この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。ImageJプラグインによるスポットプレートの正確なカウント。プラグイン設定ウィンドウのスクリーンショット。プラグインは、ドキュメントカウントの領収書を生成し、エラー修正を支援します。各スポット領域でカウントされたコロニーの数とオーバーレイします。黄色のアウトラインは単一のコロニーがカウントされたことを示し、赤色は複数のコロニーがカウントされたことを示します。0.95、シアン線、1:1の線は赤で点線。(D)フォトボックスの蛍光機能を用いてmCherry陽性コロニーを選択したときのプラグインからのフォトレシート画像。E、G、I、Kの分析レシートを使用して修正されていないことに注意してください。(F)フォトボックスの緑色蛍光機能を使用してGFP陽性コロニーを選択し、プラグインで緑色チャネルを選択した場合のプラグインからのフォトレシート画像。(h)混合コロニー形態から選択されるmCherry陽性コロニーをプラグインで高い蛍光閾値を用いる。(j)低蛍光閾値を用いた混合コロニー形態から選択されるmCherry陰性コロニー。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。補足ファイル1:フルオロボックスの組み立て手順。このファイルは、ビデオで使用される制御された照明ボックスの構築を段階的に読者に説明します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。補足ファイル2:フルオロボックスアクリルレーザーカット。このファイルは、制御された照明ボックスのアクリル片をレーザーカットするためのカットテンプレートを提供します。ファイルは、レーザーカットされたアクリルベンダーに送信できます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。補足ファイル3:ソフトウェアの説明。このファイルは、このプロトコルで提供されるCroptacularおよびCount-On-Itソフトウェアのインストールと使用法を段階的に説明します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。(S1-bead-measurer.stl)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。(Croptacular_.ijm)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。(Circus_.ijm)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。(Gridiron_.ijm)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。Discussionここで紹介する詳細な手法により、CFUカウント実験で評価できるサンプル数を>100倍に増やすことができます。この技術は、ショウジョウバエ12,35,36におけるマイクロバイオーム実験の既存の方法を、96ウェルプレートフォーマットを使用して個々のハエをアッセイすることにより進歩させます。効率的なスポットプレーティング法19、31および写真およびコロニー計数プラットフォームを備えた自動化されたワークフローを適用する。ショウジョウバエにとってのこの方法の意義は、実験を96ウェルプレートフォーマットに標準化し、CFUのハイスループット定量化を自動化して多数の生物学的複製を同時に処理できるようにすることです。96ウェルプラットフォームは、移動頻度の増加と一過性細菌の「除去」が、平均存在量とサンプル間の変動の両方を大幅に減少させることを示しており(図1B、C)、この改善されたプロトコルの厳密さを示しています。コハウジングハエの1つの制限は、ハエ間の細菌の水平移動です。Flat38など)に個別に保管することです。ハエをエタノールで洗浄した場合、細菌量の有意な減少は観察されなかったが、これらのハエは外部細菌の存在下で3日間しか飼育されていなかった。長期間収容すると、より大きな細菌負荷が蓄積する可能性があります39。したがって、エタノールでの洗浄が依然として推奨されます。ハエを96ウェルプレートに移すことは、ワークフローを設定するための重要な最初のステップです(図1A)。ハエが洗浄されると、それらは一度に1つずつウェルに分配されます。プレートチャートは、この段階で、各ウェルにどの条件が存在するかを記録し、「ハエが失われた」などのメモを追加するのに役立ちます。均質化は、いくつかの重要な注意点があるもう一つの重要なステップです。バクテリアはハエの存在下で均質化プロセスを生き延び(図1D、E)、おそらくこの原理はバクテリアがハエの腸内にいる場合にも当てはまります。細菌はビーズビータープレートのみで均質化されると死滅し、均質化が特定の状況で細菌細胞を殺すことができることを実証しており、例えば解剖された腸を均質化する場合に重要であり得る制限。CFUを使用した場合の損失は最小限に抑えられます。CFUのさらなる保存は、均質化を途中で停止し、氷上でプレートを冷却することによって達成することができる。このプロトコルでは、既知の数のCFUを無菌ハエと混合した対照実験に基づいて均質化を5分間実行し、これはハエ菌に対して経験的に機能しました。叩解が少ないとフライパーツが大きくなり、ピペッティングが妨げられますが、均質化時間が~10分と大幅に長くなると、CFUカウントの変動が大きくなります。mLチューブと比較してビーズの叩解効率が低下することが観察されました。この一般的なアプローチには、どの細菌株、どのビーズビート容器、どのビーズ、どのハエ遺伝子型が使用されるかなど、多くのバリエーションが可能です。コントロールを使用してアプローチを確立する必要があります。WFの1:2希釈をMRSプレートにスポットし、30°Cで2日間インキュベートするという特定の方法で採用されました(より小さなコロニーサイズを生成するために、より短いインキュベーション時間を実施できます)。この方法では、主にビーズビーターと96チャンネルピペッター(図2A)などの装置への先行投資が必要であり、希釈シリーズとスポットメッキの両方が必要です。スロット付きピンを備えた96ウェルプレートリプリケーターなど、より安価なオプションが利用可能です。希釈シリーズは、CFU計数結果の精度に影響を与える重要なステップです。故障モードに関しては、フライ部品やガラスビーズでピペットチップを詰まらせたり、ピペットチップがピペッターに適切にシールされなかったり、その他の理由で故障したりする可能性があります。これらすべての問題は、影響を受ける井戸の過小評価をもたらすため、監視する必要があります。希釈シリーズの各ステップでの適切な混合も重要です。各希釈液は、プレートをプレートシェーカーに置くか、チップをすすぐのにも役立つ15〜20回上下にピペッティングすることによって完全に混合する必要があります。希薄なプレートから最も希薄でないプレートまでスポッティングすることで、チップを希釈シリーズ全体に再利用できます。1:2希釈では、2〜25コロニーの範囲でカウントが正確であり、桁違いにまたがります(図2C)。したがって、1:10希釈は時間と材料を節約できます。利用できる別の変数はインキュベーション時間であり、これはより小さなコロニーを生成するように調整することができ、したがって、隣接するコロニーの合流を防ぐことによってカウント可能なスポットの範囲を広げることができる。プレートの高品質な写真は、CFUが分析され、無期限にアーカイブできる生のソースデータになるため、不可欠です。FluoroBoxは、寒天表面のまぶしさを最小限に抑える均一な光強度でプレートの写真を生成するように設計されています。この設計は、単色LEDライトとカラーフォトフィルターを使用して蛍光コロニーを選択的に撮影することができます(図3A)。照明とカメラの設定を制御したFluoroBoxのようなセットアップを構築することで、自動分析に重要なCFU画像の再現性を大幅に向上させることができます。コロニーの形態、蛍光強度、コロニーの成長に対する時間または密度の影響は、写真を使用して分析できる特性のほんの一部です。フォトボックスは、蛍光細菌を使用しない場合、カラーフィルターと単色ライトなしで構築できるため、コストと複雑さが軽減されます。ラボで異なる蛍光色素を使用する場合は、ここで推奨されているものの代わりに異なる励起光と発光フィルターを使用できます。アプリを使用してWiFi経由でタブレットに接続されているカメラは、揺れを防ぐための自動シャッター機能とデータ転送の容易さの両方に役立ちます。画像はタブレットに転送してから、ワイヤレスファイル転送ソフトウェアを使用してラップトップに転送できます。材料の表に示されています。カウントオンイットは、ImageJで書かれたプラグインです。自動CFU計数ソフトウェアは、プレート画像を均一な96ウェルグリッドに分割し、各グリッドセルのコロニーをカウントし、結果を単純なスプレッドシートにバッチ処理します。プレート上と写真内のスポットグリッドの位置は常に変動するため、ユーザーはCroptacularプラグインを使用してグリッドを写真に手動で適合させる必要があります。これは、グレアのあるプレートエッジ近くの領域を除外するのにも役立ちます。しきい値の設定は、画像から最も正確なCFUカウントを取得するための鍵です。しきい値の設定が高すぎると、コロニーがマージされます。しきい値の設定が低すぎると、コロニーは除外されます。閾値が設定されると、マクロはガウスぼかしを適用してエッジを柔らかくし、エイリアシングを減らし、流域フィルターは重なり合うコロニーを分割し、ブロブはパーティクルの分析を使用してカウントされます。時々、コロニーの密度が特定の場所で高すぎる。Count-On-Itは、これに対処する方法を提供します。部分的に結合したコロニーを有するグリッドセル内のコロニー数を推定するために、最初にプレート全体からの円形ブロブの平均面積をCavgとする。内のコロニー数の推定値になります。相対的な平均コロニー面積とマージされたブロブ面積は、しきい値がマージされたブロブにどのように影響したかによって異なります。提示されたメソッドにはいくつかの制限があります。これには、96ウェルプレートから液体媒体を正確に分注するための機器の必要性が含まれます。この装置は、96チャンネルのピペッターまたはスロット付きレプリケーターピンツールのいずれかで、入手に数千ドルかかる可能性があります。安価な代替手段は存在しますが、精度は低くなります。自動カウントには、いくつかの制限もあります。カウントではコロニーを正しいタイプに割り当てることができません。この場合、ブロブのあるスポットはカウントから削除する必要があります。抗生物質などの選択培地を使用することで、複雑な画像解析の必要性が簡素化されます。ショウジョウバエと細菌の関連表現型のハイスループットスクリーニングが容易になります。この方法は、選択培地を使用して複雑な混合物中の多くの細菌株を区別することにより拡張できると考えています。この方法は、ハエの微生物叢の研究に限定されない。CFUの定量化は、飲料水中の大腸菌群数から病原体の特定まで、微生物学の多くのアプリケーションで一般的です。Labのメンバーは、このプロトコルの開発に関する貴重な意見を提供しました。IOS助成金2032985、NIH助成金DP5OD017851、カナダカーネギー研究所助成金、およびカーネギー科学研究所の基金によって提供されました。reserved×-1::1。