微生物叢に適用します。CFUは、ここで提供される自動画像解析ソフトウェアでカウントされます。Abstract動物の腸は共生微生物によってコロニー形成され、宿主の発達、健康、行動に影響を与えます。コロニー形成の正確な定量は、微生物組成を検証し、その影響を研究するために、宿主と微生物の間の複雑な相互作用を研究するために不可欠です。ショウジョウバエメラノガスターは、天然微生物の多様性が低く、定義された微生物組成で飼育するのに経済的であり、腸内細菌叢を研究するためのモデル生物として浮上しています。個々の生物の微生物叢を分析するには、どの微生物種が存在するかを特定し、それらの絶対的な存在量を定量化する必要があります。この記事では、多数の個々のハエの微生物叢を分析する方法を紹介します。ハエは96ウェルプレートで調製され、一度に多数のサンプルを処理することができます。微生物の存在量は、1つの寒天プレート上に最大96個の全フライホモジネートを一連のスポットでメッキし、各スポットで成長するコロニー形成単位(CFU)をカウントすることによって定量化されます。このメッキシステムは、プレートの写真撮影、蛍光コロニーの分化、ImageJプラグインを使用したコロニーの自動カウントを組み込んだ自動CFU定量プラットフォームとペアになっています。利点は、(i)この方法は処理間の違いを検出するのに十分な感度であり、(ii)スポットめっき法は従来のめっき方法と同じくらい正確であり、(iii)自動計数プロセスは手動計数よりも正確で高速です。その他の小動物モデルを含む他の微生物学研究システムに適用できます。Introduction腸内細菌叢とその動物宿主との関係は、微生物叢の菌株組成が宿主生理学にとって重要であることを示す生物学的研究1の最前線にますます進んでいます2,3,4。発見のペースは、高い自然の個体間変動やコロニー形成細菌の多様性の高さなどの交絡因子によって制限されてきました5,6,7。ショウジョウバエ、ショウジョウバエメラノガスターは、その自然に多様性の低い微生物叢、取り扱いの容易さ、および堅牢な宿主遺伝学のために有望なモデルとして浮上しています8,9,10,11。ハエは無菌にすることができ、定義された微生物叢12と再関連させることができ、フローラがハエの生理学的形質に影響を与えることが示されています13,14。先天的な細菌叢は、すべて培養可能な限られた細菌のセットで構成されており、これらの近親者も、乳酸菌、プロテオバクテリア、腸球菌などの哺乳類の腸に内因性です15。宿主形質に対するマイクロバイオームの影響を研究するには、存在する種とその絶対存在量の両方の観点からマイクロバイオームを定量化する必要があります16。rRNA遺伝子のqPCR18です。CFUカウントは、高価な試薬なしで得ることができ、それらは細菌細胞の生存率を確認する19。qPCRを含む16S技術には、微生物の成長要件やコロニーの形態に関係なく、微生物の分類学的同一性を確認できるという利点があります20。実験で既知の細菌の定義された微生物叢を持つハエを使用する場合(グノトバイオティックハエ)、CFUカウントはシーケンシング21よりも特に有利です。シーケンシングは高価であり、相対的な存在量を得るためには、DNA抽出、PCRベースのライブラリ調製、およびハイスループットシーケンシングが必要です22。コストが高いため、ハイスループットシーケンシング法は、通常、サンプルあたりの価格を下げるために一括で実行する必要があります23。絶対存在量を得るためには、qPCRなどのさらなる方法が必要です16。対照的に、CFUカウントは迅速かつ安価であり、生細胞の絶対数を示します。elegans25,26、および幼虫のゼブラフィッシュ、ダニオレリオは、グノトビオティックに成長しました27、既知の成長特性28を持つ細菌の範囲が限られています。これらの場合、特にグノトバイオティック動物では、CFUカウントは、多種の腸内コミュニティ内のすべての種の細菌を区別することができます21、27、29。ハイスループットCFU計数法は、マイクロバイオームの組成を測定する費用対効果と速度をさらに向上させ、他の多くの微生物学実験に適用できます。寒天ベースの増殖培地上の細菌懸濁液の段階希釈プレーティングによるCFUの計数は、微生物学の分野全体の標準的な方法です。プレート上で成長するコロニーは、手動でカウントされます。希釈により、研究者はカウント可能なコロニーの密度(例えば、プレートあたり~100CFU)を選択できるため、コロニーは互いに成長せず、妥当な時間でカウントできます。Kochの研究室で開発されたのと本質的に同じCFU計数法を使用しており、多くのアプリケーションでは、この方法は依然として適切です。多数のサンプルを定量しようとすると問題が生じる。単一のサンプルでは、カウント可能なCFUを得るためにサンプルの1〜10段階希釈をメッキする必要がある場合があるため、数十を超えるサンプルを含む実験には負担がかかります。CFU列挙の効率を高めるために、さまざまな方法が開発されています。自動スパイラルメッキにより、連続希釈30が不要になり、CFUカウントに必要なプレートは1つだけになりますが、サンプルをプレート化する時間が長くなります。シングルプレートシリアル希釈スポッティング(SP-SDS)は、サンプル31あたりのより少ないプレートからのCFU推定を可能にします。これらの方法は、従来のスプレッドプレーティング法を改良したものですが、細菌サンプルの取り扱いとメッキを単独で行う必要があるため、ハイスループットには理想的ではありません。96ウェルプレートでサンプルを処理し、それらの96サンプルを長方形の寒天プレートにスポットプレーティングすることで、サンプル19のスループットが大幅に向上します。マイクロバイオームは通常、複数の株と種で構成されています。種はしばしばコロニー形態または成長培地によって区別することができるが、蛍光は、異なるタイプの細菌およびそれらの成長形質をさらに区別するために使用することができる32。同じ種の異なる遺伝子型は、異なる遺伝的にコードされた蛍光タンパク質で標識することができる。蛍光を組み込んだプレートイメージング法により、研究者はCFUベースのアッセイ32においてこれらの遺伝的手法を利用することができる。蛍光をハイスループットCFU計数法に組み込むことで、その有用性がさらに高まります。サンプル数が多い場合、CFUを手動でカウントするのは面倒になります。CFUの自動計数は、プレートを撮影し、専用ソフトウェア33を用いて画像を処理することによって行うことができる。Sieuwertsらは、スポットプレーティングの改善されたメッキ効率と、従来のデジタル写真とImageJソフトウェアを使用した自動コロニーカウントを組み合わせました19。特定の微生物の表現型と宿主の関連をスクリーニングするハイスループット法は、微生物叢のコミュニティアセンブリと宿主の健康とフィットネスへの影響の研究に役立ちます。微生物叢の研究には、ハイスループット微生物学プラットフォームには、96ウェルプレートフォーマットでのフライサンプルの取り扱い、細菌溶解なしのフライ溶解、スポットプレーティングの効率、蛍光を使用して複数の蛍光色素を区別する機能、CFUプレートの再現性のあるイメージングのための制御された光環境、および信頼性の高い自動コロニーカウントソフトウェアが組み込まれます。この記事では、グノトバイオティックハエのCFUアッセイに最適化された、シンプル、高速、自動化された方法について説明します。ショウジョウバエの腸内細菌叢を探索するために最適化された新しいワークフローの概要を示しています。注:この方法は、CFUの成長プレーティングによる培養可能な腸内細菌叢を持つハエの定量分析に適しています。グノトバイオティックハエを飼育するための詳細なプロトコルは、以前に公開されています12。共生細菌種による安定したコロニー形成を確立する。gで遠心分離してペレット化し、細胞ペレットをPBSに再懸濁してOD600を1.0にします。plantarumとして知られていた)を一晩でOD600の2.0に増殖させた。均等に広げ、液体を15〜30分間吸収させます。20匹の無菌ハエを、標準バイアルからバイアルへの反転技術34を用いてこのバイアルに移す。各ハエはほぼ同量の細菌量35を食べるでしょう。無菌卵を加えることができます。ハエを新鮮な滅菌食品に3日間毎日移します。これらすべてをバイオセーフティキャビネットで行い、滅菌技術を使用します(図1A-1)。CFU負荷を測定する前に、ハエを滅菌寒天水を含むバイアルに4時間移して、腸から一過性の細菌を取り除きます。寒天水バイアルは、ハエに水分源を提供しますが、ハエや表面のバクテリアには栄養を与えません。それらは標準的な食品と同じ滅菌フライバイアルで調製されますが、脱イオン水と1.5%寒天のみが含まれています。ビードビータープレートを事前に準備してください。S1-bead-measurer.stlを使用して3Dプリント)。すべてのウェルがいっぱいで水平になるようにトレイにビーズを広げてから、余分なビーズを円錐形のチューブに払い落として回収します。材料表を参照)を測定トレイに逆さまに置き、測定トレイのくぼみにはめ込んでウェルに合わせます。次に、すばやく裏返してビーズを移します。PCRプレート表面から余分なビーズを取り除き、ホイルで覆います。PCRプレートを検査して、すべてのウェルにビーズが含まれていることを確認します。必要に応じて計量スクープを使用して、単一のウェルにビーズを追加します。静電気が原因でビーズがプレート表面に付着している場合は、測定トレイとPCRプレートの背面を70%エタノールで拭くかスプレーします。アルミホイルで覆います。多くのプレートはこの方法で調製し、オートクレーブ滅菌して後で使用するために保管することができます。μLのPBSを追加します(材料の表を参照)。均質化する前に、微生物コロニー化したハエを70%エタノールで表面滅菌します(ステップ1を参照)。ハエを100%CO2で5秒間麻酔します。mLの微量遠心チューブに移します(図1A-2)。この研究では、通常、チューブごとに25匹のハエが追加されました。mLの70%エタノールをチューブにスプレーし、チューブを閉じて10秒間反転混合します。次に、ハエを吸引しないように注意しながら、P1000ピペットでエタノールを吸引します。エタノールでもう一度繰り返し、次に滅菌PBSで2回繰り返します(図1A-3)。最後のPBS洗浄後、チューブを閉じ、キャップ側を下にして、ハエがキャップに入るようにベンチで数回強くたたきます。チューブを開き、鉗子を使用してハエをウェルに分注します(図1A-4)。各ウェルに1匹のフライを置きます(図1A-5)。ハエに麻酔をかけ続けるために、ロード中はプレートを氷の上に保ちます。サーマルボンドヒートシールフォイルを使用してプレートをシールします(材料の表を参照)。ウェルの近くにある浮遊ビーズは、ホイルシールの漏れを引き起こす可能性があるため、取り除きます。ホイルの鈍い側がプレート上で下向きで、光沢のある側がヒートシーラーに向かって上を向いていることを確認してください。ヒートシーラー(材料の表を参照)を5秒間しっかりと押し下げます(図1A-6)。ハンドアプリケーター(材料の表を参照)で磨き、ホイルを固定します。シーリング不良はサンプル損失の原因です。プレートをプレートシェーカーに固定します。5分間ホモジナイズします(図1A-7)。gで30秒間スピンダウンして、シーリングフォイルから液体を取り除きます。プレートを保持しながらホイルを取り除き、ウェルからフライホモジネートの液滴をはねかけないようにします。材料の表を参照)をバイオセーフティキャビネットに入れ、蓋を取り外します。L.プランタルムの成長に使用されました。これらのプレートを少なくとも10分間乾燥させます(注ぎたてまたは保管から冷やした場合は20分)。注:プレートが濡れている場合、96ウェルプレートからの液滴が一緒に流れ、カウントが台無しになります。μLのPBSを添加して、3つの希釈プレートを調製します。P20チップのラックを96チャンネルピペッターにロードします。μLのホモジネートを吸引することにより、1:10希釈を行います(図1A-8)。フライホモジネートとガラスビーズがピペットを詰まらせるため、ウェルの底ではなくウェルの中央から必ず引き出してください。ビーズが沈み、ハエの粒子が浮き、中間層がほとんど透明になります。μLの滅菌PBSがすでに含まれている最初の希釈プレートに分注します。希釈プレートをプレートシェーカーに600rpmで10秒間保持します。5サイクル上下にピペッティングして再度混合します。μLを第1希釈プレートから第2希釈プレートに移し、次の2つの希釈プレートに対して混合ステップを繰り返します。下記のように希釈系列めっきを行う。バイオセーフティキャビネットから成長プレートを取り出します。μLスポットします(図1A-9)。寒天に刺さらないように注意しながら、ピペッターヘッドをゆっくりとプレートの上に下げます。プレートを注意深く調べ、すべてのスポットが分配されていることを確認します。液体スポットが寒天にすばやく浸り、一緒に流れないことを確認してください。スポットが一緒に走る場合は、新しい寒天プレートのセットを長期間乾燥させ、スポッティングをやり直します。複数のプレートタイプがある場合(例:異なる培地または抗生物質を使用)、それらも見つけてください。残りの溶液を希釈プレートに分注し、次に高い濃度に進みます。希釈液を見つけるときは、次の希釈液を5回混合して、ピペットチップの内容物から前の希釈液が確実に除去されるようにします。希釈プレートは、コロニー数35に影響を与えることなく、4°Cで>8時間保存できます。残りの希釈プレートについてステップ3.5で説明したようにメッキプロセスを繰り返し、元のホモジネートを含むプレートまで、最も希薄なものから最も濃縮されたものへと進行します。すべての液体が寒天に吸収されたら、プレートを反転させてインキュベーターに入れます(図1A-10)。ショウジョウバエ由来のラクチプランチバチルスおよびアセトバクターの場合、MRS培地の最適温度は30°Cです。コロニーが最適なサイズに達するまでインキュベートします:コロニーはそれらをはっきりと見るのに十分な大きさですが、それらが融合したり互いの成長を妨げたりするほど大きくはありません(最適なサイズの定量化については、代表的な結果を参照してください)。注:最適な成長条件は菌株に依存し、経験的に決定する必要があります。ショウジョウバエ由来のラクチプランチバチルスの場合、最適なインキュベーション時間はMRS寒天培地で26時間から30時間です。ショウジョウバエ由来のアセトバクターの場合、最適なインキュベーション時間は、菌株に応じてMRSで30時間から48時間です。インキュベーション後、必要に応じてプレートを4°Cでカウントする準備ができるまで保管します。プレートを撮影し、以下に詳述するように、自動化されたソフトウェアを使用してコロニーをカウントすることにより、CFUを定量化します。プレートを4°Cで保管する場合は、まず室温に到達させて、プレートに結露があってグレアが発生しないようにします。プレートを論理的な順序で整理し、撮影中にその順序で保持すると、ファイルに名前を付けやすくなります。A1がすべてのプレートの左上隅になるように、すべてのプレートの向きを設定します。写真が混同されないように、A1コーナーに一意のIDのラベルを付けることをお勧めします。各希釈系列を順番に積み重ねます。プレートの蓋を外し、A1を正しい隅に向けてプレートをステージに置きます。プレートフォトボックス(補足ファイル1、補足ファイル2)のデザインは、これらのトレイプレートの撮影に最適化されており、蛍光コロニーを画像化するための照明とフィルターのオプションが含まれています。プレートをイメージします。材料表を参照)を手動設定で使用して、プレート間で一貫した露出レベルを実現します。遠近法の歪みを最小限に抑えるために、焦点距離を長く設定することをお勧めします。手ぶれによるぼやけを最小限に抑えるために、リモートシャッターを使用して写真をキャプチャします。画像をコンピューターに転送し、実験名、培地の種類、希釈係数、その他の関連する詳細など、名前を変更します。材料表を参照)には、Finderで選択したファイルを右クリックして便利なバッチ名前変更機能があります。ImageJ用に提供されているCroptacularプラグイン(補足コーディングファイル2)を使用して画像をトリミングします。サブリージョンは個別にカウントされます。Circus_.ijmに記載されています。定量化のために処理する画像をフォルダーに整理します。プレートを区別するファイル名を選択します。これらのファイル名は、カウントのセットごとに列タイトルになります。このフォルダ内で、「トリミング済み」および「レシート」という名前のサブフォルダを作成します。クロプタキュラーを起動し、[OK]をクリックしてトリミングを開始します。メモ:デフォルト設定が表示され、通常は十分です。画像の解像度、照明、スポットサイズなどに応じて、基本パラメータを調整すると便利な場合があります。スペースキーを押すだけです。それ以外の場合は、水平になるはずのエッジに沿って線を引いて画像をまっすぐにします。それでも画像がまっすぐに表示されない場合は、必要な回数だけ線を再描画します。次に、カウントを行う領域の境界ボックスを描画します。すべてのスポットがセル内に入るまで、サイズと比率を調整します。カーソルを境界ボックスの外側にドラッグして、グリッドを更新します。次の画像が最初の画像と同じ角度に自動的に回転することを確認します。プラグインは、すべての写真が同じ位置に配置されていることを前提としています。キーを押して続行します。それ以外の場合は、前と同じように画像を傾き補正します。グリッドは、前の画像と同じ位置も呼び出します。使用して、プレート上のコロニーを列挙します。補足ファイル3に含まれています。グリッドアイアン>カウントオンイットを起動します。クロプタキュラーと同じグリッド設定を使用します。つの画像を分析したり、現在の画像から開始したりできます。ピクセル強度の上限と下限に基づいてしきい値を設定します。すべてのコロニーを選択しながら、しきい値をできるだけ厳しくします。理想的には、選択したコロニーの間にいくらかのスペースがありますが、ソフトウェアはブロブをある程度セグメント化することができます。結果を調べるには、拡大してコロニー数をより詳しく調べます。クリックすると、プラグインが中止されます。クリックして続行します。最初の画像で、続行するか、セットアップメニューに戻るオプション(たとえば、最小コロニーサイズを変更する)が指定されていることを確認します。次に、領収書と結果のテーブルを保持するフォルダーを選択します。「領収書」フォルダを使用するか、新しいフォルダを作成します。最初の画像の後、次の画像はデフォルトで前の設定と同じしきい値になります。クリックしてこれらの設定を使用するか、設定を調整します。注:バッチ内のすべての画像が完了すると、結果テーブルは領収書と同じフォルダに自動的に保存されます。ソフトウェアによって生成されたカウントレシートを確認し、カウントエラーを手動で修正します。プラグインは統計的に正確ですが、エラーが発生します。領収書を証明して外れ値を調べ、ミスカウントを特定します。ソフトウェアは、CFUデータをレシートと同じフォルダに.csvファイルとして保存します。ユーザーが好むソフトウェアを使用してデータを分析します。Resultsコロニー形成アッセイを使用した96ウェルプレートフォーマットでの数百匹の個々のハエのCFUの列挙多くの個々のハエの微生物叢の構成を理解するために、付属のプロトコルを使用してCFUを測定し、存在する種、コロニーに生息するハエの割合、および各ハエの細菌の絶対存在量を特定できました。微生物叢組成で観察された個人間の大きな変動の理由はよく理解されておらず、コロニー形成の統計的分布を定量化することは、この変動を研究するのに役立ちます36,37。かなりの数の生物学的複製を得るために、CFUカウントを使用して多くの個々のハエの微生物の存在量を定量するためのハイスループットパイプラインが開発されました(図1A)。CFUの最終的な定量は、表面滅菌、細菌の消費からの時間、腸からの一過性細菌のクリアランスなどの要因など、分析前のハエの処理方法によって影響を受ける可能性があります。CFUのLpを与え、バイアルあたり25匹のハエのグループで飼育した。これらのハエは、同じバイアルに3日間保管するか、毎日新鮮な滅菌食品に移しました(図1B)。次に、未移送のハエをエタノールで洗浄して表面の細菌を除去する(洗浄)か、洗浄しない(未洗浄)かのいずれかでした。洗浄は、測定された総CFUの有意な減少をもたらし(図1B)、これらの高度に制御された接種条件下では、ハエの表面が3日間で細菌によって有意にコロニー形成されないことを示しています。ハエの他のグループは、食物の成長による細菌の蓄積を減らすために毎日移動されました(転送)。グループをサンプリング前に4時間生鮮食品に移すか(ポストトランスファー)、または滅菌寒天水のみを入れたバイアルに4時間入れ(クリア)、一時的に摂取した微生物を腸から除去できるようにしました。厳密なコロニー形成測定を提供するためのこれらの各ステップは、エタノールでの表面洗浄を除いて、ハエのCFUの存在量の統計的に有意な減少をもたらした。測定前の4時間、無菌食品(移管後)または寒天水(クリア)に移すと、見分けがつかない効果が得られ、測定の4時間前に無菌状態に移すと細菌負荷が軽減されることが示されました。この結果は、ハエ腸内の一部の腸内細菌は一過性であり、他の細菌はより安定に関連しているという解釈と一致しています35。