Lpコロニー化されたハエと同様に、表面滅菌はCFUの有意な減少をもたらしませんでした。同様に、無菌食品への毎日の移動は細菌負荷を大幅に減少させ、均質化前の4時間の無菌条件への移動は細菌負荷のさらなる減少をもたらした。したがって、腸内細菌の正確な定量は、移植日を含む移入の頻度に依存する。エタノール中で洗浄することによって外部細菌負荷を除去することは有意な効果を有しなかったが、異なる細菌株または異なる培養条件に対してより有意な効果が観察され得る。これらの要因は実験的に制御する必要があります。CFUカウントに対する均質化法の潜在的な影響もテストされました。μmのガラスビーズを含むビーズビーターを使用して均質化され、細菌細胞の生存率を低下させる可能性がありました。培養液からのLp細菌の懸濁液をPBSで調製し、次に播種してCFUをポジティブコントロールとしてカウントしました。同じ培養物をビーズビータープレートに入れ、(i)ビーズでホモジナイズ、(ii)ビーズおよび無菌フライでホモジナイズ、または(iii)ビーズなしでPBSでホモジナイズした(図1D)。ハエがいたときのビーズの均質化は、溶液中の生細胞の存在量に大きな影響を与えませんでしたが、ハエの不在下での細菌の均質化は、かなりの数の細菌細胞を殺しました。ビーズを含まないPBSでのホモジナイズも、生細胞の数を大幅に減少させました。同様に、Aiの生存率は、ハエの存在下でホモジナイズした場合に維持されましたが、ハエなしでホモジナイズすると、溶液中の生細胞の数が減少しました(図1E)。これらの結果は、ハエ組織がホモジナイズ中にビーズによって破壊されるのから細菌を保護することを示しています。図1Dおよび図1Eの実験は、ウェルあたり10個を超える8CFUを使用して実行されました。実際には、1ウェルあたり~106細胞以下のウェルは、ビーズをフライなしで使用した場合、細胞損失がほとんど見られないことがわかりました。ビーズビートの途中でプレートを氷上で冷却すると、細胞の生存率も向上します。これらの結果の重要性は、読者がこれらの潜在的な問題を認識し、特定のユースケースに適したコントロールを設計する必要があることです。ハイスループットCFU定量のためのスポットプレーティング96ウェルプレートの精度目標は数百から数千の個々のハエのCFU存在量を測定することであるため、従来のスプレッドメッキ法は法外に時間と材料集約的です。スポットメッキは、CFUの成長と列挙のための効果的かつ効率的な方法です19,31。μLの細菌懸濁液を分注します(図2A)。各スポットは1つのサンプルの細菌負荷を表すため、1枚のプレートで96匹のハエを分析できます(図2B)。ODのLp懸濁液を使用して成長プレートを接種することにより、従来のメッキと比較されました。懸濁液をPBS中で5回連続希釈して2倍にした。μLのスポットを長方形のMRSプレートに作成しました。プレートをコロニーが計数可能になるまで30°Cでインキュベートした。得られた各希釈液のCFUカウントを使用して、懸濁液の元の濃度を計算し、比較した(図2C)。CFUの丸板をコントロールとしてカウントしました。高スループットと従来の丸型めっき法の間に有意差は見られませんでした。コロニーの密度はそれらの成長と定量に影響を与える可能性があるため、最終カウントに対するCFU密度の影響がテストされました。スポットあたり2〜25コロニーのスポットは、従来の丸板法と比較して最終カウントに差を示さなかった(図2C)。個々のスポットの写真を詳しく調べると、このスキューは密集したスポットでコロニーが重なっているためであることが示されました。白色光または蛍光のいずれかを備えた特殊な写真プラットフォームを使用して、定量化用の高品質画像を生成ハイスループットのスポットプレーティングは、自然に多数のターゲット領域を生成し、正確にカウントする必要があります。高品質の写真を使用して、データを文書化し、CFUのカウントを容易にすることができます。市販の材料を使用して、堅牢でわかりやすい写真プラットフォームが開発されました(図3A)。デジタルカメラは、FluoroBoxと呼ばれるカスタムビルドのライトボックスの上部にあるブラケットに取り付けられ、プレートの中心に垂直に真下に向けられました。着色された発光フィルターは、フィルタースライダーを使用してレンズの前に任意に配置されました。ライトシールドは、下のLEDストリップからの直接光を遮断することにより、レンズフレアを防ぎました。LEDストリップは、プレートのまぶしさを防ぐために、上ではなく側面からプレートを照らしました。白色光に加えて、単色の青色および緑色のLEDを使用して、それぞれ緑色および赤色の蛍光タンパク質を励起した。プレートは引き出しのプレートホルダーで所定の位置に保持され、引き出しにはプレートを簡単に挿入できるように引き出しスライダーが装備されていました。Lpコロニーのスポットプレートの写真は、白色光LEDとデジタルカメラを使用して撮影され、コロニーを数え、さまざまな色と形態を区別するのに役立ちます(図3B)。照明強度が均一であることを検証するために、寒天の背景強度をプレート写真のさまざまな領域で測定しました(図3C)。コロニーがバックグラウンドと明確に区別できることを実証するために、プレートの異なる部分上の10の異なるコロニーの直径にわたる強度を測定し、バックグラウンドよりも約~300%高いことがわかりました(図3C)。プレートにmCherry蛍光タンパク質発現プラスミドと、プラスミドを含まないLpを接種したため、コロニーはmCherry陽性またはmCherry陰性のいずれかでした。#29)を備えた同じカメラを使用してプレートを撮影し、mCherry陽性コロニーを蛍光させました(図3D)。mCherry陽性とmCherry陰性の間の強度の差は、コロニーのサンプル(n=10コロニー)にわたる強度を測定することによって定量化した。mCherry陽性コロニーは、mCherry陰性コロニーよりも~1,000%高い強度であった(図3E)。#58)を用いて撮影した(図3F)。GFP陽性コロニーは、GFP陰性よりも200%高い強度を示した(図3G)。自動カウント写真だけでコロニーのカウントに役立ちます(たとえば、データの保存、データの共有、ズームイン、オーバーレイのマーキング、色の分離など)。何百ものスポットの結果を手動でカウントして整理する作業は、面倒で時間がかかり、最終的なカウントに人間と人間の違いが生じやすい場合があります。カウントプロセスを高速化し、カウントの再現性を標準化するために、Count-On-Itと呼ばれる特殊なImageJプラグインが開発されました(図4A)。このプラグインは、寒天プレート上のCFUの正確な半自動カウントを可能にします。ユーザーは、最初に追加のCroptacularプラグインを使用して画像をトリミングおよび調整することにより、カウント用の画像を準備します。写真はオプションでバッチ処理でき、プレートごとにしきい値を調整できます。他のいくつかのオプションを使用すると、光の波長(RGB画像)の調整、コロニーサイズの範囲(ピクセル単位)の設定、最大アスペクト比の変更、アクティブな選択グリッドのサイズのカスタマイズなど、プレートカウントの精度を高めることができます。カウントオンイットは、各プレートがCFUカウントの列として表された結果のテーブルを出力します。オーバーレイを示す写真レシートを生成して、カウント結果を視覚的に文書化し、手動のエラー修正を支援します(図4B)。0.93)が、コロニー数が20を超えると誤差は増加しました。Count-On-Itは、FluoroBoxの蛍光機能を使用して蛍光コロニーを個別にカウントするためにも使用できます。ソフトウェアプラグイン対手動によるmCherry陽性コロニー数(図4D)は、0.92のR2を有していた(図4E)。同様に、ソフトウェアプラグインで計数したGFP陽性コロニー(図4F)は、手動と比較してR2が0.90であった(図4G)。蛍光コロニーと非蛍光コロニーは単一のサンプル内で区別でき、コロニーのサイズと形状はさらに別々の亜集団を区別するために使用できます(図4H-K)。写真の領収書は、ユーザーがカウントの精度をすばやく確認し、エラーを手動で修正できる記録を提供します。図4C、E、G、I、Kでは、読者がメソッドの生の出力を確認できるように、カウント精度を向上させるために写真の領収書は使用されていません。図4Gのように、手動で1カウントすると21の自動カウントになるケースは、写真の領収書を使用してすばやく検出できます。この場合、プレートの端のグレアはコロニーとしてカウントされたブロブを作成しました。ユースケースごとに、高スループットカウントの前にソフトウェアプラグインの最適な設定を決定する必要があります。図1:コロニー形成アッセイは、96ウェルプレートフォーマットを使用して数百匹の個々のハエのCFUを測定します。(A)プロトコルのセクションに記載されているように使用されるコロニー形成アッセイおよびハイスループット定量法の絵の概要。(Lp)の存在量を、ハイスループットCFU定量法を用いて様々な条件下で測定した。合計724匹のハエ、3回の生物学的複製、~72匹のハエの治療あたり)。(Ai)を用いて行った(n=528匹のハエ)。236サンプルウェル)。生存率は、(D)(n=282サンプルウェル)と同様の方法で試験した。パネルの統計的有意性(B-E)は、クラスカル-ウォリス検定とそれに続くボンフェローニの多重比較補正によるペアワイズウィルコクソン順位和検定を使用して計算されました。ボックスは四分位範囲を与えます。線は中央値を示します。ひげは全範囲を与えます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。図2:ハイスループットCFU定量のためのスポットプレーティング96ウェルプレートの精度。μLを分注するスポットプレーティング。コロニーの96スポットを有するMRS寒天成長プレート。680スポット)を連続希釈し、スポットあたりの平均コロニー数で配置しました(3つの複製プレートの単一希釈係数ごとに~48スポットをカウントしました)。各データポイントはスポットあたりの正確なコロニーを表し、各列はその希釈の平均コロニーを表します。横の点線は、播種した培養液の計算CFU数を示す。緑色の輪郭のポイントは、従来の丸板の数を強調しています。CFUの最適なコロニー密度を強調しています。統計的有意性は、ボンフェローニの多重比較補正を用いて、各列の平均をスプレッドプレートコントロールカラムの平均と比較する通常の一元配置分散分析を使用して計算されました。ボックスは四分位範囲を与えます。線は中央値を示します。ひげは全範囲を与えます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。図3:写真プラットフォームは、白色光または蛍光を使用してプレートの定量化可能な画像を生成します。(A)フロロボックス設計の概要。コロニーのスポットプレートの写真。(c)バックグラウンドの強度と比較した白色光下での単一コロニーの強度プロファイル(BKG)(n=10コロニー、破線は標準偏差を表す)。(E)mCherry発光の有無にかかわらずコロニーの違いを示す単一コロニーの強度プロファイル。コロニーを含むスポットプレートの写真で、そのうちのいくつかはGFP標識を有する。(g)GFP陰性コロニーとGFP陽性コロニーの違いを示す単一コロニーの強度プロファイル。E、F、G:n=各プロットにつき10コロニー。