に大きな違いを示します(図3)。図3の化合物の分解とランク順序を定量的に評価するために、用量反応プロファイルを使用して、分解率(図4A)、Dmax(図4B)、およびDmax50値(図4B)を含む主要な分解パラメータを計算しました。これらの分析は、イベルドマイド(CC-220)とポマリドマイドが非常に類似した急速な初期分解速度を有することを示していますが(図4A)、イベルドマイド(CC-220)は、直交研究で以前に見られたように最高の効力を持っています55,57(図4B)。イベルドマイドはそのような高い効力を示し、テストされたすべての濃度は50%を超える分解を示すため、イベルドマイドについて得られたDmax50値は、データを正確に適合させる際の制限に基づく推定値を表します。図3C、Dおよび図4Bのグラフから、レナリドマイドもサリドマイドも、試験した最高濃度でIkaros/IKZF1ターゲットを分解しません。サリドマイドで観察された分解がほとんどないため、分解痕跡を指数関数的減衰モデルに正確に適合させることができなかったため、この処理では分解速度を定量化できませんでした。強力な分解剤であるイベルドマイド(CC-220)55,57(図4B)。細胞生存率マルチプレックスアッセイは、試験した濃度について細胞生存率の損失を示さなかった(図4C)。図1:パンキナーゼPROTACによるCDKエンドポイントの分解と毒性、TL12-18654。時間処理で分解を評価した内因性CDK標的タンパク質のパネルを選択します。値は、各時点で測定されたDMSOコントロールに対するフラクショナルRLUとして表されます。エラーバーは、3つのテクニカル反復の平均のSDを表します。(B)(A)から算出されたCDK標的タンパク質のパネルの分解率、2、4、8、および24時間の時点で観察された各ファミリーメンバーの分解量を表す。エラーバーは、3つのテクニカル反復の平均のSDを表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。(B)プロタックの単一濃度で処理します。値は、各運動時点でDMSOコントロールから計算されたフラクショナルRLUとして表されます。エラーバーは、4回のテクニカル反復の平均のSDを表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。プロファイル2,26,55,57。LgBiTタンパク質を安定に発現するJurkat細胞をCRISPR/Cas9を用いて操作し、Ikaros/IKZF1のC末端にHiBiTペプチドをタグ付けした。処理した:(A)レナリドマイド、(B)イベルドマイド(CC−220)、(C)サリドマイド、または(D)ポマリドマイド。発光は5分ごとに合計19.5時間測定されました。(A〜D)からの相対光単位(RLU)データは、ステップ2.4.1で説明したようにフラクショナルRLUに変換され、時間の関数としてグラフ化されました。エラーバーは、3つのテクニカル反復のSDを表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。図4:Ikaros/IKZF1-HiBiTの分解率とDmax50の計算、およびマルチプレックス細胞健康アッセイ。図3の速度論的分解データを使用して、定量的劣化パラメータを計算しました。(A)分解率および(B)分解最大値(Dmax)は、示された分子糊化合物2、26、55、57について各薬物濃度でグラフ化される。(B)各化合物のDmax50値は、ヒルスロープを1に拘束した用量反応モデルを使用して計算され、ターゲットの分解化合物の順序をランク付けするために使用できます。完了時にエンドポイント測定として実施した。エラーバーは、3つのテクニカル反復のSDを表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。Discussionここでは、分解化合物活性をエンドポイント溶解フォーマットまたは生細胞動態モードのいずれかでスクリーニングする2つの方法を紹介します。これらのアプローチは、同じ発光測定原理に基づいていますが、異なるレベルの詳細と理解を提供します。どちらのアプローチを選択するかは、スクリーニングの目標と化合物ライブラリのサイズに依存する可能性があります。検出可能な分解を観察するための大規模な化合物スクリーニングデッキまたは一次スクリーニングの場合、エンドポイント溶解スクリーニングは、ウェスタンブロットや質量分析などの他のエンドポイントアプローチが実用的でないか、適応が難しい場合、高感度で効率的なハイスループット互換性を提供します14。これらのスクリーンの開始点は、限られた数の濃度とタイムポイントで実行できます。試験に推奨される初期濃度は100nM〜10μMの範囲であり、効力が低い、透過性が低い、または場合によっては非常に強力な化合物を含む初期分解剤にはフック効果があることを考慮してください。4〜6時間での早期発症劣化と18〜24時間での潜在的または持続的な劣化を確立するために、少なくとも2つの異なる時点をテストすることをお勧めします。.高い分解効力とオンターゲットメカニズムを示す化合物は、4〜6時間の時間枠内で容易に観察されますが、後の時点でのみ観察される分解または明らかなタンパク質損失は、さまざまなメカニズムが原因である可能性があります。タンパク質の損失と細胞死による損失を切り離すことができるように、早期および後期の両方の時点で細胞生存率をモニタリングすることを強くお勧めします。あらゆるタイプの発光アッセイまたは蛍光アッセイと同様に、ライブラリー内の化合物がシグナルを妨害または阻害する可能性があるため、無関係の融合またはタンパク質レベルをモニタリングするための代替アプローチを使用したリード化合物との直交フォローアップ実験は、これらのアッセイにおけるRLUの喪失が標的タンパク質分解に直接関連していることを評価するために重要です。ライブセルキネティックフォーマットで長期間にわたってスクリーニングする能力は、アッセイシグナルからバックグラウンド(S:B)に大きく依存します。その様々な天然複合体における補完のためのタグ付けされた標的の利用可能性。エンデュラジンまたはビバジンのいずれかを使用したキネティックモードでの分解を正常に測定するために、S:B15で構成される一般的なカットオフ要件を確立しました。S:Bは、エンデュラジンまたはビバジン生細胞基質のいずれかの存在下で、LgBiTのみを発現する未編集の親細胞に対して、LgBiTを共発現するHiBiT編集細胞のベースラインシグナルを測定することによって決定されます。ビバジンはより高い発光シグナルを生成しますが、エンデュラジンよりも速く崩壊し、シグナル取得を24時間以下に制限する可能性があります。S:Bは、CRISPRプールとクローンのどちらを使用するかに大きく依存することもあります。CRISPR/Cas9エンジニアリングにより適しており、効率が高い細胞株のターゲットの場合、編集された細胞の不均一なCRISPRプール集団は、速度論的分析に十分なS:Bを有する可能性があります。CRISPRを介したゲノム統合の効率が悪いとS:Bが低いプールになる、より困難な細胞株のターゲットの場合、編集された集団を濃縮し、速度論的分析のために十分に高いS:Bを達成するために、CRISPRクローンを単離する必要があるかもしれません。これらのシナリオのいずれかについて、S:Bがエンデュラジンまたはビバジン基質のいずれかで15未満の場合は、エンドポイント溶解スクリーニングが推奨されます。定量的パラメータによる分解プロファイルの決定を含む化合物のより良い理解と特性評価のために、生細胞でのリアルタイム速度論的分析が推奨されるスクリーニングアプローチです14、18。上記のエンドポイント分析と同様に、初期速度論的スクリーニングは、ハイスループット方式で100nM〜10μMの範囲の限られた濃度数で行うことができます。384ウェルフォーマットでは、100を超える化合物を1つのプレート上で1つの濃度で3回に分けて容易にスクリーニングできます。タンパク質の潜在的な回収率に関するガイダンスを提供します14,18(図2および図3)。劣化プロファイルの形状も貴重な情報をもたらします。特異的で強力な分解剤は、数時間で標的タンパク質がプラトーに急速に変化することがよくありますが18,53、転写フィードバックや化合物毒性などの他のメカニズムは、通常、時間の経過とともにタンパク質のより直線的な損失をもたらします。これらの詳細とニュアンスはエンドポイント溶解分析では見落とされており、24〜48時間にわたるリアルタイム分析では、新しい化合物または未知の化合物のセット内で真のDmaxをキャプチャする時間を予測する必要はありません。初期分解率にどのように影響するかをよりよく理解するための効率的な用量反応スクリーニングを可能にし、複数のパラメータに基づいて化合物をランク付けする可能性を提供します。対照的に、効力を評価するための私たちの速度論的アプローチは、それが時間18でいつ起こるかに関係なく、各濃度での真の分解最大値を組み込んでいます。これを速度論的分解能の測定をDmax5018と呼びます。この方法で分析すると、低濃度で分解を開始する可能性があるため、処理後Dmaxに達するまでに時間がかかる化合物が説明されます。分解率とDmaxの両方で化合物をランク付けすることは特に有益です。強力な劣化剤の場合、これは低速だが強力な劣化剤を高速で強力な分解剤とさらに区別します。包括的な全体像をもたらし、主要な分解パラメータの強化を通じて初期活性評価から下流の化学的最適化までのスクリーニングプロセスを可能にする強力なアプローチです。disclose.AcknowledgementsK.M.R、S.D.M.、M.U.、D.L.Dはすべてプロメガコーポレーションの従業員です。reserved×-1::1。